一種谷胱甘肽/超聲雙重刺激響應納米聚合物囊泡、其制備方法及應用與流程

本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種谷胱甘肽/超聲雙重刺激響應納米聚合物囊泡、其制備方法及應用。
背景技術：
：根據大量研究表明，阿霉素是一種有效的抗癌藥物，可抑制rna和dna的合成，對rna的抑制作用最強，抗瘤譜較廣，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用。但是直接注射后通過體液循環到達腫瘤組織的劑量很低，而且會給人體帶來嚴重的副反應。世界上已經有很多研究來發展目標靶向藥物傳輸體系(drugdeliverysystems,dds)來增強藥效和降低副反應，這些藥物載體包括各種形態的納米粒子、膠束、微膠囊、納米囊泡等。聚合物囊泡在藥物封裝、藥物運輸、納米反應器和微米或納米材料模板等領域擁有著無限可能的應用潛力。在各種藥物載體中，聚合物納米囊泡是一種理想的藥物載體。作為一種通過非共價鍵作用力形成的高親水性聚合物組裝體，囊泡的形態與人體的溶酶體非常接近，從某種意義上說，人體各種組織的細胞都是一個個大的囊泡。對于目標藥物載體，智能型的納米囊泡尤其重要，因為它可以選擇性的在目標區域釋放藥物，而在別的區域保持穩定，一般體現為對于ph值、溫度、離子濃度、谷胱甘肽或者它們之間的組合的刺激響應性。其中，最重要的是谷胱甘肽的刺激響應性，因為腫瘤組織與正常細胞間，以及細胞外液和細胞內的內涵體和溶酶體之間存在著明顯的差異，而由腫瘤細胞內液和外液不同濃度的谷胱甘肽濃度產生的環境差異則使得谷胱甘肽刺激響應性也非常重要。除此之外，超聲是一種對人體無害的物理信號，信號強弱易于控制，而且可以特定地施加在腫瘤組織，因此超聲響應性囊泡對于抗癌藥物定點快速釋放具有非常積極的作用。目前，正在積極開發可有效針對腫瘤組織部位的，可以智能化的控制釋藥從而實現對于腫瘤細胞具有靶向殺傷性的藥物的載體。技術實現要素：為解決上述現有技術中存在的問題，本發明提供一種谷胱甘肽/超聲雙重刺激響應納米聚合物囊泡、其制備方法及應用。本發明制得的納米囊泡對谷胱甘肽、超聲具有刺激響應特性，同時具有優異可降解性。具體地，本發明提供一種谷胱甘肽/超聲雙重刺激響應納米聚合物囊泡的制備方法，其包括下述步驟：1)在反應球瓶中加入促溶解劑，溶劑n-甲基吡咯烷酮和吡啶，緩慢加熱至40-70℃，攪拌使之完全溶解，隨后再向溶液中加入含磺酸基的芳香族二元羧酸和亞磷酸三苯酯，待其完全溶解后，再加入稍過量的二元胺，隨后關閉控溫儀，待溶液冷卻后，再抽排三次，用惰性氣體置換出體系中的空氣，在保持體系惰性氣氛下，進行反應，得到親水聚酰胺鏈段；2)在另一個反應球瓶中加入促溶解劑，溶劑n-甲基吡咯烷酮和吡啶，緩慢加熱至40-70℃，攪拌使之完全溶解，隨后再向溶液中加入二硫代二元羧酸和亞磷酸三苯酯，待其完全溶解后，再加入稍過量的二元胺，隨后關閉控溫儀，待溶液冷卻后，再抽排三次，用惰性氣體置換出體系中的空氣，在保持體系惰性氣氛下，進行反應，得到疏水聚酰胺鏈段；3)隨后，將疏水聚酰胺鏈段和親水聚酰胺鏈段混合加入到反應球瓶中，同時補加促溶解劑補償整個反應體系的損失，在惰性氣氛下，繼續反應，得到共聚酰胺溶液，經沉淀、靜置、過濾、洗滌后，收集到多嵌段共聚酰胺，然后將其在30-100℃下真空干燥6-24小時；4)將多嵌段共聚酰胺溶于去離子水中，制備多嵌段共聚酰胺溶液，在40-60℃下加熱攪拌，最后得到多嵌段共聚酰胺囊泡溶液。根據如上所述的制備方法，所述溶劑n-甲基吡咯烷酮與吡啶的體積比為5-9:1-4。其中，該體積比優選9:1、7:2、8:3或4:1。根據如上所述的制備方法，所述的含磺酸基的芳香族二元羧酸為間苯二甲酸-5-磺酸鈉、對苯二甲酸-5-磺酸鈉中的一種或幾種；所述二元胺為乙二胺、丁二胺、己二胺、和癸二胺中的一種或幾種；所述的二硫代二元羧酸為3,3'-二硫代二丙酸、硫代二甘酸、2,2'-二硫代二苯甲酸中的一種或幾種；所述促溶解劑為氯化鋰、氯化鎂或氯化鈣中的一種或幾種。根據如上所述的制備方法，在步驟1)及步驟2)中，以當量比計，含磺酸基的芳香族二元羧酸：二元胺(步驟1))＝1:1、二硫代二元羧酸：二元胺(步驟2))＝1:1、含磺酸基的芳香族二元羧酸：二硫代二元羧酸＝1:0.4-1；亞磷酸三苯酯與二元酸和二元胺的總量的當量比為1:1。根據如上所述的制備方法，在所述步驟1)及步驟2)中，反應溫度為95℃～110℃、反應時間為2～20小時；其中，反應溫度可以95℃、100℃和105℃，反應時間可以是24小時、48小時或72小時等。在步驟3)中，所述反應的溫度為60℃～80℃、時間為24小時～72小時。根據如上所述的制備方法，在所述步驟1)及步驟2)中，所述促溶解劑的濃度為0.04-0.06g/ml、反應物二元胺及二元羧酸的濃度均為0.4mol-0.6mol/l；在步驟4)中，多嵌段共聚酰胺溶液的濃度為0.1mg/ml-0.5mg/ml。一種如上所述制備方法制得的谷胱甘肽/超聲雙重刺激響應納米聚合物囊泡，所述納米囊泡的大小為80-300nm，多分散度為0.10-0.16，壁厚為4-10nm。根據如上所述的囊泡，所述囊泡壁包括懸掛鏈、貫穿鏈和折疊鏈。一種如上所述的雙重刺激響應聚合物納米囊泡的應用，將所述納米囊泡用作藥物載體。根據如上所述的應用，所述藥物為抗癌藥物阿霉素。根據上述本發明所述的制備方法制得的納米囊泡具有谷胱甘肽、超聲雙重響應性，在水中可長期保持均相不沉淀，具有良好的穩定性和分散性，是一種優異的藥物載體。此外，本發明制備工藝清晰簡潔，得到的納米囊泡藥物載體具有谷胱甘肽/超聲雙重刺激響應性，谷胱甘肽響應性可以使得納米囊泡在腫瘤細胞外低谷胱甘肽濃度的環境中保持穩定，長時間循環，很少泄露藥物，而在腫瘤細胞內谷胱甘肽濃度高的環境中快速降解，變為小分子量的線性鏈，從而快速釋放藥物，達到在目標腫瘤細胞內控制釋放抗癌藥物的效果。超聲響應則可通過定點施加超聲信號，加速抗癌藥物的釋放，體現出與谷胱甘肽的協同效應。而囊泡粒子的可生物降解性和降解后的小分子量又可以使得藥物載體迅速代謝排出體外，進一步減少對人體的副作用。以上設計思路基本覆蓋了藥物傳遞領域所關心的一些基本問題，因此產品具有良好的全面性。附圖說明圖1(a)是囊泡中聚合物鏈堆積模式的dpd模擬圖；圖1(b)是各粒子在囊泡中的徑向密度分布圖。圖2(c)為囊泡形貌圖afm照片；圖2(d)粒子的高度圖和粒子截面示意圖。圖3是谷胱甘肽/超聲響應納米囊泡中間態的透射電鏡圖像。圖4(a)是包裹了尼羅紅染料的多嵌段共聚酰胺囊泡水溶液超聲作用下的熒光發射光譜；圖4(b)是不同溫度下囊泡水溶液的熒光發射光譜的歸一化曲線。具體實施方式下面結合實施例對本發明進行詳細描述，本部分的描述僅是示范性和解釋性，不應對本發明的保護范圍有任何的限制作用。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明，均可從商業途徑得到。一、谷胱甘肽/超聲雙重刺激響應納米聚合物囊泡的制備實施例11)在反應球瓶中加入1g氯化鈣，22.5ml溶劑n-甲基吡咯烷酮和2.5ml吡啶，緩慢加熱至70℃，攪拌使之完全溶解。隨后再向溶液中加入2.68g間苯二甲酸-5-磺酸鈉和5.24ml亞磷酸三苯酯，待其完全溶解后，再加1.16g己二胺。隨后關閉控溫儀，待溶液冷卻后，再抽排三次，用氮氣置換出體系中的空氣。在保持體系惰性氣氛下，開始加熱升溫至95℃，反應3小時。得到親水聚酰胺鏈段。2)在另一個反應球瓶中加入1g氯化鈣，22.5mln-甲基吡咯烷酮和2.5ml吡啶，緩慢加熱至70℃，攪拌使之完全溶解。隨后再向溶液中加入2.10g3,3'-二硫代二丙酸和5.24ml亞磷酸三苯酯，待其完全溶解后，再加入1.16g己二胺。隨后關閉控溫儀，待溶液冷卻后，再抽排三次，用氮氣置換出體系中的空氣。在保持體系惰性氣氛下，開始加熱升溫至95℃，反應3小時。得到疏水聚酰胺鏈段。3)隨后，把疏水聚酰胺鏈段溶液和親水聚酰胺鏈段混合加入到反應球瓶中。同時補加促溶解劑補償整個反應體系的損失。在惰性氣氛下，于60℃繼續反應48小時。最后得到的共聚酰胺溶液用甲醇沉淀。靜置后，過濾可以得到最終產物，并用甲醇洗滌產物三次。收集到的谷胱甘肽、超聲雙重刺激響應性多嵌段共聚酰胺在50℃下真空干燥24小時。4)將多嵌段共聚酰胺溶于去離子水中，制備濃度為0.3mg/ml的多嵌段共聚酰胺溶液，在50℃下加熱攪拌12小時，最后得到多嵌段共聚酰胺囊泡溶液。囊泡靜置144小時后，其水溶液是均相的，完全沒有沉淀，分散性好。實施例21)在反應球瓶中加入0.5g氯化鎂和0.52g氯化鋰，13.2ml溶劑n-甲基吡咯烷酮和3.8ml吡啶，緩慢加熱至40℃，攪拌使之完全溶解。隨后再向溶液中加入2.68g間苯二甲酸-5-磺酸鈉和5.24ml亞磷酸三苯酯，待其完全溶解后，再加0.6g乙二胺。隨后關閉控溫儀，待溶液冷卻后，再抽排三次，用氮氣置換出體系中的空氣。在保持體系惰性氣氛下，開始加熱升溫至100℃，反應20小時。得到親水聚酰胺鏈段。2)在另一個反應球瓶中加入0.2g氯化鈣和0.2g氯化鋰，6.22mln-甲基吡咯烷酮和1.78ml吡啶，緩慢加熱至40℃，攪拌使之完全溶解。隨后再向溶液中加入1.225g2,2'-二硫代二苯甲酸和2.10ml亞磷酸三苯酯，待其完全溶解后，再加入0.24g乙二胺。隨后關閉控溫儀，待溶液冷卻后，再抽排三次，用氮氣置換出體系中的空氣。在保持體系惰性氣氛下，開始加熱升溫至100℃，反應20小時。得到疏水聚酰胺鏈段。3)隨后，把疏水聚酰胺鏈段溶液和親水聚酰胺鏈段混合加入到反應球瓶中。同時補加促溶解劑補償整個反應體系的損失。在惰性氣氛下，于80℃繼續反應24小時。最后得到的共聚酰胺溶液用甲醇沉淀。靜置后，過濾可以得到最終產物，并用甲醇洗滌產物三次。收集到的谷胱甘肽、超聲雙重刺激響應性多嵌段共聚酰胺在100℃下真空干燥6小時。4)將多嵌段共聚酰胺溶于去離子水中，制備濃度為0.5mg/ml的多嵌段共聚酰胺溶液，在40℃下加熱攪拌12小時，最后得到多嵌段共聚酰胺囊泡溶液。囊泡靜置144小時后，其水溶液是均相的，完全沒有沉淀，分散性好。實施例31)在反應球瓶中加入0.5g氯化鈣和0.5g氯化鋰，8.89ml溶劑n-甲基吡咯烷酮和1.11ml吡啶，緩慢加熱至70℃，攪拌使之完全溶解。隨后再向溶液中加入2.68g對苯二甲酸-5-磺酸鈉和5.24ml亞磷酸三苯酯，待其完全溶解后，再加0.88g丁二胺。隨后關閉控溫儀，待溶液冷卻后，再抽排三次，用氮氣置換出體系中的空氣。在保持體系惰性氣氛下，開始加熱升溫至105℃，反應12小時。得到親水聚酰胺鏈段。2)在另一個反應球瓶中加入0.5g氯化鈣和0.1g氯化鋰，5.56mln-甲基吡咯烷酮和4.44ml吡啶，緩慢加熱至70℃，攪拌使之完全溶解。隨后再向溶液中加入0.9g硫代二甘酸和3.14ml亞磷酸三苯酯，待其完全溶解后，再加入0.70g己二胺。隨后關閉控溫儀，待溶液冷卻后，再抽排三次，用氮氣置換出體系中的空氣。在保持體系惰性氣氛下，開始加熱升溫至105℃，反應12小時。得到疏水聚酰胺鏈段。3)隨后，把疏水聚酰胺鏈段溶液和親水聚酰胺鏈段混合加入到反應球瓶中。同時補加促溶解劑補償整個反應體系的損失。在惰性氣氛下，于60℃繼續反應72小時。最后得到的共聚酰胺溶液用甲醇沉淀。靜置后，過濾可以得到最終產物，并用甲醇洗滌產物三次。收集到的谷胱甘肽、超聲雙重刺激響應性多嵌段共聚酰胺在30℃下真空干燥24小時。4)將多嵌段共聚酰胺溶于去離子水中，制備濃度為0.1mg/ml的多嵌段共聚酰胺溶液，在60℃下加熱攪拌12小時，最后得到多嵌段共聚酰胺囊泡溶液。囊泡靜置144小時后，其水溶液是均相的，完全沒有沉淀，分散性好。實施例41)在反應球瓶中加入0.5g氯化鈣和0.7g氯化鋰，16ml溶劑n-甲基吡咯烷酮和4ml吡啶，緩慢加熱至60℃，攪拌使之完全溶解。隨后再向溶液中加入2.68g對苯二甲酸-5-磺酸鈉和5.24ml亞磷酸三苯酯，待其完全溶解后，再加1.72g癸二胺。隨后關閉控溫儀，待溶液冷卻后，再抽排三次，用氮氣置換出體系中的空氣。在保持體系惰性氣氛下，開始加熱升溫至110℃，反應3小時。得到親水聚酰胺鏈段。2)在另一個反應球瓶中加入0.5g氯化鈣和0.15g氯化鋰，10.4mln-甲基吡咯烷酮和2.6ml吡啶，緩慢加熱至60℃，攪拌使之完全溶解。隨后再向溶液中加入1.68g3,3'-二硫代二丙酸和4.19ml亞磷酸三苯酯，待其完全溶解后，再加入0.93g己二胺。隨后關閉控溫儀，待溶液冷卻后，再抽排三次，用氮氣置換出體系中的空氣。在保持體系惰性氣氛下，開始加熱升溫至110℃，反應3小時。得到疏水聚酰胺鏈段。3)隨后，把疏水聚酰胺鏈段溶液和親水聚酰胺鏈段混合加入到反應球瓶中。同時補加促溶解劑補償整個反應體系的損失。在惰性氣氛下，于70℃繼續反應48小時。最后得到的共聚酰胺溶液用甲醇沉淀。靜置后，過濾可以得到最終產物，并用甲醇洗滌產物三次。收集到的谷胱甘肽、超聲雙重刺激響應性多嵌段共聚酰胺在80℃下真空干燥12小時。4)將多嵌段共聚酰胺溶于去離子水中，制備濃度為0.2mg/ml的多嵌段共聚酰胺溶液，在50℃下加熱攪拌12小時，最后得到多嵌段共聚酰胺囊泡溶液。囊泡靜置144小時后，其水溶液是均相的，完全沒有沉淀，分散性好。實施例5在步驟2)中，以0.84g3,3'-二硫代二丙酸代替2,2'-二硫代二苯甲酸、以0.48g己二胺代替乙二胺，其他與實施例2相同。囊泡靜置144小時后，其水溶液是均相的，完全沒有沉淀，分散性好。實施例6在步驟2)中，以1.26g3,3'-二硫代二丙酸代替硫代二甘酸，其他與實施例3相同。囊泡靜置144小時后，其水溶液是均相的，完全沒有沉淀，分散性好。二、谷胱甘肽/超聲雙重刺激響應納米聚合物囊泡的性能測試(1)粒徑及多分散度測試取實施例1-6中制得的納米囊泡粒子，分別配制1mg/ml的納米囊泡水溶液，在zetasizernanozs90儀(malvern)上測定納米囊泡的粒徑大小和粒徑分布，取五次測試的平均值。其中，粒徑分布的五次測試平均值為多分散度。另外，4mwhe-nelaser的波長為633nm，測試角為90°，采用contin分析方法。結果如表1所示。表1實施例1實施例2實施例3實施例4實施例5實施例6粒徑(nm)18919312729419883多分散度0.100.160.140.120.130.15由測試可知，本發明制得的納米囊泡為球狀，且由表1中測得的數據可知，本發明制得的納米囊泡粒徑在80-300nm之間，多分散度在0.1-0.16之間。利用耗散粒子動力學模型模擬囊泡的組裝體，結果如圖1所示，其中圖1(a)是分子鏈在囊泡結構中的形態，其中包括懸掛鏈、貫穿鏈和折疊鏈，不同于一般的雙分子層囊泡圖1(b)模擬結果中囊泡中心到外部的質量密度分布曲線，根據密度分布曲線計算出聚酰胺囊泡薄膜的厚度，其壁厚為4.5nm。為了驗證模擬結果的可靠性我們又隨機選取實施例1，對其進行原子力顯微鏡測試。結果如圖2，其中圖2(c)為afm照片；圖2(d)粒子的高度圖和粒子截面示意圖。根據結果，其壁厚為4.55nm，囊泡半徑為92.6nm。去除水合直徑的影響，測試結果與模擬結果高度吻合。同樣驗證實施例2-6的囊泡壁厚在4-10nm之間。(2)降解性測試取50ml的單口燒瓶，加入10mg的納米囊泡粒子，然后加入20ml磷酸鹽緩沖溶液(ph＝7.4)，然后加入20mm的谷胱甘肽，放入恒溫搖床(200rpm搖速，37.5℃)勻速振蕩12小時。通過gpc測定降解后納米囊泡粒子的分子量。對本發明實施例1-6中制得的納米囊泡粒子分別進行如上的降解性測試，分子量結果如表2所示。表2由表2可知，本發明所制備的納米囊泡在還原劑降解后，分子量小于2000且分子量分布均勻(pdi<1.5)，遠小于代謝閡值(45-50kda}，預計可以很好的代謝排出體外。(3)載藥性測試將5mg的阿霉素(起始藥物量)和25mg的納米囊泡，溶于5ml的dmf中，再加入10ul的三乙胺，攪拌24小時。然后將混合溶液在冷凍干燥箱中凍干。精確稱取2mg適量凍干后的納米囊泡載藥粉末，溶于4mldmso中，用紫外分光光度計測定吸光度(λ＝485nm)，根據阿霉素吸光度的標準曲線得到阿霉素的含量，進而算出阿霉素含量，計算載藥率和包封率。對實施例1-6中的制得的納米囊泡進行上述實驗，結果如表3所示。載藥率和包封率按以下公式計算:載藥率＝阿霉素的含量/納米藥物的質量×100％實際載藥量＝載藥率×上述凍干后的納米囊泡載藥粉末包封率＝實際載藥量/起始藥物量×100％表3實施例1實施例2實施例3實施例4實施例5實施例6實施例7載藥率(％)58.259.150.158.754.658.455.7包封率(％)79.681.676.374.373.771.977.3由上述表3可知，本發明中制得的納米囊泡的載藥率及包封率均優異。(4)谷胱甘肽釋藥試驗將8-10mg載藥納米囊泡粒子分散在8-10ml的兩種緩沖溶液中(磷酸鹽緩沖溶液ph＝7.4；醋酸—醋酸鈉緩沖溶液ph＝6.0)，分散均勻，然后分為4-5份，每份2ml左右，再放入80ml的含不同濃度的谷胱甘肽的緩沖溶液中，即刻開始測試，通過紫外測定藥物濃度來計算釋藥率。在48小時后，從瓶內取出3ml釋藥的緩沖溶液進行紫外測量，并且分別在25℃、36℃和37.5℃的條件下恒測定。隨機選取實施例1及實施例5制得的納米囊泡進行上述實驗，藥物釋放率結果如表4所示。表4藥物釋放率結果由表4可知，在相同濃度、相同ph值條件下，隨著谷胱甘肽濃度增加，阿霉素的釋放增加，其對谷胱甘肽濃度有優異的響應性。并且，關于阿霉素的釋放，在高谷胱甘肽濃度、較低ph值條件下和較高溫度下展現出較快的釋放速度，可以達到65％以上，而在低谷胱甘肽濃度、中性的ph值及低溫度條件下保持穩定、釋放量小于20％。而眾所周知，谷胱甘肽濃度高、ph值低、溫度高的條件下，相似于腫瘤細胞內的環境，在該環境下藥物釋放率高，可實現藥物最大量釋放的效果，相反，在谷胱甘肽濃度低、ph值高、溫度低的條件下，相似于正常細胞內的環境下，藥物釋放得到控制，保證對正常細胞的安全性。由此可知，通過本發明制得的納米囊泡，谷胱甘肽濃度、ph值及溫度具有刺激響應性，通過本發明的納米囊泡對藥物包封可實現藥物選擇性釋放的效果。(5)超聲釋藥試驗用功率為150w、頻率為40khz的超聲作用于包裹了尼羅紅分子的納米聚合物囊泡溶液。在超聲作用下測定納米聚合物囊泡的溶液的熒光光譜。當激發波長為600nm時，囊泡水溶液可以發出波長為670nm的紅光。圖3為超聲作用1分鐘后，囊泡電鏡圖，可以發現，超聲作用一分鐘后，部分囊泡已經發生破裂。隨著超聲時間的延長，多嵌段共聚酰胺囊泡溶液的熒光強度逐漸降低。超聲9min以后，囊泡水溶液的熒光強度下降了近50％，測試結果如圖4(a)中所示。圖4(b)是不同溫度下囊泡水溶液的熒光發射光譜的歸一化曲線。結果顯示其在超聲作用下才能釋放尼羅紅，證明了納米囊泡對超聲刺激響應的獨特性。當前第1頁12