雜交疫苗載體及其應用的制作方法

專利名稱：雜交疫苗載體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明是一種治療和/或預防傳染性疾病、癌癥和自身免疫性疾病的方法及其組成成份。該發明由至少兩個基因表達單位經雜交形成一個基因表達載體；其中一個基因表達單位表達細胞生長因子和/或淋巴因子，另一個基因表達單位表達單個、融合和/或多個病原體抗原基因；該發明主要應用這個基因表達雜交載體研發治療和預防疾病的疫苗。
背景技術：
在疾病防治歷史上，疫苗一直是最有效、價廉和實用的方法。沒有任何一種措施包括抗生素在內曾經如此有效地降低人口的死亡率，疫苗對人類健康的影響之大是難以用語言做評價的。疫苗曾在世界上許多國家成功地控制了以下九種疾病天花、百喉、破傷風、猩紅熱、百日咳、脊髓灰質炎、麻疹、腮腺炎和風疹。天花是在世界范圍內得到最有效控制的疾病。一個疫苗的有效性是取決于它能誘導機體產生保護性免疫反應的能力。
脊椎動物尤其是鳥類和哺乳動物戰勝微生物感染的機制是一個復雜的過程。病原體侵入宿主后會激活機體多系統多種保護性反應，如果病原體或其毒素成功地攻破機體的外層防線而進入血循環，淋巴器官如脾、肝和骨髓將會分解和清除進入血循環中的病原體或其毒素。淋巴組織是由一系列相互交織的細胞和纖維組成，這些細胞包括白細胞即淋巴細胞和處于不同分化階段的其它細胞，如漿細胞、淋巴纖維細胞、單核-巨噬細胞、嗜酸細胞和肥大細胞。淋巴細胞主要分為T和B淋巴細胞，它們在機體的抗原特異性免疫反應中起不同作用但又互補。
免疫系統通過識別外源性病原體而成為保持機體內環境穩定的重要防線。機體對外源性病原體的初步反應稱為“先天性免疫”，先天性免疫的特征是自然殺傷細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和其它白細胞首先對病原體產生應答，這些細胞通過吞噬、消化、裂解或分秘淋巴因子在短時間內消滅病原體。先天性免疫是抗原非特異性的，它是機體產生“獲得性免疫”應答之前的第一道抵御病原體的防線。T和B淋巴細胞是參于獲得性免疫反應的主要細胞，獲得性免疫反應的特征是B細胞識別抗原后被激活從而分秘抗原特異性抗體、T細胞的激活和抗原提呈。
B細胞識別抗原是指抗原與B細胞表面的免疫球蛋白受體結合，這些抗原包括細菌細胞壁、細菌毒素或病毒表面糖蛋白，該結合促使信號傳導到B細胞內，此過程稱為“第一信號”，在某些情況下，僅需要一個信號就能激活B細胞，這些無需輔助性T細胞就能激活B細胞的抗原稱為“不依賴T細胞抗原”(或不依賴胸腺抗原)；某些情況下，B細胞的激活需要“第二信號”，第二信號通常由輔助性T細胞提供，這類細胞抗原稱為“T細胞依賴性抗原”(或胸腺依賴性抗原)；結合到B細胞表面的抗原通過內吞進入B細胞并被消化為小片段，這些片段又與B細胞表面的MHC II分子結合形成“抗原多肽-MHC II分子復合物”，該復合物提供T細胞依賴性抗原激活B細胞所需的第二信號。激活B細胞的另一種方式是B細胞與淋巴結和脾臟生發中心的樹突狀細胞(DentriticCells，DC)結合。
獲得性免疫的一個重要機制是T細胞的激活，激活T細胞需要抗原提呈細胞如巨噬細胞和DC細胞與T細胞結合，巨噬細胞表面有多個識別病原體抗原的受體，如甘露糖和清道夫受體，巨噬細胞吞噬這些病原體后在內體和溶酶體的作用下將其消化裂解為多肽片段，這些多肽片段與巨噬細胞表面的MHC II分子結合形成“抗原多肽-MHC II分子復合物”，當T細胞與該復合物結合后被激活。DC細胞是既能形成“抗原多肽-MHC II分子復合物”又能形成“抗原多肽-MHC I分子復合物”的抗原提呈細胞。
當B細胞與抗原結合后通過“同型轉換”使分泌普通IgM抗體的B細胞轉化為分泌特異性的IgG抗體，這些細胞分為兩類一類不斷分裂稱為克隆擴增，這類細胞成熟后每秒鐘可釋放2000個同樣的抗體，約2-3天后死亡；另一類細胞此時不分泌抗體而成為記憶細胞，這些記憶細胞可存活數月到數年，當再次遇到同樣抗原時這類記憶細胞會迅速產生大量抗體，這種免疫反應稱為次級免疫反應。研發疫苗的目標就是要誘導這種較初級免疫反應更快更強的次級免疫反應。
經典的主動疫苗分為亞單位和完整病原體疫苗，亞單位疫苗是完整病原體的一部分，其目的是避免應用有致病性的完整病原體或避免應用完整病原體的有毒組份。B型副流感病毒的脂多糖做為腦膜炎疫苗就是應用抗原組份的一個亞單位疫苗例子；完整病原體疫苗通常是滅活或減毒的病原體，如滅活的百日咳疫苗。由于滅活或減毒過程有時會損害一些誘導免疫反應所必需的抗原決定基，因此這類疫苗常需添加免疫增強劑。
傳統的預防性疫苗是通過接種疫苗后使機體在再次遇到相同病原體時能產生保護性免疫反應，這種理論適用于病毒或細菌傳染性疾病，因病毒或細菌僅有有限數量的抗原；但抗癌疫苗并非如此，抗癌疫苗是必須能夠根除已經存在的癌細胞，這樣就使我們必須更好地明白腫瘤抗原和宿主免疫的作用機制，當代的疫苗理論是要誘導細胞免疫反應。
迄今為止沒有成功的艾滋病(AIDs)疫苗，在某些有癥狀和無癥狀的艾滋病患者體內檢測到滴度很高的抗gp160/120抗體提示，這些抗體也許不僅不起保護作用，反而有可能促進病毒顆粒與細胞的連接和穿入宿主細胞，更重要的是，現在還沒有疫苗能夠誘導足夠強的細胞免疫反應來消滅已被HIV感染的并不斷釋放新病毒顆粒的被感染細胞。
盡管有許多基礎和臨床研究表明免疫系統有清除癌細胞的能力，但大多數情況下，免疫系統或者不能識別癌細胞或者所產生的免疫反應太弱而無明顯效果[Farzaneh，etal.，Immunol.Today，19294(1998)]，尤其是對已廣泛轉移的晚期腫瘤。癌癥治療中的手術、化療、放療及其聯合療法仍不能達到治愈的目的事實提醒我們，免疫和生物療法也許是新的希望[Ockert，et al.，Immunol.Today，2063(1999)]。目前，刺激機體免疫反應來誘導腫瘤消退成為腫瘤免疫的目標，為此，我們需要更好地明白腫瘤抗原基因和T細胞介導的免疫反應與腫瘤逃避[Boon，et al.，Immunol.Today，18267(1998)；Chen，et al.，Immunol.Today，1927(1998)]。
腫瘤動物模型的研究表明，細胞毒性T細胞(Cytotoxicity T cells，CTL)在抗腫瘤免疫反應中起著重要的作用[Denfeld，et al.，Int J.Cancer，62；259；Greten，etal.，J.Clin.Oncol.，171047(1998)；Sampson，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9310399(1996)]，但是誘導T細胞介導的免疫反應是研發腫瘤疫苗的最重要挑戰[Sampson，et al.]。激活淋巴細胞的雙信號模型被認為是最理想的激活方式，它需要TCR提呈的抗原性特異性信號和抗原非特異性刺激信號的共同參與[Van Seventer，et al.，Curr.Opin.Immunol.，3294(1991)；Linsley，et al.，J.Exp.Med.，173721(1991)]。由此看來，腫瘤細胞侵潤機體不僅涉及腫瘤細胞本身，而且損害宿主細胞的整體免疫功能，這些包括腫瘤細胞MHC復合物的表達缺陷、抗原提呈缺陷、T細胞識別腫瘤相關抗原的缺陷、協同刺激信號的缺陷、粘附分子表達缺陷、Fas受體和配體的表達缺陷、腫瘤微環境免疫因子分泌缺陷等[Boon，et al.，1997]。因此，在病理狀態下常是因為免疫反應太弱而不能抵御疾病，而全面激活抗原特異性T細胞至少需要兩個刺激信號[Young，et al.，J.Clin.Invest.，90229(1992)；Allison，et al.，Science，270932(1995)]，一是由抗原提呈細胞(APC)提呈的與T細胞受體(TCR)偶聯的抗原多肽MHC復合物，二是由T細胞和APC細胞提呈的細胞因子，如CD28和B7-1，這兩個信號協同作用激活T細胞，被激活的T細胞通過克隆擴增和分化而成為功能性T細胞[Lisley，et al.，1991；Young，et al.1992；Bluestone，Immunity，2555(1995)；Guerder，etal.，J.Immunol.，1555167(1995)；Webb，et al.Blood，863479(1995)；Thompson，Cell，81979(1995)]。功能性T細胞與天然性T細胞不同，功能性T細胞一旦被激活，它就不再需要協同刺激信號來識別和消滅帶有抗原的靶細胞，一旦免疫反應被啟動，一部分功能性T細胞就成為記憶細胞以備再次遇到相同抗原時產生更強更快的免疫反應[Gray，Ann.Rev.Immunol.，1149(1993)；Ahmed，et al.，Science，27254(1996)]，而缺乏第二個刺激信號時常產生無功能性T細胞[Chen，1998；Van Gool，et al.，Res.Immunol.，146183(1994)]。
許多腫瘤細胞都表達靶抗原，但它們通常都不能刺激免疫反應[Boon，et al.，1997；Boon，et al.，J.Exp.Med.，183725(1996)]，小鼠動物模型中的研究已證明，CTL反應能夠使已形成的腫瘤消退[Mogi，et al.，Clin.Cancer Res.，4713(1998)；Gong，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，972715(2000)]，誘導強有力的CTL反應是目前抗癌疫苗的策略。
CTL依賴性抗腫瘤免疫不僅需要CTL能識別的抗原而且需要有效的抗原導入方法，CTL能夠識別的靶抗原是MHC I分子與抗原多肽的復合物，為有效激活CTL，MHC I-抗原多肽復合物必須通過專業性APC細胞提呈給CTL，而將外源性抗原有效地導入MHC I限制性的APC細胞是設計癌癥疫苗的關鍵，目前正在研究階段的抗原導入方法有多肽、熱休克蛋白、負載抗原的APC細胞的被動移植等。近來一些研究表明，應用病毒或脂質體載體導入DNA疫苗或裸體DNA疫苗都能誘導一定程度的抗腫瘤免疫。
研究表明，CTL的激活通常需要IL-2使CTL-P轉化為CTL，IL-2缺乏或不足時會使更被激活的CTL發生細胞凋亡，在這種情況下，已激活的免疫反應又會被迅速終止。
為了克服通過激活CTL的方法來戰勝HIV和癌癥，目前急需新型有效的疫苗載體系統。最理想的莫過于載體本身具有免疫佐劑作用，這種載體能有效地將抗原導入巨噬細胞和DC，如果這個載體能攜帶多種抗原分子將更有利于全面激活所希望的獲得性免疫反應，雙信號激活模型能提供有效和持久的T細胞活性，現代大多數疫苗都需要誘導強效的由細胞介導的免疫反應(CMI)，包括CTL免疫反應，但是，僅用蛋白很難誘導強效的CTL反應，因此，如何有效地將蛋白或DNA導入體內靶部位成為疫苗成功的關鍵。
本發明是一種雜交酵母疫苗載體，它能誘導與MHC I和II分子偶聯的強效、持久的保護性CTL免疫反應，也就是說是能達到理想免疫效果的疫苗載體系統。

發明內容
本發明第一部分是一個基因載體系統。該載體由兩個DNA質粒組成，一個編碼協同刺激信號，如由啟動子操作的細胞因子；另一個DNA質粒編碼由啟動子操作的至少一個或多個抗原基因。
本發明第二部分是一種誘導抗腫瘤免疫的方法。包括從病人分離癌細胞，將攜帶有由啟動子操終的細胞因子和一個或多個抗原基因的該載體轉染癌細胞，將轉化的癌細胞在體外孵育以表達所攜帶的細胞因子如IL-2和抗原基因，然后將此癌細胞注射入病人。
本發明第三部分是一種誘導細胞毒性T淋巴細胞免疫反應(CTL)來對抗病原體微生物如病毒的方法。
本發明第四部分是一種基因表達系統，該系統由獨立啟動子分別表達細胞生長因子如IL-2和病原體抗原基因。
本發明第五部分是一種誘導脊椎動物免疫反應的方法，所需免疫反應通過該載體及載體所攜帶的抗原基因或細胞生長因子來體現。


以下

是對本發明以圖表示時的一些部分的具體描述，同時也是對本發明原理的輔助性解釋。
圖1.本發明操作原理的圖解。
圖2.本發明應用的一個實例圖解。
圖3.應用本發明所表達的hIL-2水平的線圖示。
圖4.應用本發明所生產的疫苗免疫接種小鼠后所誘導的CTL反應條形圖示。
具體實施例方式
本發明的疫苗載體系統是一種誘導強效、持久的CTL免疫反應的方法，它通過激活依賴MHC I和II的途徑來產生保護性免疫反應。圖1是對本發明操作原理的圖解，圖中的酵母質粒α和a分別表達抗原基因和一個協同刺激信號，該協同刺激信號通常是促使抗原基因刺激最有效免疫反應的相應細胞生長因子，而且很可能若沒有同時將此細胞因子導入，其免疫反應將不能達到其最佳狀態。這些抗原分子有如下所列但并不限于這些，如病毒、細菌、寄生蟲和腫瘤細胞組份、百喉毒素C片斷、霍亂毒素B亞單位、B型肝炎病毒表面抗原、HIV抗原、志賀氏桿菌脂多糖(LPS)等以及單個、多個或不同排列組合的抗原。另一些抗原可以是真菌、原蟲、蛔蟲和癌細胞抗原；癌細胞抗原有如下所列但并不限于這些，如K-ras、EGFR、HER2、PSMA、CEA、MAGE、MART-1等；細胞因子有如下所列但并不限于這些，IL-2、TNF、IFN、B7-1、GM-CSF、IL-12、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-14、IL-18、B7-2、CD28、CD40、TNFR、lymophotoxin-betaR、NF-KappaB、ICAM-1、LFA-3、M-CSFR、mM-CSF、Flt3-L、SCF、TPO、CD80和CD58。
本發明的疫苗載體系統首先是由兩個分離的質粒通過真核生物基因交配的方法形成。該真核生物包括如下所列但并不限于這些，Saccharomyces，Schizosaccharomyces，Yarrowia，candida，hansenula。另外，這個載體系統也可由原核細胞組成，如大腸桿菌和病毒質粒等但并不限于這些。因此，無論是真核或原核細胞所形成的最后產品是由一個啟動子控制表達細胞因子，另一個多克隆位點供插入各種各樣的抗原基因，另有復制子、轉錄、翻譯元件的DNA序列、篩選標記等通過連接子將其連成完整質粒，真核細胞表達載體的篩選標記有neo、leu2、ura3、trp1、ade1、his3等，該疫苗載體被用于需要治療的機體。
本發明疫苗載體的結構如圖1所示，首先，構建二個功能性的多核苷酸序列組成的DNA表達質粒；這兩個質粒的具體應用例子如圖2所示。其中的啟動子可以是真核生物啟動子但并不限于此，如酵母Sccharomyces cerevisine和Candida albicans。啟動子可以是誘導性的或組成性的，誘導性啟動子可以被調介，如營養成份(carbon souces，nitrogen souces和其它)、藥物(抗藥性等)、與感染過程有關的特殊試劑(血清等)和溫度(熱休克和冷休克等)。將所得到的兩個質粒分別轉化為真核微生物如單倍體酵母，轉化DNA的方法可以是多種多樣的，包括鈣磷沉淀法、顯微注射法、脂質體法、電穿孔法和病毒載體法等，這里也包括各種各樣的含有載體的宿主細胞。
本發明中的DNA質粒的啟動子也可以是原核細胞啟動子，在這種情況下，宿主可以是原核細胞表達質粒，其目的也是誘導所需的免疫反應，可用多種方法將此原核細胞表達質粒轉化為真核微生物，如轉導、偶聯、轉化、電穿孔法和轉染等。
當用酵母作為宿主微生物時，一旦酵母質粒被成功地轉化為酵母時，可用氨基酸缺陷培養基篩選轉化子，然后通過單倍體酵母基因交配而形成雙倍體雜交酵母，此時再用雙氨基酸缺陷培養基篩選雙倍體雜交轉化子[Guthrie Fink，Guide to Yeast Genetics& Molecular Biology，Methods in Enzymology，1943-231(1999)]，在這個過程中，非轉化子被自然淘汰。
本發明疫苗載體用于研發人類和動物的多種疾病的治療性和/或預防性疫苗，這些疾病如下所列但并不限于此，如HIV、流感、白血病、C型肝炎、B型肝炎、人乳頭瘤病毒、生殖道皰疹、自身免疫性疾病、瘧疾、肺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、風濕性關節炎和其它病毒、細菌、寄生蟲感染。
應用該疫苗的另一個方法是從患者分離巨噬細胞或DC細胞，然后將該疫苗導入被分離出的巨噬細胞或DC細胞，在體外培養這種細胞并加入一些淋巴因子，然后將該細胞輸回入患者。
為構建肺癌疫苗，將GM-CSF克隆到在組成性酵母啟動子控制下的酵母質粒α上，將肺癌細胞抗原EGFR克隆到酵母質粒a，將所得到的兩個單倍體酵母質粒α和a分別轉化到宿主酵母W303α和a上，將所得到的轉化子交配形成雙倍體，通過leu2/ura3氨基酸缺陷培養基篩選終末疫苗產品。
本發明中的疫苗通常通過胃腸道使用，也可通過注射，如皮下、肌內、腹腔、皮內等；也可通過鼻腔滴入、噴霧吸入和口服；本發明也包括該疫苗的其它配方，如栓劑；使用疫苗的途經可根據個體情況選擇以達到最佳臨床效果；如果該疫苗用于農場動物，也可采用口服，如雞；本疫苗可通過計算單位來定量，可以是無菌胃腸道型和非胃腸道型的，也可以是普通胃腸道型和非胃腸道型的；可以是油水或水油乳劑；使用該疫苗的療程可以是2-3周內2次或視具體情況決定。
應用該疫苗的方法還包括從患者體內分離腫瘤細胞，將該疫苗表達載體轉染入腫瘤細胞，體外培養細胞使腫瘤細胞轉化為APC細胞，用同位素放射照射法殺死此APC，然后用此APC細胞激活從病人分離的T細胞，將激活的功能性T細胞輸回患者，該功能性T細胞成為有效的CTL通過免疫反應消滅體內腫瘤，該治療方法稱為體外體內法。一旦腫瘤消失，機體以具有記憶細胞存在，也就是說機體已具有了潛在的更快更強的免疫反應能力。
如前所述，本發明也是一種腫瘤免疫療法，將攜帶有細胞因子和抗原的DNA轉染入腫瘤細胞，被如此修飾的腫瘤細胞可作為腫瘤疫苗使用，該治療方法稱為細胞疫苗療法。
本發明還可應用上述修飾的腫瘤細胞在體外激活從患者分離的T淋巴細胞，這種被激活的T淋巴細胞可在體內誘導原發和/或已轉移的腫瘤消退，此時，這種經修飾的腫瘤細胞成為一種誘導免疫反應的疫苗。
以下舉例說明本發明但并不限于這些，所用的科學和技術術語都以本領域普通人員能理解和明白為原則。這里所舉出的特例是為說明本發明之用，以供參考，并不是說本發明的應用僅限于此，另外，用同樣方式同樣組份但又作些修改仍顯而易見屬于本發明之范疇。
例1.構建酵母表達質粒表達hIL-2和構建表達抗原基因的廣譜質粒載體圖2中的質粒pcDNA3.IL-2由上海醫科大學何博士贈送，將該質粒中的hIL-2用限制性內切酶smalI/NotI消化后克隆到pYES3/CT(Invitrogen)的多克隆位點區(MCS)smalI/NotI，將質粒pYEX-BX(Clontech)的MCS區域修飾即增加多個限制性內切酶位點使其容易克隆，由此構建成表達抗原基因的廣譜質粒載體pYEX.UIG。
所得到的質粒pYEX.UIG可用于克隆表達疾病病原體抗原基因，在此例中為HIV-1融合抗原基因(gp41.36，由中國AIDS協會何敏博士贈送)，用EcoRI/XhoI內切酶將其抗原基因克隆到pYEX.UIG載體。
例2.雜交酵母疫苗載體的構建如圖2所示，將例1中所得質粒pYES3/CT.IL-2用TE/LiOAc方法轉化為酵母W303-1Aα(ATCC)，用Leu營養缺陷瓊脂培養基平板篩選轉化子；將例1中所得質粒pYEX.UIG.gp41.36用TE/LiOAc方法轉化為酵母W303-1Aa(ATCC)，用Ura3營養缺陷瓊脂培養基平板篩選轉化子；將所得兩個轉化子IGV.IL-2(α)和IGV.gp41.36(a)通過基因配型雜交生成終末疫苗產品，該疫苗具有表達IL-2和抗原蛋白的能力。
例3.hIL-2的測定向8月齡雌性DBA/J小鼠腹腔注射1ml礦物油，24小時后用無血清的HPBS液清洗出腹腔滲出液，收集滲出液中的巨噬細胞，將1-6×106個巨噬細胞分為二組并分別與IGV.IL-2和IGV.gp41.36共同孵育，在不同時間時，取出200μl培養上清液儲存于-70C°待作IL-2定量測定，用hIL-2測定試劑盒(DuoSet Kit)(Genzyme Diagnostics，Cambridge，MA)定量測定IL-2。如圖3所示，接種表達IL-2和gp41.36的疫苗IGV.Factor的IL-2水平為6-67ng/ml，而接種僅gp41.36但無IL-2的疫苗的IL-2水平為僅為1-3ng/ml，該結果表明用本發明所生產的疫苗能有效地激活機體APC細胞分泌足夠量的淋巴因子，它有利于進一步激活CTL。
例4.CTL活性的測定將4-6周齡雌性C57BL/6小鼠(H-2b)(Jackson Lab，Bar Harbor，Maine)分為4組，每組10只，向小鼠皮下注射1×106穩定轉染HIV-1 gp41.36基因的黑色素瘤細胞(B16)，接種腫瘤后第1和7天時向小鼠接種疫苗產品(IGV.Factor)和對照疫苗IGV.gp41.36，接種劑量為2mg/200μl/次，對照組注射200μl PBS，在第28天時用數字測量儀測量腫瘤體積。在第120天時用CO2安樂死法殺死小鼠，取出脾臟，以51Cr標記的B16.gp41.36細胞為靶細胞，以取出的脾臟細胞為功能性T細胞，按照40∶1的E∶T比例測定CTL活性，百分裂解率(lysis％)實驗CPM減去自發CPM的百分比。圖4結果表明，疫苗產品(IGV.Factor)的CTL活性為85％，而對照疫苗IGV.gp41.36和IGV.IL-2的活性分別為34％和16％，而PBS組僅為4％。
例5.疫苗誘導的保護性免疫反應如前所述向小鼠接種腫瘤和疫苗，當腫瘤長到約50-70mm3時開始測量，追蹤測量至120天，腫瘤完全消退后長達21天以上定義為治愈，否則為無效，用疫苗產品(IGV.Factor)接種的小鼠達到92％的治愈率，如表1所示，這是迄今為止艾滋病疫苗臨床前期試驗很少能達到的治愈率。
表1.IGV.Factor疫苗誘導的保護性免疫反應疫苗 治愈率(治愈數/感染數)試驗1 試驗2試驗3 總平均IGV.Factor 9/1010/109/1092％IGV.gp41.36 6/104/10 5/1050％IGV.IL-22/104/10 3/1030％PBS(對照) 0/100/10 0/100％新一代的重組蛋白和DNA疫苗比傳統的疫苗免疫原性弱，因此我們急需具有免疫佐劑作用的疫苗載體，當今以誘導細胞免疫為主的疫苗通常缺乏有效的導入刺激T細胞活性的協同刺激淋巴因子的方法，本發明為最有效地刺激機體的免疫反應提供了一個理想的方法，該理論可延伸到基因治療的所有領域，因為最有效地刺激機體的免疫反應常需要合適的協同因子的配合。
本發明是一個創新性的疫苗平臺技術，它可用于研發多種以誘導細胞免疫為主的治療性和預防性疫苗。
權利要求
1.刺激機體產生免疫反應的疫苗，該疫苗由一個DNA質粒通過啟動子控制表達協同刺激信號的細胞因子和第二個DNA質粒通過啟動子控制表達至少一個病原體的抗原基因組成，這兩個質粒都由一個宿主微生物作為載體來攜帶。
2.1中所說的細胞因子包括如下IL-2、TNF、B7-1、GM-CSF、IL-12、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-14、IL-18、B7-2、CD28、CD40、TNFR、Lymphotoxin-betaR、NF-KappaB、ICAM-1、LFA-3、M-CSFR、M-CSF、Flt3-L、SCF、TPO、CD80、CD58、GM-CSF和B-7。
3.1中所說的病原體抗原是來源于病毒、細菌、真菌、原蟲、寄生蟲和癌細胞。
4.1中所說的機體是脊椎動物，如哺乳動物、人、家畜。
5.1中所說的宿主微生物載體是真核和/或原核細胞。
6.5中所說的真核細胞是真菌，如酵母。
7.5中所說的原核細胞是病毒和細菌。
8.將1中所說的疫苗配以賦形劑或與其它藥物聯合應用。
9.3中所說的病原體抗原是HIV、流感病毒、肝炎病毒、瘧疾、冠狀病毒和腫瘤細胞相關抗原(k-ras、EGFR、HER2、PSMA、CEA、MAGE、MART-1)。
10.應用該疫苗載體轉染APC細胞或腫瘤細胞使其成為細胞疫苗而誘導機體產生免疫反應。
全文摘要
該雜交疫苗載體由基因重組雜交酵母組成。雜交載體產物來源于兩個分別表達不同目的基因的酵母質粒，其中一個質粒表達細胞生長因子，另一個質粒表達疾病抗原基因；由此產生的重組雜交酵母載體本身是一種無致病性的基因治療載體，該載體本身具有免疫增強活力，即免疫佐劑作用；該載體主要用于研發基因工程疫苗，如艾滋病、非典型性肺炎、瘧疾、流感和癌癥等。
文檔編號A61P31/00GK1541713SQ20031011395
公開日2004年11月3日 申請日期2003年11月6日 優先權日2003年11月6日
發明者孫娟, 孫 娟 申請人:孫娟, 孫 娟