一種載體傳遞的佐劑化抗原及其制備方法

專利名稱：一種載體傳遞的佐劑化抗原及其制備方法
技術領域：
本發明屬生物技術免疫制劑領域，涉及疫苗的佐劑載體系統及其制備方法和應用。具體的說，本發明采用載體傳遞佐劑化抗原，在稀釋給藥后，能誘生強的體液和細胞免疫應答，可用于傳染性疾病的預防和治療。
背景技術：
已有的研究表明，持續性病毒感染如慢性乙肝病毒持續性感染的原因是由于機體缺陷的免疫應答能力。如何有效的啟動機體對持續性感染病毒的應答，產生清除病毒所需的體液和細胞免疫應答，尤其是細胞免疫應答，是目前治療性疫苗研制的熱點。
據報道，由重組DNA技術產生的蛋白質疫苗免疫原性較差，常需要添加佐劑才能更有效的誘生免疫應答，目前疫苗所采用的佐劑大多為鋁佐劑，對持續性病毒感染的疫苗治療其效果尚不盡理想，其原因可能是鋁佐劑為Th2型佐劑，不能有效的誘生細胞免疫應答。CpG ODN是目前報道有Th1型佐劑作用的一種含胞嘧啶-磷酸硫代-鳥嘌呤(PS-CpG)基序的寡聚脫氧核苷酸。實驗表明PS-CpG能激活B細胞，單核細胞，NK細胞，誘生大量細胞因子的產生(IL-6，IL-10，IL-12，IL-18，IFN-α，IFN-γ和TNF-α)。在小鼠模型研究中，已表明PS-CpG能增強抗原特異性抗體應答，促進免疫應答向Th1型方向發展，增強CTL活力。PS-CpG作為乙肝疫苗的佐劑于1999年在美國進入I期臨床。臨床結果表明PS-CpG安全并耐受良好，但由于CpG基序的種屬特異性，小鼠有效的PS-CpG序列在人免疫細胞中沒有或表現很低的免疫刺激活力，由于難以用人體評價寡核苷酸的免疫刺激活力，有關CpG刺激人免疫刺激研究大多通過對人外周血單核細胞(PBMC)進行。有研究鑒定出兩種ODN結構特性不同的有免疫刺激作用的CpG，其一為“K”型，為磷酸硫代化骨架，含多重5’-TCGTT-3’和/或5’-TCGTT-3’基序，能激發漿細胞狀樹突細胞(PDC)的成熟和分泌IL-8，刺激B細胞增殖和IgM的分泌，促進巨噬細胞產生IL-6；其二為D型，為磷酸硫代和磷酸二酯混合骨架，含有5’-pur-pyr-CpG-pur-pyr-3’基序，兩側由互補的堿基形成頸環結構，3’端由polyG組成，D型CpG能促進PDC成熟并產生大量的IFN-α，直接或間接激發NK細胞分泌IFN-α，以及促進髓樣樹突細胞(MDC)的成熟。
TLR9在人和小鼠免疫細胞對CpG的激活中起作用的重要細胞表面分子。但Verthelyi D etc，al等采用TLR9轉染的HEK 293細胞研究，發現K ODN的識別是通過TLR9實現的，但轉染的細胞并不對D ODN反應。對乙肝病毒慢性攜帶者的PDC進行分析，發現其啟動免疫應答能力低下，可能是導致T細胞免疫缺陷的主要原因。CpG有提高DC協調刺激分子的表達，上調細胞因子的分泌，改善DC功能，可以用來作為慢性病毒感染的免疫治療。
上述對CpG的研究基本都是采用PS-CpG或PS/PE混合骨架CpG。在早期對小鼠B細胞的刺激實驗中，含5’pur-pur-CpG-pyr-pyr-3’基序的磷酸二酯CpG(PE-CpG)有刺激活力，尤以含5’-GACGTT-3’基序的最佳。后來Yi AK發現在這個基序的5’端增加5’-TpC-3’能提高CpG的刺激活力，而在3’端增加一個多聚嘧啶尾巴會進一步增強寡核苷酸的刺激作用。根據這個原理，Gunther Hartmann設計了一系列的PE-CpG和PS-CpG用于人PBMC體外刺激實驗，結果發現PE-CpG和PS-CpG的最大免疫刺激活力是相似的，含有8個寡核苷酸基序5’-TCGTCGTT-3’的PE-CpG(2080)能強烈上調人B細胞CD86，再增加一個5’-GTCGTT-3’基序不能進一步增強其活力，有些CpG磷酸硫代修飾后，其免疫刺激活力完全喪失，需添加額外的CpG基序才能重新獲得刺激活力。有些CpGDNA磷酸硫代修飾后與相應蛋白的結合能力降低。ODN磷酸硫代后，由于空間位阻的加大，堿基配對能力下降，也會影響CpG的三維結構。有實驗表明將CpGODN于抗原通過共價交聯或生物素-親和素蛋白方式連接免疫，結果比游離形式分別免疫要好。但是無論共價交聯或通過生物素-親和素蛋白方式連接，都存在改變抗原和/或CpG ODN三維結構的問題。
脂質體作為疫苗載體已有廣泛研究，如脂質性瘧疾疫苗，霍亂疫苗，HIV疫苗。磷脂脂質體中的主要原料為卵磷脂，原料不均一，含較多的不飽和健，易發生過氧化反應，形成有毒的過氧化物而導致脂質體結構破裂，雖可以通過加氫法來改善，但費用很昂貴。

發明內容
本發明的目的是提供一種用于預防性和治療性疫苗的佐劑載體系統及其制備方法。本發明的進一步目的是提供所述佐劑載體系統的應用。
本發明將抗原佐劑化后，用載體包裹佐劑化抗原制備成佐劑化抗原載體系統，載體傳遞的佐劑化抗原在稀釋給藥后，能誘生強的體液和細胞免疫應答，能用于傳染性疾病的預防和治療。
所述佐劑化抗原，其特征在于所說抗原與所說的佐劑混合。
所述載體傳遞的佐劑化抗原，其特征在于佐劑化抗原被包裹在所說的載體中。
本發明采用脂質體和高分子復合物制備的顆粒化載體為載體，用以傳遞較易受降解佐劑和抗原的降解及在輔助免疫應答產生中起作用。所述脂質體優選非磷脂脂質體，它是由膽固醇和具有R1-O-(CH2-CH2-O-)M-親水親脂兩性結構的聚氧乙烯脂肪醚類表面活性劑。具有穩定性好，包裹率高，使抗原在體內緩慢釋放，延長對機體免疫刺激的時間，可被巨噬細胞、肝細胞、腸微生物及大多數環境微生物的氧化代謝所分解的優點。更為突出的是脂質體作為免疫調節劑和抗原的共傳遞載體時，還可增強這種免疫反應CpG介導的免疫刺激作用的內化和內吞體中的酸化過程，保持天然骨架的PE-CpG能更好地模擬細菌DNA，為TLR9所識別。
所述抗原，可為重組DNA技術來源的多肽、蛋白質、福爾馬林滅活的微生物疫苗和編碼基因的DNA載體。其中蛋白質抗原優選乙型肝炎表面抗原。
所述佐劑采用可有效刺激哺乳動物免疫系統的寡核苷酸，其中寡核苷酸的免疫刺激元件具有5’pur/pyr/CG/pur/pyr3’、5’pur/pur/CG/pyr/pyr3’結構，寡核苷酸的骨架為磷酸硫代骨架、磷酸二酯鍵骨架和混合骨架。
本發明載體傳遞的佐劑化抗原，通過載體將佐劑和抗原同時傳遞，實驗證實能誘生很強的體液和細胞免疫應答，可用于預防性和治療性疫苗，尤其針對持續性病毒感染的治療性疫苗。其給藥方式為與水溶性溶液混勻稀釋后給藥，可減低副作用，，加快局部吸收，有效誘導免疫應答。
具體實施例方式
本發明的實施例與效果可由以下實例說明，但必須指出，以下僅為實例，并不意味限制本發明的范圍。
實施例1 脂質體傳遞破傷風類毒素(TT)與PE-CpG誘生的抗體應答用非磷脂脂質體(Np)包裹TT與PE-CpG免疫Balb/c小鼠，于0，3，6周免疫三次，最后一次免疫后一周采血，用間接ELISA法測定抗體滴度，以無佐劑、鋁佐劑和CFA的TT組比較，結果誘生的抗體滴度為無佐劑和鋁佐劑組的20倍左右，為CFA組的3倍。抗體亞類分析結果表示脂質體傳遞的TT和PE-CpG誘生了很高的IgG2a與IgG1，誘生的是Th1/Th2型均衡的免疫應答。
表1不同佐劑TT組誘生的特異性抗體及亞類滴度GroupIgG2a IgG1 IgG2a/IgG1總IgGNone ＜100 16117 045600Al 672 61466 0.1 42380CFA 30300 1675650.2 203761Np(TT+PE-CpG)2826062744421.0 757133實施例2 脂質體傳遞乙腦滅活疫苗(inactivate JEV)與PE-CpG誘生的抗體應答用非磷脂脂質體(Lp)包裹乙腦滅活疫苗與PE-CpG免疫Balb/c小鼠，以無佐劑和CFA組為對照，于0，3，周免疫2次，第9周采集血清，血清以50倍稀釋，以乙腦活病毒包板，用間接ELISA法檢測anti-JEV抗體，結果以OD490nm表示。Lp包裹PE-CpG和乙腦滅活疫苗后免疫，可提高乙腦滅活疫苗誘生的特異性抗體滴度。
表2第九周免疫小鼠抗乙腦病毒特異性抗體(OD490nm)疫苗 佐劑總IgG乙腦滅活疫苗 無 0.174±0.042乙腦滅活疫苗 CFA 0.617±0.012ab乙腦滅活疫苗 LpCpG 0.906±0.011ab正常小鼠 0.082±0.044注a表示與乙腦滅活疫苗相比有顯著差異(P＜0.05)；實施例3 脂質體傳遞乙腦滅活疫苗(inactivate JEV)與PE-CpG誘生的細胞免疫效果用非磷脂脂質體(Lp)包裹乙腦滅活疫苗與PE-CpG免疫Balb/c小鼠，以無佐劑和CFA組為對照，于0，3，周免疫2次，于第5周取免疫小鼠脾淋巴細胞體外用病毒刺激培養后收集母細胞，以乙腦病毒感染12小時的Balb/c乳鼠原代腎細胞為靶細胞，以效靶比為20∶1采用MTT法進行CTL的檢測。結果表明，乙腦滅活疫苗只誘生很低的CTL活力，用Lp傳遞的PE-CpG與乙腦滅活疫苗誘生的CTL活力有顯著的提高，與乙腦減毒活疫苗誘生的CTL活力相當。
表3不同乙腦疫苗組免疫小鼠第五周的anti-JEV CTL活力疫苗 佐劑特異性殺傷(E∶T＝20)乙腦滅活疫苗 無 6.5％乙腦滅活疫苗 CFA 31.9％乙腦滅活疫苗 LpCpG 42.6％乙腦減毒活疫苗無 44.3％正常小鼠 5.1％實施例4 脂質體傳遞乙肝表面抗原與PE-CpG誘生的抗體應答脂質體包裹乙肝表面抗原與PE-CpG后免疫Balb/c小鼠，雄性，每組15只，隨機分組，以無佐劑、鋁佐劑、PE-CpG和單純脂質體Lp組為對照，于0，3周免疫兩次，第五周采血用間接ELISA法檢測抗體滴度。結果表明，LpCpG組誘生了很高的抗體滴度，為鋁佐劑的8倍左右，PE-CpG組和Lp組誘生的抗體滴度與無佐劑組相似。亞類分析結果顯示LpCpG不僅誘生很高的Th1型IgG2a，還誘生較高滴度的IgG1，屬混合型應答。
表4不同佐劑的乙肝疫苗組第5周誘生的特異性抗體及亞類滴度佐劑 IgG2a IgG1 總IgG無 ＜100 1182 1100鋁佐劑 ＜100 590.8 1256CpG107.5 104 700Lp 2421957 1314LpCpG 3854.8 914.3 7984實施例5 脂質體傳遞乙肝表面抗原和PE-CpG免疫的Balb/c小鼠脾淋巴細胞分泌細胞因子水平脂質體傳遞乙肝表面抗原和PE-CpG免疫Balb/c小鼠，以未免疫的正常小鼠和鋁佐劑組小鼠為對照，第8周檢測小鼠脾淋巴細胞在特異性抗原的刺激下IFN-γ分泌水平。結果表明，LpCpG組的小鼠脾淋巴細胞在HBsAg的刺激下分泌了很高水平的IFN-γ。
表5不同佐劑乙肝疫苗組免疫小鼠脾淋巴細胞在不同刺激原刺激后的上清IFN-γ含量(pg/ml)組別 刺激原None ConA HBs(1.25ug)normal189.31±15.081229.25±8.16a 243.34±91.26Al177.62±23.551474.12±88.36a188.47±22.31LpCpG 274.20±120831182.94±15.34a847.44±67.87a實施例6 脂質體傳遞乙肝表面抗原和PE-CpG免疫的Balb/c小鼠誘生的CTL活力脂質體傳遞乙肝表面抗原和PE-CpG免疫Balb/c小鼠，以未免疫的正常小鼠和鋁佐劑組小鼠為對照，于0，3，12周免疫三次，最后加強后兩周(14周)取小鼠的脾淋巴細胞在體外用絲裂霉素失活HBsAg Ld限制性的表位肽S29-38脈沖過的P815細胞為刺激細胞刺激培養5天，收集淋巴母細胞，以HBsAg Ld限制性的表位肽S29-38脈沖過的P815細胞為靶細胞，用MTT法進行CTL活力分析。
表6可以看出LpCpG組誘生了較高的CTL活力。
表6不同佐劑乙肝疫苗組免疫小鼠抗原特異性CTL活力(specific lysis％)效靶比(effector∶target)佐劑 100∶1 50∶1 20∶1Normal5.0±6.0 1±1.42.8±3.0Al0±0 1.0±1.0 0±0LpCpG 45.7±11.2a21.1±7.7a4.9±8.0注a表示與正常小鼠組相比有統計意義(P＜0.05)b表中小鼠個數normal5；Al3；LpCpG5c表內數據為特異性殺傷％＝殺傷P815-S％-殺傷P815％實施例7 脂質體傳遞乙肝表面抗原和PE-CpG以稀釋給藥后免疫Balb/c小鼠的抗體應答脂質體傳遞乙肝表面抗原和PE-CpG，免疫時與生理鹽水按一定比例(1∶4)稀釋，，以正常未免疫小鼠和鋁佐劑組小鼠為對照，第0，3周免疫，第5周采血檢測血清抗體滴度，結果表明，稀釋免疫的LpCpG誘生的抗體滴度是LpCpG 5倍，抗體亞類分析結果表明，稀釋給藥后，誘生的免疫應答更傾向Th1/Th2型均衡應答。
表7不同佐劑乙肝疫苗免疫的小鼠的特異性抗體及亞類滴度佐劑 稀釋比例 IgG2a IgG1 總IgG無 - ＜100 1182 2176鋁佐劑 - 259.7 2535 3716LpCpG- 1582 3829 4479LpCpG1∶4 19776 14304 20008實施例8 脂質體傳遞乙肝表面抗原和PE-CpG以稀釋給藥后誘生的CTL活力脂質體傳遞乙肝表面抗原和PE-CpG，免疫時與生理鹽水按一定比例(1∶4)稀釋，，以正常未免疫小鼠和鋁佐劑組小鼠為對照，第0，3周免疫，第7周檢測CTL活力，結果顯示LpCpG稀釋給藥后，依然誘生了CTL，活力較未稀釋的LpCpG組的還高。
表8不同佐劑乙肝疫苗組免疫小鼠的CTL活力佐劑CTL(1∶50)無 0鋁佐劑 0LpCpG 21.7％LpCpG(1∶2) 65.60％實施例9 脂質體傳遞乙肝表面抗原和PE-CpG以稀釋給藥后硬結消失時間LpCpG肌肉免疫小鼠后，于注射部位有明顯硬結的產生，需要3個月才完全消失，稀釋2倍以上，注射后24小時即觀察不到硬結。
表9不同比例稀釋給藥的LpCpG免疫后產生硬結消失情況佐劑 稀釋度 硬結消失時間LpCpG - 3個月LpCpG 1∶11個月LpCpG 1∶23周LpCpG 1∶324小時LpCpG 1∶4無硬結
權利要求
1.一種載體傳遞的佐劑化抗原，其特征在于含有載體和佐劑化抗原，其中載體包裹佐劑化抗原。
2.按權利要求1所述的載體傳遞的佐劑化抗原，其特征在于所說的佐劑化抗原其中抗原為重組DNA技術來源的多肽或蛋白質、福爾馬林滅活的微生物疫苗和編碼基因的DNA載體。
3.按權利要求1所述的載體傳遞的佐劑化抗原，其特征在于所說的佐劑化抗原其中蛋白質為乙型肝炎表面抗原。
4.按權利要求1所述的載體傳遞的佐劑化抗原，其特征在于所說的佐劑為可有效刺激哺乳動物免疫系統的寡核苷酸。
5.按權利要求4所述的抗原，其特征在于所述寡核苷酸的免疫刺激元件具有5’NNCGNN3’結構，N可為任何嘌呤或嘧啶，所述寡核苷酸的骨架為磷酸二酯鍵骨架。
6.按權利要求1-5所述的載體傳遞的佐劑化抗原，其特征是所述佐劑化抗原是所說的抗原與所說的佐劑混合。
7.按權利要求1所述的載體傳遞的佐劑化抗原，其特征在于所說的載體為脂質體。
8.按權利要求1所述的載體傳遞的佐劑化抗原，其特征在于所說的載體為非磷脂脂質體。
9.上述任一權利要求的載體傳遞的佐劑化抗原，在制備預防性和治療性疫苗中的用途。
10.權利要求9所述的用途，其特征是所述抗原與水溶性溶液混勻稀釋后在制備預防性和治療性疫苗中的用途。
全文摘要
本發明屬生物技術免疫制劑領域，涉及疫苗的佐劑載體系統及其制備方法和應用。本發明將抗原佐劑化后，用脂質體載體包裹佐劑化抗原制備成佐劑化抗原載體系統，通過載體將佐劑和抗原同時傳遞，實驗證實，在稀釋給藥后，能誘生很強的體液和細胞免疫應答，能提高疫苗的吸收，降低毒副作用，可用于預防性和治療性疫苗，尤其針對持續性病毒感染的治療性疫苗。
文檔編號A61K39/39GK1554446SQ20031012286
公開日2004年12月15日 申請日期2003年12月26日 優先權日2003年12月26日
發明者何春艷, 劉慶良 申請人:上海生物制品研究所