水溶性陰離子型細菌葉綠素衍生物及其用途的制作方法

專利名稱：水溶性陰離子型細菌葉綠素衍生物及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的水溶性陰離子型細菌葉綠素衍生物，其制備方法，及其在體內光動力治療以及診斷腫瘤和不同血管疾病如年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration)、以及體內和體外殺死病毒和微生物的方法中的用途。
定義和縮寫AMD年齡相關性黃斑變性；Bchl細菌葉綠素a，即五環7，8，17，18-四氫卟啉，其具有第五同素環(5thisoayclic ring)，中心Mg原子，在173位的葉綠基或者香葉基香葉基，在132位的COOCH3基團，在132位的H原子，在2、7、12、18位的甲基，在3位的乙酰基，和在8位的乙基；Bphe細菌脫鎂葉綠素a(其中中心Mg被兩個H原子替代的Bchl)；Bpheid細菌脫鎂葉綠甲酯酸a(衍生自BPhe的C-172-游離羧酸)；Pd-BpheidPd-細菌脫鎂葉綠甲酯酸a；PDT光動力治療；玫紅細菌卟吩(Rhodobacteriochlorin)四環7，8，17，18-四氫卟啉，其在17位具有-CH2CH2COOH基團，在13位具有-COOH，在2、7、12、8位具有甲基，在3和8位具有乙基。
在說明書全文中使用了細菌葉綠素衍生物的IUPAC編號規則。使用這一命名法，天然細菌葉綠素在132和172位帶有兩個羧酸酯，然而他們在133和173位被酯化。
背景技術：
光動力治療(PDT)是腫瘤的非手術治療方法，其中將無毒藥物與無危險的光敏照射組合使用，原位產生細胞毒活性氧物質。這一技術比通常所用的腫瘤化療和放療技術的選擇性更高。迄今為止，在臨床中已經使用卟啉作為主要的光敏劑。然而當前敏化劑的幾個缺點限制了他們的應用，所述缺點主要包括(1)在可見光譜區內相對弱的吸收使治療局限于較淺的腫瘤；(2)敏化劑在患者皮膚的蓄積和長期滯留，導致長期(數天到數月)的皮膚光毒性；和(3)PDT對被照射腫瘤和非腫瘤組織的作用的差別很小或沒有差別。當前藥物的缺點引發了對尋找長波長吸收第二代敏化劑的廣泛研究，第二代敏化劑在腫瘤細胞的滯留和其在皮膚或其它正常組織的滯留之間具有更好的差異。
為了實現卟啉藥物在治療學和診斷學中性能的最優化，已經提出了幾種卟啉衍生物，例如其中具有與四吡咯環絡合的中心金屬原子(不同于Mg)，和/或吡咯環的周圍取代基經過修飾和/或大環被二氫化成為葉綠素衍生物(二氫卟酚)或被四氫化成為細菌葉綠素衍生物(菌綠素)。
由于它們在有利光譜區(650-850nm)的強吸收及其在處理后的易于降解，已經確定葉綠素和細菌葉綠素衍生物是腫瘤PDT的優異敏化劑，并具有與卟啉相媲美的出眾性質，但是他們不易獲得并且較難處理。
細菌葉綠素與葉綠素相比具有潛在的優點，因為他們比葉綠素衍生物表現強的近紅外波段，即處在相當長的波長處的波段。
天然的細菌葉綠素(Bchl)的光譜學、光物理學、和光化學使得他們成為最佳的光捕獲分子，與PDT目前所用的其它敏化劑相比明顯的有優點。特別是，這些分子在長波長處具有非常高的消光系數(λmax＝760-780nm，ε＝(4-10)×104M-1cm-1)，這些波長的光透過深入到組織內。他們在高量子場(依靠中心金屬)產生活性氧物質(ROS)。
在正常的遞送條件下，即，在室溫和正常的光條件和氧的存在下，BChl部分與例如血卟啉衍生物(HPD)相比是不穩定的并多少具較低的三線態形成所需的量子場。然而，由于他們可能引發生物氧化還原反應、光譜特性有利及其在體內易降解，使得細菌葉綠素具有優于例如卟啉和葉綠素化合物的潛在的優越性，用于PDT治療和診斷，殺死樣品和活組織內的細胞、病毒和細菌。預計細菌葉綠素的化學修飾可進一步改善它們的性質，但是這受到了缺乏制備這種改良細菌葉綠素的適當方法的約束。
已經研究了不含金屬的Bchl衍生物的生物攝取和PDT效力，目的是控制敏化劑與腫瘤細胞區室的親合力。這一方法主要是利用高親脂性藥物，其可增加藥物在腫瘤細胞的積聚，但這也使遞送困難。另外，所報道的生物分布顯示了在給藥后在非腫瘤組織內的長期(至少數天)顯著的光毒性藥物水平。
在本申請人在先的以色列專利102645和相應的EP 0584552、US5,726,169、US 5,726,169、US 5,955,585和US 6,147,195中，發明人使用了不同的方法。研究了在給藥后未從循環中外滲并且在血液中具有較短持續時間的高效抗血管敏化劑。人們期望在正常組織和異常組織如腫瘤或其它依靠新生血管的組織之間的固有差異將能夠相對選擇性地破壞異常組織。因此，目的是合成極性更大的Bchl衍生物，從而更好地停留在血管腔室內，在那里他們發揮了主要的光動力作用。為此目的，Bchla(本文示意圖1中的化合物1)的C-17位的香葉基香葉基殘基被各種殘基如氨基酸、肽或蛋白質替代，他們提高了敏化劑的親水性。發現一個具體衍生物，Bchl-Ser(示意圖1，化合物1，其中R是絲氨酰基)是水溶性的并在細胞培養物中具有高的光毒性。在腹膜內注射后，Bchl-Ser以相對短的時間(t1/2分別為～2h和16h)從小鼠血液和組織內以雙指數方式清除。在靜脈內注射后從循環的清除更快一些。在所選治療方案中(在藥物注射后幾分鐘內施用光)，光毒性主要地施加于腫瘤血管系統(Rosenbach-Belkin等人，1996；Zilberstein等人，2001和1997)。然而，令人遺憾的是，像天然Bchl那樣，Bchl-Ser衍生物經歷迅速的光氧化，形成相應的2-desvinyl-2-乙酰基-脫植基葉綠素酯及其它產物。
為增加Bchl衍生物的穩定性，在后一申請人的PCT公開WO 00/33833和US 6,569,846中，中心Mg原子被Pd替代。這一重原子先前顯示出顯著增加Bchl大環的氧化電位，并同時大大提高分子向其三線態的系統間跨越(intersystem-crossing，ISC)速率。金屬置換通過直接將Pd2+離子引入到Bpheid分子中進行，如WO 00/33833所述。基于顏料生物分布和藥代動力學，推測衍生物Pd-Bpheid在循環中停留很短時間，并且實際上不向其它組織外滲，因此是血管靶向PDT的良好候選藥物，其避免了皮膚光毒性。對血管的治療效果通過被治療血管的活體鏡檢法并用依文氏藍(Evans-Blue)染色證明。使用治療方案，用最小的藥物-光照間隔，發現Pd-Bpheid(也稱作Tookad)在小鼠、大鼠及其他動物模型的不同腫瘤的根除中是有效的，衍生物Pd-Bpheid目前進入了患有前列腺癌患者的I/1I期臨床試驗階段，所述患有前列腺癌的患者經過放療后治療失敗(Chen等人，2002；Schreiber等人，2002；Koudinova等人，2003)。
由于Pd-Bpheid在水溶液中的低溶解性，Pd-Bpheid臨床應用要求使用增溶劑如Cremophor，高劑量使用Cremophor時可引起副作用。非常希望使Pd-Bpheid具有水溶性并同時保持其理化性質。或者，希望制備具有細胞光毒性并同時具有水溶性較Pd-bpheid自身水溶性更高的Bchl衍生物。預計這種水溶性進一步提高藥物在循環中的滯留，從而提高上述選擇性。另外，無需使用載體如洗滌劑或lyposomes，可防止副作用。
發明概述本發明涉及含有至少一個、優選兩個或三個帶負電荷的基團和/或在生理pH條件下轉化為帶負電荷的基團的酸性基團的細菌葉綠素衍生物，不包括在17位具有游離CH2CH2COOH或CH2CH2COO-基團的五環細菌葉綠素衍生物和無中心金屬原子，在17位具有-CH2CH2COOH基團，在15位具有-CH2COOH或-COOH基團，在13位具有-COOH基團，在2、7、12、18位具有甲基，和在3和8位具有乙基的四環細菌葉綠素衍生物。
本發明的帶負電荷的基團包括但是不限于羧酸根(COO-)，硫代羧酸根(COS-)，磺酸根(SO3-)，和磷酸根(PO32-)，在生理pH條件下生成所述帶電荷基團的酸性基團是羧酸(COOH)，硫代羧酸(COSH)，磺酸(SO3H)和膦酸(PO3H2)基團。
在一個實施方案中，細菌葉綠素衍生物具有下式I或II的結構
其中M表示2H或選自二價Pd、Pt、Co、Sn、Ni、Cu、Zn和Mn，三價Fe、Mn和Cr的金屬原子，R1、R2和R4各自獨立地是Y-R5；Y是O、S或NR5R6；R3選自-CH＝CH2、-C(＝O)-CH3、-C(＝O)-H、-CH＝NR7、-C(CH3)＝NR7、-CH2-OR7、-CH2-SR7、-CH2-NR7R′7、-CH(CH3)-OR7、-CH(CH3)-SR7、-CH(CH3)-NR7R′7、-CH(CH3)Hal、-CH2-Hal、-CH2-R7、-CH＝CR7R′7、-C(CH3)＝CR7R′7、-CH＝CR7Hal、-C(CH3)＝CR7Hal和-C≡CR7；R5，R6，R7和R′7各自獨立地是H或選自(a)C1-C25烴基，其任選含有一個或多個雜原子，碳環或雜環部分，和/或任選被一個或多個選自鹵素、氧代、OH、SH、CHO、NH2、CONH2、帶負電荷的基團、和在生理pH條件下變成帶負電荷的基團的酸性基團的官能團取代；(b)氨基酸、肽或蛋白質的殘基；和(c)當Y是O或S時，R5可進一步是R8+；m是0或1；和R8+是H+或陽離子；條件是(1)R5，R6，R7和R′7中的至少一個、優選兩個是被帶負電荷的基團或被在生理pH條件下變成帶負電荷的基團的酸性基團取代的上述(a)中的烴鏈；或(ii)R1、R2和R4中的至少一個、優選兩個是OH、SH、O-R8+或S-R8+；(iii)R1、R2和R4中的至少一個是OH、SH、O-R8+或S-R8+并且R5，R6，R7和R′7中的至少一個是被帶負電荷的基團或被在生理pH條件下變成帶負電荷的基團的酸性基團取代的烴鏈；或(iv)R1、R2和R4中的至少一個是OH、SH、O-R8+或S-R8+并且R5，R6，R7和R′7中的至少一個是氨基酸、肽或蛋白質的殘基；或(v)R5，R6，R7和R′7中的至少一個是被帶負電荷的基團或被在生理pH條件下變成帶負電荷的基團的酸性基團取代的烴鏈并且R5，R6，R7和R′7中的至少一個是氨基酸、肽或蛋白質的殘基；但是排除了以下結構的式I化合物其中M如定義所述，R3是-C(＝O)CH3，R1是OH或O-R8+，R2是-OCH3，并且排除了以下結構的式II化合物其中M是2H，R3是C(＝O)CH3，R1、R2和R4是OH，m是0或1。
本發明進一步涉及包括以上定義的細菌葉綠素衍生物的藥物組合物，用于光動力治療(PDT)。特別是用于血管靶向PDT，如腫瘤或年齡相關性黃斑變性(AMD)的PDT，或用于體內或體外殺死包括細菌和病毒的細胞或傳染物，以及用于診斷目的。
本發明提供了使用光敏劑的光動力治療，其中改進之處在于所述光敏劑是本發明的細菌葉綠素衍生物。根據這一方面，本發明涉及通過PDT進行治療的方法，其包括對需要的個體給予有效量的本發明的細菌葉綠素衍生物，然后局部照射。
本發明進一步提供了使用光敏劑診斷腫瘤的方法，其中改進之處在于所述光敏劑是本發明的細菌葉綠素衍生物。根據這一方面，本發明涉及診斷腫瘤的方法，其包括對懷疑患有腫瘤的個體給予有效量的本發明的細菌葉綠素衍生物，然后局部照射并檢查懷疑區域的熒光，其中較強的熒光表明了腫瘤位置。
本發明還進一步提供了使用光敏劑殺死包括細菌和病毒的細胞或傳染物的方法，改進之處在于其中所述光敏劑是本發明的細菌葉綠素衍生物。按照這一方面，本發明涉及生物制品例如血液滅菌的方法，其包括向所述生物制品如血液中加入有效量的本發明的細菌葉綠素衍生物，然后照射。
附圖詳述本發明的不同化合物在以下


中用粗體和加下劃線的數字代表，它們的完全表征見于下文化學部分開頭的化合物列表。
圖1A-1B表示磺化化合物8對H5V小鼠內皮細胞(圖1A)和M2R小鼠黑色素瘤細胞(圖1B)的光毒性曲線圖。細胞在8濃度增加的條件下培養4小時，洗滌并照射(空心形狀)或保持在黑暗中(黑暗對照，實心形狀)，各點是三個值的平均數±STD。
圖2A-2B表示磺化化合物4對H5V小鼠內皮細胞(圖2A)和M2R小鼠黑色素瘤細胞(圖2B)的光毒性曲線。細胞在化合物4濃度增加的條件下培養4小時，洗滌并被照射(空心形狀)或保持在黑暗中(黑暗對照，實心形狀)。各點是三個值的平均數±STD。
圖3是磺化化合物5對M2R小鼠黑色素瘤細胞的光毒性曲線。細胞在化合物5濃度增加的條件下培養4小時，洗滌和照射(圈)或保持在黑暗中(黑暗對照，菱形)。各點是三個值的平均數。
圖4是磺化化合物11對M2R小鼠黑色素瘤細胞的光毒性曲線。細胞在化合物11濃度增加的條件下培養4小時，洗滌和被照射(圈)或保持在黑暗中(黑暗對照，菱形)。各點是三個值的平均數。
圖5是化合物4在CD1裸鼠血液中的藥代動力學曲線。注射化合物4(6mg/kg)后，在標示時間從相同小鼠收集血樣并測量Pd。每一時間點表示三只小鼠的平均數±STD。
圖6表示化合物4在CD1裸鼠中的生物分布。在注射化合物4(6mg/kg)后在不同時間處死小鼠，測量標示器官的Pd含量。每一時間點表示三只小鼠的平均數±STD。
圖7表示使用化合物4的黑色素瘤異種移植的PDT。M2R黑色素瘤異種移植的小鼠被靜脈內注射化合物4(6mg/kg)并用光強為30J/cm2(n＝14，實心正方形)、39J/cm2(n＝8，實心菱形)、或45J/cm2(n＝10，實心三角形)照射5分鐘。注射了9mg/kg的化合物4的小鼠用光強為30J/cm2(n＝10，實心圈)照射5分鐘。對照組未經治療(n＝4，空心正方形)，接受6mg/kg的化合物4的黑暗對照(n＝4，空心圈)或接受9mg/kg化合物4的黑暗對照(n＝5，空心三角形)，和光對照(n＝6，空心菱形，45J/cm2)。
圖8a-8h是表示在異種移植大鼠C6膠質瘤并用化合物4治療的小鼠中PDT的選擇性效果的照片。(a-d)用PDT治療的動物；(e-h)未經治療的動物。(a)治療前；(b)PDT和注射伊文氏藍(EB)后3小時；(c)PDT后24小時經過治療的區域的皮瓣；(d)PDT后24小時經過治療的腫瘤的軸向切片；(e)注射EB之前；(f)注射EB后3小時；(g)注射EB后24小時的皮瓣；(h)注射EB后24小時的未經治療的腫瘤的軸向切片。T-腫瘤；S-皮膚；M-肌肉；E-水腫。
圖9A-9D表示在兔眼模型中使用化合物4(光強為50J/cm2，劑量為5mg/Kg，DLI 1分鐘)進行阻塞PDT2小時，病灶中心的半薄切片和TEM。觀察到了具有保存相對很好的RPB細胞和視網膜的脈絡膜血管的停滯和擴張(9A和9B)。TEM表示在脈絡膜毛細管腔(9D的白色箭頭)和破裂的單核細胞(白色箭頭形)中血細胞的溶血。透明層(Bm)保持完整，容納有容易識別的視網膜色素上皮細胞細胞(RPE)。一些脈絡膜毛細管內皮細胞顯著改變，顯示了凝聚染色質(9C上的白色星形)。縮寫ONL外核層，ROS桿狀外部片段，CC脈絡膜毛細管，e脈絡膜毛細管內皮細胞。
發明詳述本發明在較寬的方面提供了含有至少一個、優選兩個或三個帶負電荷的基團和/或生理pH條件下轉化為帶負電荷基團的酸性基團的細菌葉綠素衍生物，不包括在17位具有游離-CH2CH2COOH或-CH2CH2COO-基團的五環細菌葉綠素衍生物和具有以下結構的四環細菌葉綠素衍生物無中心金屬原子，在17位具有-CH2CH2COOH基團，在15位具有-CH2COOH或-COOH基團，在13位具有-COOH基團，在2、7、12、18位具有甲基，和在3和8位具有乙基。
細菌葉綠素衍生物可衍生自天然或合成的細菌葉綠素衍生物，包括其中無中心Mg原子或中心Mg原子被其它金屬原子替代的化合物，所述其它金屬原子如二價Pd、Pt、Co、Sn、Ni、Cu、Zn和Mn，三價Fe、Mn和Cr。在優選方案中，無金屬原子或金屬原子是Pd、Cu、Zn或Mn。在最優選方案中，中心金屬原子是Pd。
在一個優選方案中，本發明提供了如上文定義的式I或II的細菌葉綠素衍生物。
根據本發明，R5，R6，R7和R′7定義中的“烴基”是指任何直鏈或支鏈、飽和或不飽和、非環狀或環狀、包括芳烴的烴基，其具有1-25個碳原子、優選1-20個碳原子、更優選1-6個碳原子、最優選2-3個碳原子。烴基可以是優選具有1-4個碳原子的烷基如甲基、乙基、丙基、丁基，或鏈烯基，炔基，環烷基，芳基如苯基，或芳烷基如芐基，或在17位具有衍生自天然Chl和Bchl化合物的基團，如香葉基香葉基(2，6-二甲基-2，6-辛二烯基)或植基(2，6，10，14-四甲基-十六-14-烯-16-基)。
R5，R6，R7和/或R′7的烴鏈可任選含有一個或多個雜原子如O、S、和/或NH，以及一個或多個碳環部分如苯基，或雜環部分如吡啶基。在一個實施方案中，烴鏈含有一個或多個O原子和OH端基，由含4-10個碳原子的低聚乙二醇殘基、優選五氧乙二醇(pentaoxyethyleneglycol)代表。
R5，R6，R7和/或R′7也可是被一個或多個以下官能團取代的烴基如Cl、CHO、OH、SH、NH2、CONH2、COOH、COSH、SO3H、PO3H2、或帶負電荷的基團如COO-、COS-、SO3-、或PO32-。在一個優選方案中，官能團COOH、COSH、SO3H、PO3H2、COO-、COS-、SO3-、或PO32-是末端官能團。在最優選方案中，烴基具有2或3個碳原子和選自COO-、或PO32-，或最優選SO3-的端基。
在另一個實施方案中，R5，R6，R7或R′7也可被一個以上的OH和任選的NH2基團取代，并且可以是單糖(monoaccharide)如葡糖胺的殘基。
在另一個實施方案中，R5，R6，R7或R′7也可以是氨基酸、肽或蛋白質的殘基。在一個優選方案中，在任意位上，但優選在173位上的R5是氨基酸、肽或蛋白質的殘基。如果氨基酸、肽或蛋白質含有游離的末端羧基和/或含非末端游離羧酸基團的氨基酸如天冬氨酸或谷氨酸的殘基，則該氨基酸、肽或蛋白質可以是帶負電荷的基團的來源。
在一個實施方案中，R5，R6，R7或R′7是含有羥基的氨基酸或肽(寡肽或多肽)的殘基，所述含有羥基的氨基酸或肽如絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸，或含有它們的肽，或選自以下的所述氨基酸或肽的衍生物酯如烷基酯優選甲酯，其中N-保護基是例如叔丁氧基、芐氧羰基或三苯甲基的N-保護衍生物，并且所述羥基化氨基酸或肽或其衍生物通過其羥基與Bchl衍生物的COO-基團連接。這種氨基酸衍生物的例子是絲氨酸甲酯、N-叔丁基氧羰基絲氨酸、N-三苯甲基絲氨酸甲酯、酪氨酸甲酯、和N-叔丁基氧酪氨酸甲酯，這種肽的例子是N-芐氧羰基-絲氨酰基絲氨酸甲酯，其制備都在上述EP 0584552中描述。
在另一個實施方案中，R5，R6，R7和/或R′7是通過酰胺鍵(Y是NH)與-CO基團連接的氨基酸或肽(寡肽或多肽)。
在另一個實施方案中，R5，R6，R7或R′7是選自肽和蛋白質的細胞特異性或組織特異性配體，其例證為，但不限于，激素肽，例如促黑素細胞激素如α-MSH，和抗體，如免疫球蛋白，和腫瘤特異性抗體。肽或蛋白可能通過酯鍵、硫代酯鍵或酰胺鍵直接與-CO基團連接，或者可通過酯鍵或酰胺鍵與C1-C25烴基的選自OH、COOH和NH2的末端官能團連接。
如以上EP 0584552中所述，通過使Bchl結合不同的氨基酸，和進一步使Bchl氨基酸結合物結合激素、生長因子或其衍生物、或腫瘤特異性抗體、或任何其它細胞特異性配體，獲得了適當的定位的光敏劑。
在一個實施方案中，本發明的帶負電荷的基團COO-、COS-、SO3-、或PO32-分別來自R5，R6，R7和/或R′7的取代烴鏈的官能團COOH、COSH、SO3H、或PO3H2。在另一個實施方案中，COOH、COSH、COO-、和/或COS-基團來自分別為OH、或SH、O-R8+或S-R8+的R1、R2和R4，即，當在131、151(m是0)、152(m是1)、和/或173位存在羧酸或硫代羧酸基團、或羧酸根或硫代羧酸根陰離子時。
陽離子R8+可為來自堿金屬或堿土金屬的單價或二價陽離子如K+、Na+、Li+、NH4+、Ca+，更優選為K+，或者R8+為衍生自胺的陽離子。
在一個優選實施方案中，本發明的細菌葉綠素衍生物為式I，其中M表示二價的Pd；R1為-NH-(CH2)n-SO3-R8+、-NH-(CH2)n-COO-R8+、-NH(CH2)n-PO32-(R8+)2；R2為甲氧基；和R3為-C(＝O)-CH3；R8+為單價陽離子，如K+、Na+、Li+、NH4+；和n為1到10的整數，優選為2或3。
根據這一實施方案，在式I的化合物中，R1優選為基團-NH-(CH2)n-SO3-R8+，其中n為3，R8+為K+。
在另一個優選實施方案中，本發明的細菌葉綠素衍生物為式II，其中M表示2H，二價的Pd、Cu、或Zn，或三價的Mn；R1為-O-R8+、-NH-(CH2)n-SO3-R8+、-NH-(CH2)n-COO-R8+、-NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2；或Y-R5，其中Y為O、S或NH，R5為氨基酸、肽或蛋白質的殘基；R2為C1-C6烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基，更優選為甲氧基；R3為-C(＝O)-CH3、-CH＝N-(CH2)n-SO3-R8+、-CH＝N-(CH2)n-COO-R8+、-CH＝N-(CH2)n-PO32-(R8+)2、-CH2-NH-(CH2)n-SO3-R8+、-NH-(CH2)n-COO-R8+、或-NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2；R4為-NH-(CH2)n-SO3-R8+、-NH-(CH2)n-COO-R8+、-NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2；R8+為單價陽離子，如K+、Na+、Li+、NH4+、更優選為K+；m為1，n為1到10的整數，優選為2或3。
在本發明更優選的實施方案中，細菌葉綠素衍生物為式II并且M為Pd。
在另一個更優選的實施方案中，本發明涉及式II的細菌葉綠素衍生物，其中M為Pd；R1為-O-R8+、-NH-(CH2)n-SO3-R8+、或Y-R5，其中Y為O、S或-NH，R5為蛋白質的殘基，優選為免疫球蛋白的殘基；R2為C1-C6烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基，更優選為甲氧基；R3為-C(＝O)-CH3、-CH＝N-(CH2)nSO3-R8+、或-CH2-NH-(CH2)n-SO3-R8+；R4為-NH-(CH2)n-SO3-R8+、NH-(CH2)n-COO-R8+、NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2；R8+為單價陽離子，如K+，Na+，Li+，NH4+，更優選為K+；和m為1，n為2或3，更優選為2。
在17位具有唯一帶負電荷的基團(SO3-)的本發明的細菌葉綠素衍生物的例子由在下文中的化合物目錄中標識為化合物7的式I的化合物表示。
在13和17位具有兩個帶負電荷的基團的本發明的細菌葉綠素衍生物的例子包括在下文中的化合物目錄中標識為化合物4、5、8、10、11、12、13、14、15的式II的化合物。在最優選的實施方案中，本發明的化合物為化合物4。
在3、13和17位具有三個帶負電荷的基團的本發明的細菌葉綠素衍生物的例子包括在下文中的化合物目錄中標識為化合物9和16的式II的化合物。化合物13在13位具有一個帶負電荷的基團并在173位具有作為蛋白質分子的一部分的-COOH基團，化合物15在13位具有一個二價的帶負電荷的基團并在173位具有-COO-基團。
可以通過例如本文圖解1所述的方法制備本發明的化合物。對于其中R5為氨基酸、肽或蛋白質的殘基的化合物的制備方法，可如圖解1所示用于與氨基磺酸(牛磺酸和高牛磺酸)的反應使用上述提及的EP0584552中所述的方法，特別是催化縮合法。
因此，制備其中R1為-O-R8+、R2為-OCH3、R3為乙酰基、R4為基團-NH-(CH2)n-SO3-R8+、R8+為單價陽離子、m為1、n為1到10的式II的化合物的方法包括(i)使相應的其中R1為OH的式I的M-細菌脫鎂葉綠甲酯酸與式H2N-(CH2)n-SO3H的氨基磺酸在R8+-緩沖液中反應；和(ii)分離所需的式II的化合物。
對于制備化合物4，該方法包括使Pd-細菌脫鎂葉綠甲酯酸a3與式H2N-(CH2)2-SO3H的牛磺酸在K+-緩沖液中反應并分離所需的化合物。
對于制備化合物5，該方法包括使細菌脫鎂葉綠甲酯酸a2與式H2N-(CH2)2-SO3H的牛磺酸在K+-緩沖液中反應并分離所需的化合物。
對于Cu和Zn化合物10、11的制備，該方法包括通過使化合物5分別與醋酸銅或乙酸鋅反應，直接嵌入中心金屬Cu或Zn原子，而對于Mn化合物12的制備，中心金屬Mn原子的嵌入通過首先使化合物5與乙酸鎘反應然后與氯化錳反應的金屬轉移作用進行。
對于其中R1為-O-R8+、R2為-OCH3、R3為乙酰基、R4為基團-NH-(CH2)n-COO-R8+、R8+為單價陽離子、m為1、n為1到10的式II的化合物的制備，該方法包括(i)使相應的其中R1為OH的式I的M-細菌脫鎂葉綠甲酯酸與式H2N-(CH2)n-COOH的氨基羧酸在R8+-緩沖液中反應、和(ii)分離所需的式II的化合物。
因此，對于化合物14的制備，該方法包括使Pd-細菌脫鎂葉綠甲酯酸a3與式H2N-(CH2)2-COOH的β-丙氨酸在K+-緩沖液中反應并分離所需的化合物。
對于其中R1為-O-R8+、R2為-OCH3、R3為乙酰基、R4為基團-NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2、R8+為單價陽離子、m為1、n為1到10的式II的化合物的制備，該方法包括(i)使相應的其中R1為OH的式I的M-細菌脫鎂葉綠甲酯酸與式H2N-(CH2)n-PO3H2的氨基膦酸在R8+-緩沖液中反應、和(ii)分離所需的式II的化合物。
因此，對于化合物15的制備，該方法包括使Pd-細菌脫鎂葉綠甲酯酸a3與式H2N-(CH2)3-PO3H2的3-氨基-1-丙烷膦酸在K+-緩沖液中反應，并分離所需的化合物。
對于在13和17位具有相同的帶負電荷的基團的化合物的制備，可如上所述使相應的M-細菌脫鎂葉綠甲酯酸與過量的試劑如氨基磺酸、氨基羧酸或氨基膦酸反應，并分離所需的式II的13，17-二取代衍生物，或者遵循圖解1中所述和如下所述的不同反應路線。
因此，對于其中R1和R4各自為基團-NH-(CH2)n-SO3-R8+、R2為-OCH3、R3為乙酰基、R8+為單價陽離子、m為1、n為1到10的式II化合物的制備，該方法包括(i)使相應的其中R1為OH的式I的M-細菌脫鎂葉綠甲酯酸與N-羥基-磺基琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)的存在下偶聯；(ii)使得到的M-細菌脫鎂葉綠甲酯酸-173-N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯與過量的式H2N-(CH2)n-SO3H的氨基磺酸在R8+-緩沖液中反應，從而得到在17位具有唯一帶負電荷的基團的式I的化合物；(iii)將這一產物與過量的H2N-(CH2)n-SO3H在R8+-緩沖液中反應；并分離所需的式II的化合物。
對于化合物8的制備，與過量的式H2N-(CH2)3-SO3H高牛磺酸進行反應。
當氨基磺酸被氨基羧酸和氨基膦酸代替時，得到相應的羧酸酯和膦酸酯衍生物。
本發明的化合物，在本文中往往也稱為“顏料”，具有充分高的極性，為水溶性的，可以以水溶液形式注射而不需要加入表面活性劑。在一個實施方案中，對于優選的磺化-Pd-Bchl化合物4，還顯示了其生物分布和藥代動力學，并以此為基礎，推測本發明的這一衍生物和其它衍生物保留在循環中，并且保留很短的時間。因此，它們是用于血管靶向PDT的良好光敏劑。本文所示的對小鼠中的M2R黑素瘤和HT-29人結腸癌異種移植物的治療證明顏料對腫瘤血管系統的選擇性效果。使用磺化-Pd-Bchl4的推薦方案者慮了藥物的短的消除時間。由于它們對腫瘤血管系統的選擇性作用，這些化合物可用于腫瘤以及年齡相關性黃斑變性和其它基于新血管形成的組織異常。
因此，另一個方面，本發明提供包括本發明的細菌葉綠素衍生物和可藥用載體的藥物組合物。
在優選實施方案中，該藥物組合物包括本文中式I或II的細菌葉綠素衍生物，更優選為式II的磺化衍生物，最優選為化合物4。
使用本領域公知的技術，如在Remington的PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Co.，Easton，Penna.，最新版中所概括的，將本發明的陰離子型細菌葉綠素衍生物配制成最終的用于對患者給藥或應用于體外靶的藥物組合物。該組合物可全身給藥，特別是注射給藥，或者可局部給藥。
本發明的陰離子型Bchl化合物具有與各自的非陰離子型Bchl類似的光學吸收特征和光物理學特征，因此，當存在于被處理的組織內時，預計它們為有效的光動力學治療劑。因此，它們可用作光敏劑，作為治療劑和診斷劑，例如對若干類型的癌癥的治療，例如但不限于黑素瘤、前列腺癌、腦癌、結腸癌、卵巢癌、乳腺癌、皮膚癌、肺癌、食管癌、和膀胱癌，和其它激素敏感的腫瘤，以及用于治療年齡相關性黃斑變性，和用于如PDT領域中公知的殺死樣品和活組織中的細胞、病毒、真菌和細菌和用于其它光敏劑應用。
本發明的新型水溶性Bchl衍生物可用于例如使贅生性細胞或其它異常組織敏化，使用適當波長的光通過體內或體外輻射將其破壞。相信光活化能量被轉移到內源性氧，將其轉化為被認為具有細胞毒性作用的單線態氧和/或其它活性氧(ROS)如超氧化物和羥基基團。另外，Bchls的光活化形式發出熒光，該熒光有助于定位給予Bchl衍生物的腫瘤或其它部位。
本領域中已知的可使用本發明的細菌葉綠素衍生物治療的適應癥的例子包括破壞實體瘤中的腫瘤組織、和溶解血管中的斑塊(參見例如美國專利4,512,762)。特別是，由于這些衍生物極少保留在循環中和由于它們只最低限度地被非循環組織如皮膚和肌肉吸收，這些衍生物適合于血管靶向PDT。因此，這些化合物使得在刺激時活性氧(ROS)的生產局限在血管內，從而產生異常血管如存在于腫瘤和年齡相關性黃斑變性中的那些血管的選擇性響應。另外，細菌葉綠素衍生物可用于在局部病癥如粉刺、腳癬、疣、乳頭瘤和牛皮癬的治療中選擇性破壞；用于治療良性前列腺肥大和用于通過破壞傳染物用于生物制品如輸血用血液的滅菌。
可通過PDT中使用的標準程序將本發明的藥物組合物給予患者。可根據PDT中使用其它卟啉積累的經驗建立給予有需要的個體以本發明陰離子型Bchl衍生物的量和給藥途徑，并且將取決于用作活性成分的衍生物的選擇、病癥如待治療腫瘤的種類、疾病的階段、患者年齡和健康狀況、和醫生的判斷而改變，但是其應比現在使用的PhotofrinII的約20-40HPD/kg體重的用量低得多。優選的給藥途徑為將包括常規的可藥用載體和添加劑的活性化合物水溶液靜脈內注射或直接注射到實體瘤中和使用適當的局部組合物的皮膚腫瘤的局部治療。
優選選擇輻照光的波長與細菌葉綠素光敏劑的最大吸光度匹配。任何化合物的適合波長可從其吸收光譜容易地測定。
除了體內應用之外，本發明的陰離子型Bchl衍生物可用于體外處理材料以殺死有害病毒或傳染物如有害細菌。例如，可使用本發明的Bchl處理并照射將來用于輸血的血液和血漿以滅菌。
特異性結合于靶細胞受體的蛋白質如激素、生長因子或其衍生物、抗體、肽對Bchl部分的結合和細胞營養素如酪氨酸對Bchl部分的結合意味著增加在腫瘤和被處理位點的保留。紅移的增加使得能夠進行更深入地滲透，同時保持天然系統的普遍性。由其它金屬代替Mg優化了Bchl部分的固有的穩定性和代謝穩定性及其向受激三線態的系統間過渡，以及開啟了新的診斷方法的可能性。
對新生內皮細胞具有高親合力的腫瘤特異性抗體和肽優先將Bchl部分導向腫瘤或處理位置，同時激素和細胞營養素也可由正常的非轉化對應物吸收。然而，選擇作為激素和細胞營養素的靶的細胞如黑素細胞和新生內皮細胞在正常情況下分散于其它細胞中和當轉化為惡性細胞時群集為實體瘤。結果是，預計惡性組織的血管和/或細胞區室中的光敏劑濃度相對于其在細胞更為分散的正常組織中顯著增加，保證了PDT效果在腫瘤位置中的放大。這使得能夠有效使用比正常組織損壞閾值更低的光劑量，從而減少了對空間界限清晰的輻射的需要。另外，由于具有非常強烈的熒光，定位的Bchl可用于腫瘤位置或其它靶點的熒光標記。
在本發明的一個最優選的實施方案中，由于正常和異常的血管固有的對本文所述的PDT方案的敏感性的不同，使用本發明的光敏劑治療的靶為異常的血管，特別是實體瘤和年齡相關性黃斑變性的血管。
本發明另外涉及光動力學治療方法，其包括對有需要的個體給予有效量的本發明的Bchl衍生物，隨后局部照射。
在一個實施方案中，本發明的PDT方法用于治療癌癥，其包括對患有實體瘤癌癥的患者給予治療有效量的本發明的Bchl衍生物，然后使用670-780nm的強光源照射腫瘤位置。
本發明的Bchl衍生物還可用于正常或惡性動物細胞以及培養物中微生物的光破壞，其能夠選擇性地光破壞培養物中的某些類型的細胞或傳染物；用于通過將卟啉部分結合于特定的多肽如激素或其它受體配體、結合于細胞或組織特異性抗體、或結合于其它配體如外源凝集素而使卟啉部分針對所選細胞；用于在實驗室、診斷和工業應用中的分析目的的熒光標記分子；和用于熒光標記動物細胞或微生物或顆粒，用于實驗室、診斷或工業應用。由于它們優異的吸光系數和較高的熒光收率，它們可以代替幾種現在使用的熒光標記物如異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅蛋白。
對于診斷目的，可單獨使用本發明的Bchl衍生物，或可用本領域中已知的放射性同位素或其它檢測手段標記。例如，可通過標準程序由例如用67Ga、111In、201Tl、99mTc放射性標記Bchl衍生物，并將放射性診斷劑給予患者，優選通過靜脈注射給藥。在數小時后，可以通過標準程序造影癌癥部位。
本發明另外提供本發明的Bchl衍生物用于體內或體外殺死生物制品如血液中的細胞或傳染物如細菌、病毒、寄生蟲和真菌的用途，其包括用本發明的化合物處理被感染的樣品，隨后照射樣品。
下文通過非限制性實施例說明本發明。
實施例為了方便和更好地理解，實施例部分分為兩個小部分(I)化學部分，描述水溶性衍生物和中間體4-16的合成，和(II)生物學部分，描述新型Bchl衍生物的生物活性。
I化學部分在本文的實施例中，根據以下化合物目錄，本發明的衍生物(4-5、7-9、和10-16)和中間體(1-3、和6)由它們各自為粗體并加下劃線的阿拉伯數字表示。相應的分子式出現在說明書結尾、權利要求之前的圖解中。
化合物目錄1.細菌葉綠素a(Bchl a)2.細菌脫鎂葉綠甲酯酸a(Bpheid a)3.Pd-細菌脫鎂葉綠甲酯酸a(Pd-Bpheid a)4.鈀31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩 131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽[實施例1]5. 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩 131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽[實施例2]6.鈀 細菌脫鎂葉綠甲酯酸a 173-(3-磺基-1-氧琥珀酰亞胺)酯鈉鹽[實施例6]7.鈀 細菌脫鎂葉綠甲酯酸a 173-(3-磺基丙基)酰胺鉀鹽[實施例7]8.鈀 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩 131，173-二(3-磺基丙基)酰胺二鉀鹽[實施例8]9.鈀 31-(3-磺基丙基亞胺基)-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺三鉀鹽[實施例9]10.銅(II)31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩 131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽[實施例3]11.鋅 31-氧代-15-甲氧基羰基甲基-玫紅細菌卟吩 131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽[實施例4]12.錳(III)31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩 131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽[實施例5]13.鈀 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-致紅細菌卟吩 131-(2-磺基乙基)酰胺，173-(N-免疫球蛋白G)酰胺鉀鹽][實施例10]
14.鈀 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩 131-(2-羧乙基)酰胺二鉀鹽[實施例11]15.鈀 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩 131-(3-膦丙基)酰胺三鉀鹽[實施例12]16.鈀 31-(3-磺基丙基氨基)-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺三鉀鹽[實施例13]材料和方法(i)Bchl a(1)為從前述(WO 00/33833)的RhodovolumSulfidophilum凍干細胞提取并純化得到。
(ii)鈀細菌脫鎂葉綠甲酯酸(Pd-Bpheid，2)為如前所述(WO00/33833)制備或通過Negma-Lerads，France得自Steba BiotechLtd.。
(iii)3-氨基-1-丙烷磺酸(高牛磺酸)和3-氨基-1-丙烷膦酸購自Aldrich(USA)，2-氨基乙烷磺酸(牛磺酸)和3-氨基丙酸(β-丙氨酸)購自Sigma(USA)，N-羥基-磺基琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)購自Pierce(USA)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)購自Fluka(瑞士)。
(iv)除了作HPLC時使用HPLC級溶劑之外，使用分析級的化學品和溶劑。
(v)TLC硅膠板(Kieselgel-60，Merck，德國)；氯仿-甲醇(4∶1，v/v)。
(vi)在Avance DPX 250儀器(Bruker，法國)上記錄1H核磁共振(NMR)光譜，并以剩余溶劑峰作為內標的四甲基硅烷低場的ppm(δ)表示。
(vii)通過使Pd濃度(使用PdCl2作為標準的火焰光度法)與在特定波長的受檢溶液的光學密度相關測定Pd-衍生物的吸光系數。
(viii)在平臺LCZ光譜儀(Micromass，英國)上記錄電噴霧離子化質譜(ESI-MS)。
(ix)使用ELAN-6000儀器(Perkin Elmer，CT)進行電感耦合等離子質譜(ICP-MS)，用于測定Pd濃度。
(x)使用Genesis-2(Milton Roy，英國)和V-570(JASCO，日本)分光光度計記錄各種絡合物的光學吸收。
(xi)使用裝備有UV-915二極管陣列檢測器的LC-900儀器(JASCO，日本)進行HPLC。
化學實施例實施例1.鈀31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽(化合物4)在含有120ml的DMSO并在氬氣(在溶液中鼓泡)下攪拌的1L圓底燒瓶中溶解935mg的Pd-Bpheid(3)。將牛磺酸(1288mg)溶解于40ml的1M K2HPO4緩沖液中，并(使用HCl)將溶液pH調節為8.2。在攪拌下將該水溶液加入到DMSO溶液中，并繼續向溶液中鼓入氬氣20分鐘。然后在30℃在2毫巴下蒸發反應混合物3.5小時，然后在37℃再蒸發2小時以徹底干燥。將干燥的固體溶解于300ml的MeOH中，并通過脫脂棉過濾有色溶液，以除去過量的緩沖鹽和牛磺酸。
通過TLC(未反應的Pd-Bpheid的Rf為0.8-0.85，反應(氨解)產物的Rf為0.08-0.1)和通過跟蹤在凍干和在MeOH中重溶之后反應混合物的光學吸收譜測定反應的進行。吸收光譜的特征為從756nm(Pd-Bpheid)到747nm(產物4)的Qy躍遷位移和Pd-Bpheid從534nm到519nm(產物4)的Qx位移。蒸發MeOH并通過使用ODS-A 250×20 S10Pμm柱(YMC，日本)的HPLC純化產物4。溶劑A95％的0.005M磷酸鹽緩沖液，pH 8.0的5％的甲醇。溶劑B100％甲醇。將干燥的固體溶解于42ml蒸餾水中并各自以1.5ml小份注入。
洗脫方案在表1中說明。將產物4(見下文圖解1)洗脫并在～9-11分鐘收集。在4-7分鐘收集的主要的雜質(約5-10％)相當于具有所述結構7的副產物。在22-25分鐘(約2-5％)的峰可能相當于主要產物4的異構體(iso-form)和未處理的Pd-Bpheid殘留。
表1.化合物4梯度純化方案

減壓蒸發溶劑(含水的甲醇)。然后，將純化的產物4再溶解在～150ml MeOH中并通過脫脂棉過濾。再次蒸發溶劑并將固體顏料4在黑暗中在Ar下在-20℃貯存。反應收率～90％(以重量計，相對于3)。
通過電噴霧離子質譜確認產物4的結構(ESI-MS，負電模式，圖2)(在875(M--K-H)，859(M--2K-H+Na)，837(M--2K)，805(M2K-H-OMe)，719有峰)，1H-NMR光譜(圖4，在MeOH-d4中)。
表4提供了主要的NMR峰的位移(以ppm為單位)。
光學吸收(UV-VIS)光譜(MeOH)λ747(1.00)，516(0.13)，384(0.41)，330(0.50)；ε747(MEOH)為1.2×105mol-1cm-1。
NMR(MeOH-d4)9.38(5-H，s)，8.78(10-H，s)，8.59(20-H，s)，5.31和4.95(151-CH2，dd)，4.2-4.4(7，8，17，18-H，m)，3.88(153-Me，s)，3.52(21-Me，s)，3.19(121-Me，s)，3.09(32-Me，s)，1.92-2.41、1.60-1.75(171、172-CH2，m)，2.19(81-CH2，m)，1.93(71-Me，d)，1.61(181-Me，d)，1.09(82-Me，t)，3.62，3.05(牛磺酸的CH2)。
辛醇/水的分配比為40∶60。
實施例2. 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽(化合物5)的制備將160mg的牛磺酸溶解于5ml的1M K2HPO4緩沖液中，并調節溶液的pH為8.2。向該溶液中加入溶解于15ml DMSO中的120mg化合物2，反應和隨后的純化與前述實施例中所述的類似。
吸收光譜(MeOH)λ750(1.00)，519(0.30)，354(1.18)nm。
ESI-MS(-)734(M--2K)。
NMR(MeOH-d4)9.31(5-H，s)，8.88(10-H，s)，8.69(20-H，s)，5.45和5.25(151-CH2，dd)，4.35(7，18-H，m)，4.06(8，17-H，m)，4.20和3.61(牛磺酸的2-CH2，m)，3.83(153-Me，s)，3.63(21-Me，s)，3.52(牛磺酸的3-CH2，m)，3.33(121-Me，s)，3.23(32-Me，s)，2.47和2.16(171-CH2，m)，2.32和2.16(81-CH2，m)，2.12和1.65(172-CH2，m)，1.91(71-Me，d)，1.66(181-Me，d)，1.07(82-Me，t)。
辛醇/水的分配比為60∶40。
實施例3.銅(II)31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽(化合物10)的制備將50mg的實施例2化合物5和35mg的醋酸銅(II)溶解于40ml甲醇中，并向溶液中鼓入氬氣10分鐘。然后加入500mg的棕櫚酰抗壞血酸酯，并攪拌溶液30分鐘。吸收光譜的特征為在750nm(5)到768nm(產物10)的Qy躍遷位移和從5的519nm到537nm(產物10)的Qx位移。然后蒸發反應混合物，再溶解于丙酮中并通過脫脂棉過濾除去過量的醋酸鹽。蒸發丙酮并另外通過HPLC在表2中所述洗脫方案的條件下純化產物。
減壓下蒸發溶劑(含水的甲醇)。然后將純化的顏料10再溶解于甲醇中并通過脫脂棉過濾。再次蒸發溶劑并在Ar在黑暗中在-20℃貯存固體顏料10。反應收率90％。
表2.化合物10梯度純化方案

吸收光譜(MeOH)λ768(1.00)，537(0.22)，387(0.71)和342(0.79)nm。
ESI-MS(-)795(M--2K)。
辛醇/水的分配比為40∶60。
實施例4.鋅31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽(化合物11)的制備如前所述(美國專利5,726,169)使用醋酸中的醋酸鋅將Zn嵌入到化合物5中。以與實施例2中化合物5同樣的條件通過HPLC進行最終的純化。
吸收光譜(MeOH)λ762(1.00)，558(0.26)，390(0.62)和355(0.84)nm。
辛醇/水的分配比為50∶50。
實施例5.錳(III)31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽(化合物12)的制備使用對如前所述(WO 97/19081、US 6,333,319)的方法略加改變的方法使用醋酸中的醋酸鋅將錳嵌入到化合物5中。因此，將在10ml的DMF中的50mg的化合物5與220mg乙酸鎘攪拌并在氬保護氣氛下在110℃下加熱約15分鐘(通過在丙酮中的從519到585nm的Qx躍遷吸收譜帶移動監測Cd-絡合物的形成)。然后將反應混合物冷卻并蒸發。將干燥的殘余物再溶解于15ml的丙酮中并與氯化錳(II)攪拌以形成Mn(III)-產物12。通過在丙酮中的從585到600nm的Qx躍遷吸收譜帶移動和從768到828nm的Qx躍遷吸收譜帶移動監測產物的形成。蒸發丙酮并另外通過HPLC在上述實施例2中提及的條件下以以下表3中所述的洗脫方案純化產物12，其中溶劑系統包括A-5％含水甲醇，B-甲醇。
表3.化合物12梯度純化方案

減壓下蒸發溶劑(含水的甲醇)并在-20℃下在黑暗中在Ar下貯存固體顏料111012。
吸收光譜(MeOH)λ828(1.00)，588(0.32)和372(0.80)nm。
辛醇/水的分配比為5∶95。
實施例6.鈀 細菌脫鎂葉綠甲酯酸a 173-(3-磺基-1-氧基-琥珀酰亞胺)酯鈉鹽(化合物6)的制備在室溫下將50mg的Pd-Bpheid(化合物2)，80mg的N-羥基磺基琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)和65mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)在7ml的無水DMSO中混合過夜。然后減壓下排出溶劑。將干燥的殘余物再溶解于氯仿(約50ml)中，濾掉不溶性物質并蒸發。轉化率為約95％(TLC)。產物6隨后不經進一步的色譜純化而使用。ESI-MS(-)890(M-Na)。
NMR(CDCl3)9.19(5-H，s)，8.49(10-H，s)，8.46(20-H，s)，5.82(132-H，s)，4.04-4.38(7，8，17，18-H，m)，3.85(134-Me，s)，3.47(21-Me，s)，3.37(121-Me，s)，3.09(32-Me，s)，1.77(71-Me，d)，1.70(181-Me，d)，1.10(82-Me，t)，4.05(NHS的CH2，s)，3.45(NHS的CH，s)。
實施例7.鈀 細菌脫鎂葉綠甲酯酸a 173-(3-磺基丙基)酰胺鉀鹽(化合物7)的制備將1ml DMSO中的10mg化合物6與1ml的0.1M K-磷酸鹽緩沖液(pH8.0)中的20mg高牛磺酸(3-氨基-1-丙烷磺酸)混合過夜。然后將反應混合物在氯仿/水中分配。無水硫酸鈉干燥有機層并蒸發。將干燥的殘余物再溶解于氯仿-甲醇(19∶1)中并用于硅膠色譜柱純化。使用氯仿-甲醇(4∶1)洗脫得到產物7。收率為約80-90％。
ESI-MS(-)834(M-K)m/z。
NMR(MeOH-d4)9.16(5-H，s)，8.71(10-H，s)，8.60(20-H，s)，6.05(132-H，s)，4.51，4.39，4.11，3.98(7，8，17，18-H，都是m)，3.92(134-Me，s)，3.48(21-Me，s)，3.36(121-Me，s)，3.09(32-Me，s)，2.02-2.42(171和172-CH2，m)，2.15(81-CH2，q)，1.81(71-Me，d)，1.72(181-Me，d)，1.05(82-Me，t)，3.04、2.68和2.32(高牛磺酸的CH2，m)。
實施例8.鈀 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺二鉀鹽(化合物8)的制備將10mg的化合物6或7溶解于3ml的DMSO中，將其與1ml的pH為8.2的0.5M K-磷酸鹽緩沖液中的100mg高牛磺酸混合，并在室溫下保溫過夜。然后如上所述減壓排出溶劑，在HPLC上純化產物8。收率83％。
吸收光譜(MeOH)747(1.00)，516(0.13)，384(0.41)，330(0.50)，ε747＝1.3×105mol-1cm-1。
ESI-MS(-)1011(M--K)，994(M--2K+Na)，972(M--2K)，775(M--2K-CO2Me-高牛磺酸NHCH2CH2CH2SO3)，486([M-2K]/2)NMR(MeOH-d4)9.35(5-H，s)，8.75(10-H，s)，8.60(20-H，s)，5.28和4.98(15-1-CH2，dd)，4.38，4.32，4.22，4.15(7，8，17，18-H，都是m)，3.85(15-3-Me，s)，3.51(21-Me，s)，3.18(121-Me，s)，3.10(32-Me，s，2.12-2.41(171-CH2，m)，2.15-2.34(81-CH2，m)，1.76-2.02(172-CH2，m)，1.89(71-Me，d)，1.61(181-Me，d)，1.07(82-Me，t).3.82，3.70，3.20，3.10，2.78，2.32，1.90(C-高牛磺酸的131和C-173的CH2)。
實施例9.鈀 31-(3-磺基丙基亞胺基)-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺三鉀鹽(化合物9)在合成8的過程中從HPLC得到化合物9作為副產物。
吸收光譜(MeOH)729(1.00)，502(0.10)，380(0.69)，328(0.57)。
ESI-MS(30.4.2000)1171(M-K+H)，1153(M--2K-H+Na)，1131(M-2K)，566([M-K]/2)，364([M-3K]/3)。
NMR(MeOH-d4)8.71(1H)，8.63(1.5H)，8.23(0.5H)(5-，10-和20-H，都是m)，5.30和4.88(151-CH2，dd)，4.43和4.25(7，8，17，18-H，m)，3.85(15-3-Me，s)，3.31(21-Me，s)，3.22(121-Me，s)，3.17(32-Me，m)，1.89-2.44(171和172-CH2，m)，2.25(81-CH2，m)，1.91(71-Me，s)，1.64(181-Me，s)，1.08(82-Me，t)，4.12，3.56，3.22，3.16，2.80和2.68(高牛磺酸的CH2)。
實施例10.鈀 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺，173-(N-免疫球蛋白G)酰胺鉀鹽(化合物13)在室溫下將10mg的化合物4與1毫升無水DMSO中的20mg磺基-NHS和15mg的EDC反應1小時，然后加入PBS(2.5ml)中的兔IgG(0.6mg)，并在室溫下進一步保溫混合物過夜。蒸干混合物，然后再溶解于1ml的PBS中并加載到由PBS平衡的Sephadex G-25柱上。使用4-5ml的PBS洗脫色帶。分別通過753和280mn的光學密度測定得到的共軛物13中的顏料/蛋白質比，其顏料13/蛋白質為0.5/1到1/1。
實施例11.鈀 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131-(2-羧乙基)酰胺二鉀鹽(化合物14)的制備如實施例2中所述進行標題化合物14的制備和純化，使化合物2與代替牛磺酸的3-氨基丙酸(β-丙氨酸)(150mg)反應。收率85％。
實施例12.鈀 31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131-(3-膦酸丙基)酰胺三鉀鹽(化合物15)的制備如實施例2中所述進行標題化合物15的制備和純化，使化合物2與代替牛磺酸的3-氨基丙烷膦酸(180mg)反應。收率68％。
實施例13.鈀 31-(3-磺基丙基氨基)-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺三鉀鹽(化合物16)為了將31-(3-磺基丙基亞胺基)中的亞氨基還原為相應的31-(3-磺基丙基氨基)基團，使化合物9(8mg)在室溫下通過攪拌與5ml甲醇中的氰基硼氫化鈉(15mg)反應過夜。然后用0.05M HCl(5ml)處理反應混合物，用0.01 M KOH中和并蒸發。在實施例2中所述條件下用HPLC純化標題產物16。收率80-90％。
II 生物學部分材料和方法體外研究(i)細胞培養在包含25mM HEPES、pH 7.4、10％胎牛血清(FBS)、谷氨酰胺(2mM)、青霉素(0.06mg/ml)和鏈霉素(0.1mg/ml)的Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM)/F12(以下簡稱為“培養液”)中將M2R小鼠黑素瘤、H5V小鼠內皮細胞和C6大鼠神經膠質瘤細胞培養成為單層。細胞在37℃下在8％CO2的濕潤環境中生長。
(ii)光毒性分析為了測定光動力學效力，在各個實驗所示的時間和條件下在黑暗中在增加顏料濃度下預培養細胞。通過用培養液洗細胞除去未結合的光敏劑，并在室溫下從底部照射板(λ＞650nm，12J/cm2)。光源為裝備有4cm水過濾器的100W鹵素燈(Osram，德國)。將培養物置于培養孵育器中并在照射24小時后通過中性紅生活力分析法測定細胞存活。使用了三種類型的對照(i)光照對照在沒有顏料的情況下照射細胞；(ii)黑暗對照用顏料處理細胞但保持在黑暗中；和(iii)保持在黑暗中的未經處理的細胞。
體內研究(iii)腫瘤植入在小鼠背上皮下植入M2R或C6細胞(2×106)；在2-3周內腫瘤發展到治療尺寸(6-8mm)。
(iv)光敏劑的制備通過在使用之前將干燥的顏料直接溶解于PBS中到所需的注射濃度制備本發明的化合物的儲備液。
(v)生物分布和藥代動力學將本發明的顏料4(6mg/kg體重)通過尾部靜脈注射給CD1裸鼠。在標示時間將小鼠處死并將標示器官或組織的樣品置于預先稱重的小瓶中并稱重，并立即在干冰上冷凍。檢驗時，將各個樣品解凍并在雙蒸水中(1∶10w/v)勻漿。將勻漿的等份試樣(0.5ml)在Eppendorff試管中凍干。然后向各個干燥樣品中加入0.2ml的HNO3(70％，TraceSelect，Fluka)，在90℃培養1小時并在雙蒸水中稀釋到10ml。通過ICP-MS測定鈀濃度。使用取自未經處理的小鼠的相同的樣品測定各個器官/組織的基底值，并相應地減去該數值。
(vi)PDT方案將患有M2R腫瘤的小鼠麻醉并通過尾部靜脈靜脈內(i.v.)注射顏料。立即通過755nm二極管激光器(CeramOptec，Germany)以30J/cm2(100mW/cm2)、39J/cm2(130mW/cm2)或45J/cm2(150mW/cm2)的光劑量經皮照射腫瘤5分鐘。在治療之后，將小鼠放回籠中。在黑暗對照組中，為小鼠i.v.注射光敏劑并將其置于黑暗的籠中24小時。在光照對照組中，在45J/cm2下照射小鼠。
(vii)血管的關閉和滲透性用顏料4(9mg/kg)和光(100mW/cm2，5分鐘)處理患有C6神經膠質瘤異種移植的小鼠。在處理后立即注射(0.5ml，i.p.)伊文思藍(EB，1％的PBS溶液)。在處理后的3和24小時為小鼠照相。在處理后24小時將小鼠處死并制備每只小鼠的皮瓣并照相。然后移取腫瘤，在其上面帶有皮膚，在-20℃冷凍1小時，然后制備軸向切片并為切片照相。對照小鼠與被處理的小鼠同時注射伊文思藍，并對所有小鼠一起進行如上所述的方案。
實施例14.磺化細菌葉綠素衍生物對腫瘤細胞培養物的細胞光毒性如以上(ii)中所述測定化合物4和8在M2R小鼠黑素瘤和H5V小鼠內皮細胞中的光毒性。在增加化合物濃度下預培養細胞4小時，洗滌并照射或保持在黑暗中。
圖1A-1B中所示為雙磺化化合物8分別在H5V和MR2細胞中的結果，圖2A-2B為單磺化化合物4(對照)分別在H5V和MR2細胞中的結果。可以看出，顏料4和8兩者的光毒性為濃度依賴性和光依賴性的，在測試的范圍內沒有任何的黑暗毒性。兩種顏料的LD50相同(～5μM)。并在兩個細胞系中相似。
在M2R小鼠黑素瘤細胞上測定磺化顏料5和11的光毒性。在圖3和4中可以看出，顏料5和11的光毒性為濃度依賴性和光依賴性的，兩種顏料的LD50相同(～5μM)。在測試的范圍內沒有黑暗毒性。
實施例15.化合物4的藥代動力學和生物分布在測試4對實體黑素瘤異種移植的PDT的光毒性之前的第一步為如上述部分(vi)中所述測定顏料的體內藥代動力學和生物分布。在圖5可以看出，在i.v.注射后的第一個10分鐘內約90％的顏料4以單相動力學模型清除，t0.5為1.65分鐘(表4)。4從血液的快速清除可能意味著只有小部分(即使有的話)結合于血漿組分，否則清除會較慢。
表4.4在小鼠血液中的藥代動力學參數

Ke1-消除速率；Vd-分布容積；CL-清除率。
化合物4的生物分布表明，在小鼠的大多數被測器官中，顏料水平在注射后立即很高，并在20-30分鐘內降低到基底水平，它們的清除率與從血液的清除率類似(圖6)。這些結果可能表示在脾、肺和心臟中看見的器官的血管系統中截留的血液中的顏料水平。此外，該結果還暗示了到器官中的顏料擴散可以忽略。顏料4迅速地從小鼠體內清除并在注射后30分鐘內在所有組織中處于基底水平。4從小鼠體內的清除率比Pd-Bpheid(3)快得多，其只能在注射后48小時達到基底水平(未顯示)。
實施例16.用磺化顏料4對CD1裸鼠中的M2R黑素瘤異種移植物的光動力學治療基于上述實施例15的結果，設置化合物4的治療方案為在注射顏料后立即照射5分鐘。在這些實驗(參見上述部分(vii))中，使用與4的最大吸收相匹配的專用醫用激光器(CeramOptec，Germany，755nm)。為了測定最佳的藥物/光照方案，用6mg/kg劑量的藥物處理小鼠并增加光強(圖7)。從Kaplan-Meier存活曲線中可以看出，增加光強使小鼠的治愈率從30J/cm2的43％改善到45J/cm2的60％。當使用30J/cm2的光強將藥物劑量升高到9mg/kg時，小鼠存活率有顯著的增加，達到70％(圖7)。在使用6或9mg/kg處理并保持在黑暗中的動物中沒有看到黑暗毒性。
實施例17.化合物4的光動力學治療的選擇性效果如上述部分(vii)中所述進行該實驗。圖8說明了光動力學治療對植入小鼠的C6異種移植物中血液灌流的效果(a，e)。與同一動物的未照射區域和未經處理的動物相比，在PDT之后立即給予伊文思藍的被處理的動物在照射區域表現出浮腫和增加的由藍色顯示的EB血管滲漏到間質組織(由于白蛋白-伊文思藍滲漏)(b，f)。在二十四小時后，可以看出，在被處理的小鼠中，腫瘤周圍為較深著色的藍色(浮腫，c)，而由于在PDT之后立即發生血管關閉，腫瘤保持白色(沒有EB著色)(d)。腫瘤下的肌肉組織以及腫瘤以上和周圍的皮膚(除了被處理區域內)為藍色，表明沒有發生血管關閉(c，d)。在未經處理的動物中，腫瘤與其它組織一樣被著色為藍色(g，h)。本發明的化合物選擇性地密封腫瘤中的新生血管，表明其可用于如年齡相關性黃斑變性(AMD)中的異常血管系統的選擇性治療。
實施例18.化合物4的PDT治療-AMD動物模型已經針對從脈絡膜長出的新形成血管膜誘導局限性血管阻塞(脈絡膜新血管形成-CNV)研究了光動力學治療(PDT)。在年齡相關性黃斑變性(AMD)中，使用維替泊芬的PDT降低了CNV繼發的失明的危險。認為PDT的作用機制涉及釋放活性氧物質，其破壞內皮細胞和激活下游的內皮凝血級聯反應。這些事件導致在血管腔內形成血栓。
對于脈絡膜血管增生的治療已經開發了能夠精確集中和靶向病態血管并使對健康視網膜和脈絡膜組織的繼發性損傷效果最小化的高選擇性參數(激光功率密度或流量、光敏劑劑量和光照距離(DLI))。然而，使用目前臨床使用的唯一的光敏劑(維替泊芬)，通常需要重復的治療以實現所需的CNV阻塞效果。因此，側副組織損傷的危險增加，并可能成為該治療的顯著副作用。
在這一實驗中，我們評價了本文中命名為WST11或化合物4的水溶性光敏劑的光動力學治療(PDT)效力，并將其特征與維替泊芬的那些特征進行了比較。
化合物4為純的和穩定的細菌葉綠素衍生物，其分離后為黑紫色晶體粉末。其分子量為916，并可溶解于水溶液中。其具有以下特征(a)有4個主要的吸收峰(750、530、385和330nm)。最強的吸光度接近其中組織透光度最高的紅外區(約750nm)；(b)在黑暗中具有非常低的細胞毒性。因此，可通過光劑量和照射時間控制組織損傷；(c)其在給藥之后迅速從體內清除。因此，使暴露于環境光照或太陽光照的潛在的皮膚光敏損傷最小化；(d)由于有效的系統間跨越(ISC)活性氧(ROS)的產生量很高。
將WST11粉末在不含內毒素的無菌水中稀釋為10mg/ml的濃度，并振搖直到完全溶解。該制劑在4℃下避光保持穩定24小時。為了計算注射的量，根據兔的體重進行調節。通過耳靜脈將適當量的溶液以小團(bolus)形式靜脈內注射。
使用兔眼模型比較化合物4和維替泊芬(Visudyne，Novartis，Switzerland)對年齡相關性黃斑變性(AMD)的PDT效力。使用著色的兔(136“Fauve de Bourgogne”兔，10-12周齡，2.5-3kg，Elevagedes Pins，Epeigne-sur-Deme，France)。根據以下參數研究急性和長期PDT對兔眼的效果1)753nm激光流(25和50J/cm2)、化合物4(也稱為WST11)劑量(2.5和5mg/kg)和光照間距(DLI)為1、5、10和15分鐘。2)689nm激光流(10、50、100J/cm2)，維替泊芬劑量(3、6和12mg/m2)，恒定的DLI為5分鐘。遞送這些對脈絡膜及疊加的視網膜具有一系列作用的PDT參數83秒，以誘導阻塞、閾下阻塞和非阻塞的血管事件。檢查了經過治療的兔眼并隨后在PDT后以不同的間隔進行間接眼底檢查、熒光素血管造影(FA)和組織學檢查。使用流量為50J/cm2、5mg/kg藥物劑量和DLI為1分鐘的WST11 PDT在100％的經過處理的眼中誘導了與疊加的RPE和視網膜結構損害有關的完全脈絡膜阻塞(圖9A-9D)。較弱的非阻塞PDT參數(25J/cm2，5mg/kg藥物劑量和DLI為10分鐘)沒有誘導脈絡膜毛細血管阻塞也沒有誘導視網膜損害。使用藥物劑量為12mg/m2、流量為100J/cm2的和DLI為5分鐘的維替泊芬PDT在89％的眼睛中誘導了阻塞事件(通過FA觀察)，并在所有的眼睛中誘導了疊加的視網膜和RPE層的組織學損傷。使用藥物劑量為3mg/m2、流量為10J/cm2和DLI為5分鐘的較弱的非阻塞的維替泊芬PDT參數在FA上沒有誘導任何的脈絡膜毛細血管阻塞。然而，在這些眼睛中，在組織學上觀察到視網膜和脈絡膜組織的有限的結構破壞。與維替泊芬類似，WST11 PDT在直到處理后一周誘導了脈絡膜毛細血管的短暫阻塞。與維替泊芬不同，沒有誘導血管阻塞的WST11 PDT參數也沒有引起RPE或視網膜結構破壞。因此，盡管其具有誘導血管阻塞的能力，但當沒有發生脈絡膜毛細血管阻塞時，WST11 PDT不引起RPE和疊加的視網膜的損害。這些特征的優點表明WST11為用于年齡相關性黃斑變性中CNV的PDT治療的適合候選物。
對于組織學，在雙目顯微鏡下解剖摘出的眼睛。使用4mm的活檢穿孔器(biopsy punch)切除處理區域的全部厚度。將這些組織在戊二醛中固定，在二甲胂酸鹽緩沖液中處理并包在塑料中。使用切片機得到半薄切片并使用蘇木素-曙紅復染。使用相差顯微鏡分析這些切片。對感興趣的特定部位進一步處理用于TEM。使用切片機得到超薄切片并使用乙酸雙氧鈾復染。
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圖解權利要求
1.細菌葉綠素衍生物，其包含至少一個、優選兩個或三個帶負電荷的基團和/或在生理pH條件下轉化為帶負電荷的基團的酸性基團，不包括在17位具有游離的CH2CH2COOH或CH2CH2COO-基團的五環細菌葉綠素衍生物，和沒有中心金屬原子并在17位有-CH2CH2COOH基團、在15位有-CH2COOH或-COOH基團、在13位有-COOH基團、在2、7、12、18位有甲基、和在3和8位有乙基的四環細菌葉綠素衍生物。
2.權利要求1的細菌葉綠素衍生物，其包含兩個帶負電荷的基團。
3.權利要求1的細菌葉綠素衍生物，其包含三個帶負電荷的基團。
4.權利要求1到3中任一項的細菌葉綠素衍生物，其中所述帶負電荷的基團選自COO-、COS-、SO3-、和/或PO32-。
5.權利要求1的細菌葉綠素衍生物，其中所述在生理pH條件下轉化為帶負電荷的基團的酸性基團選自COOH、COSH、SO3H和/或PO3H2。
6.權利要求1到5中任一項的細菌葉綠素衍生物，其衍生自天然或合成的細菌葉綠素衍生物，包括其中中心Mg原子已經被除去或由其它金屬原子代替的化合物。
7.式I或II的權利要求1的細菌葉綠素衍生物 其中M表示2H或選自二價的Pd、Pt、Co、Sn、Ni、Cu、Zn和Mn，和三價的Fe、Mn和Cr的金屬原子；R1、R2、和R4各自獨立地為Y-R5；Y為O、S或NR5R6；R3選自-CH＝CH2、-C(＝O)-CH3、-C(＝O)-H、-CH＝NR7、-C(CH3)＝NR7、-CH2-OR7、-CH2-SR7、-CH2-NR7R′7、-CH(CH3)-OR7、-CH(CH3)-SR7、-CH(CH3)-NR7R′7、-CH(CH3)Hal、-CH2-Hal、-CH2-R7、-CH＝CR7R′7、-C(CH3)＝CR7R′7、-CH＝CR7Hal、-C(CH3)＝CR7Hal、和-C≡CR7；R5、R6、R7和R′7各自獨立地為H或選自(a)C1-C25烴基，其任選包含一個或多個雜原子、碳環或雜環部分，和/或任選被選自鹵素、氧代、OH、SH、CHO、NH2、CONH2、帶負電荷的基團、和在生理pH條件下轉化為帶負電荷的基團的酸性基團的一個或多個官能團取代；(b)氨基酸、肽或蛋白質的殘基；和(c)當Y為O或S時，R5可進一步為R8+；m為0或1；和R8+為H+或陽離子；條件是(i)R5、R6、R7和R′7中的至少一個、優選兩個為由帶負電荷的基團或在生理pH條件下轉化為帶負電荷的基團的酸性基團取代的上述(a)中定義的烴鏈；或(ii)R1、R2和R4中的至少一個，優選兩個為OH、SH、O-R8+或S-R8+；或(iii)R1、R2和R4中的至少一個為OH、SH、O-R8+或S-R8+，和R5、R6、R7和R′7中的至少一個為由帶負電荷的基團或由在生理pH條件下轉化為酸性基團的帶負電荷的基團取代的烴鏈；或(iv)R1、R2和R4中的至少一個為OH、SH、O-R8+或S-R8+，和R5、R6、R7和R′7中的至少一個為氨基酸、肽或蛋白質的殘基；或(v)R5、R6、R7和R′7中的至少一個為由帶負電荷的基團或由在生理pH條件下轉化為帶負電荷的基團的酸性基團取代的烴鏈，和R5、R6、R7和R′7中的至少一個為氨基酸、肽或蛋白質的殘基；但是排除其中M如定義的、R3為-C(＝O)CH3、R1為OH或OR8+、R2為-OCH3的式I的化合物，和其中M為2H、R3為-C(＝O)CH3、R1和R2和R4為OH、m為0或1的式II的化合物。
8.權利要求7的式I或II的細菌葉綠素衍生物，其中所述帶負電荷的基團選自COO-、COS-、SO3-和/或PO32-。
9.權利要求7的式I或II的細菌葉綠素衍生物，其中所述在生理pH條件下轉化為帶負電荷的基團的所述酸性基團選自COOH、COSH、SO3H和/或PO3H2。
10.權利要求7的式I或II的細菌葉綠素衍生物，其中R1為Y-R5；Y為O、S或NH；R5為由選自OH、SH、SO3H、NH2、CONH2、COOH、COSH、PO3H2的官能團取代的烴鏈。
11.權利要求7的式I或II的細菌葉綠素衍生物，其中R5為氨基酸、肽或蛋白質的殘基。
12.權利要求1的式I或II的細菌葉綠素衍生物，其中包含中心Pd金屬原子。
13.權利要求7的式I的細菌葉綠素衍生物，其中M為Pd；R1為-NH-(CH2)n-SO3-R8+、-NH-(CH2)n-COO-R8+、-NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2；R2為甲氧基；R3為-C(＝O)-CH3；R8+為單價陽離子，如K+、Na+、Li+、NH4+；和n為1到10的整數，優選2或3。
14.權利要求7的式II的細菌葉綠素衍生物，其中M表示2H，二價的Pd、Cu、或Zn，或三價的Mn；R1為-O-R8+、-NH-(CH2)n-SO3-R8+、-NH-(CH2)n-COO-R8+、-NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2；或Y-R5，其中Y為O、S或NH，R5為氨基酸、肽或蛋白質的殘基；R2為C1-C6烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基，更優選為甲氧基；R3為-C(＝O)-CH3、-CH＝N-(CH2)n-SO3-R8+、-CH＝N-(CH2)n-COO-R8+、-CH＝N-(CH2)n-PO32-(R8+)2、-CH2-NH-(CH2)n-SO3-R8+、-NH-(CH2)n-COO-R8+或-NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2；R4為-NH-(CH2)n-SO3-R8+、-NH-(CH2)n-COO-R8+、-NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2；R8+為單價陽離子，如K+、Na+、Li+、NH4+、更優選為K+；和m為1，n為1到10的整數，優選為2或3。
15.權利要求7的式II的細菌葉綠素衍生物，其中M為二價的Pd；R1為-O-R8+、-NH-(CH2)n-SO3-R8+、或Y-R5，其中Y為O、S或-NH，R5為氨基酸、肽或蛋白質的殘基；R2為C1-C6烷氧基，優選為甲氧基；R3為-C(＝O)-CH3、-CH＝N-(CH2)n-SO3-R8+、或-CH2-NH-(CH2)n-SO3-R8+；R4為-NH-(CH2)n-SO3-R8+、NH-(CH2)n-COO-R8+、NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2；R8+為單價陽離子，優選為K+；和m為1，n為2或3。
16.權利要求13的式I的細菌葉綠素衍生物，其包括化合物鈀細菌脫鎂葉綠甲酯酸a 173-(3-磺基丙基)酰胺鉀鹽。
17.權利要求15的式II的細菌葉綠素衍生物，其包括化合物鈀31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽；31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽；鈀31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺二鉀鹽；鈀31-(3-磺基丙基亞胺基)-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺三鉀鹽；銅(II)31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽；鋅31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽；錳(III)31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽；鈀31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺，173-(N-免疫球蛋白G)酰胺鉀鹽；鈀31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131-(2-羧基乙基)酰胺二鉀鹽；鈀31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131-(3-膦酸基丙基)酰胺三鉀鹽；和鈀31-(3-磺基丙氨基)-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131，173-二(3-磺基丙基)酰胺三鉀鹽。
18.鈀31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽。
19.藥物組合物，其包括權利要求1到18中任一項的細菌葉綠素衍生物和可藥用載體。
20.用于光動力學治療的權利要求19的藥物組合物。
21.用于血管靶向光動力學治療的權利要求20的藥物組合物。
22.用于腫瘤包括轉移性腫瘤的光動力學治療的權利要求20或21的藥物組合物。
23.用于黑素瘤、結腸癌、乳腺癌、肺癌、或前列腺癌的光動力學治療的權利要求22的藥物組合物。
24.用于年齡相關性黃斑變性的光動力學治療的權利要求20或21的藥物組合物。
25.用于良性前列腺肥大的光動力學治療的權利要求20或21的藥物組合物。
26.用于腫瘤診斷的權利要求19的藥物組合物。
27.用于殺死細胞或包括細菌和病毒的傳染物的權利要求19的藥物組合物。
28.用于在照射生物制品時體外殺死所述制品中的細胞和包括細菌和病毒的傳染物的權利要求27的藥物組合物。
29.權利要求28的藥物組合物，其中所述生物制品為血液。
30.權利要求1到18中任一項的化合物用于生產用于光動力學治療的藥物組合物中的用途。
31.權利要求30的用途，用于腫瘤包括轉移性的腫瘤的光動力學治療。
32.權利要求31的用途，用于黑素瘤、結腸癌、乳腺癌、肺癌、或前列腺癌的光動力學治療。
33.權利要求30的用途，用于年齡相關性黃斑變性的光動力學治療。
34.權利要求1到18中任一項的化合物用于生產用于腫瘤診斷的藥物組合物中的用途。
35.權利要求1到18中任一項的化合物用于生產殺死細胞或包括細菌和病毒的傳染物的藥物組合物中的用途。
36.腫瘤的光動力學治療方法，其包括(a)對有需要的個體給藥權利要求1到18中任一項的化合物；和(b)照射腫瘤部位。
37.年齡相關性黃斑變性的光動力學治療方法，其包括(a)對有需要的個體給藥權利要求1到18中任一項的化合物；和(b)照射黃斑變性部位。
38.腫瘤診斷方法，其包括(a)對懷疑患有腫瘤的受試者給藥權利要求1到18中任一項的化合物；和(b)通過標準程序照射受試者并測量被懷疑區域的熒光，其中較強熒光表示腫瘤部位。
39.在使用光敏劑的光動力學治療方法中，改進之處在于所述光敏劑為權利要求1到18中任一項的細菌葉綠素衍生物。
40.在使用光敏劑的腫瘤診斷方法中，改進之處在于所述光敏劑為權利要求1到18中任一項的細菌葉綠素衍生物。
41.在使用光敏劑的體外殺死細胞或包括細菌和病毒的傳染物的方法中，改進之處在于所述光敏劑為權利要求1到18中任一項的細菌葉綠素衍生物。
42.作為中間體的化合物鈀細菌脫鎂葉綠甲酯酸a 173-(3-磺基-1-氧琥珀酰亞胺)酯鈉鹽。
43.制備其中R1為-O-R8+、R2為-OCH3、R3為乙酰基、R4為基團-NH-(CH2)n-SO3-R8+、R8+為單價陽離子、m為1、n為1到10的權利要求7的式II的化合物的方法，該方法包括(i)使相應的其中R1為OH的式I的M-細菌脫鎂葉綠甲酯酸與式H2N-(CH2)n-SO3H的氨基磺酸在R8+-緩沖液中反應；和(ii)分離所需的式II的化合物。
44.用于制備鈀31-氧代-15-甲氧羰基甲基-玫紅細菌卟吩131-(2-磺基乙基)酰胺二鉀鹽的權利要求43的方法，其包括(i)使Pd-細菌脫鎂葉綠甲酯酸與式H2N-(CH2)2-SO3H的牛磺酸在K+-緩沖液中反應；和(ii)分離標題化合物。
45.制備其中R1為-O-R8+、R2為-OCH3、R3為乙酰基、R4為基團-NH-(CH2)n-COO-R8+、R8+為單價陽離子、m為1、n為1到10的權利要求7的式II的化合物的方法，該方法包括(i)使相應的其中R1為OH的式I的M-細菌脫鎂葉綠甲酯酸與式H2N-(CH2)n-COOH的氨基羧酸在R8+-緩沖液中反應；和(ii)分離所需的式II的化合物。
46.制備其中R1為-O-R8+、R2為-OCH3、R3為乙酰基、R4為基團-NH-(CH2)n-PO32-(R8+)2、R8+為單價陽離子、m為1、n為1到10的權利要求7的式II的化合物的方法，該方法包括(i)使相應的其中R1為OH的式I的M-細菌脫鎂葉綠甲酯酸與式H2N-(CH2)n-PO3H2的氨基膦酸在R8-緩沖液中反應；和(ii)分離所需的式II的化合物。
47.制備其中R1和R4包含同樣的帶負電荷的基團的權利要求7的式II的化合物的方法，該方法包括(i)使相應的M-細菌脫鎂葉綠甲酯酸與過量的氨基磺酸、氨基羧酸或氨基膦酸在R8+-緩沖液中反應；和(ii)分離所需的式II的13，17-二取代衍生物。
48.制備其中R1和R4各自為基團-NH-(CH2)n-SO3-R8+、R2為-OCH3、R3為乙酰基、R8+為單價陽離子、m為1、n為1到10的權利要求7的式II化合物的方法，該方法包括(i)使相應的其中R1為OH的式I的M-細菌脫鎂葉綠甲酯酸與N-羥基-磺基琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)的存在下偶聯；(ii)使得到的M-細菌脫鎂葉綠甲酯酸-173-N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯與過量的式H2N-(CH2)n-SO3H的氨基磺酸在R8+-緩沖液中反應，從而得到在17位具有唯一帶負電荷的基團的式I的化合物；(iii)將步驟(ii)的產物與過量的H2N-(CH2)n-SO3H在R8+-緩沖液中反應；和(iv)分離所需的式II的化合物。
49.制備其中R1和R4各自為基團-NH-(CH2)n-COO-R8+、R2為-OCH3、R3為乙酰基、R8+為單價陽離子、m為1、n為1到10的權利要求7的式II化合物的方法，該方法包括(i)使相應的其中R1為OH的式I的M-細菌脫鎂葉綠甲酯酸與N-羥基-磺基琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)的存在下偶聯；(ii)使得到的M-細菌脫鎂葉綠甲酯酸-173-N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯與過量的式H2N-(CH2)n-COOH的氨基羧酸在R8+-緩沖液中反應，從而得到在17位具有唯一帶負電荷的基團的式I的化合物；(iii)將步驟(ii)的產物與過量的H2N-(CH2)n-COOH在R8+-緩沖液中反應；和(iv)分離所需的式II的化合物。
50.制備其中R1和R4各自為基團-NH-(CH2)n-PO32-R8+、R2為-OCH3、R3為乙酰基、R8+為單價陽離子、m為1、n為1到10的權利要求7的式II的化合物的方法，其包括(i)使相應的其中R1為OH的式I的M-細菌脫鎂葉綠甲酯酸與N-羥基-磺基琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)的存在下偶聯；(ii)將得到的M-細菌脫鎂葉綠甲酯酸-173-N-羥基-磺基琥珀酰亞胺酯與過量的式H2N-(CH2)n-PO3H2的氨基膦酸在R8+-緩沖液中反應，從而得到在17位具有唯一帶負電荷的基團的式I的化合物；(iii)將步驟(ii)的產物與過量的H2N-(CH2)n-PO3H2在R8+-緩沖液中反應；和(iv)分離所需的式II的化合物。
全文摘要
本發明提供了用于光動力治療和診斷的陰離子型水溶性四環和五環的細菌葉綠素衍生物(Bchl)，其包含至少一個，優選兩個或三個帶負電荷的基團和/或在生理pH條件下轉化為帶負電荷的基團的酸性基團，優選具有通過酯或酰胺鍵結合于四環或五環Bchl分子的1文檔編號A61K31/40GK1741801SQ200380108906
公開日2006年3月1日 申請日期2003年11月17日 優先權日2002年11月17日
發明者阿維格多·謝爾茲, 亞歷山大·布蘭迪斯, 奧哈德·梅佐爾, 約拉姆·薩洛曼, 雨果·希爾 申請人:耶達研究及發展有限公司