包含用于治療自身免疫疾病的基因的重組肽載體的制作方法

專利名稱：包含用于治療自身免疫疾病的基因的重組肽載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及包含用于治療自身免疫疾病的基因的重組肽載體。更具體地，本發明涉及一種重組肽載體(圖1)，該載體包含前導肽、接頭DNA和DNA構建體，該構建體是通過將表達控制序列與編碼融合蛋白的治療性基因可操作性地連接而形成的，在所述融合蛋白中CTLA4的胞外域與免疫球蛋白的Fc片段相結合，其中所述前導肽通過所述接頭DNA連接到所述DNA構建體的兩個末端。另外，本發明還涉及所述重組肽載體的制備方法，以及用于治療自身免疫疾病，尤其是系統性紅斑狼瘡的組合物，該組合物包含藥學有效量的所述重組載體和藥學可接受的載體。
背景技術：
系統性紅斑狼瘡(或狼瘡)是一種自身免疫疾病，其可引起非腐蝕性多關節炎、腎小球性腎病、溶血性貧血、血小板減少癥、中性粒細胞減少癥、多肌炎、持續性/陣發性發熱和面部/粘膜與皮膚的皮炎等癥狀。
狼瘡在不同的患者會表現出不同癥狀并且顯示出從輕微到嚴重的各種癥狀，因此，應該根據其癥狀而進行適當的治療。對于皮膚癥狀或關節炎，通常使用抗瘧制劑，并且當需要抗炎癥作用時，有時會使用少量的腎上腺皮質激素。對于腎病或諸如嚴重的血小板減少癥或中風等嚴重癥狀的治療，要使用高劑量的腎上腺皮質激素或免疫抑制劑。最近，除了所述現有的常規療法之外，還嘗試使用利用能夠抑制免疫應答的天然或人工構建的基因的基因療法。
對于所述的基因療法，主要使用病毒載體來將具有治療作用的基因轉到細胞中。然而直到目前為止，雖然已經開發了各種病毒載體，并已經對所述載體進行了臨床試驗，但是由于病毒特性而使所述病毒的使用受到限制。病毒結合到細胞膜中的特定配體，從而進入細胞中。因此，能夠被感染的細胞由于病毒能夠結合的配體的種類而受到限制。因此，可應用病毒載體來防治的疾病不可避免地受到了限制。
病毒載體使用受限的另一個重要原因是當病毒進入活體時，所有病毒都會引起宿主的免疫反應(在急性情況中的炎癥反應和慢性情況中的針對載體的抗體的產生)，盡管在反應程度上有所不同。因此，會造成因免疫應答所引起的病毒的大量損失并產生針對載體的抗體，因而使載體在二次接種中具有缺陷性(再次施用它們時沒有效果)。另外，根據病毒的種類，還存在諸如毒性、治療性基因的大小、體內持續時間以及整合到宿主細胞的染色體中等問題。由于這些原因，盡管從病毒因子被證明可用于基因療法起已過去了20年，但是病毒載體在臨床使用中還非常有限。
因此，本發明人此前已經開發了克服上述所有問題的非病毒性肽載體(專利申請韓國10-2001-6587；美國10/071,476；日本2002-032708；中國02104729.4和歐洲02002623)，并將該載體用來轉移特定的治療性基因。
同時，自身免疫疾病涉及T細胞的激活。作為用于自身免疫疾病的治療性基因，可以考慮能夠基本抑制T細胞的激活的基因。
對于T細胞的激活，通常需要兩種由抗原呈遞細胞(APC)提供的信號。第一種信號通過T細胞受體/CD3復合體和由APC的主要組織相容性復合體(MHC)分子呈遞的抗原所介導。所述信號誘導能識別MHC/抗原復合體的特定T細胞的激活。第二種信號也稱為共刺激信號并誘導T細胞的增殖。該信號通過APC的B7所介導。B7是具有在T淋巴細胞上表達的兩個配體CD28和CTLA-4的反受體。稱為CD28的第一個配體在T細胞膜上組成性表達，并在與B7結合后，誘導IL-2分泌和T細胞的增殖。稱為CTLA4的第二個配體與CD28同源，并在T細胞激活之后表達。B7對CTLA4的親和性比對CD28的親和性高20倍，因而CTLA4抑制T細胞的激活。因此，CTLA4蛋白可以是抑制B7:CD28共刺激途徑的最有效物質。

發明內容
因此，為了使用CTLA4作為治療性基因，本發明人構建了這樣的治療性基因，其中CTLA4的胞外域(B7結合域)結合到免疫球蛋白的一部分，使CTLA4進行二聚，同時延長了該蛋白在體內施用后的半衰期。本發明人還發現，使用含有所構建基因的本發明肽載體，表現出抗自身免疫疾病的治療效果，并完成了本發明。
因此，一方面，本發明提供一種重組肽載體，該載體包含前導肽、接頭DNA和DNA構建體，該構建體是通過將表達控制序列與編碼融合蛋白的治療性基因可操作性地連接而形成的，在所述融合蛋白中CTLA4的胞外域與免疫球蛋白的Fc片段相結合，其中所述前導肽通過所述接頭DNA連接到所述DNA構建體的兩個末端。
另一方面，本發明提供制備重組肽載體的方法，該方法包括以下步驟(1)將編碼CTLA4的胞外域的基因與編碼免疫球蛋白的Fc片段的基因連接，從而制備治療性基因；(2)可操作性地連接所述治療性基因和表達控制序列，從而制備DNA構建體；(3)合成前導肽和接頭DNA，然后將前導肽和接頭DNA連接在一起，從而制備肽載體；和(4)通過接頭DNA將步驟(2)中得到的DNA構建體的兩個末端與所述前導肽連接。
另一個方面，本發明提供用于治療自身免疫疾病的組合物，該組合物包含藥學有效量的所述重組肽載體和藥學可接受的載體。
本文使用的術語“自身免疫疾病”是指因對機體內自身抗原產生免疫應答而引起的疾病。自身免疫疾病是在人體整個系統中發生的疾病，其例子包括諸如牛皮癬、特應性皮炎、潰瘍性口炎和系統性紅斑狼瘡等皮膚病；I型糖尿病(也稱為兒童糖尿病)；諸如慢性甲狀腺炎等內分泌系統疾病；諸如再生障礙性疾病等造血性系統疾病；諸如肝炎、原發性肝硬化、潰瘍性結腸炎或克羅恩病等消化系統疾病；諸如哮喘、硅肺病或石棉沉著病等呼吸系統疾病；和諸如免疫球蛋白腎病或球菌感染后腎小球腎炎等腎病。此外，以后認為是自身免疫疾病的所有疾病均包括在本發明治療的疾病對象中。
I.治療性基因和肽載體本文使用的術語“治療性基因”是指為自身免疫疾病的徹底恢復、抑制和減輕而施用的基因。具體地，術語“治療性基因”是指編碼通過將CTLA4的胞外域結合到免疫球蛋白Fc片段的鉸鏈上而形成的融合蛋白(也稱為CTLA4-Ig)的基因。
本文使用的術語“胞外域”是指相對于跨膜域暴露在細胞外的區域，所述跨膜域由定位于磷脂組成的細胞膜中的膜蛋白中的疏水氨基酸組成。所述胞外域主要含有親水氨基酸，并折向蛋白表面，因而可溶于水溶液。在大多數的細胞表面受體蛋白中，胞外域具有結合配體的功能，而胞內域具有胞內信號轉導的功能。
本文使用的術語“免疫球蛋白”是指由B細胞產生的蛋白分子，其起到B細胞的抗原受體的作用而特異性識別各種抗原。該分子具有Y型結構，由兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成。輕鏈和重鏈均含有可變區和恒定區。四條鏈由位于重鏈的柔性鉸鏈區的二硫鍵結合在一起。輕鏈和重鏈中的可變區相互結合，而形成兩個相同的抗原結合域。根據免疫球蛋白的重鏈恒定區可將它們分為五類A(IgA)、D(IgD)、E(IgE)、G(IgG)和M(IgM)。所述五類稱為同型，并具有獨特結構特性和不同的生物學性質。例如，IgG在Fc結構上與其它同型稍有不同。此外，IgG和IgA被分為許多亞型。例如，人類IgG同型被分為四個亞型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，它們分別具有γ1、γ2、γ3和γ4重鏈。免疫球蛋白分子的功能，例如補體激活、與吞噬細胞-Fc受體的結合以及抗原依賴性細胞毒性均由重鏈的Fc片段中存在的結構決定簇介導。重鏈的該Fc片段用作本發明的重組肽載體的組分，并且可以來自所有上述類型或亞型的免疫球蛋白。
本文使用的術語“免疫球蛋白Fc片段”是指功能性劃分的免疫球蛋白片段中的片段，該片段不具有抗原結合能力，但是容易進行結晶，并通過使鉸鏈區與CH2和CH3結構域結合而形成，是在抗體中涉及與有效物質和細胞結合的部分。與本發明有關提到的所述Fc片段可能不同于一些文獻所述的片段，而是包含鉸鏈區，該術語的使用只是為了便于描述本發明，參照本發明的說明書及所附附圖，該術語會得到本領域技術人員的充分理解。
同時，如本領域所公知的，為了提高治療性基因在導入重組肽載體的細胞(或靶細胞)中的表達水平，治療性基因必須可操作性地連接到在靶細胞中具有功能的轉錄和翻譯表達控制序列上。特別是由于特征性地用于本發明的肽載體沒有包含獨立的控制序列，因此優選將治療性基因可操作性地連接到表達控制序列上以形成“DNA構建體”，然后該DNA構建體被導入到肽載體中來制備。在另一個實施方式中，本發明的重組肽載體還可以通過將表達控制序列與肽載體連接，然后將治療性基因導入所得的肽載體結構中。本文使用的術語“DNA構建體”是指通過將表達控制序列可操作性地連接到本發明的治療性基因上而形成的DNA產物。
本文使用的術語“表達控制序列”是指對本發明的治療性基因的表達必要或有益的核苷酸序列。各表達控制序列相對于編碼融合蛋白的核苷酸序列可以內源的也可以是外源的。所述表達控制序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、增強子或上游激活序列、信號肽序列和轉錄終止子。在本發明中，表達控制序列優選包括啟動子、信號肽序列和聚腺苷酸化序列。也可以選擇性地包括其它控制序列，以進一步提高本發明的治療性基因的表達水平。
對于本發明的治療性基因的表達，只要適合于指導在哺乳動物細胞中的表達，任意表達控制序列都可以使用。所述控制序列的例子包括SV40和腺病毒的早期啟動子和后期啟動子(例如腺病毒主要后期啟動子)、MT-1(金屬硫蛋白基因)啟動子、人巨細胞病毒(CMV)早期基因、人延長因子1α(EF-1α)、果蠅小熱激蛋白70啟動子、Rous肉瘤病毒(RSV)啟動子、人泛素C(UbC)啟動子、人生長激素轉錄終止子、腺病毒Elb區聚腺苷酸化序列和牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化序列。
本文使用的術語“信號肽序列”是指誘導表達后的蛋白運輸到細胞膜外的氨基酸序列。通常，運輸到細胞膜外的表面蛋白或分泌蛋白具有被細胞膜中的信號肽酶切割的N末端序列。作為本發明中的信號肽序列，適合于指導哺乳動物細胞中的分泌的任何序列都可以使用。優選來自同種或相關種的分泌蛋白的信號肽序列。可以使用但不限于hG-CGF、鼠免疫球蛋白κ輕鏈或人制瘤素M的信號肽序列。
本文使用的術語“可操作性地連接”是指將核酸與另外的核酸序列置于在功能上具有關系的狀態。這可以是相互連接的基因和控制序列以這樣的方式，使得當適當的分子(例如轉錄激活子蛋白)被結合到控制序列時，該基因的表達變得可行。例如，如果啟動子控制編碼序列的轉錄，那么該啟動子將可操作性地與該序列結合。通常，術語“可操作性地連接”是指被連接的DNA序列是相鄰的，并且在分泌性前導序列的情況中，是相鄰的且在閱讀框內。所述序列的連接是通過在適當的限制酶位點上進行連接來實施的。如果所述位點不存在，可以使用根據常規方法合成的寡聚核苷酸銜接子或接頭。
同時，本文使用的術語“載體”是指能夠將治療性基因穩定地攜帶入靶細胞中的載體。術語“肽載體”包括由本發明人提交、公開的公布號為10-2001-0053621(名稱為“肽載體”)的韓國專利中公開的載體并由肽和DNA的復合體組成。“重組肽載體”是指包含通過可操作性地連接表達控制序列和治療性基因而形成DNA構建體的肽載體，使得該治療性基因可以在靶細胞中表達。
在本發明中，用以將治療性基因攜帶到細胞中的肽載體通常由(1)前導肽和(2)接頭DNA構成。
前導肽起到通過細胞膜進入細胞的作用。具體地，前導肽可以具有附著到N末端胺基團的乙酰基，以消除與其它分子的活性，并在C末端可以具有Cys，以通過二硫鍵結合接頭DNA。
根據本發明，肽載體可以包含由16個氨基酸構成的前導肽。由16個氨基酸構成的本發明的前導肽可以以不同的實施方式提供。第1位氨基酸至第4位氨基酸起到易于滲透到細胞膜的磷脂中的作用，并可以選自帶有非極性脂肪族側鏈的氨基酸，例如Gly、Als、Val、Leu和Ile。第5位氨基酸和第6位氨基酸可以起到支持所述4個氨基酸在滲透到細胞膜中時保持處于穩定的滲透狀態的作用，并可以選自帶有非離子極性側鏈的氨基酸，例如Asn、Gln、Ser和Tyr。第7位氨基酸可以起到上述6個氨基酸和隨后9個氨基酸的間隔子的作用，并且它雖然可以是除了酸性氨基酸(Asp和Glu)以外的任意氨基酸，但是特別優選為Gly。第8位氨基酸至第12位氨基酸起到提供吸引力的作用，即它們可以通過與細胞膜內的負電荷的相互作用而被驅動到細胞中，并且它們可以選自帶有堿性側鏈的氨基酸，例如Lys、Arg和His。考慮到細胞膜的間隔，第13位氨基酸起到間隔子的作用，因此可以是除了酸性氨基酸之外的任意氨基酸，但是Gly是優選的。第14位氨基酸和第15位氨基酸可以是任意氨基酸。
在一個優選的實施方式中，前導肽可以具有以下氨基酸序列AC-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gly-Arg-Arg-Cys(SEQ ID NO21)對應于SEQ ID NO21的氨基酸序列，前導肽序列包括以下所有的氨基酸序列其中(1)第2位的Leu被Ile取代，(2)第4位的Ile被Leu取代，(3)第10位的Lys被Arg取代，(4)第11位的Arg被Ile取代，或(5)第13位的Gly被Leu、Ile、Arg或Gln取代。
接頭DNA起到將前導肽連接到本發明的DNA構建體的中介體的作用，其可以由15～18個核苷酸組成，并可以具有不同的堿基序列。在一個優選的實施方式中，接頭DNA可以具有以下堿基序列接頭-1DNA5’-Cys-CTA-ATA-CGA-CTC-ACT-AT-3’(SEQ ID NO22)接頭-2DNA3’-GAT-TAT-GCT-GAG-TGA-T- -5’(SEQ ID NO23)肽載體的形成，即前導肽與接頭DNA的連接，可以通過前導肽的C末端Cys與接頭-1DNA的5’末端的Cys之間的二硫鍵來實現。在這種情況中，接頭-2DNA和前導肽沒有通過任何共價鍵相互連接，但是因為接頭-2DNA和接頭-1DNA由于互補堿基序列退火在一起，因此前導肽和接頭DNA(接頭-1DNA和接頭-2DNA)可以相互連接。在這樣的連接狀態中，前導肽和接頭-2DNA之間存在缺口。
隨后，重組肽載體的形成，尤其是肽載體與5’末端磷酸基團已經去除了的本發明DNA構建體的連接，可以通過肽載體的接頭-2DNA的5’末端的磷酸基團 和DNA構建體的3’末端的羥基(OH)之間的磷酸二酯鍵來實現。在這方面，接頭-2DNA和前導肽雖然沒有任何共價鍵連接，但是由于接頭-2DNA和接頭-1DNA通過互補堿基序列退火在一起，因此前導肽和接頭DNA(接頭-1DNA和接頭-2DNA)可以相互連接。在這樣的連接狀態中，前導肽和接頭-2DNA之間存在缺口。此外，由于在DNA構建體的兩個末端都形成磷酸二酯鍵，因此最終完成其中前導肽通過接頭DNA連接到所述DNA構建體兩個末端的重組肽載體。
通過這種特異性連接制備的重組肽載體允許本發明的DNA構建體在被導入細胞核中時易于與肽載體分離。
II.制備方法在另一方面，本發明提供制備重組肽載體的方法，該方法包括以下步驟(1)將編碼CTLA4的胞外域的基因與編碼免疫球蛋白的Fc片段的基因連接，從而制備治療性基因；(2)可操作性地連接所述治療性基因和表達控制序列，從而制備DNA構建體；(3)合成前導肽和接頭DNA，然后將前導肽和接頭DNA連接在一起，從而制備肽載體；和(4)通過接頭DNA將步驟(2)得到的DNA構建體的兩個末端與所述前導肽連接。
在本發明的制備方法中，步驟(1)、(2)和(3)可以以任意順序獨立進行。此外，如上所述，所述制備還可以通過將表達控制序列與肽載體連接，然后將治療性基因與所得的肽載體結構進行連接而實施。
下文將對制備重組肽載體的各步驟進行描述。
(1)制備治療性基因的步驟治療性基因可以通過以下步驟制備(a)制備編碼CTLA4的胞外域的各基因和編碼免疫球蛋白的Fc片段的基因，(b)通過PCR，將相同的限制酶識別序列插入到所制備的編碼CTLA4的胞外域的基因和所制備的編碼免疫球蛋白的Fc片段的基因中，(c)用與限制酶識別序列相對應的限制酶切割CTLA4的胞外域編碼基因和免疫球蛋白的Fc片段編碼基因的限制酶識別序列；和(d)通過連接酶將兩條DNA的切割部分連接在一起，從而制備其中CTLA4的胞外域連接到免疫球蛋白的Fc片段上的治療性基因。
在一個實施方式中，編碼CTLA4的胞外域的基因和編碼免疫球蛋白的Fc片段的基因可以通過使用編碼CTLA4胞外域編碼基因或免疫球蛋白Fc片段編碼基因的兩個末端的寡核苷酸作為引物，在從欲處理的物種(優選單個體的)的細胞中分離的模板mRNA上進行RT-PCR而容易地獲得。
在一個實施方式中，所述基因還可以通過本領域已知的任意標準方法，例如使用自動DNA合成儀(從Biosearch，Applied Biosystems等商購獲得)來合成。例如，硫代磷酸寡核苷酸可以通過Stein等(Nucl.Acids Res.163209(1988))所描述的方法合成。膦酸甲酯寡核苷酸可以通過使用可控孔度玻璃聚合物支持物來制備(Sarin等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.857448-7451(1988))。
(2)本發明DNA構建體的制備步驟在本發明中，優選將所制備的治療性基因可操作性地連接到表達控制序列上而形成DNA構建體，并將該DNA構建體導入到肽載體中。這些序列的連接通過在適當的限制酶切位點上進行連接而實施。如果所述位點不存在，可以使用根據常規方法合成的寡核苷酸銜接子或接頭。為了可操作性地進行連接，期望以特定的順序和方向來對DNA片段進行連接。
DNA可以用某些限制酶在適當的緩沖液中進行切割。通常，在20μl的緩沖溶液中，使用約0.2μg～1μg的DNA片段和1～2單位的相應限制酶。適當的緩沖液、DNA濃度、培養時間和溫度可以由限制酶制造商規定。通常適合于在37℃培養約1小時～2小時，但有些酶需要較高的溫度。培養后，通過用酚和氯仿的混合物對消化溶液進行提取來去除酶和其它雜質，且經消化的DNA用乙醇沉淀，并從水層中收集。
通過電泳按照大小來分離和選擇切割的DNA片段。DNA可以在瓊脂糖或聚丙烯酰胺基質上電泳。基質的選擇取決于所要分離的DNA片段的大小。電泳后，DNA通過電洗脫從基質中提取，或者當使用低熔點的瓊脂糖時，可以融化瓊脂糖，從中提取DNA。
將欲連接在一起的DNA片段以等摩爾量加到溶液中。所述溶液通常含有ATP、連接酶緩沖液和連接酶，例如T4連接酶(每0.5μg的DNA約10個單位)。為了將DNA片段連接到載體上，該載體可以通過用適當的限制酶切斷以進行線性化，然后用堿性磷酸酶和牛小腸水解酶進行處理。所述磷酸酶處理可以防止載體在連接過程中發生自連接。
在本發明DNA構建體的制備方法的一個實施方式中，本發明的治療性基因被可操作性地連接到表達載體的表達控制序列上，所述表達載體已知在哺乳動物中有效地指導表達。然后，以這樣的方式用適當的限制酶切割經連接的基因結構體，使得切割片段含有治療性基因和可操作性地連接到治療性基因上的表達控制序列。用這種方式，可以容易地獲得本發明的DNA構建體。
(3)肽載體的制備步驟前導肽(本發明的肽載體的組分)可以通過生物化學領域技術人員公知的化學合成方法容易地制備(Creighton，ProteinsStructures andMolecular Principles，W.H.Freeman and Co.，NY(1983))。典型的方法包括但不限于液相或固相合成、片段縮合和F-MOC或T-BOC化學法(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins，Williams等編著，CRC Press，Boca Raton Florida，(1997)；A Practical Approach，Atherton和Sheppard編著，IRL Press，Oxford，英格蘭，(1989))。
根據常規的固相法，本發明的前導肽可以以C末端、第1位氨基酸、第2位氨基酸、第3位氨基酸等的順序在經保護的氨基酸之間進行縮合反應來合成。在縮合反應之后，可以通過已知方法，如酸解或氨解除去保護基團和連接到C末端氨基酸的載體。上述肽合成方法在文獻中有描述(Gross和Meienhofer的The Peptides，第2卷，Academic Press(1980))。
可用于本發明肽的合成的固相載體為生物化學領域中的常用載體，其典型的例子包括但不限于取代芐基型的聚苯乙烯樹脂、羥基甲基苯基乙酰胺型的聚苯乙烯樹脂、取代的二苯甲基聚苯乙烯樹脂和具有能夠結合到肽上的官能團的聚丙烯酰胺樹脂等。
在常規的肽合成中使用最初的經保護的氨基酸的保護基團，并且容易地將其通過常規方法，例如酸解、還原或氨解予以去除。氨基保護基團的具體例子包括甲酰基；三氟乙酰基；芐氧基羰基；取代的芐氧基羰基，例如鄰氯芐氧基羰基或對氯芐氧基羰基和鄰溴芐氧基羰基或對溴芐氧基羰基；以及脂肪族氧羰基，例如叔丁氧羰基和叔戊氧羰基。氨基酸的羧基可以通過轉換成酯基進行保護。所述酯基包括芐基酯；取代的芐基酯，如甲氧基芐基酯；以及烷基酯，如環己基酯、環庚基酯或叔丁基酯。胍基不需要保護基團，但是可以用硝基、甲苯磺酰基或諸如甲氧基苯磺酰基或均三甲苯磺酰基等芳基磺酰基進行保護。咪唑的保護基團包括甲苯磺酰基、芐基和二硝基苯基等。色氨酸的吲哚基不需要保護基團，但是可以用諸如甲酰基等保護基團進行保護。
肽與保護基團和載體的分離可以在各種清除劑存在的情況下通過無水氫氟化物來實現。清除劑的例子包括苯甲醚、鄰甲酚、間甲酚和對甲酚、二甲基硫化物、硫代甲酚、乙二醇和巰基吡啶，這些物質常用在肽合成中。
作為本發明肽載體的其它部分的接頭DNA，可以通過本領域已知的任意標準方法，例如使用自動DNA合成儀(從Biosearch，AppliedBiosystems等商購獲得)來合成。例如，硫代磷酸寡核苷酸可以通過Stein等(Nucl.Acids Res.163209(1988))所描述的方法合成。膦酸甲酯寡核苷酸可以通過使用可控孔度玻璃聚合物支持物來制備(Sarin等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.857448-7451(1988))。
如此制備的前導肽和接頭DNA可以通過以下方法相互連接通過二硫鍵將前導肽連接到接頭-1DNA上，將接頭-2DNA加到所連接的結構上，并通過堿基配對使接頭-1DNA和接頭-2DNA退火。在這種情況中，前導肽和接頭DNA之間的二硫鍵可以在pH約為10的堿性條件下形成，其中優選加有諸如DTT(二硫蘇糖醇)等抗氧化劑。這是因為抗氧化劑起到防止蛋白氧化、保護酶等的活性的作用并可以保護所形成的二硫鍵和在隨后連接時維持酶的活性。然后，接頭-1DNA和接頭-2DNA之間的退火可以通過使它們保持在50℃(適合于退火的溫度)來實現。
(4)連接本發明DNA構建體與肽載體的步驟在將步驟(1)中制備的本發明的DNA構建體與步驟(2)中制備的肽載體連接前，優選用磷酸酶處理DNA構建體，以去除5’末端的磷酸基團。這使DNA構建體不能與接頭-1DNA的3’末端的羥基反應或結合。當去除了磷酸基團的DNA構建體與肽載體混合時，向該混合物中加入適當的連接酶，DNA構建體與接頭DNA將通過接頭-2DNA的5’末端的磷酸基團和DNA構建體的3’末端的羥基之間的磷酸二酯鍵連接在一起。在這種情況中，由于3’末端的羥基位于DNA構建體的兩個末端，前導肽將最終通過接頭DNA連接到所述DNA構建體的兩個末端。
III.藥物組合物本發明提供用于治療自身免疫疾病的組合物，該組合物包含治療有效量的重組肽載體和藥學可接受的載體。
包含在本發明組合物中的藥學可接受的載體常用于制劑中，其例子包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、甲基羥基苯甲酸酯、丙基羥基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。本發明的組合物可以另外包含潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、調味劑、乳化劑、懸浮劑和防腐劑等。
本發明的藥物組合物可以通過基因療法中常用的途徑施用。該藥物組合物優選通過腸胃外途徑施用，例如靜脈內、腹內、肌肉內、皮下或局部施用途徑施用。
本發明的藥物組合物的適當劑量根據許多因素而變化，所述因素如配制方法，施用方式，患者的年齡、體重、性別、疾病的嚴重程度、飲食、排瀉和反應敏感性，以及施用時間和施用途徑。普通技術醫師可以容易地確定和規定對所需治療有效的劑量。例如，本發明的藥物組合物中的重組肽載體可以以1μg/kg/天～100μg/kg/天的劑量施用。
包含本發明的重組肽載體的藥物組合物可以按照本發明技術領域的技術人員能夠容易地完成的方法，用藥學可接受的載體和/或賦形劑配制成單劑量形式或者多劑量包裝中的產品。所得制劑可以是在油或水性介質中的溶液、懸浮液或乳液，以及提取物、粉末、顆粒、片劑或膠囊等形式，并可以另外包含分散劑或穩定劑。
為了提高在室溫的穩定性、減少對昂貴的低溫貯藏的需要并延長保存期，可以對包含本發明的重組肽載體的藥物組合物進行冷凍干燥。冷凍干燥過程可以包括以下連續步驟冷凍、一次干燥和二次干燥。冷凍干燥組合物后的二次干燥步驟包括降壓和加熱以使蒸汽升華。進行第二步是為了從經干燥的物質中蒸發余留的吸收水分。
在一個實施方式中，本發明的藥物組合物的冷凍干燥按以下順序進行(1)通過使用冷凍干燥顯微鏡測定制劑的坍塌溫度(collapsetemperature)(Pikal，M.J等，Int.J.Pharm.，1990，第62卷，第165頁)；(2)在室溫將小瓶放在冷凍干燥機架子上，然后在-1℃平衡約30分鐘；(3)將架子冷卻至-55℃，并保持在該溫度2小時；(4)在約-32℃或比坍塌溫度低5℃的產品溫度進行二次干燥；(5)在35℃進行二次干燥。室壓控制在55mmHg～120mmHg，然后結束干燥；(6)在冷凍干燥機的真空下塞住小瓶，并將冷凍干燥小瓶用鉗口蓋密封(crimp-sealed)，并貯藏在2℃～8℃。
凍干制劑可以包含賦形劑和凍干保護劑。賦形劑包括但不限于含有0.9％NaCl和10mM磷酸鈉(pH 7.0)或10mM檸檬酸鈉(pH 7.0)的緩沖液。凍干保護劑在冷凍和干燥步驟中起到保護生物分子并為最終產品提供機械支持的作用，其例子包括PBS(pH 7.0)、PBS/4％、12％或15％的海藻糖等。


圖1是本發明的重組肽載體的示意圖。CMV巨細胞病毒啟動子；SP制瘤素M的信號肽序列；VCTLA4的胞外域；H、CH2和CH3IgA的Fc片段；BGH牛生長激素聚腺苷酸化序列；以及圖底部的字母IgA的鉸鏈(H)區的氨基酸序列，其中符號*表示半胱氨酸被取代為絲氨酸。
圖2(a)顯示，為了檢測治療性基因是否在宿主中表達，對從施用本發明重組肽載體的試驗組的大鼠和未施用本發明的重組肽載體的對照組的大鼠的各組織中提取的RNA進行RT-PCR和電泳的結果。M100bp梯度；泳道1和6肝；泳道2和7腎；泳道3和8脾；泳道4和9肺；泳道5和10肌肉；以及泳道11和12施用蒸餾水的陰性對照組。圖2(b)顯示對從施用本發明重組肽載體的試驗組的狗和未施用本發明的重組肽載體的對照組的狗的血中提取的RNA進行RT-PCR和電泳的結果。泳道N施用蒸餾水的陰性對照的狗；泳道C未施用重組肽載體的陰性對照的狗；泳道0、1、3、7、11、15、19、26和30分別為于施用重組肽載體后0、1、3、7、11、15、19、26和30天的施用重組肽載體的狗的結果；泳道21和168分別為于施用重組肽載體后21和168天的施用重組肽載體的其它狗的結果。
圖3圖示在施用重組肽載體的試驗組的狗(狗1和狗2)和未施用重組肽載體的對照組的狗中測定針對重組肽載體的抗體的結果，其中抗體測定在基因治療后0、3、7、15和30天進行，以檢測是否產生針對重組肽載體的抗體。
圖4是顯示在用本發明的重組肽載體進行基因治療之前以及之后的脫毛情況的圖。(a)、(c)、(e)和(g)基因治療前；和(b)、(d)、(f)和(h)基因治療后。
圖5顯示為檢測用本發明的重組肽載體進行基因治療之前和之后皮膚組織的狀態而進行的H&E染色的結果。(a)和(b)分別為用本發明的重組肽載體進行基因治療之前和之后滲透到上皮層中的淋巴細胞和漿細胞的量；(c)和(d)分別為基因治療之前和之后毛囊的情況；(d)和(e)分別為基因治療之前和之后沉積在真皮-表皮交界處的免疫球蛋白的量。
具體實施例方式
下文將通過以下實施例對本發明進行更為詳細的描述。但是對本領域技術人員來說顯而易見的是，本發明的范圍并沒有限于這些實施例，也不受到這些實施例的限制。
實施例1
(1)狗CTLA4的編碼序列的擴增將1.4ml作為抗凝血劑的CPDA(檸檬酸磷酸葡萄糖酸)加到10ml取自健康狗的靜脈血中，然后進行Ficoll-Plaque梯度離心以分離外周血單核細胞(PBMC)。經分離的PBMC用PBS(磷酸緩沖鹽水)洗滌2次，在完全沒有內毒素的培養基RPMI 1640(含有10％胎牛血清、50μl/ml慶大霉素、10μl/ml伴刀豆球蛋白A)中調至1×106細胞/ml，并在5％CO2于37℃培養4小時。培養后，PBMC通過離心收集并冷凍在液氮中。用Trizol試劑從經分離的PBMC中分離總RNA，用75％乙醇洗滌，并將RNA沉淀溶解在DEPC處理水中。將2μg經純化的mRNA和1μloligo(dT)30引物混合，在70℃加熱2分鐘，并通過加冰進行冷卻。向該混合物中加入200U M-Mulv反轉錄酶、5μl的5倍緩沖液、1μl的dNTP，并用DEPC處理水加至50μl的總體積。讓該混合物在42℃反應1小時，以合成第一鏈cDNA。
用以下引物對對上述獲得的第一鏈cDNA模板進行PCR，以擴增758bp的CTLA4。具體地，在加入3μl第一鏈cDNA、2U Pfu DNA聚合酶、10μl的10倍緩沖液、1％Triton X-100、1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、3μl的CTLA4正向引物(10μM)、3μl的CTLA4反向引物(10μM)、2μl的dNTP(各為10mM)，并用三重蒸餾水加至100μl的總體積之后進行PCR反應。而且PCR反應由以下步驟組成3分鐘，95℃；30個循環(30秒，95℃；1分鐘，52℃和1分鐘30秒，72℃)；以及10分鐘，72℃。PCR產物具有完全的平末端。
CTLA4正向引物5’-AAGACCTGAACACTGCTCCA-3’(SEQ IDNO1)CTLA4反向引物5’-TTGAAATTGCCTCAGCTCCT-3’(SEQ ID NO2)(2)狗免疫球蛋白(IgA)Fc片段的編碼序列的擴增為了擴增IgA的Fc片段(H-CH2-CH3區)，用5μl/ml LPS激活以上獲得的PBMC，然后以與以上(1)部分相同的方式從該細胞中提取總RNA，并進行RT-PCR。所得第一鏈cDNA模板用以下引物對進行PCR，于是擴增到726bp的IgA Fc片段。
IgA正向引物5’-GATAACAGTCATCCGTGTCA-3’(SEQ ID NO3)IgA反向引物5’-GTAGCAGATGCCGTCCACCT-3’(SEQ ID NO4)。
實施例2CTLA4的胞外域與IgA Fc片段的連接為了在實施例1中擴增的CTLA4的胞外域與IgA Fc片段之間進行連接，設計正向引物(含有HindIII限制酶識別序列)和反向引物(含有EcoRI限制酶識別序列)，以擴增CTLA4的胞外域，同樣，設計與實施例1(2)相同的正向引物(含有EcoRI限制酶識別序列)和反向引物(含有XbaI限制酶識別序列)，以擴增IgA Fc片段。然后，用所述引物進行PCR。
在這種情況中，由于CTLA4的信號肽還沒有得到確定，所以將人制瘤素M的信號肽附著到所擴增的CTLA4的5’末端，以用于胞外分泌。這通過兩步的重疊PCR來實現。第一步PCR用以下正向引物和反向引物進行，所述正向引物和反向引物經合成使它們具有來自制瘤素M的信號肽的15個氨基酸和來自CTLA4的N末端的7個氨基酸。
SP-CTLA4正向引物5’-CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGTCCAAAGGGATGCATGTGGCT-3’(SEQ ID NO5)SP-CTLA4(EcoRI)反向引物5’-GAATTCGTCAGAATCTGGGCAAGGTTC-3’(SEQ ID NO6)第二步PCR通過純化第一步PCR的PCR產物，然后用以下在制瘤素M的N末端含有HindIII限制酶識別序列的正向引物和上述SP-CTLA4(EcoRI)反向引物擴增經純化的產物來進行。
SP-CTLA4(HindIII)正向引物5’-AAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC-3’(SEQ ID NO7)IgA Fc片段用以下引物擴增
IgA(EcoRI)正向引物5’-GAATTCGATAACAGTCATCCGTCTCAT-3’(SEQ ID NO8)IgA(XbaI)反向引物5’-TCTAGAGTAGCAGATGCCGTCCAC-3’(SEQ ID NO9)使用這些引物組，獲得了472bp(CTLA4胞外域)PCR產物和741bp(IgA Fc片段)PCR產物。在這一過程中，IgA鉸鏈區的4個半胱氨酸中的3個半胱氨酸被絲氨酸取代以在鏈間形成一個二硫鍵。將各擴增的PCR產物克隆到pCR2.1載體中，從而制備pCR2.1-CTLA4和pCR2.1-IgA。用這些載體轉化E.coli(大腸桿菌)TOP10，選取陽性克隆，并將其培養在液體培養基中。培養后，用相應的限制酶對提取的質粒(HindIII和EcoRI用于pCR2.1-CTLA4，而EcoRI和XbaI用于pCR2.1-IGHAC)進行處理，然后，在瓊脂糖凝膠上分離所期望的條帶，并使其相互連接。再次對連接產物進行PCR擴增，然后將其克隆到pCR2.1載體中。
實施例3治療性CTLA4-Ig基因與pcDNA 3.1(+)的連接用HindIII和XbaI分別處理實施例2中獲得的治療性CTLA4-Ig基因和pcDNA 3.1(+)載體。然后，在瓊脂糖凝膠上對該治療性基因和載體進行分離和純化并進行連接。用該重組載體轉化E.coli TOP10菌株，并進行選擇性培養。
實施例4治療性基因的PCR為了制備用于最終用途的可操作性地連接到表達控制序列的治療性基因(DNA構建體)，將以下正向引物置于pcDNA3.1(+)的CMV啟動子之前，將以下反向引物置于BGH的Poly(A)信號之后CMV-正向引物5’-GCCAGATATACGCGTTGACAT-3’(SEQ ID NO10)BGH-反向引物5’-GCTTAATGCGCCGCTACA-3’(SEQ ID NO11)使用這些引物進行PCR而獲得治療性基因可操作性地連接到表達控制序列上的2213bp的DNA構建體。該DNA構建體的堿基序列如SEQ IDNO12所示。
實施例5來自人類的治療性CTLA4-Ig基因同時，為了制備可用于人類的治療性CTLA4-Ig基因，使用來自人類的CTLA4基因和免疫球蛋白基因，所有制備步驟以與實施例1～4相同的方式進行。在各步驟中使用的引物對的堿基序列如下所示，所得的具有可操作性地連接到表達控制序列上的治療性基因的DNA構建體具有如SEQ ID NO20所示的堿基序列。
hCTLA4正向引物5’-AAGACCTGAACACCGCTCCC-3’(SEQ IDNO13)hCTLA4反向引物5’-GTTAGAATTGCCTCAGCTCTT-3’(SEQ IDNO14)hIgG正向引物5’-GAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC-3’(SEQ IDNO15)hIgG反向引物5’-AGCATCCTCGTGCGACCGCG-3’(SEQ ID NO16)hSP-CTLA4正向引物5’-CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC-3’(SEQ ID NO17)hSP-CTLA4(EcoRI)反向引物與SP-CTLA4(EcoRI)反向引物相同hSP-CTLA4(HindIII)正向引物與SP-CTLA4(HindIII)正向引物相同hIgA(EcoRI)正向引物5’-GAATTCGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTG-3’(SEQ ID NO18)hIgA(XbaI)反向引物5’-TCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC-3’(SEQ ID NO19)實施例6肽載體的合成在本發明中，用以將治療性基因轉導入細胞中的肽載體由前導肽和接頭DNA組成。
前導肽具有以下氨基酸序列，由Fmoc固相法合成，包含附著于N末端的乙酰基團(Ac)(Peptron Inc.)。
Ac-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gly-Arg-Arg-Cys(SEQ ID NO21)接頭序列接頭-1DNA5’-Cys-OO-CTA-ATA-CGA-CTC-ACT-AT-3’(SEQ IDNO22)，其中-OO-表示酯鍵。
接頭-2DNA3’-GAT TAT GCT GAG TGA-T-5’(SEQ ID NO23)。
在接頭序列中，將半胱氨酸結合到接頭-1DNA的5’末端，以與前導肽連接，并通過T4聚合激酶(polykinase，Perkin Elmer)將磷酸基團附著于接頭-2DNA的5’末端，以與治療性基因連接。
在緩沖液(含有50mM Tris、0.1mM EDTA和10mM DTT，pH 10.5)中，將2納摩爾(nmol)的前導肽和2納摩爾的接頭-1DNA于37℃反應1小時，從而通過S-S鍵將它們連接在一起。然后，為了使接頭-1DNA與在5’末端具有磷酸基團的接頭-2DNA雜交，加入2nmol的接頭-2DNA，并在60℃反應30分鐘。隨后，每次分裝10pmol(20pmol/μl)，然后保藏在-20℃以下。
實施例7DNA構建體與肽載體的連接用二氧化硅在瓊脂糖凝膠片段上純化實施例5中通過PCR擴增的DNA構建體，然后用T4連接酶將其連接到載體上。連接后，通過瓊脂糖凝膠上的條帶遷移來確認連接產物，然后施用于患病模型動物。圖1顯示本發明的重組肽載體和DNA構建體的示意圖。
實施例8(1)將治療性基因遞送于大鼠的檢測為了檢測肽載體是否能夠將治療性基因遞送到各種組織中，對大鼠施用重組肽載體，并從大鼠的各種組織中提取治療性基因的RNA和進行RT-PCR。結果如圖2所示。
圖2a顯示對從施用重組肽載體的試驗組的大鼠和未施用重組肽載體的對照組的大鼠的各種組織中提取的RNA進行RT-PCR和電泳的結果(M100bp梯度；泳道1和6肝；泳道2和7腎；泳道3和8脾；泳道4和9肺；泳道5和10肌肉；以及泳道11和12施用蒸餾水的陰性對照組)。從圖2a中的結果可以看出，插入到重組肽載體中的治療性基因被遞送到各種組織如肝、腎、脾、肺和肌肉中，并在所述組織中表達。
(2)將治療性基因遞送于狗的檢測為了檢測治療性基因是否在狗中充分表達，設計在正常狗中沒有發現的能夠擴增治療性基因(CTLA4和IgA)的結合位點的引物對，用所設計的引物對，對取自狗的外周血單核細胞的RNA進行RT-PCR。結果如圖2b所示。
圖2(b)顯示對從施用本發明重組肽載體的試驗組的狗和未施用本發明的重組肽載體的對照組的狗的各種組織中提取的RNA進行RT-PCR和電泳的結果(泳道N施用蒸餾水的陰性對照的狗；泳道C未施用重組肽載體的陰性對照的狗；泳道0、1、3、7、11、15、19、26和30分別為在施用重組肽載體的狗中，在施用重組肽載體后0、1、3、7、11、15、19、26和30天的試驗結果；泳道21和168分別為在施用重組肽載體的另外的狗中，在施用重組肽載體后21和168天的試驗結果。如圖2b所示，可以觀察到對應于治療性基因(CTLA4和IgA)的結合域的394bp的特異條帶，并且治療性基因在施用本發明的重組肽載體后至少表達了168天。
檢驗例1尿蛋白與肌酸的比例的檢測在上午10點到下午2點，用導尿管收集經硫酸乙酰肝素免疫引起SLE的狗的尿。通過Lott JA等(Clin.Chem.1983，第29卷(11)，第1946頁)描述的方法測定尿蛋白，而尿肌酸則在用蒸餾水以1∶100稀釋后通過改進的Jaffe反應來測定。尿蛋白與肌酸的比例小于0.6可以評價為正常，尿蛋白與肌酸的比例大于1可以評價為嚴重腎小球疾病(Sodikoff CH.Urine tests.In Sodikoff CH(編)，Laboratory profiles of small animal diseasesA guide to laboratory diagnosis.第2版，St.LouisMosby，199550)。可以看出，在用本發明重組肽載體處理前尿蛋白與肌酸的比例顯示高的狗，在用肽載體處理后顯示出正常的尿蛋白與肌酸的比例。這表明根據本發明制備的治療性基因緩解了腎小球疾病(表1)。
表1

檢驗例2針對肽載體的抗體的ELISA檢測為了檢測本發明使用的肽載體在宿主中是否產生抗體而進行了競爭ELISA。
在基因治療后0、3、7、15和30天，從未用本發明的肽載體處理的對照組的狗和用本發明的肽載體處理的試驗組的狗采血，并從該血中分離血清。將12.5μg/孔的肽載體稀釋在PBS中，然后在4℃包被過夜。為了封閉余留的結合位點，用PBS中的1％BSA溶液作為封閉緩沖液。在檢測中，狗血清以1∶200的稀釋度使用，作為特異性結合到肽載體上的抗體，用過氧化物酶偶聯的兔抗狗IgG作為二抗，并使用二鹽酸鄰苯二二胺(Sigma p9187)作為底物。用3M HCl作為終止液來終止反應，并測定492nm處的吸光度。結果如圖3所示。
圖3中的柱狀圖顯示與重組肽載體結合的特異性抗體的量在施用重組肽載體的檢驗組的狗(狗1和狗2)和未施用肽載體的對照組的狗之間的比較，其中抗體量的測定在基因療法后0、3、7、15和30天進行。從圖3的結果可以看出，在試驗組的狗的血中并沒有產生針對肽載體的抗體。
檢驗例3組織學檢測對狗施用硫酸乙酰肝素(HS)，以引起系統性紅斑狼瘡，在12周后取狗的皮膚組織。在用本發明的重組肽載體處理的狗的情況中，在處理后99天取其皮膚組織。對所取的皮膚組織進行H&E(蘇木精和曙紅)染色，并針對免疫球蛋白和C3進行免疫染色。以1∶200稀釋重鏈特異性羊抗狗IgG、μ鏈特異性羊抗狗IgM和羊抗狗C3(benthyl laboratories，Montgomery，TX)并用作一抗，以1∶200稀釋過氧化物酶抗羊IgG(H+L)并用作二抗。
在施用治療性基因的情況中，目視檢測的結果表明，與系統性紅斑狼瘡有關的皮膚病，如脫毛、紅斑、疥、痂和脂溢性皮炎完全消失(圖4a至4h)。
類似地，對基因療法后99天所取的皮膚組織進行H&E染色的結果顯示，已滲透到上皮層中的淋巴細胞和漿細胞的數目顯著降低(圖5a和5b)。而且，在已經處于休眠期且沒有毛的毛囊中長出新毛，所述毛囊恢復到正常的毛發再生期(圖5c和圖5d)。對皮膚組織進行免疫染色后，免疫球蛋白(IgM)和補體(C3)向真皮-表皮結合處(也稱為狼瘡特異帶，在紅斑狼瘡中特征性地顯示)中的滲透消失(圖5e和5f)。
檢驗例4HS免疫的狗和基因治療的狗中的抗核抗體的檢測采用以丙酮固定的Crandall-Reese貓腎(Crandall-Reese FelineKidney，CRFK)細胞作為基質，通過間接免疫熒光法檢測針對細胞核的自身抗體(抗核抗體)。以1∶2至1∶128稀釋狗血清并測定熒光。用異硫氰酸熒光素偶聯的羊抗狗IgG(1∶16的稀釋度)檢測自身抗體的結合。用落射熒光顯微鏡觀察熒光。在用HS免疫后3、7、11、18、25和27周以及基因療法后7、32和99天取血清。
如果即使在高稀釋比的血清中也檢測到熒光(即血清表現為陽性)，那么這意味著該血清中存在著較多的抗核抗體。通常，正常狗的血清在稀釋比至多為1∶10時會顯示出熒光。在稀釋比至多為1∶16時顯示的熒光將認為是低滴度陽性，在稀釋比為1∶64時顯示的熒光將認為是高滴度陽性。在下表2中，在甚至大于1∶128時顯示陽性的情況可以明確診斷為SLE，只在1∶2顯示陽性的情況與正常動物的情況沒有差異。因此，可以看出，重組肽載體有效地治療了SLE。
表2

工業實用性如上所述，通過使用本發明的重組肽載體的基因療法，可以將治療性基因遞送到所有細胞中，同時使針對該載體的抗體的產量最小。因此，本發明的重組肽載體可用于治療在整個系統中出現的疾病，尤其是自身免疫疾病。
序列表<110>蔡瑩鎮崔恩華<120>包含用于治療自身免疫疾病的基因的重組肽載體<130>FCI06KR1235<160>23<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1aagacctgaa cactgctcca 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2ttgaaattgc ctcagctcct 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>3gataacagtc atccgtgtca 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4gtagcagatg ccgtccacct 20<210>5<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca agcatggcga gcatgtccaa agggatgcat 60gtggct 66<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6gaattcgtca gaatctgggc aaggttc 27<210>7
<211>61<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7aagcttcacc atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact 60c 61<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8gaattcgata acagtcatcc gtctcat 27<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9tctagagtag cagatgccgt ccac 24<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>10gccagatata cgcgttgaca t21<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11gcttaatgcg ccgctaca18<210>12<211>2213<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>治療性基因<400>12gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta 600
gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg gagacccaag 660ctggctagcg tttaaactta agcttcacca tgggtgtact gctcacacag aggacgctgc 720tcagtctggt ccttgcactc ctgtttccaa gcatggcgag catgtccaaa gggatgcatg 780tggctcagcc tgcagtggtt ctggccagca gccggggtgt tgctagcttc gtgtgtgaat 840atgggtcttc aggcaacgca gccgaggtcc gggtgacagt gctgcggcag gctggcagcc 900agatgactga agtctgtgcc gcgacataca cagtggagga tgagttggcc ttcctggatg 960attctacctg cactggcacc tccagtggaa acaaagtgaa cctcaccatc caagggttga 1020gggccatgga cacggggctc tacatctgca aggtggagct catgtaccca ccaccctact 1080atgtaggcat gggaaatgga acccagattt atgtcatcga tcctgaacct tgcccagatt 1140ctgacgaatt cgataacagt catccgtctc atccatctcc ctcgtccaat gagccccgcc 1200tgtcactaca gaagccagcc ctcgaggatc tgcttttagg ctccaatgcc agcctcacat 1260gcacactgag tggcctgaaa gaccccaagg gtgccacctt cacctggaac ccctccaaag 1320ggaaggaacc catccagaag aatcctgagc gtgactcctg tggctgctac agtgtgtcca 1380gtgtcctacc aggctgtgct gatccatgga accatgggga caccttctcc tgcacagcca 1440cccaccctga atccaagagc ccgatcactg tcagcatcac caaaaccaca gagcacatcc 1500cgccccaggt ccacctgctg ccgccgccgt cggaagagct ggccctcaat gagctggtga 1560cactgacgtg cttggtgagg ggcttcaaac caaaagatgt gctcgtacga tggctgcaag 1620ggacccagga gctaccccaa gagaagtact tgacctggga gcccctgaag gagcctgacc 1680agaccaacat gtttgccgtg accagcatgc tgagggtgac agccgaagac tggaagcagg 1740gggagaagtt ctcctgcatg gtgggccacg aggctctgcc catgtccttc acccagaaga 1800ccatcgaccg cctggcgggt aaacccaccc acgtcaacgt gtctgtggtc atggcagagg 1860tggacggcat ctgctactaa tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg 1920tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 1980aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 2040
gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 2100aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa 2160ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag cggcgcatta agc2213<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13aagacctgaa caccgctccc 20<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>14gttagaattg cctcagctct t 21<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>15gagcccaaat cttgtgacaa aac 23<210>16<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>16agcatcctcg tgcgaccgcg 20<210>17<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>17ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc 60cagcc 65<210>18<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>18gaattcgagc ccaaatcttc tgacaaaact cacacatccc caccgtcccc agcacctgaa 60ctcctg 66<210>19<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>19tctagaagca tcctcgtgcg accgcgagag c31<210>20<211>2446<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>治療性基因<400>20gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta 600gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg gagacccaag 660ctggctagcg tttaaactta agcttcacca tgggtgtact gctcacacag aggacgctgc 720tcagtctggt ccttgcactc ctgtttccaa gcatggcgag catggcaatg cacgtggccc 780agcctgctgt ggtactggcc agcagccgag gcatcgccag ctttgtgtgt gagtatgcat 840ctccaggcaa agccactgag gtccgggtga cagtgcttcg gcaggctgac agccaggtga 900ctgaagtctg tgcggcaacc tacatgatgg ggaatgagtt gaccttccta gatgattcca 960
tctgcacggg cacctccagt ggaaatcaag tgaacctcac tatccaagga ctgagggcca1020tggacacggg actctacatc tgcaaggtgg agctcatgta cccaccgcca tactacctgg1080gcataggcaa cggaacccag atttatgtaa ttgatccaga accgtgccca gattctgacg1140aattcgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca ggtaagccag1200cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg1260gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct cttcctcagc acctgaactc1320ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc138Ccggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag1440ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag1500cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg1560aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa1620accatctcca aagccaaagg tgggacccgt ggggtgcgag ggccacatgg acagaggccg1680gctcggccca ccctctgccc tgagagtgac cgctgtacca acctctgtcc tacagggcag1740ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag1800gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag1860agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc1920tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc1980ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc2040ctgtctccgg gtaaatgagt gcgacggccg gcaagccccg ctccccgggc tctcgcggtc2100gcacgaggat gcttctagag ggcccgttta aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc2160tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc2220cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg2280tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa2340tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg2400
gggctctagg gggtatcccc acgcgccctg tagcggcgca ttaagc 2446<210>21<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端Gly被乙酰化；第二個氨基酸可被Ile替換；第4個氨基酸可被Leu替換；第10個氨基酸可被Arg替換；第11個氨基酸可被Lys替換；第13個氨基酸可被Leu、Ile、Arg、Gln、Asn和Ser中的一個替換。
<400>21Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gly Arg Arg Cys1 5 10 15<210>22<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>接頭-1DNAC的5’端與Cys形成酯鍵<400>22ctaatacgac tcactat 17<210>23<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>接頭-2DNA<400>23gattatgctg agtgat 1權利要求
1.一種重組肽載體，該重組肽載體包含前導肽、接頭DNA和DNA構建體，該構建體是通過將表達控制序列與編碼融合蛋白的治療性基因可操作性地連接而形成的，在所述融合蛋白中CTLA4的胞外域與免疫球蛋白的Fc片段相結合，其中所述前導肽通過所述接頭DNA連接到所述DNA構建體的兩個末端。
2.如權利要求1所述的重組肽載體，其中所述前導肽由16個氨基酸組成。
3.如權利要求2所述的重組肽載體，其中第1位至第4位的氨基酸為帶有非極性脂肪族側鏈的氨基酸。
4.如權利要求3所述的重組肽載體，其中所述帶有非極性脂肪族側鏈的氨基酸選自Gly、Ala、Val、Leu和Ile。
5.如權利要求2所述的重組肽載體，其中第5位和第6位的氨基酸為帶有非離子極性側鏈的氨基酸。
6.如權利要求5所述的重組肽載體，其中所述帶有非離子極性側鏈的氨基酸選自Asn、Gln、Ser和Thr。
7.如權利要求2所述的重組肽載體，其中第7位氨基酸為Gly。
9.如權利要求2所述的重組肽載體，其中第8位至第12位的氨基酸為帶有堿性側鏈的氨基酸。
10.如權利要求9所述的重組肽載體，其中所述帶有堿性側鏈的氨基酸為Lys或Arg。
11.如權利要求2所述的重組肽載體，其中第13位的氨基酸為Gly。
12.如權利要求1所述的重組肽載體，其中所述前導肽具有SEQ IDNO21的氨基酸序列。
13.如權利要求1所述的重組肽載體，其中所述接頭DNA具有通過將SEQ ID NO22的堿基序列與SEQ ID NO23的堿基序列退火而形成的堿基序列。
14.如權利要求1所述的重組肽載體，其中所述DNA構建體和一條接頭DNA是通過該一條接頭DNA的5’末端的磷酸基團和治療性基因的3’末端的羥基之間的磷酸二酯鍵連接在一起的，所述前導肽和另一條接頭DNA是通過前導肽的C端的Cys和所述另一條接頭DNA的5’端的Cys之間的二硫鍵連接在一起的，并且所述兩條接頭DNA是退火在一起的，借此通過接頭DNA將DNA構建體的兩個末端與前導肽連接。
15.如權利要求1所述的重組肽載體，其中所述CTLA4和免疫球蛋白來自哺乳動物。
16.如權利要求15所述的重組肽載體，其中所述哺乳動物為人或狗。
17.如權利要求1所述的重組肽載體，其中所述表達控制序列包括啟動子、信號肽序列和聚腺苷酸化序列。
18.如權利要求17所述的重組肽載體，其中所述啟動子為來自巨細胞病毒的啟動子。
19.如權利要求17所述的重組肽載體，其中所述信號肽序列為來自人制瘤素M的分泌序列。
20.如權利要求17所述的重組肽載體，其中所述聚腺苷酸化序列來自牛生長激素，即BGH。
21.如權利要求1所述的重組肽載體，其中所述DNA構建體為SEQID NO12或SEQ ID NO20所示的堿基序列。
22.如權利要求1所述的重組肽載體，其中所述免疫球蛋白為IgA或IgG。
23.一種制備重組肽載體的方法，該方法包括以下步驟(1)將編碼CTLA4的胞外域的基因與編碼免疫球蛋白的Fc片段的基因連接，從而制備治療性基因；(2)將所述治療性基因和表達控制序列可操作性地連接，從而制備DNA構建體；(3)合成前導肽和接頭DNA，然后將所述前導肽和接頭DNA連接在一起，從而制備肽載體；和(4)通過接頭DNA將步驟(2)中得到的DNA構建體的兩個末端與所述前導肽連接。
24.如權利要求23所述的方法，其中通過一條接頭DNA的5’末端的磷酸基團和所述DNA構建體的3’末端的羥基之間的磷酸二酯鍵將所述DNA構建體和所述接頭DNA之一連接在一起，通過所述前導肽C端的Cys和所述另一條接頭DNA的5’端的Cys之間的二硫鍵將所述前導肽和另一條接頭DNA連接在一起，并將所述兩條接頭DNA退火在一起，借此通過所述接頭DNA將所述治療性基因的兩個末端與所述前導肽連接。
25.一種用于治療自身免疫疾病的組合物，該組合物包含藥學有效量的權利要求1～22任一項所述的重組肽載體和藥學可接受的載體。
26.如權利要求25所述的組合物，其中所述自身免疫疾病為系統性紅斑狼瘡。
全文摘要
本發明提供一種重組肽載體，該載體包含前導肽、接頭DNA和DNA構建體，該構建體是通過將表達控制序列與編碼融合蛋白的治療性基因可操作性地連接而形成的，在所述融合蛋白中CTLA4的胞外域與免疫球蛋白的Fc片段相結合，其中所述前導肽通過所述接頭DNA連接到所述DNA構建體的兩個末端。此外，本發明還提供制備所述重組肽載體的方法，以及用于治療自身免疫疾病的藥物組合物，該組合物包含藥學有效量的所述重組肽載體和藥學可接受的載體。
文檔編號A61K48/00GK1878867SQ200380110758
公開日2006年12月13日 申請日期2003年11月29日 優先權日2003年11月29日
發明者蔡瑩鎮, 崔恩華 申請人:蔡瑩鎮, 崔恩華