專利名稱：家畜用去勢疫苗基因及重組基因載體的制作方法
技術領域：
本發明動物去勢疫苗基因及重組基因載體，用于生產家畜家禽去勢用促黃體素釋放激素(LHRH)基因工程亞單位疫苗，屬于生物技術高科技領域。
(二)技術背景促黃體素釋放激素(Luteinizing hormore releasing hormore，LHRH)是由動物下丘腦分泌的一種十肽激素，其主要生物學功能是控制腦下垂體前葉細胞合成和分泌促黃體激素(LH)及促卵泡激素(FSH)，這些激素能促進性腺及性器官的正常發育，維持動物的生殖功能。去勢疫苗可免疫調控動物內分泌系統的性相關激素水平，抑制動物性器官發育，使動物喪失性行為和性功能，從而防止混亂交配(引起畜群退化)和爭斗，促進動物生長，改善胴體組成和肉質(使肉質鮮嫩并防止膻味)，提高飼料報酬。其機理是通過LHRH合成抗原或重組抗原作疫苗免疫動物后，在體內形成LHRH抗體，中和內源性LHRH，從而顯著降低睪酮及雌激素等性激素水平，達到溫和去勢的目的。與傳統手術去勢相比，疫苗去勢不僅簡便易行，給管理上帶來極大的方便，尤其適合于規模化養殖和放牧畜群，而且可防止手術去勢導致的出血、感染及應激造成的減食和體重下降，另外疫苗去勢可適用于大動物或小動物(雞等小動物手術較困難)、雌性或雄性動物、幼齡和成年動物、畜禽和其他動物，再者疫苗去勢可通過配套技術實現可逆性控制。
通過免疫方法促使動物產生抗LHRH的抗體，以中和LHRH的生理作用，從而抑制性腺的發育以達到去勢的目的，其可行性已被國內外許多學者證實，但大多數研究都集中在合成肽疫苗，雖然免疫效果顯著，終因成本太高而無法進入實際應用。王彩平等將LHRH/HBsAg融合蛋白在家蠶桿狀病毒中進行表達，但也因表達產量低，提純工藝繁瑣而未能推廣應用。
發明內容技術問題本發明的目的是設計動物去勢疫苗基因，構建能高效表達LHRH融合蛋白的動物去勢疫苗重組基因載體，可以用于研制高產、優質、高效、低成本、工藝簡便，適合規模生產、使用方便，而且安全性高，無殘留，無潛在危險的動物去勢基因工程疫苗，免疫動物，替代傳統的手術去勢。
技術方案 本發明所提供的動物去勢疫苗基因，其通式為5′--保護性堿基--限制性酶切位點--框架保證堿基--LHRH基因--終止子--限制性酶切位點--保護性堿基--3′其中，保護性堿基可以是A、T、G、C任選；限制性酶切位點是指Nco I、EcoR I、HindIII、Xho I、BamH I等限制性酶的切點；框架保證堿基可以是A、T、G、C任選；LHRH基因是指家畜LHRH基因，或者是家禽LHRH基因，或者是LHRH基因和家禽LHRH基因串聯。
上述動物去勢疫苗基因，例舉具體的基因序列如下家畜用去勢疫苗LHRH基因序列——L15′-GGCCATGGCTGAGCATTGGTCTTATGGCCTGCGCCCAGGTNcoITAATGAACTCGAGCA-3′終止子Xho I家禽用去勢疫苗LHRH基因序列——L25′-GGCCATGGCTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTNco ITAATGAACTCGAGCA-3′終止子 Xho I畜/禽通用去勢疫苗LHRH基因序列之1——L35′-GGCCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTNco IGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTTAATGAACTCGAGCA-3′終止子 Xho I畜/禽通用去勢疫苗LHRH基因序列之2——L45′-GGCCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTNco IGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTTAATGAACTCGAGCA-3′終止子 Xho I用上述動物去勢疫苗基因構建的重組基因載體，pET-32c LHRHn-N/X重組表達質粒，是通過以下方法構建獲得的1.LHRH基因片段的退火將人工合成的動物去勢疫苗基因片段的正鏈和負鏈，分別用滅菌超純水溶解成濃度為100pmol/μl(相當于1.82μg/μl)的溶液，各取2μl加入72μl超純凈水中混勻，置沸水浴中2min后緩慢冷卻至室溫，-20℃凍存備用；2.LHRH基因的酶切用NcoI及XhoI對退火后的LHRH基因進行雙酶切，酶切產物直接用于連接反應；3.pET-32c質粒的提取、酶切及回收pET-32c質粒的提取后，用NcoI及XcoI對pET-32c質粒進行雙酶切。取10μl酶切產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切大片段，置液氮中凍5min，而后置37℃水浴中融化，10000r/min離心10min，吸取上清-20℃凍存備用；4.連接DNA連接反應體系如下PET-32c雙酶切回收產物 2.5μlLHRH基因酶切產物 7.5μlDNA Ligation Kit Solution I 10μl上述混合物16℃反應30min后立即用于轉化；5.大腸桿菌DH5α感受態細胞的制備；6.轉化取10μl連接產物轉化200μl大腸桿菌DH5α感受態細胞，取200μl轉化產物涂布含Amp 50μg/ml的LB瓊脂平板，平板置37℃溫箱中培養18小時，挑取轉化后的單個菌落，接種含Amp的LB肉湯擴大培養后提取質粒，即為重組基因載體pET-32c LHRHn-N/X重組質粒。
有益效果 本發明所提供的動物去勢疫苗基因及其重組基因載體，可高效表達LHRH-Trx融合蛋白(表達量30％以上)，用于生產家畜家禽去勢用促黃體素釋放激素(LHRH)基因工程亞單位疫苗。由于鳥類和哺乳動物的LHRH有一個氨基酸不同，分別構建了表達鳥類、哺乳類及不同數量鳥類/哺乳類相間串聯的LHRH基因的重組表達質粒(Ll、L2、L3、L4)。經檢驗測試，本發明所提供的重組基因載體，在表達量、免疫原性、生產簡便性、去勢有效性、安全性、成本等各方面均符合產業化要求。用其制造疫苗，生產簡易，成本低廉，安全有效。4種質粒中，L1表達產物對家畜有效，L2對家禽有效，L3及L4家畜家禽通用，L4免疫產生期及免疫持續期等方面的效力又優于L3，可根據各種不同的應用需要加以選擇。
采用該工程體在實驗室條件下生產L1、L2、L3和L4苗樣各3批，其表達產量穩定，表達產物蛋白量均達菌體總蛋白量的30％以上。表達產物均穩定具有良好的免疫原性，表現在(1)表達產物與Sigma公司的LHRH標準抗體發生特異性反應；(2)免疫動物后能有效激發產生高效價的LHRH抗體，該抗體能在體外試驗中與LHRH發生特異性反應。共免疫小鼠210只，兔50只，土雞30只，豬640頭，貓6只，狗4只，免疫動物后均能有效激發抗體，性成熟期觀測，在性行為、性功能、性激素水平、性器官發育抑制等各方面綜合評定，可有效去勢，明顯改善肉質，并可明顯促進增重和提高飼料報酬。以公兔為例，免疫組平均睪丸重量為1.32±0.38g，對照組平均睪丸重為3.18±0.47g，組織學觀察證實，免疫組睪丸實質萎縮，多無精子形成能力(個別有精子，但活檢時沒有活力)。
A.正常對照兔睪丸組織切片B.表達產物免疫兔睪丸組織切片
1.1.家畜用疫苗LHRH基因序列——L15′-GGCCATGGCTGAGCATTGGTCTTATGGCCTGCGCCCAGGTNcoITAATGAACTCGAGCA-3′終止子XhoI1.2.家禽用疫苗LHRH基因序列——L25′-GGCCATGGCTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTNcoITAATGAAC TCGAGCA-3′終止子 XhoI1.3.畜/禽通用疫苗LHRH基因序列之1——L35′-GGCCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTNcoIGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTTAATGAACTCGAGCA-3′終止子 XhoI1.4.畜/禽通用疫苗LHRH基因序列之2——L45′-GGCCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTNcoIGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTTAATGAACTCGAGCA-3′終止子 XhoI2.LHRH基因克隆(
圖1)2.1.LHRH基因片段的退火將人工合成的動物去勢疫苗基因片段的正鏈和負鏈，分別用滅菌超純水溶解成濃度為100pmol/μl(相當于1.82μg/μl)的溶液，各取2μl加入72μl超純水中混勻，置沸水浴中2min后緩慢冷卻至室溫，-20℃凍存備用。
2.2.LHRH基因的酶切用NcoI及XhoI對退火后的LHRH基因進行雙酶切。酶切產物直接用于連接反應。
2.3.pET-32c質粒的提取、酶切及回收pET-32c質粒的提取用堿裂解法，參照文獻[美]J.薩姆布魯克等著，《分子克隆實驗指南》介紹的方法。用NcoI及XhoI對pET-32c質粒進行雙酶切。取10μl酶切產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切大片段，置液氮中凍5min，而后置37℃水浴中融化，10000r/min離心10min，吸取上清-20℃凍存備用。
2.4.連接DNA連接反應體系如下pET-32c雙酶切回收產物 2.5μlLHRH基因酶切產物 7.5μlDNA Ligation Kit Solution I 10μl上述混合物16℃反應30min后立即用于轉化。
2.5.感受態細胞的制備參照文獻[美]J.薩姆布魯克等著，《分子克隆實驗指南》介紹的方法制備大腸桿菌DH5α感受態細胞。
2.6.轉化取10μl連接產物轉化200μlDH5α感受態細胞，具體操作參照文獻[美]J.薩姆布魯克等著，《分子克隆實驗指南》介紹的方法進行。取200μl轉化產物涂布含Amp 50μg/ml的LB瓊脂平板，同時設未轉化的感受態細胞對照(陰性對照)及pET-32c質粒轉化的感受態細胞對照(陽性對照)。平板置37℃溫箱中培養18小時。
2.7.重組質粒的酶切篩選
pET-32c質粒多克隆位點有EcoRI及HandIII酶切位點，當插入LHRH基因后這兩個酶切位點應該消失，而NcoI和XhoI酶切位點仍然存在。據此原理，挑取轉化后的單個菌落，接種含Amp的LB肉湯擴大培養后提取質粒，分別用HindIII、EcoRI、NcoI及XhoI進行單酶切，挑選HindIII及EcoRI酶切位點消失而NcoI及XhoI酶切位點仍存在的陽性克隆。
2.8.重組質粒的序列測定挑選經酶切鑒定的重組質粒，以T7 Terminater primer作為測序引物，由寶生物工程(大連)有限公司進行序列測定。
3.pET-32c LHRHn-N/X重組質粒在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達3.1.BL21(DE3)感受態細胞的制備方法同1.2.5。
3.2.轉化用堿裂解法小量提取經序列測定的重組質粒及pET-32c質粒分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，方法同2.6。
3.3.重組質粒在BL21(DE3)中的表達挑取重組質粒轉化菌落接種5ml含Amp 50μg/ml的LB肉湯，37℃搖震培養過夜(轉速為250rpm，下同)，次日按1％接種量接種于30ml含Amp 50μg/min的LB肉湯中，于37℃搖床中培養至OD600達0.5左右，取出1ml菌液置Eppendorf管中2000r/min離心1min，棄上清于-20℃凍存備用，作為誘導前對照，其余培養物加入終濃度為1mM的IPTG進行誘導表達3-4小時，取1ml誘導后菌液同樣離心棄上清保留沉淀。同時對pET-32c質粒轉化菌進行同樣操作作為對照。
3.4.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將誘導前菌體，誘導后重組質粒轉化菌及誘導后pET-32c載體質粒轉化菌沉淀用蒸餾水重懸加等體積的2×載體buffer，煮沸5min，各取10μl進行不連續SDS-PAGE(濃縮膠5％，分離膠13％)。電泳結束后，凝膠用考馬斯亮藍(R250)進行染色。用凝膠成像處理系統進行條帶灰度掃描，測定表達融合蛋白與菌體總蛋白之比。
3.5.表達蛋白的可溶性將LHRH-pET-32c質粒轉化菌過夜培養物按1％接種量接種100ml LB肉湯，37℃搖床培養至OD600＝0.5左右時，加入IPTG至終濃度1mM，繼續培養4h后，離心棄上清，全部菌體沉淀用10ml PBS(pH7.4)重懸，超聲波破碎(冰浴)5min，超聲功率為240W，離心后將上清轉移至另一容器中，沉淀用10ml PBS重懸，各取50μl上清及沉淀懸液加入等體積的2×載樣buffer，進行SDS-PAGE；同時，對pET-32c質粒轉化菌進行上述同樣操作作對照。另外設未用超聲波裂解的全菌對照。對凝膠進行灰度掃描確定目的蛋白的含量。
4.LHRH-Trx融合蛋白的免疫原性鑒定4.1.試驗動物小鼠200只，兔50只，土雞30只，豬600頭，貓6只，狗4只。
4.2.免疫方案將表達產物用弗氏佐劑及白油佐劑等配制疫苗，通過皮內注射和肌肉注射等免疫途徑注射動物，免疫劑量0.2-2ml不等，視動物體重大小而定。一般在動物性成熟前免疫。
4.3.免疫動物性功能及性器官檢查4.3.1.性功能檢查在性成熟期后，將試驗動物與同種異性健康成年動物合養，觀察性行為、性征及繁殖能力等情況。
4.3.2.性腺、性器官檢查剖解檢查，采集睪丸、卵巢，其一立即置中性福爾馬林中固定，作組織切片分析，其二稱重、測量大小和檢查睪丸有無精子及精子活力等。
結果分析1.四種能穩定、高效表達LHRH-Trx融合蛋白的重組質粒構建了表達鳥類、哺乳類及不同數量鳥類/哺乳類相間串聯的LHRH融合蛋白的4種重組表達質粒。序列分析表明基因合成和插入正確。質粒經保存后多次轉化大腸桿菌，表達量及表達產物的免疫原性均很穩定，表達水平始終在菌體總蛋白的30％以上。
2.可溶性的表達產物實現了LHRH-Trx融合蛋白的可溶性表達，表達產物幾乎完全以可溶性形式存在(而非包涵體)。用滲透休克方法對LHRH融合蛋白及pET-32c載體蛋白進行提取，結果LHRH重組菌經高滲處理后能將LHRH-Trx融合蛋白單一地釋放出來，而且純度達90％以上，而pET-32c空載體蛋白仍存在于菌體中不能釋放出來。為提取和純化表達產物制備疫苗提供了極大的方便。
3.表達產物有很強的LHRH抗原性表達產物和LHRH抗體有很好的反應性，該反應能被LHRH標準品阻斷；免疫動物能有效激發LHRH抗體，中和內源性LHRH，從而顯著降低睪酮及FSH等性激素水平，達到溫和去勢的目的，而且，疫苗免疫可防止手術去勢導致的出血、感染及應激造成的減食和體重下降。
權利要求
1.家畜用去勢疫苗LHRH基因，其具體的基因序列如下5′-GGCCATGGCTGAGCATTGGTCTTATGGCCTGCGCCCAGGTNcoITAATGAACTCGAGCA-3′終止子 XhoI
2.含權利要求1所述家畜用去勢疫苗基因的重組表達載體，是通過以下方法構建獲得的2.1LHRH基因片段的退火人工合成的家畜用去勢疫苗基因片段L15′-GGCCATGGCTGAGCATTGGTCTTATGGCCTGCGCCCAGGTNcoITAATGAACTCGAGCA-3′終止子 XhoI將人工合成的家畜用去勢疫苗基因片段的正鏈和負鏈，分別用滅菌超純溶解成濃度為100pmol/l的溶液，各取2μl加入72μl超純水中混勻，置沸水浴中2min后緩慢冷卻至室溫，-20℃凍存備用；2.2 LHRH基因的酶切用NcoI及XhoI對退火后的LHRH基因進行雙酶切，酶切產物直接用于連接反應；2.3 pET-32c質粒的提取、酶切及回收pET--32c質粒的提取后，用NcoI及XhoI對PET-32c質粒進行雙酶切。取10μl酶切產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切大片段，置液氮中凍5min，而后置37℃水浴融化，10000r/min離心10min，吸取上清-20℃凍存備用；2.4連接DNA連接反應體系如下PET-32c雙酶切回收產物 2.5μlLHRH基因酶切產物7.5μlDNA Ligation Kit Solution I 10μl上述混合物16℃反應30min后立即用于轉化；2.5.大腸桿菌DH5α感受態細胞的制備；2.6轉化取10μl連接產物轉化200μlDH5α感受態細胞，取200μl轉化產物涂布含Amp 50μg/ml的LB瓊脂平板，平板置37℃溫箱中培養18小時，挑取轉化后的單個菌落，接種含Amp的LB肉湯擴大培養后提取質粒，即為重組質粒。
全文摘要
本發明家畜用去勢疫苗基因及重組基因載體，用于生產家畜家禽去勢基因工程亞單位疫苗，屬于生物技術高科技領域。其方法如下人工合成畜用、禽用或畜禽通用的LHRH基因片段，其5′端和3′端分別加有NcoI和XhoI酶切位點，插入pET－32c質粒，構建成4種表達LHRH－Trx融合蛋白的pET－32c LHRHn－N/X重組質粒。將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，表達產物為可溶性蛋白，便于提取純化，家畜、家禽通用，免疫雞、豬、羊、兔、犬、貓等動物，可有效去勢。圖為重組質粒pET－32c LHRHn(L1、L2、L3、L4)－N/X的構建。
文檔編號C07H21/04GK1436789SQ02155220
公開日2003年8月20日 申請日期2002年12月10日 優先權日2002年12月10日
發明者吉傳義, 杜念興, 朱杰青, 龔光明, 王凌, 龔曉明 申請人:成都瑞盛高科技有限責任公司