專利名稱：作為免疫疾病治療劑的可溶性淋巴毒素－β受體和抗淋巴毒素受體及配體的抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及包括“淋巴毒素-β受體阻滯劑”的組合物和方法，其阻礙淋巴毒素-β受體的信號傳導。淋巴毒素-β受體的阻滯劑用于治療淋巴細胞介導的免疫疾病，特別是阻礙Th1細胞介導的免疫應答。本發明涉及淋巴毒素-β受體胞外結構域的可溶形式，這一結構域可作為淋巴毒素-β受體的阻滯劑。本發明也涉及抗淋巴毒素-β受體或其配體表面淋巴毒素的抗體的應用，它可作為淋巴毒素-β受體的阻滯劑。本發明還提供了選擇可溶性受體、抗體和其它阻礙LT-β受體信號傳導的試劑的一種新的篩選方法。
當一個免疫攻擊開始時所釋放的細胞因子的類型可能影響接下來的選擇活化哪些免疫效應途徑。免疫效應細胞機制的選擇由CD4-陽性的輔助性T淋巴細胞(輔助性T細胞或Th細胞)來決定。Th細胞與抗原呈遞細胞(APC)相互作用，抗原呈遞細胞在其表面展示與MHC II類分子結合的被加工的外源抗原的肽段。當Th細胞識別展現在適當的APC細胞表面的外源抗原的特殊表位時，它們就被活化，表達一種特異受體。接著活化的Th細胞分泌細胞因子(淋巴因子)，這些因子激活相應的免疫效應機制。
Th細胞能夠活化各種各樣的效應機制，包括殺傷性T細胞的活化、B細胞抗體的產生和巨噬細胞的活化。效應機制的選擇主要由活化了的Th細胞所產生的細胞因子決定。
根據Th細胞的細胞因子分泌類型可將其分為三個亞類(Fitch等，Ann.Rev.Immunol.，11，pp.29-48(1993))，稱為Th0、Th1和Th2。在小鼠中，非激活的“天然”輔助性T細胞產生IL-2。短期的刺激導致產生Th0前體細胞，它產生的細胞因子范圍很廣，包括IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-10。慢性刺激可使Th0細胞轉變為Th1或Th2細胞類型，此時細胞因子的表達類型也改變了。
一些細胞因子Th1和Th2細胞都釋放(例如，IL-3、GM-CSF和TNF)。另一些細胞因子只由一種Th細胞亞類制造。輔助性T細胞亞類的專一性效應最初是在小鼠中被認識的。在人類中也存在輔助性T細胞的類似分類(Romagnani等，Ann.Rev.Immunol.，12，pp.227-57(1994))。
Th1細胞產生LT-α、IL-2和IFN-γ。在人類中，細胞因子分泌的Th1類型通常是與細胞免疫和抵抗感染相聯系的。Th1細胞因子傾向于激活巨噬細胞和某些炎癥反應，例如IV類“遲發型”超敏反應(見下)。Th1細胞因子在組織移植和器官移植的細胞排斥中起重要作用。
Th2細胞產生細胞因子IL-4、IL-5、IL-6和IL-10。Th2細胞因子提高噬酸性粒細胞和肥大細胞的產生和促進B細胞的完全擴張和成熟(Howard等，“T細胞產生的細胞因子和它們的受體”，基礎免疫學(Fundamental Immunology)，第三版，Raven Press，紐約(1993))。Th2細胞因子也可以加強抗體的產生，包括與變態反應相關的IgE抗體和抗移植的抗體。Th2細胞也可以參與對持續性抗原的免疫抑制和耐受。
Th1和Th2相關的細胞因子在特定的超敏反應-接觸以前遇到過的抗原而引發的不恰當的或不均衡的免疫應答-中起作用。有四種已識別的超敏反應類型(Roitt等，免疫學(Immunology)，pp.19.1-22.12(Mosby-Year Book Europe Ltd.，3d ed.1993))。
I型“速發性超敏反應”包括變應原介導的Th2細胞活化和Th2細胞因子釋放。Th2細胞因子IL-4刺激B細胞經過同種型轉換產生IgE，激活肥大細胞產生急性炎癥反應，例如導致濕疹、哮喘和鼻炎。
II和III型超敏反應是由抗細胞表面或特異性組織抗原(II型)或可溶性血清抗原(III型)的IgG和IgM抗體引發的。這些類型的超敏反應認為不是由Th細胞介導的。
IV型“遲發型”超敏反應(DTH)是Th1細胞介導的。DTH反應發展要花12個小時以上，因為它在小鼠中的轉移是通過轉移Th1細胞而不能只用血清，所以又被稱為是“細胞介導的”。IV型DTH反應通常又被分為三類接觸型、結核菌素型和肉芽腫型超敏反應。
許多能引起疾病的細胞介導的反應是可以通過從染病的小鼠轉移淋巴細胞到健康小鼠身上而誘發的(例如，胰島素依賴性糖尿病和實驗自身免疫腦炎)。這一特征將IV型DTH與其他三種類型的超敏反應區別開，其他三種類型是主要由抗體引起的體液免疫應答，可以經無細胞血清轉移而得。
輔助性T細胞也參與新生免疫球蛋白同種型轉換的調節。不同的Th亞類可以影響免疫攻擊產生的給定的同種型免疫球蛋白的相對比例。例如，Th2細胞因子IL-4可以將活化的B細胞轉變為IgG1同種型而抑制其他的同種型。正如上面所討論的，在I型超敏反應中IL-4也激活IgE的過量產生。Th2細胞因子IL-5誘導IgA同種型。這些Th2細胞因子對同種型轉換的影響由Th1細胞產生的IFN-γ來抗衡。
Th1和Th2細胞分泌的不同類型的細胞因子介導不同免疫效應機制。激活細胞介導的或體液效應機制的轉變通過Th1和Th2細胞之間的交叉抑制而致敏Th1細胞產生的IFN-γ阻礙Th2細胞的增殖，而Th2細胞分泌的IL-10減少Th1細胞分泌細胞因子。
基于細胞因子與其靶分子的相對親和性，Th1和Th2的負調節循環可以擴增Th1和Th2細胞因子之間的很小的濃度差別造成的影響。一個被擴增了的Th1或Th2細胞因子信號可以在Th1和Th2細胞因子的相對濃度發生小變化的基礎上開啟細胞介導的或體液的效應機制之間的轉變。這種通過調節Th1和Th2細胞因子的相對濃度而控制該轉變的能力對于治療各種導致免疫紊亂和疾病的Th1和Th2細胞依賴性的免疫反應中的不平衡將很有幫助。
病理性Th1反應與大量器官特異性的和系統的自身免疫情況、慢性炎癥和遲發型超敏反應有關。正如上面討論的、Th1反應也與細胞反應有關，導致被移植的組織和器官的排斥反應。
目前，對各種基于Th1細胞的免疫不良狀態的治療通常采用免疫調節劑和免疫抑制劑，以及各種機理不明的藥物(例如，金或青霉胺)。現在常用的三種免疫抑制劑是類固醇、環孢菌素和硫唑嘌呤。
類固醇是多向性的抗炎癥試劑，它能抑制活化的巨噬細胞和在逆轉Th1細胞因子IFN-γ許多效應的途徑中抑制抗原呈遞細胞的活性。環孢菌素-一種強免疫抑制劑-抑制細胞因子的產生和減少淋巴細胞在活化過程中IL-2受體的表達。硫唑嘌呤是一種抗增殖劑，它抑制DNA的合成。這些非特異性的免疫抑制劑通常需要大劑量使用，這就提高了它們的毒性(例如，腎毒性和肝毒性)并引起有害的副作用，因此不適合用于長期的治療。
為了決用非特異性免疫抑制劑進行傳統治療所引起的問題，目前許多治療策略的目標是選擇免疫系統的某些方面進行抑制或活化。一個特別具有吸引力的方向是控制Th1和Th2細胞因子之間的平衡，從而操縱細胞介導的和體液的效應機制之間的平衡。
為了完成細胞介導的和體液的效應機制之間的轉移，能夠調節可以改變Th1和Th2細胞亞類相對活性的分子的活性是很有幫助的。這樣的分子的候選者包括細胞因子和它們的受體。最近的資料表明，LT-α、IL-12，IFN-α和IFN-γ促進Th1反應的發展，而IL-1和IL-4極化朝向Th2效應機制的反應(Romagnani等，Ann.Rev.Immunol.，12，pp.227-57(1994))。
許多Th細胞因子是免疫發展和功能的多效性調節物，阻止它們的產生將對非T細胞介導的反應產生有害作用。選擇性調節Th1和Th2效應機制之間的選擇的合適而有效的目標還未確定。
本發明通過提供治療免疫疾病的藥物組合物和方法，用淋巴毒素-β受體的阻滯劑阻止淋巴毒素-β受體(LT-β-R)的信號傳導，從而解決上面提出的問題。特別是這些包括LT-β-R阻滯劑的組合物和方法對于阻止Th1細胞介導的免疫疾病如炎性腸綜合癥很有幫助。
一種實施方案是提供淋巴毒素-β受體的胞外結構域的可溶形式作為LT-β-R阻滯劑。這一實施方案的優選組合物和方法包括重組的淋巴毒素-β受體的融合蛋白，它把LT-β-R胞外配體結合區域與免疫球蛋白的重鏈恒定區相融合。更優選的是將LT-β-R配體結合區域融合到人的IgG Fc區域上。
本發明的另一實施方案是提供抗體作為LT-β-R阻滯劑。這一方案的優選組合物和方法包括抗淋巴毒素-β受體的一種或多種抗體。更優選是單克隆抗體。這一方案其他的優選組合物和方法包括抗表面淋巴毒素的一種或多種抗體。該抗體更優選是抗淋巴毒素-β的單克隆抗體。
本發明進一步提供一種選擇LT-β-R阻滯劑-例如LT-β-R的可溶性形式、抗LT抗體和抗LT-β-R抗體-的新的篩選方法。這一篩選方法包括進行監測LT-β-R信號傳導的腫瘤細胞毒性實驗。在腫瘤細胞毒性實驗中利用當一種LT-β-R激活劑(例如LT-α1/β2)出現時，人類腺癌細胞對配體或抗體誘導的LT-β-R信號傳導的敏感性增強這一現象。
LT-β-R阻滯劑阻止腫瘤細胞上的LT-α/β異聚體(或其他的LT-β-R激活劑)的細胞毒效應。用于測試推定的LT-β-R阻滯劑的方法以抗LT-β-R抗體(在有LT-β-R激活劑LT-α1/β2存在的情況下)為例加以說明，包括下面幾個步驟1)腫瘤細胞(例如HT29人類腺癌細胞)在含有IFN-γ和純化的LT-α1/β2的培養基中在有或無待測的抗LT-β-R抗體存在下培養幾天，2)用染活細胞的染料處理細胞；3)計數染上顏色的細胞以確定當LT α1/β2、IFN-γ和試驗抗-LT-β-R抗體存在下每個樣品中被殺死的腫瘤細胞所占的比例。另一種可選擇的方法是，用許多熟知的測定細胞存活力實驗中的一種，例如3H-胸腺嘧啶摻入DNA的實驗確定存活細胞的數目。在這個實驗中若抗LT-β-R抗體(或抗體組合物)至少能使被殺死的腫瘤細胞的百分數下降20％，則它是一種本發明范圍內的LT-β-R阻滯劑。
單獨或聯合使用LT-α/β異聚體和其他的LT-β-R激活劑可以進行細胞裂解實驗。這一實驗也可以按要求改造，以鑒定新的LT-β-R阻滯劑。
圖1編碼配體結合區域的人類LT-β受體胞外部分的序列。
圖2偶聯到人類IgG1 Fc區域上的可溶性鼠LT-β受體(mLT-β-R-Fc)，在小鼠WEHI 164細胞中阻止可溶性小鼠LT-α/β配體誘導的LT-β-R信號傳導。增大LT配體(mLT-α/β)濃度可以殺死WEHI 164細胞。可溶性mLT-β-R-Fc(10μg/ml)阻止這種LT配體誘導的細胞死亡。可溶性的鼠TNF受體融合蛋白(p55TNF-R-Fc)對阻止LT-α/β激活的細胞死亡具有很小的作用。三天之后通過測定反應了的MTT的光密度(OD 550)值可測量生長狀況，該值與細胞數目成比例。
圖3抗人LT-β-R的抗體(BDA8 mAb)阻止可溶性LT配體與人細胞表面的LT-β-R之間的相互作用。WiDr腫瘤細胞的生長被IFN-γ和可溶性LT-α1/β2配體聯合抑制。抗LT-β-R抗體BDA8阻礙LT-α1/β2配體抑制WiDr腫瘤細胞生長的能力。實心符號顯示了IgG1對照mAb(10μg/ml)存在下細胞的生長。空心符號顯示了抗LT-β-R mAb BDA8(10μg/ml)的效應。
圖4抗人LT-β(B9 mAb)的抗體阻止細胞表面的LT-α/β配體與可溶性LT-β受體(hLT-β-R-Fc；2μg/ml)之間的相互作用。用藻紅蛋白標記的驢抗人IgG和FACS分析可測定表面結合的LT-β-R-Fc。所得峰的平均熒光強度被繪制出來作為通道數。虛線顯示了缺乏B9 mAb時與結合的受體數量相符的平均熒光強度。
圖5LT-β-R阻滯劑(mLT-β-R-Fc)在接觸型遲發性超敏反應(DTH)的小鼠模型的耳腫大中的效應。這個圖顯示了0.2％DNFB抗原攻擊到致敏小鼠的耳上后24小時中耳朵厚度的增加。每種符號代表不同的實驗。所有的實驗除了用菱形劃邊界線的每點只用了四個動物外，其余的每點都用了七到八個動物。用緩沖液(PBS)和20mg/kg的對照IgG融合蛋白(LFA3-Fc)處理的小鼠作為陰性對照。用8mg/kg抗VLA4 mAb(PS/2 mAb)處理的小鼠作為陽性對照，這種抗體阻止接觸型DTH耳腫大。
圖6用mLT-β-R-Ig和hLFA3-Ig融合蛋白處理后14天觀察到的小鼠的重量變化圖。
圖7用mLT-β-R-Ig和hLFA3-Ig融合蛋白處理后14天觀察到的小鼠結腸長度的變化圖。
圖8注射了CD4RBlowCD4陽性T細胞、CD45RBhighCD4陽性T細胞、CD45RBhigh和LT β R-Ig及CD45RDhigh和hLFA3-Ig后小鼠體重的時間曲線。
圖9圖示在圖8-11的處理后觀察到的體重平均值和標準偏差。
圖10表示用陽性和陰性對照及mLT β R-Ig注射后小鼠腳墊厚度的增加。
為了很完整地理解所描述的發明，給出下面的詳細說明。
術語“細胞因子”指介導細胞之間相互作用的分子。“淋巴因子”是淋巴細胞釋放的細胞因子。
術語“輔助性T細胞”指T細胞的一個功能亞類，它幫助產生細胞毒性T細胞和與B細胞共同作用刺激抗體產生。輔助性T細胞識別與II類MHC分子結合的抗原。
術語“Th1”指輔助性T細胞的一個亞類，它產生LT-α、干擾素-γ和IL-2(及其他細胞因子)，并引發與抗攻擊的細胞應答(例如非免疫球蛋白的應答)相關的炎癥反應。
術語“Th2”指輔助性T細胞的另一亞類，它產生的細胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，與免疫攻擊的免疫球蛋白(體液)應答相關。
術語“細胞介導的”指那些起因于T細胞和其產物的直接效應而產生應答的免疫事件。這種類型的應答通常(并非完全)與T細胞的Th1類相關。不包括在這一類中的是T細胞在B細胞分化和擴張上的輔助作用，這一作用通常與T細胞的Th2類有關。
術語“遲發型超敏反應(DTH)”指以對抗原的緩慢應答為特征，1-3天才表現出它完全的效應的免疫應答。這種慢速應答是與在免疫球蛋白介導的(體液的)變態反應中看到的相對快的應答相比而言的。有三種類型的DTH反應接觸型超敏反應、結核菌素型超敏反應和肉芽腫反應。
術語“免疫球蛋白應答”或“體液應答”指動物對外源抗原的免疫應答，產生外源抗原的抗體。輔助性T細胞的Th2類對于高親和力抗體的有效生產是必需的。
術語抗體的“Fc區域”指抗體分子的一部分，包括絞鏈區、CH2和CH3區域，但缺少抗原結合部位。這個術語意味著也包括IgM或其他抗體同種型的等價區域。
術語“抗LT-β受體抗體”指至少能特異性結合LT-β受體的一個表位的任何抗體。
術語“抗LT抗體”指至少能特異性結合LT-α、LT-β或LT-α/β復合物的一個表位的任何抗體。
術語“LT-β-R信號傳導”指與LT-β-R途徑相關的分子反應和從此導致的接下來的分子反應。
術語“LT-β-R阻滯劑”指能減少配體結合LT-β-R、細胞表面的LT-β-R聚族或LT-β-R信號傳導的試劑，或者指能影響LT-β-R信號在細胞內如何作用的試劑。
作用于配體-受體結合步驟的LT-β-R阻滯劑至少能抑制LT配體結合LT-β-R 20％。作用于配體-受體結合步驟之后的LT-β-R阻滯劑至少能抑制LT-β-R在腫瘤細胞上活化的細胞毒作用20％。LT-β-R阻滯劑的例子包括可溶性LT-β-R-Fc分子和抗LFα、抗LT-β、抗LT-α/β及抗LT-β-R的抗體。優選這些抗體與LT-α的分泌形式沒有交叉反應。
術語“LT-β-R生物活性”指1)LT-β-R分子或衍生物與可溶性或表面LT配體結合競爭可溶性或表面LT-β-R分子的能力；或2)與天然LT-β-R分子一樣的刺激免疫應答或細胞毒活性的能力。
術語“LT-α/β異聚體”和“LT異聚體”指在至少一個LT-α和一個或多個LT-β亞單位之間的穩定結合，包括一個或多個亞單位的可溶性的、突變的、改變了的和嵌合的形式。這些亞基可以通過靜電力、范德華力或共價相互作用結合。優選LT-α/β異聚體至少有兩個鄰近的LT-β亞單位并缺少鄰近的LT-α亞單位。當LT-α/β異聚體在細胞生長測試中作為一個LT-β-R激活劑時優選是可溶的并具有化學計量關系的LT-α1/β2。可溶的LT-α/β異聚體缺少穿膜結構域，能被工程化表達LT-α和或LT-β亞單位的適當宿主細胞分泌(Crowe等，免疫學方法雜志(J.Immund.Methods)，168，pp.79-89(1994))。
術語“ LT配體”指能特異性結合LT-β受體的LT異聚體或其衍生物。
術語“LT-β-R配體結合區域”指涉及LT配體的特異性識別和與LT配體相互作用的LT-β-R的部分。
術語“表面LT-α/β復合體”和“表面LT復合體”指由LT-α和膜結合的LT-β亞單位-包括一個或多個亞單位的突變體、改變了的和嵌合的形式-組成的復合體，它展示在細胞表面。“表面LT配體”指能特異性結合LT-β受體的表面的LT復合體或其衍生物。
術語“受試者”指一個動物或一個或多個由動物而來的細胞。優選動物是哺乳動物。細胞可以任何形式存在，包括但不僅限于保留在組織中的細胞，細胞簇，無限增殖化的、轉染的或轉化的細胞，以及由發生了物理或表型改變的動物而來的細胞。
腫瘤壞死因子(TNF)相關的細胞因子是作為一個宿主防御和免疫調節的多效媒介的大家族而出現的。這一家族的成員以膜結合的形式存在，通過細胞與細胞的接觸原位發揮作用，或者作為分泌蛋白作用于遠距離的目標。TNF相關受體的一個平行家族與這些細胞因子反應，開啟包括細胞死亡、細胞增殖、組織分化和促炎應答在內的各種途徑。
TNF、淋巴毒素-α(LT-α，也叫TNF-β)和淋巴毒素-β(LT-β)是TNF配體家族的成員，這一家族也包括Fas、CD27、CD30、CD40、DX-40和4-1BB受體的配體(Smith等，細胞(Cell)，76，pp-959-62(1994))。TNF家族的若干成員-包括TNF、LT-α、LT-β和Fas-的信號傳導能誘導腫瘤細胞經壞死或凋亡(程序性細胞死亡)而死亡。在非致瘤性細胞中，TNF和許多TNF家族配體-受體相互作用影響了免疫系統的發育和對各種免疫攻擊的應答。
大多數TNF家族的配體是以膜結合的形式在細胞表面發現的。在人類中，發現TNF和LT-α有分泌的和膜結合的表面形式。表面TN具有跨膜區域，可以被蛋白水解切斷后產生分泌的形式。相比之下，表面LT-α缺乏跨膜區域。膜相關的LT-α作為異聚體與LT-β(一個相關的跨膜多肽)一起，以LT-α/β復合體的形式連在細胞表面。
大多數膜結合的LT-α/β復合體(“表面LT”)具有LT-α1/β2的化學計量關系(Browning等，細胞，72，pp.847-56(1993)；Browning等，免疫學雜志，154，pp.33-46(1995))。表面LT配體不與TNF-R高親和力結合，不激活TNF-R信號傳導。另一個TNF相關的受體被稱為LT-β受體(LT-β-R)，它與這些表面淋巴毒素復合體高親和力結合(Crowe等，科學(Science)，264，pp.707-10(1994))。
LT-β-R信號傳導與TNF-信號傳導一樣，具有抗增殖效應和對腫瘤細胞有細胞毒作用。在本申請人的共同未決美國申請流水號0/378,968中，用LT-β-R激活劑選擇性刺激LT-β-R的組合物和方法被披露了。LT-β-R激活劑對于不同時活化TNF-R誘導的促炎或免疫調節途徑時抑制腫瘤細胞的生長是有幫助的。
在非腫瘤細胞中，TNF或TNF相關的細胞因子在種種免疫應答中廣泛發揮活性。TNF和LT-α配體都與TNF受體(p55或p60和p75和p80，這里稱為TNF-R)結合并活化之。TNF和LT-α是巨噬細胞在對微生物感染的早期和快速應答中產生的，這種應答可提高巨噬細胞和嗜中性白細胞的殺微生物活性。巨噬細胞或細胞毒性T淋巴細胞(CTL或“殺傷性T細胞”)產生的TNF和LT-α結合到靶細胞表面的TNF受體上并啟動敏感細胞的死亡。
TNF和TNF相關的細胞因子也能應答于感染或應激而啟動炎癥級聯反應。TNF、LT-α和IFN-γ的釋放改變了血管內皮細胞與特定淋巴細胞類型之間的粘連性質。增強粘連促進吞噬細胞和白細胞從血流遷移到炎癥部位周圍的組織中。類似的炎癥反應在組織移植和器官移植的細胞排斥以及某些免疫紊亂中扮演了主要角色。
細胞表面淋巴毒素(LT)復合體已經在CD4+T細胞雜交瘤細胞(II-23.D7)中鑒定了，該細胞表達高水平的LT(Browning等，免疫學雜志，147，pp.1230-37(1991)；Androlewicz等，生物學化學雜志(J.Biol.Chem)，267，pp.2542-47(1992))。LT-β-R、LT亞單位和表面LT復合體的表達和生物角色參見C.F.Ware等。“淋巴毒素系統的配體和受體”，刊于《細胞裂解途徑，微生物學免疫學當今話題》(Pathwaysfor Cytolysis，Current Topics Microbiol.Immunol.)Springer-Verlag，pp.175-218(1995)。
LT-α的表達是可被誘導的，主要由活化的T、B淋巴細胞和自然殺傷(NK)細胞分泌。在輔助性T細胞亞類中，LT-α由Th1而不是由Th2細胞產生。LT-α在黑素細胞中也被檢測到了。多發性硬化病人病灶中的小神經膠質細胞和T細胞也可以用抗LT-α的抗血清染色。
淋巴毒素-β(也叫p33)已經在T淋巴細胞、T細胞系、B細胞系和淋巴因子激活的殺傷性細胞(LAK)的表面鑒定了。LT-β是本申請人的共同未決國際申請PCT/0591/04588的主題，1992年1月9日以WO92/00329出版，也是PCT/US93/11669的主題，1994年6月23日以WO94/13808出版，引入這里以供參考。
表面LT復合體主要由活化的T、B淋巴細胞和自然殺傷細胞(NK)表達，正如FACS分析或者利用抗LT-α抗體或可溶性LT-β-R-Fc融合蛋白的免疫組織學確定的那樣。關于下述細胞，表面LT也已被描述了人類細胞毒性T淋巴細胞(CTL)克隆、活化的外周單核淋巴細胞(PML)、IL-2活化的外周血淋巴細胞(LAK細胞)、美洲商陸促有絲分裂因子活化的或抗CD40活化的外周B淋巴細胞(PBL)和T、B細胞系的各種淋巴系統腫瘤。帶有同種異體抗原的靶細胞的接觸特異性地誘導CD8+和CD4+CTL克隆表達表面LT。
LT-β受體是TNF受體家族的一個成員，它特異性地結合表面LT配體。LT-β-R結合LT異聚體(主要是LT α1/β2和LT-α2/β1)，但不結合TNF或LT-α(Crowe等，科學，264，pp.707-10(1994))。LT-β-R信號傳導可以在外周淋巴系統器官的發育和體液免疫應答方面起作用。
關于LT-β-R表達的研究處于早期階段。LT-β-R mRNA在人脾、胸腺和其他主要器官中找到了。LT-β-R的表達方式類似于報道的p55-TNF-R的方式，但外周血T細胞和T細胞系缺少LT-β-R。
可溶性LT復合體的產生可溶性LT-α/β異聚體包括LT-β亞單位，它已由膜結合的形式變為可溶形式。這些復合體在本申請人的共同未決國際申請(PCT/US93/11669，1994年6月23日以WO94/13808出版)中詳細描述了。可溶性LT-β多肽用淋巴毒素-β的氨基酸序列確定，根據Browning等的編號系統(細胞，72，pp.847-56(1993))，該序列在跨膜區域的末端(即在大約氨基酸#44)和第一個TNF同源區(即在氨基酸#88)之間任一點被切斷。
可溶性LT-β多肽可以通過截去LT-β的N末端而去除胞質尾和跨膜區而產生(Crowe等，科學，264，pp.707-710(1994))。另一選擇是，跨膜結構域可以經缺失而失活，或者用親水氨基酸取代組成跨膜結構域的正常的疏水性氨基酸殘基而失活。在這兩種情況下都創造了一個基本親水的親水性分布圖，降低了脂親合力而提高了水溶性。缺失跨膜結構域比用親水性氨基酸殘基替代更好一些，因為它避免了引入潛在的免疫原性表位。
已缺失或失活的跨膜結構域可以用I型前導序列取代或連上此序列(例如VCAM-1前導肽)，這樣該蛋白從Val 40到pro88的任何一處開始被分泌出來。可溶性LT-β多肽可以在N末端包含任何數目的已知的前導序列。這樣的序列應允許多肽表達并導向真核系統的分泌途徑。參見，例如Ernst等，美國專利號5,082,783(1992)。
可溶性LT-α/β異聚體可以通過用編碼LT-α和可溶性LT-β的DNA共轉染一個合適的宿主細胞而產生(Crowe等，免疫學方法雜志(J.Immunol.Methods)，168，pp.79-89(1994))。缺乏LT-α而分泌的可溶性LT-β是高度寡聚的。但是，當與LT-α一起表達時形成一個包含二種蛋白的70KDa的三聚體狀結構。也可以用一個編碼可溶性LT-β多肽的基因轉染通常只表達LT-α的細胞系(例如上面討論的RPMI 1788細胞)，從而產生可溶性LT-α1/β2異聚體。
LT-α和LT-β多肽可以分別合成，用溫和的去污劑變性，混和在一起再除去去污劑復性，形成可被分離的混合的LT異聚體(見下)。
LT-α1/β2復合體的純化用TNF和LT-β受體作為親和純化試劑層析將可溶性LT-α1/β2異聚體從共表達的具有不同亞單位計量關系的復合體中分離出來。TNF受體只結合在LT復合體的α/α裂隙中。LT-β受體與LT-α/β異聚體的β/β裂隙高親和力結合，與α/β裂隙低親和力結合。因此，LT-α3和LT α2/β1將結合TNF-R。LT-β-R也結合LT-α2/β1三聚體(在α/β裂隙中)但不能結合LT-α3。另外，LT-β-R(并非TNF-R)結合LT α1/β2和LT-βn(這樣的制劑的確切組成未知，但它們是很大的集合體)。
受體親和試劑可以制備成可溶性的胞外結構域(例如見Loetscher等，生物學化學雜志，266，pp.18324-29(1991))或者為胞外配體結合區域偶聯到一個免疫球蛋白Fc區域上的嵌合蛋白(Loetscher等，生物學化學雜志，266.pp.18324-29(1991)；Crowe等，科學，264，pp.707-710(1994))。以常規的方法用化學交聯將受體偶聯到親和基質上。
有二種方案利用受體和免疫親和層析可以純化LT-α1/β2配體。第一種方案中，來自共表達LT-α和截短LT-β形式的合適表達系統的上清液經過一個TNF-R柱。TNF-R將結合LT-α3和LT-α2/β1三聚體。流出TNF-R柱的液體將包含LT-β(n)和LT-α1/β2。
第二種方案中，所有的LT-β包含形式(LT-β(n)、LT-α1/β2和LT-α2/β1)用經典的方法例如離液劑或pH變化結合于LT-β-R柱上并從中洗脫下來。(LT-α3流過這樣的柱)。洗脫液被中和或除去離液劑，然后通過一個TNF-R柱，該柱只結合LT-α2/β1三聚體。流過這個柱的溶液將含有LT-β(n)和LT-α1/β2三聚體。
在二種情況下，純的LT-α1/β2三聚體能夠通過隨后的本領域已知的凝膠過濾和/或離子交換層析與LT-β分離。
另一選擇是，不同形式的LT-α/β異聚體可以用各種傳統的層析方法分離和純化。結合一系列傳統的純化方案和上述的免疫親和純化步驟中的一種也可能是比較好的。
LT-β-R阻滯劑的篩選在本發明的一個實施方案中，LT-β-R阻滯劑包括抗LT-β-R的抗體，它阻止LT-β-R信號傳導。優選抗LT-β-R抗體是單克隆抗體(mAb)。一個這樣的抑制性的抗LT-β-R mAb是BDA8 mAb。
抑制性的抗LT-β-R抗體和其他的LT-β-R阻滯劑能用檢測一種或多種試劑結合LT-β-R或LT配體的能力，或者阻止細胞上LT-β-R信號傳導效應的能力的篩選方法確定。
一種篩選方法利用了LT-β-R信號傳導在帶有LT-β-R的腫瘤細胞上的細胞毒作用。腫瘤細胞被暴露給一種或多種誘導LT-β-R信號傳導的LT-β-R激活劑。LT-β-R激活劑包括IFN-γ存在下的LT-α/β異聚體(最好是可溶性LT-α1/β2)或激活性抗LT-β-R抗體(見下；在本申請人的共同未決美國申請流水號08/378,968中也描述了)。在下面的實驗中，能阻止LT-β-R信號傳導的抗體和其他試劑基于他們阻止LT-β-R信號傳導對腫瘤細胞的細胞毒作用的能力而被篩選出來1)腫瘤細胞如HT29細胞在一系列含有培養基和至少一種LT-β-R激活劑的培養孔中培養3到4天，培養基中含有或缺少被檢測試劑的系列稀釋液；2)將一種測試線粒體功能的活體染料如MTT加到腫瘤細胞混合物中反應幾個小時；3)用550nm波長的光測量每個孔中混合物的光密度值(OD 550)。OD550與每個孔中存在LT-β-R激活劑和待測LT-β-R阻滯劑時仍存活的腫瘤細胞數成比例。在這個實驗中能至少降低LT-β-R活化的腫瘤細胞細胞毒性20％的試劑或試劑組合就是本發明范圍內的LT-β-R阻滯劑。
任何能活化LT-β-R信號傳導的試劑或試劑組合能用于上述實驗以鑒定LT-β-R阻滯劑。誘導LT-β-R信號傳導的LT-β-R激活劑(例如激活性抗LT-β-R mAb)可以基于它們用上述腫瘤細胞實驗單獨或與其他試劑聯合激發腫瘤細胞細胞毒性的能力而被篩選出來。
篩選LT-β-R阻滯劑的另一種方法是檢測推定試劑直接干擾LT配體-受體結合的能力。能阻止配體-受體結合至少20％的試劑或試劑組合是本發明范圍內的LT-β-R阻滯劑。
許多能測量配體-受體結合力的實驗的任何一種可用于與推定的LT-β-R阻滯劑一起進行競爭實驗。受體與配體之間的結合力可用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)或放射性免疫實驗(RIA)測量。特異性結合也可以用熒光標記的抗體-抗原復合物和進行熒光激活的細胞分類(FACS)分析測量，或者實行其他的類似免疫檢測方法測量，所有的方法都是本領域中熟知的技術。
配體-受體結合反應也可以用BIAcore儀器(PharmaciaBiosensor)測量，該儀器利用細胞質基因組共振檢測(Zhou等，生物化學，32，pp.8193-98(1993)；Faegerstram和O’Shannessy，“親和技術中的表面細胞質基因組共振檢測”，《親和層析手冊》Handbook of AffinityChromatography，pp.229-52，Marcel Dekker，Inc.，紐約(1993))。
BIAcore技術是先將受體結合到金表面，然后在上面流過配體。細胞質基因組共振檢測直接定量在一定時間內結合到表面的質量。該技術得到結合和脫離的速率常數，這樣在出現和缺少推定的LT-β-R阻滯劑的情況下直接確定配體-受體的解離常數和親和常數。
利用這樣或那樣的技術來測量受體-配體相互作用可以估計一種LT-β-R阻滯劑單獨或與其他試劑聯合阻止表面或可溶性LT配體結合表面或可溶性LT-β-R分子的能力。這樣的實驗也可以用于檢測LT-β-R阻滯劑或其衍生物(例如，融合體、嵌合體、突變體和化學變化形式)-單獨或聯合-以最優化改變了的試劑阻止LT-β-R活化的能力。
可溶性LT-β-R分子的產生本發明的一個實施案中的LT-β-R阻滯劑由可溶性LT-β受體分子組成。圖1顯示了人LT-β-R胞外部分的序列，它編碼配體結合區域。利用圖1中的序列信息和本領域熟知的重組DNA技術，編碼LT-β-R配體結合區域的功能片段可被克隆到一個載體上并在合適的宿主中表達，產生可溶性LT-β-R分子。根據這里描述的實驗，能與天然LT-β受體競爭性結合LT配體的可溶性LT-β-R分子被選為LT-β-R阻滯劑。
含有選自圖1所示的氨基酸序列的可溶性LT-β受體可以連上一個或多個異源的蛋白區域(“融合區域”)以增大受體融合蛋白在體內的穩定性，或者調節它的生物活性或定位。
優選用穩定的血漿蛋白-通常在循環中的半壽期大于20小時-構建受體融合蛋白。這樣的血漿蛋白包括，但不僅限于免疫球蛋白、血清白蛋白、脂蛋白、載脂蛋白和轉運蛋白。能將可溶性LT-β-R分子導向特異的細胞或組織類型的序列也可以連到LT-β-R配體結合區域，產生特殊定位的可溶性LT-β-R融合蛋白。
含有LT-β-R配體結合區的LT-β-R胞外區域(圖1)的全部或一個功能部分可以融合于一個免疫球蛋白的恒定區，比如人IgG1重鏈的Fc區域(Browning等，免疫學雜志，154，pp.33-46(1995))。可溶性受體-IgG融合蛋白是優選的，是常見的免疫試劑，它們的構建方法在本領域已知(參見例如，美國專利號5,225,538)。
具功能的LT-β-R配體結合區域可融合于來自IgG1之外的免疫球蛋白類或亞類的免疫球蛋白(Ig)Fc區域。屬于不同Ig類或亞類的抗體的Fc區域能激活各種次級效應功能。當Fc區域結合于相應的Fc受體時就產生了激活作用。次級效應功能包括激活補體系統、穿過胎盤和結合各種微生物蛋白的能力。免疫球蛋白不同類和亞類的性質描述于Roitt等，免疫學(Immunology)，p.4.8(Mosby-Year Book Europe Ltd.，3ded.1993)。
補體系統的活化啟動了介導炎癥的酶級聯反應。補體系統的產物具有各種不同的功能，包括結合細菌、胞吞作用、吞噬作用、細胞毒作用、自由基產生和免疫復合物溶解。
補體酶級聯反應能被結合抗原的IgG1、IgG3和IgM抗體的Fc區域激活。IgG2的Fc區域表現出較低的效力，IgG4、IgA、IgD和IgE的Fc區域則不能激活補體。這樣可以根據是否在特殊的免疫應答或用LT-β-R-Fc融合蛋白治療疾病時需要相應的次級效應功能來選擇Fc區域。
如果損傷或殺死帶LT配體的靶細胞是有利的話，可以選擇特別有活性的Fc區域(IgG1)來制備LT-β-R-Fc融合蛋白。另一選擇是，如果想要把LT-β-R-Fc導向細胞而不啟動補體系統，可選擇無活性的IgG4 Fc區域。
減少或除去結合Fc受體和補體活化功能的Fc區域的突變已被描述過(S.Morrison，Annu.Rev.Immunol.，10，pp.239-65(1992))。可以單獨或聯合應用這些或其他的突變，以最優化用于構建LT-β-R-Fc融合蛋白的Fc區域的活性。
含有配體結合序列和與其融合的人免疫球蛋白Fc區域的可溶性人LT-β-R融合蛋白(hLT-β-R-Fc)的產生在實施例1中描述。根據實施例1制備的分泌hLT-β-R-Fc的CHO細胞系稱作“hLTβ；R-hG1CHO#14”根據布達佩斯條約的規定，該細胞系的樣品于1995年7月21日已在美國典型培養物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD)保藏，指定的ATCC入藏號為CRL11965。
可溶性鼠LT-β-R融合分子(mLT-β-R-Fc)的產生在實施例2中描述。根據實施例2制備的分泌mLT-β-R-Fc的CHO細胞系稱作“mLT β；R-hG1 CHO#1.3.BB”。根據布達佩斯條約的規定，該細胞系的樣品于1995年7月21日已在美國典型培養物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD)保藏，指定的ATCC編號為CRL11964。
對公眾獲得上述ATCC保藏物的所有限制將隨著本申請被授予專利而取消。
形成受體-Ig融合蛋白連接點的不同的氨基酸殘基可以改變可溶性LT-β受體融合蛋白的結構、穩定性和最終生物活性。可以在所選擇的LT-β-R片段的C末端加上一個或多個氨基酸修飾與所選擇的融合區域的連接點。
LT-β-R融合蛋白的N末端也可以通過改變所選擇的LT-β-R DNA片段為插入重組表達載體而在5’末端切斷的位置而發生變化。每個LT-β-R融合蛋白的穩定性和活性可以被檢測，用這里描述的選擇LT-β-R阻滯劑的常規實驗和測定達到最優化。
利用圖1所示的胞外區域中的LT-β-R配體結合區的序列也可以構建氨基酸序列變異體以修飾可溶性LT-β受體或融合蛋白對LT配體的親和性。本發明的可溶性LT-β-R分子能與內源的細胞表面LT-β受體競爭表面LT配體。可見，任何含有能與細胞表面LT-β受體競爭LT配體的LT-β-R配體結合區域的可溶性分子都是本發明范圍內的LT-β-R阻滯劑。
作為LT-β-R阻滯劑的可溶性LT-β-R分子可溶性人LT-β受體-免疫球蛋白融合蛋白(hLT-β-R-Fc)是根據實施例1的方法制備的，在人HT29腫瘤細胞中檢查它阻止LT-β-R誘導的細胞毒性的能力。表1(實施例3)比較了可溶性LT-β受體(hLT-β-R-Fc)與TNF受體(p55-TNF-R-Fc)融合蛋白阻止各種TNF和可溶性LT配體對HT29腫瘤細胞生長的抑制作用的能力。
表1的數據指出了可溶性LT-β受體(hLT-β-R-Fc)阻止LT-α1/β2配體和細胞表面LT-β受體相互作用而導致的腫瘤細胞死亡50％的濃度。根據本發明，能阻止腫瘤細胞生長至少20％可確定此可溶性LT-β受體為LT-β-R阻滯劑。正如所料，通過結合TNF和防止它與表面受體相互作用，可溶性TNF-R融合蛋白(p55-TNF-R-Fc)完全阻止了TNF誘導的生長抑制。
可溶性TNF-R融合蛋白不影響LT配體(LT-α1/β2)介導的抗增殖效應。相比之下，LT-β-R融合蛋白阻止LT配體效應而不阻止TNF或LT-α效應。因此，可溶性人LT-β-R融合蛋白不干擾TNF和LT-α配體活化TNF-R。
為確定是否LT-β-R信號傳導在小鼠中對腫瘤細胞也有細胞毒性。以及是否可溶性LT-β-R融合蛋白能阻止LT-β-R誘導的細胞毒作用，用小鼠的腫瘤細胞進行了類似實驗。檢測了一種可溶性鼠LT-β-R-Fc融合蛋白阻止用LT配體處理的鼠WEHI 164細胞死亡的能力(實施例4)圖2顯示了可溶性鼠LT-β-R(mLT-β-R-Fc)在鼠WEHI 164細胞中對LT配體誘導的LT-β-R信號傳導的作用。正如此實驗所表明的，用可溶性LT-α1/β2配體處理，WEHI 164細胞被殺死了。加入mLT-β-R-Fc阻止了LT配體激活的細胞死亡。對照的TNF受體融合蛋白(p55 TNF-R-Fc)在阻止細胞死亡上只有很小的作用。
這些數據顯示，可溶性LT-β-R融合蛋白能有效地與表面LT-β-R分子競爭結合LT配體。因此，可溶性mLT-β-R-Fc融合蛋白可作為小鼠的LT-β-R阻滯劑。
抗人LT-β-R抗體的來源在本發明的另一實施方案中，抗人LT-β受體的抗體(抗LT-β-R Abs)作為LT-β-R阻滯劑起作用。本發明的抗LT-β-R抗體可以是多克隆或單克隆的(mAb)，能被修飾以最優化它們阻止LT-β-R信號傳導的能力、體內的生物利用度、穩定性或其他的想獲得的特性。
抗人LT-β受體的多克隆抗體血清用傳統技術制備，用人LT-β受體-Fc融合蛋白(實施例1)在完全弗氏佐劑中皮下注射動物，例如山羊、兔子、大鼠、倉鼠或小鼠，接著在不完全弗氏佐劑中進行輔助的腹膜內或皮下注射。含有想要的抗LT-β受體抗體的多克隆抗血清用傳統的免疫學方法篩選。
抗人LT-β受體-Fc融合蛋白的鼠單克隆抗體(mAb)如實施例5中所述進行制備。產生鼠抗人LT-β-R mAb BDA48的一個雜交瘤細胞系(BD.A8.Ab9)已根據布達佩斯條約的規定，于1995年1月12日在美國典型培養物保藏中心(ATCC)保藏。對公眾獲得上述ATCC保藏物的所有限制將隨著本申請被授予專利而取消。
抗LT-β-R抗體的不同形式也能用標準的重組DNA技術(Winter和Milstein，自然(Nature)，349，pp.293-99(1991))制備。例如，“嵌合”抗體能通過把來自動物抗體的抗原結合區域連接到人的恒定區域上而構建成(例如，Cabilly等，US4,816,567；Morrison等，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)，81，pp.6851-55(1984))。嵌合抗體減少了動物抗體用于人臨床治療時引發的免疫原應答。
另外，識別LT-β-R的重組“人源化抗體”能合成出來。人源化抗體是包含插入了負責特異性抗原結合區域的大部分人IgG序列的嵌LT-β-R mAb BDA8阻止了可溶性LT-α1/β2配體抑制WiDr細胞生長的能力。因此，抗人LT-β-R的抗體可作為本發明定義的LT-β-R阻滯劑起作用。
通過檢測其他抗人LT-β受體的抗體，預計能用這里描述的實驗和測試鑒定出另外的可作為人LT-β-R阻滯劑的抗LT-β-R抗體。
抗表面LT配體的抗體來源本發明另一個優選的實施方案涉及的組合物和方法含有作為LT-β-R阻滯劑的抗LT配體的抗體。與上面描述抗LT-β-R抗體一樣，抗LT配體的抗體作為LT-β-R阻滯劑可以是多克隆或單克隆的，能根據常規方法進行修飾，調節它們的抗原結合性質和免疫原性。
本發明的抗LT抗體可以分別抗二種LT亞單位中的任何一種，包括可溶的、突變的、改變的和嵌合形式的LT亞單位。如果把LT亞單位用作抗原，則優選LT-β亞單位。如果用LT-α亞單位，優選使得到的抗LT-α抗體結合表面LT配體而不會與分泌的LT-α發生交叉反應或調節TNF-R的活性(根據實施例3描述的實驗)。
另一選擇是，可產生抗含有一個或多個LT亞單位的均聚(LT-β)或異聚(LT-α/β)復合體的抗體并篩選作為LT-β-R阻滯劑的活性。優選用LT-α1/β2復合體作抗原。正如上面討論的，獲得的抗LT-α1/β2抗體優選結合表面LT配體而不結合分泌的LT-α也不影響TNF-R活性。
多克隆抗人LT-α抗體的產生在申請人的共同未決申請(WO94/13808)中描述了。單克隆抗LT-α和抗LT-β抗體也被描述了(Browning等，免疫學雜志，154，pp.33-46(1995))。
小鼠抗人LT-β mAb按實施例6中所述進行制備。產生小鼠抗人LT-β-R mAb B9的一個雜交瘤細胞系(B9。C9.1)已根據布達佩斯條約的規定于1995年7月21日在美國典型培養物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD)保藏，指定的ATCC編號為HB11962。
單克隆倉鼠抗小鼠LT-α/β抗體按實施例7中所述進行制備。產生倉鼠抗小鼠LT-α/β mAb BB.F6的一個雜交瘤細胞系(BB.F6.1)已按照布達佩斯條約的規定于1995年7月21日在美國典型培養物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD)保藏，指定的ATCC編號為HB 11963。
對公眾獲得上述ATCC保藏物的所有限制將隨著本申請被授予專利權而取消。
作為LT-β-R阻滯劑的抗LT配體的抗體發展了一種熒光活化細胞分類實驗(FACS)去篩選能作為LT-β-R阻滯劑的直接抗LT亞單位和LT復合體的抗體(實施例6和7)。在這個實驗中，可溶性人LT-β-R-Fc融合蛋白在遞增量實驗抗體存在的情況下被加給PMA-活化的II-23細胞-該細胞表達表面LT復合體(Browning等，免疫學雜志，154，pp.33-46(1995))。能抑制LT-β受體-配體相互作用至少20％的抗體被選為LT-β-R阻滯劑。
圖4顯示了該實驗檢測小鼠抗人LT-β mAbB9的結果。圖4表明抗LT-β mAb B9能選擇性地阻止可溶性LT-β-R-Fc融合蛋白結合到活化細胞上誘導的表面LT配體。這些結果證明直接抗LT配體亞單位的抗體可作為LT-β-R阻滯劑。
上述的FACS實驗也用于檢測提自倉鼠的抗可溶性小鼠LT-α/β復合體的mAb(實施例7)。檢測倉鼠抗小鼠LT-α/β mAb BB.F6的實驗結果見表2(實施例7)。表2顯示抗LT-α/β mAb BB.F6能有效地阻止可溶性mLT-β-R-Fc融合蛋白(實施例2)結合到小鼠T細胞雜交瘤上表達的表面LT配體，因此它是本發明的一種LT-β-R阻滯劑。
用LT-α/β復合體而不是LT亞單位作為抗原去免疫動物可以導致更有效的免疫，或者致使抗體對表面LT配體有更高的親和力。可以想象用LT-α/β復合體免疫后，能識別LT-α和LT-β亞單位上的氨基酸殘基(例如形成LT-α/β裂隙的殘基)的抗體可以被分離出來。通過檢測直接抗人LT-α/β異聚體的抗體，可以預計能用這里描述的實驗和測試鑒定出另外的作為LT-β-R阻滯劑的抗LT抗體。
抑制小鼠中Th1細胞介導的接觸型超敏反應的LT-β-R阻滯劑合體(例如，WO94/04679)。用適當的抗原免疫動物，分離相應的抗體，移出負責特異性抗原結合的可變區序列部分。然后把來源動物的抗原結合區域克隆到刪除了抗原結合區域的人抗體基因的適當位置。人源化抗體在人抗體中最少地應用了異源(種間)序列，在被治療的受試者中很少引發免疫反應。
不同類重組抗LT-β-R抗體的構建也可以通過制備嵌合的或人源化抗體來完成，它含有抗LT-β-R可變區和從不同類免疫球蛋白中分離出的人恒定區(CH1，CH2，CH3)。例如，具有增加的抗原結合位價的IgM抗體能通過克隆抗原結合位點到帶有人μ鏈恒定區的載體中而重組產生(Arulanandam等，實驗醫學雜志(J.Exp.Med.)177，pp.1439-50(1993)；Lane等，歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol]，22，pp.2573-78(1993)；Traunecker等，自然，339，pp.68-70(1989))。
另外，標準的重組DNA技術能用于改變重組抗體結合抗原的親和力，通過改變抗原結合位點附近的氨基酸殘基而實現。人源化抗體的抗原結合力能用基于分子模擬的突變提高(Queen等，美國國家科學院院報，86，pp.10029-33(1989)；WO94/04679)。
根據靶組織的類型或設想的特殊治療安排來增大或減小抗LT-β-R抗體對LT-β-R的親和力可能是需要的。例如，用穩定水平的降低了通過LT-β途徑進行信號傳導的能力的抗LT-β-R抗體治療病人對于半預防性治療是有利的。同樣地，增大了對LT-β-R的親和力的抑制性抗LT-β-R抗體對于短期治療有利。
作為LT-β-R阻滯劑的抗LT-β-R抗體作為LT-β-R阻滯劑的抗LT-β-R抗體可以通過檢測它們在腫瘤細胞中抑制LT-β-R誘導的細胞毒作用的能力而選擇出來(實施例5)。
在本發明的一個優選的實褲方案中，組合物和方法包括鼠抗人LT-β-R mAb BDA8。圖3顯示mAb BDA8充當了本發明定義的LT-β-R阻滯劑。有IFN-γ和可溶性LT α1/β2配體時WiDr腫瘤細胞停止生長。對照抗體(IgG1)在生長抑制上沒有作用。相比之下，抗本發明的LT-β-R阻滯劑能抑制Th1細胞介導的免疫應答。Th1介導的一種應答是遲發性超敏反應(DTH；Cher和Mosmann，免疫學雜志，138，pp.3688-94(1987)；普遍討論又見I.Roitt等，免疫學，pp.22.1-22.12，Mosby-Year Book Europe Ltd.，第3版(1993))。DTH是當抗原致敏的Th1細胞再次接觸相同抗原而分泌細胞因子時引發的。Th1細胞因子吸引和活化巨噬細胞釋放其他的效應分子，引發炎癥反應。
DTH反應被分為三種不同類型接觸型超敏反應、結核菌素型超敏反應和肉芽腫型超敏反應。當外源抗原直接應用或注射到致敏的受試者皮下后，根據對外源抗原應答的速度和性質可以區分三種類型的超敏反應(HS)。測量皮膚變厚的速度和程度可監測DTH反應。
結核菌素型HS反應是皮膚反應，它發生在來自微生物的外源抗原的注射處，受試者過去曾接觸過該微生物(例如結核分支桿菌或麻瘋分支桿菌)。這種皮膚反應最長達48到72小時，常被用作診斷過去遇到過的微生物的敏感性測試的基礎(例如結核菌素皮試)。當一個結核菌素型病灶發展時，如果抗原還在組織中它能變為一個肉芽腫型反應。
肉芽腫型反應是臨床上最嚴重的DTH反應，因為它們將導致許多與Th1細胞介導的疾病相關的病理學效應。當抗原或免疫復合物不能從巨噬細胞清除并繼續刺激Th1細胞因子分泌時肉芽腫型反應便發生了。刺激部位的慢性炎癥和活化的巨噬細胞聚集是肉芽腫型反應的特征。
上皮細胞和巨噬細胞為核心，也可能圍繞著淋巴細胞和纖維狀沉積，形成一個堅硬的結構叫做肉芽腫。有時在肉芽腫的核心大量細胞死亡(例如在染結核病的肺組織中)。大約4個星期肉芽腫型反應的靶組織發生硬化。
影響肉芽腫形成頻率的試劑能用血吸蟲感染的小鼠鑒定(Amiri等，自然，356，pp.604-607(1992))。血吸蟲(血蛭)能引起寄生蟲病，致使在被感染的肝的門靜脈中圍繞著血吸蟲卵形成肉芽腫。抑制這種Th1細胞介導的DTH反應的試劑可以減小肉芽腫的大小，或者在血吸蟲感染的小鼠肺中的肉芽腫形成頻率和速率。用隨時間遞增的LT-β-R阻滯劑的濃度來處理小鼠，測量小鼠中形成的肉芽腫的數目和大小，從而估計細胞對血吸蟲卵的反應。
接觸型超敏反應(CHS)是DTH的一類，它的靶器官是皮膚。在CHS中，炎癥反應起因于皮膚上局部使用有反應性的半抗原。變應原通常含有至少一個半抗原分子，半抗原分子一般太小而不能單獨具有抗原性。半抗原透過表皮與皮膚下的正常蛋白反應產生一個新的抗原復合體。
致敏的受試者再次遇到半抗原時引發DTH反應。半抗原載體蛋白偶聯物與抗原呈遞細胞聯合活化啟動釋放細胞因子(包括IL-2，IL-3、IFN-γ和GM-CSF)的效應機制。釋放的細胞因子的級聯反應使CD4+T細胞增殖，各種細胞表面粘連分子的表達類型改變，以及吸引T細胞和巨噬細胞到皮膚的發炎部位。細胞因子級聯反應和所導致的血管舒張、細胞浸潤和真皮、表皮水腫促使靶組織腫大和發炎，這可以說明為什么在對DTH反應的應答中皮膚有可測量的變厚。
特殊的半抗原致敏個體的程度依賴于各種因素。這些因素包括半抗原穿透皮膚的效果和與宿主載體蛋白形成偶聯物的情況。一種幾乎能致敏所有個體的半抗原是2，4-二硝基氟苯(DNFB)。
對于如DNFB的半抗原的皮膚CHS反應是細胞介導免疫的典型動物模型。將這種CHS反應定位到致敏小鼠的耳朵上可以通過測量耳朵厚度容易、準確和可重復性地定量體內的這種細胞介導的免疫反應。鼠CHS反應的細節和DNFD介導的炎癥反應的組織病理學已被報道(Chisholm等，歐洲免疫學雜志23，pp.682-688(1993))。
DNFB的這種在大多數個體中誘導接觸型超敏反應的能力可以用于鑒定減小或消除與Th1細胞介導的DTH反應相關的炎癥反應的試劑。可溶性鼠LT-β-R-Fc融合蛋白有效地抑制小鼠中DNFB誘導的接觸型超敏反應(實施例8)。初級致敏小鼠是連續二天把DNFD涂在每只后腳的底部。五天之后，將亞刺激劑量的含于載體溶液中的DNFB涂到左耳的表面。單獨載體溶液涂到右耳上作為對照。
然后將遞增濃度的LT-β-R阻滯劑mLT-β-R-Fc(實施例2)靜脈注射到小鼠中(實施例8)。只注射PBS緩沖液或者人IgG融合蛋白(LFA3-Fc)作為陰性對照。注射已知能抑制CHS的抗VLA4特異性mAb(PS/2 mAb)作為陽性對照。24小時后，測量每只耳朵(DNFB攻擊的和未攻擊的)的厚度。對比治療組和陰性對照組，判斷LT-β-R阻滯劑對耳腫大反應的抑制。
圖5顯示，與不被抑制的DNFB處理的對照動物(PBS和LFA3-FC)相比，mLT-β-R-Fc明顯減小了DNFB處理小鼠的耳腫大反應。可溶性LT-β-R能與抑制劑抗VLA4特異性mAb(PS/2mAb)一樣有效地阻止這種CHS反應，后者靠阻止T細胞流到攻擊部位而起作用(Chisholm等，歐洲免疫學雜志，23，pp.682-88(1993))。
這些資料顯示給動物服用時，在體外作為LT-β-R阻滯劑的可溶性LT-β-R融合蛋白也能有效地阻止Th1細胞介導的免疫反應。本發明體外鑒定的LT-β-R阻滯劑能用這個耳腫大實驗或者諸如上面描述的那些其他的DTH實驗檢測，以選擇出其他的能在體內有效降低Th1細胞相關的免疫反應程度的LT-β-R阻滯劑。
LT-β-R阻滯劑不抑制Th2細胞介導的(體液的)免疫應答如上所示，本發明的LT-β-R阻滯劑能阻止Th1細胞介導的效應機制，例如接觸型遲發性超敏反應(圖5)。這種Th1細胞介導的反應被抑制了而不明顯影響Th2細胞依賴性的反應。LT-β-R阻滯劑在Th1細胞介導的免疫應答上的差別效應通過在LT-β-R阻滯劑存在的情況下監測Th2細胞依賴性的免疫應答-例如初次抗體應答和同種型轉換-顯示出來。
十天內用可溶性LT-β-R融合蛋白(mLT-β-R-Fc；實施例2)或者對照的IgG融合蛋白(LFA3-Fc)注射小鼠五次，同時另一些小鼠不處理。第二次注射后，所有小鼠都在尾巴基部注射含有100μg卵清蛋白的完全佛氏佐劑100μl。11天之后，用ELISA特異性地針對IgG1、IgG2a和IgM同種型分析初次的血清中抗卵清蛋白的特異性抗體的效價。
圖6顯示了在卵清蛋白免疫過的小鼠中，小鼠LT-β-R阻滯劑mLT-β-R-Fc對產生血清抗卵清蛋白抗體的影響(實施例6)。施用LT-β-R阻滯劑不能明顯影響卵清蛋白免疫后初次抗體的效價。相比之下，用CD40配體誘導的CD40受體信號傳導干擾，完全阻止了小鼠中抗原特異性的IgG應答(Renshaw等，實驗醫學雜志，180，pp.1889-1990(1994)。CD40是TNF家族的另一個配體/受體對。
全部免疫球蛋白的產生和成熟都明顯依賴于Th2細胞。然而，也有證據表明Th1細胞因子IFN-γ參與了IgG2a亞類轉換，但不是絕對必需的(Huang等，科學，259，pp.1742-45(1993))。LT-β-R阻滯劑mLT-β-R-Fc在這些實驗中不抑制IgG2a轉換。有可能本發明的LT-β-R阻滯劑不阻止Th1細胞介導反應的這一體液的方面。另外，來自mLT-β-R-Fc處理的小鼠的淋巴細胞的增殖應答沒有降低(實施例10；圖7)。
這些實驗表明，以施用本發明的LT-β-R阻滯劑為基礎的療法對于免疫應答中Th2依賴的抗體生產功能沒有不利影響。圖6中所示的抗體應答的正常方式也意味著用可溶性mLT-β-R-Fc進行密集治療對小鼠是無毒的，進一步表明了本發明前面所列的組合物和方法的有用治療性質。
輔助性T細胞介導的疾病許多器官特異性的自身免疫情況涉及病理學的Th1應答。對這樣的資料已做過綜述(Modlin和Nutman，免疫學中的流行觀點(CurrentOpinion in Immunol)，5，pp.511-17(1993)；Romagnani等，Ann.Rev.Immunol，12，pp.227-57(1994))。這些器官特異性的自身免疫情況包括；多發性硬化、胰島依賴性糖尿病、交感性眼炎、葡萄膜炎和牛皮癬。
胰島素依賴性糖尿病是一種自身免疫疾病，它是由于白細胞侵入朗氏小島而破壞了產生胰島素的β胰腺細胞。轉移活化的前糖尿病脾細胞能在新生的非肥胖糖尿病(NOD)小鼠中快速誘發糖尿病。最近，Th1或Th2類似細胞，否則是遺傳相似的細胞被轉移到新生的NOD小鼠中。在幾乎所有受試者中只有Th1細胞快速誘導了糖尿病(Katz等，科學，268.pp.1185-88(1995))。這表明本發明的LT-β-R阻滯劑-它能在體內抑制Th1細胞介導的免疫應答效應-對于治療或預防胰島素依賴性的糖尿糖有用。
幾種全身性自身免疫疾病(包括各種關節炎)是Th1細胞相關的。類風濕性關節炎和斯耶格倫氏綜合癥都涉及Tho和Th1細胞。相比之下，全身性紅斑狼瘡(SLE)表現一種非常規的Tho/Th2主導的應答。
一些慢性炎癥疾病也表現有非常規的Th1類型的應答，包括炎性腸疾病、肺結節病和同種異體移植排斥。人炎性腸疾病(IBD)至少包括二種潰瘍性結腸炎和Grohn氏病。兩種疾病都被認為起因于免疫病理學的自身免疫類紊亂。在一些IBD小鼠模型中，清楚地看到一些阻止Th1應答的試劑能阻止該病的發展或進程(F.Powrie等，免疫(Immunity)1553，1994)。可能免疫應答的Th1成分的抑制在人IBD中有有益的效應。許多IBD模型已被描述和回顧(C.Elson等，胃腸病學(Gastroenterology)1091344 1995)。至少有三組模型化學誘導的、聚合物/微生物誘導的和使用突變小鼠的免疫類型。
在一個常用的聚合物/微生物誘導的模型中，引入硫酸葡聚糖溶液到小鼠的飲用水中，吸收時腸的上皮細胞防線被刺激，導致對傷害的深度免疫應答。動物發生結腸炎，其癥狀為腹瀉、糞便中有血、體重減輕和由于結腸壁膨脹而造成結腸縮短。該模型誘發了左側結腸炎和上皮細胞發育異常。后者會導致癌癥，這是潰瘍性結腸炎的特征。
另一個模型是把選擇的一組CD4 T細胞移植到Scid小鼠中，例如缺乏T、B細胞的小鼠(F.Powrie等，國際免疫學(InternationalImmunology)51461-1471，1993，Morrissey等，實驗醫學雜志.1782371993)。當被選擇的細胞-稱為CD45RBhi細胞-擴展開成為Scid小鼠的成分時，防止出現自身反應性T細胞的正常機制發生功能障礙，自身反應性細胞就出現了。在大鼠中觀察到與許多器官反應的細胞，而在小鼠中反應性主要發生在腸。改變自身反應性細胞擴展和生長方式的試劑或能阻止細胞攻擊腸的能力的試劑在這個模型中將是有效的。另外，因為此模型至少部分地模擬了自身反應性免疫系統細胞的病理發展，能抑制該模型的療法實際上可能在人體中具有疾病緩和作用。在這個模型中，TNF的抗體能阻止疾病(F.Powrie等，免疫1，552 1994)，發現它們在人類疾病治療中是有效的(H.M.Van Dullemen等，胃腸病學109109 1995)。因此，該模型能預言哪種試劑可能在治療IBD中有用。此外，因為CD45RB模型是一個Th1介導的疾病過程的例子，而且在大鼠中該模型確實在許多器官中導致了疾病，該系統中LT β R-Ig的效能意味著LT β R Ig或其他的阻斷LT β R與其配體相互作用的方法可以對很大范圍的相關免疫疾病有益。
一般情況下，對抗特殊T細胞的自身抗體的精確作用還未在這些自身免疫疾病中描述出。細胞應答可能在那些目前被認為主要由抗體驅動的全身性自身免疫疾病(例如各種關節炎)的致病性上有主要作用。
對一些致病性感染劑的正常免疫應答也引發Th1應答，它可能過度而使自己成為醫學問題。導致嚴重的醫學問題的肉芽腫型反應(上面描述的一類DTH應答)的例子包括麻風病、結核病病人肺中的肉芽腫形成、結節病和血吸蟲病(Roitt等，免疫學，pp.22.5-6(Mosby-Year BookEurope Ltd.3d ed.1993))。牛皮癬也可能是Th1細胞介導的。
溶細胞的T細胞即CTL(CD8陽性T細胞)也可再細分為Th1和Th2類群。所以可能許多已知的有關Th1群的東西也適用于CD8+細胞，CD8+細胞主要涉及抗病毒和移植組織排斥反應。
用LT-β-R阻滯劑治療本發明的組合物將以有效劑量使用，治療所述的特殊臨床狀態。對于給定的應用，優選的藥劑和治療有效的劑量方案的確定在本領域的技術范圍內，考慮例如病人的狀況和體重、希望治療的程度和病人對治療的耐受性來決定。大約1mg/kg可溶性LT-β-R的劑量認為是優化治療劑量的合適起始點。
治療有效劑量的確定也能通過進行體外實驗來估計，測量1到14天覆蓋靶細胞(根據所用阻滯劑，為LT-β-R或LT配體-陽性細胞)所需求的LT-β-R阻滯劑的濃度。上述的受體-配體結合實驗也可用于監測細胞覆蓋反應。用FACS能把LT-β-R或LT配體-陽性細胞從活化的淋巴細胞群中分離出來，基于這些體外結合實驗的結果，可選擇出合適的LT-β-R阻滯劑的濃度范圍，根據上述實驗在動物中測試。
本發明的可溶性LT-β-R分子、抗LT配體和抗LT-β-R的抗體(單獨的或組合的形式，包括抗體或復合體的分離和純化的形式，它們的鹽或藥物上可接受的衍生物)的施用可以用傳統接受的顯示免疫抑制活性的試劑的給藥方式來完成。
這些治療中所用的藥物組合物也可以是各種各樣的形式。例如包括固體、半固體和液體制劑形式，諸如片劑、丸劑、粉劑、溶液或懸浮液、栓劑和可注射和可輸液的溶液。優選的形式依賴于所企望的給藥方法和治療應用而定。給藥方式可包括口服、腸胃外、皮下、靜脈、病灶內的或表皮給藥。
本發明的可溶性LT-β-R分子、抗LT配體和抗LT-β-R的抗體可以例如配制成無菌的等滲的形式，帶有或沒有刺激吸收或穩定性的輔助因子。優選液體形式，或者是凍干粉。例如，本發明的可溶性LT-β-R分子、抗LT配體和抗LT-β-R的抗體可以用含有5.0mg/ml單水合檸檬酸、2.7mg/ml檸檬酸三鈉、41mg/ml甘露糖醇、1mg/ml甘氨酸和1mg/ml多乙氧基醚20的配制緩沖液稀釋。該溶液可被凍干，冰箱保存，使用前用無菌的注射用水(USP)再配制。
該組合物還優選含有傳統的醫藥上可接受的本領域熟知的載體(參見，例如Remington's Pharmaceutical Sciences，16th Edition，1980，MacPublishing company)。這樣的藥物上可接受的載體可包括其他的藥用試劑、載體、遺傳載體、佐劑、賦形劑等，諸如人血清白蛋白或血漿制備物。該組合物優選以單位劑量的形式通常每天用一次或多次。
本發明藥物組合物也可以用微球、脂質體、其他的微粒轉運系統給藥或者以持續釋放形式置于被感染組織或血流中、近旁、或以其他形式與之相聯系。持續釋放載體的適當例子包括半滲透的顆粒狀聚合物基質，諸如栓劑或微囊。可植入的或微囊性持續釋放基質包括聚乳酸(美國專利號3,773,319；EP 58,481)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物(Sidman等，生物聚合物(Biopolymers)，22，pp.547-56(1985)。多聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物(Langer等，J.Biomed.Mater，Res，15，pp.167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.12，pp.98-105(1982))。
含有單一或組合形式的本發明可溶性LT-β-R分子、抗LT配體和抗LT-β-R抗體的脂質體可以用已熟知的方法制備(參見，例如DE 3,218,121，Epstein等，美國國家科學院院報，82，pp.3688-92(1985)；Hwang等，美國國家科學院院報77，pp.4030-34(1980)；美國專利號4,485,045和4,544,545)。通常脂質體是小的(大約200-800)單層類型，其中脂含量大于大約30mol％膽固醇。選擇膽固醇的比例以控制可溶性LT-β-R分子、抗LT配體和抗LT-β-R的抗體釋放的最佳速率。
本發明的可溶性LT-β-R分子、抗LT配體和抗LT-β-R的抗體也可連到含有其他LT-β-R阻滯劑免疫抑制劑或調節該LT-β-R阻止活性的細胞因子的脂質體上。LT-β-R分子、抗LT配體和抗LT-β-R的抗體與脂質體的連接可用任何已知的交聯劑來實現，例如已廣泛用于偶聯毒素或化學治療劑到抗體上以進行靶向轉運的異雙功能交聯劑。與脂質體的偶聯也可以使用糖指導的交聯劑4(4-馬來酰亞胺苯基)丁酸酰肼(MPBH)(Duzgunes等，細胞生物化學雜志(J.Cell Biochem.)Abst.Suppl.16E 77(1992))。
含有LT-β-R阻滯劑的治療用組合物的優點本發明的LT-β-R阻滯劑能選擇性地抑制Th1而非Th2細胞依賴性的免疫效應機制。LT-β-R阻滯劑將對治療由Th1型細胞因子(例如IL-2和IFN-γ)的活性惡化的疾病有用。因為Th1細胞因子能抑制Th2細胞依賴性應答，LT-β-R阻滯劑也可以間接刺激通常被Th1誘導的細胞因子級聯系統抑制的某些Th2細胞依賴性應答。
選擇性抑制Th1(或間接刺激Th2)細胞應答的能力對治療各種細胞介導的免疫應答失常有用，包括各種自身免疫和慢性炎癥情況、抗原耐受、以及組織和器官移植的細胞排斥。
正如上面所討論的，Th1細胞為基礎的免疫病的治療采用對多種細胞類型和免疫應答具有多向效應的免疫調節劑和免疫抑制劑。這些非特異性的免疫抑制劑通常需要用很高的經常為細胞毒性的劑量，引起各種副作用。
上面討論的對小鼠糖尿病的最近研究(Katz等，科學，268，pp.1185-88(1995))和一個同種異體移植模型(Sayegh等，實驗醫學雜志，181，pp.1869-74(1995))支持這一轉變免疫應答性質的能力。在后期的研究中，一個阻止CD28-B7T細胞共刺激途徑的融合蛋白表現出誘導腎移植耐受性。此耐受性與體內Th1細胞因子減少和Th2細胞因子增多有關。這些資料表明本發明的LT-β-R阻滯劑將在通過抑制Th1細胞介導的細胞因子釋放而抑制組織和器官移植的細胞排斥反應。
本發明的組合物和方法的LT-β-R阻滯劑可經修飾后依待治療的不良情況、紊亂或疾病而獲得所希望的LT-β-R信號傳導水平。可見，LT-β-R信號傳導的真實水平可以通過控制LT-β-R阻滯劑的濃度和對各個靶分子的親和力來進行微調。
例如在本發明的一個實施方案中，含有可溶性LT-β-R分子的組合物給予受試者。這個可溶性LT-β受體能有效地與細胞表面LT-β受體競爭結合表面LT配體。競爭表面LT-配體的能力依賴于可溶性的和細胞表面LT-β-R分子的相對濃度和它們與配體結合的相對親和力。
具有突變的可溶性LT-β-R分子-該突變能增大或減小突變的可溶性LT-β-R與表面LT配體結合的親和力-能用本領域技術人員熟知的標準的重組DNA技術制備。帶有位點特異突變或隨機突變的大量分子能用常規實驗和這里所描述的技術檢驗它們作為LT-β-R阻滯劑的能力。
同樣，在本發明的另一實施方案中，抗LT-β受體或者一個或多個LT配體亞單位的抗體作為LT-β-R阻滯劑起作用。對于這些抗體，阻止LT-β受體信號傳導的能力可以經突變、化學修飾或其他的能改變予以受試者的抗體的有效濃度或活性的方法進行修飾。
減少而不完全抑制LT-β-R信號傳導的性能可能對在抑制Th1-細胞介導的被夸大的或反常的反應同時建立或保持維持正常免疫功能的低水平的LT-β-R信號傳導是很重要的。
小鼠LT-α基因斷裂導致異常的外周淋巴器官發育(De Togni等，科學，264，pp.703-7(1994))。這樣的小鼠缺少淋巴結，它們的脾在濾泡中T、B細胞豐富區之間缺少通常很清晰的界線。我們認為這種表型與表面LT誘導的LT-β-R信號傳導缺失有關，因為經調節TNF-R活性沒有觀察到類似的表型。因此，選擇性地或部分阻止LT-β-R信號傳導的能力可以用于治療與錯誤或過量表達LT-β-R途徑信號傳導相關的異常淋巴器官發育。
一些Th1相關反應是許多細胞介導的免疫應答的關鍵成分(Romagnani，S.，Ann.Rev.Immunol.12，pp.227-57(1994))，在某些情況下并不希望完全抑制Th1細胞活性。例如，當能建立很好的Th1應答時，小鼠便可以有效地抑制寄生蟲感染。感染物諸如李斯特菌和弓形蟲也引發強烈的Th1型應答。在人類中結核分枝桿菌應答表現為Th1為基礎。利什曼病致病性在小鼠中與類似于Th1應答的應答相關(Reed和Scott，免疫學流行觀點，5，pp.524-31(1993))。
通過阻止LT-β-R信號傳導而影響Th1抑制水平的能力可能在最大化用本發明的LT-β-R阻滯劑治療所能獲得的有利效果中很重要。
下面是說明本發明的可溶性LT-β受體、抗LT配體和抗LT-β-R的抗體以及其特征方法的實施例。這些實施例不應被解釋為限制包含這些實施例是為了說明的需要，本發明只受限于權利要求書。
實施例1作為免疫球蛋白Fc融合蛋白的可溶性人LT-β受體的制備從一個來自體細胞雜種的人12p轉錄序列庫中分離出的人cDNA克隆序列(Baens等，基因組(Genomics)，16，pp.214-18(1993))進入了GenBank，后來被確定為編碼人LT-β-R的序列。這個全長的人LT-β-R cDNA克隆序列自1992年以來可作為GenBank條目L04270而獲得。
直至LT-β-R跨膜區域的胞外結構域(圖1)從一個cDNA克隆中用PCR擴增出來，所用引物在5’和3’端分別摻入了Not I和Sal I限制酶切位點(Browning等，免疫學雜志，154，pp.33-46(1995))。擴增產物用Not I和SalI酶切，純化，與編碼人IgG1 Fc區域的SalI-NotI片段一起連到Not I-線性化的載體pMDR901中。所得到的載體包括各自啟動子起動的二氫葉酸還原酶基因和LT-β-R-Fc融合蛋白。
載體用電穿孔進入CHO dhfr-細胞，每一個標準程序中分離出氨甲蝶呤抗性克隆。LT-β-R-Fc被分泌到培養基中，用ELISA實驗選擇產生最高水平的受體融合蛋白的細胞系。高產量的細胞系大量生長后收集條件培養基。用A蛋白瓊脂糖快速流動親和層析(Pharmacia)分離出純的LT-β受體融合蛋白。
實施例2作為免疫球蛋白Fc融合蛋白的可溶性鼠LT-β受體的制備把來自兩個部分cDNA分離物的5’Not I/ApaLI和3’ApaLI/Not I片段連到pCDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)的Not I位點處，制備出完整的mLT-β-R cDNA克隆。這個cDNA克隆的序列可從GenBank條目U29173獲得。與在GenBank條目L38423的mLT-β-R序列作比較未發現編碼序列有差別。
可溶性mLT-β-R(hIgG1)融合蛋白用PCR擴增制備，全長的mLT-β-R cDNA克隆作模板，引物為5’AACTGCAGCGGCCGCCATGCGCCTGCCC 3’和5’GACTTTGTCGACCATTGCTCCTGGCTCTGGGGG 3’。純化擴增產物，用Not I和SalI酶切，與一個SalI/Not I人IgG1 Fc片段一起連到NotI線性化和磷酸酶處理的SAB132中，形成JLB122。為了能穩定表達，含有mLT-β-R-Fc片段的N0tI序列組件轉移到pMDR901的Not I位點上，形成PSH001，再轉染上述的CHO細胞(Browning等，免疫學雜志，154，pp.33-46(1995))。分泌mLT-β-R-Fc的細胞克隆用ELISA分析鑒定了。純化的受體融合蛋白從CHO細胞上清液中用A蛋白瓊脂糖快速流動層析(Pharmacia)分離出。
實施例3用可溶性人LT-β-R-Fc阻止LT-β受體-配體相互作用在上述腫瘤細胞細胞毒性實驗中檢測了可溶性hLT-β-R-Fc阻止LT配體結合到LT-β受體上的能力。這個實驗中，LT配體的一種可溶性形式(hLT-α1/β2)-它激活LT-β-R信號傳導-用于殺死人腫瘤細胞。LT-β-R信號傳導的抑制劑能降低LT-β-R誘導的腫瘤細胞細胞毒性。
可溶性LT-α1/β2配體包括截短的或修飾的缺乏功能性跨膜結構域的LT-β亞單位。可溶性LT-α1/β2配體與表面形式的LT配體一樣結合并刺激LT-β-R信號傳導(Browning等，免疫學雜志，154，pp.33-46(1995))。
制備hLT-α1/β2、hTNF或hLT-α的系列稀釋液0.05ml放到96孔板中，加入放于0.05ml含有80U/ml(活性單位)hu-IFN-γ的培養基中的5000個胰蛋白消化的HT29細胞(ATCC)。四天之后，如下測量染料MTT的線粒體還原加入10μl的MTT，3小時后用0.09ml含10mM HCl的異丙醇溶解被還原的染料，在550nm測量0.D.值。加細胞之前先加入10μl可溶性受體形式或純的人IgG，使其終濃度為5μg/ml。
表1比較了hLT-β-R-Fc和p55-TNF-R-Fc嵌合體(人IgG作為對照)阻止各種可溶性TNF和LT配體對HT29腫瘤細胞生長抑制效應的能力。
表1LT-β-R和p55-TNF-R免疫球蛋白融合蛋白阻止各種TNF和LT配體對HI29生長抑制效應的能力。
導致50％生長抑制的細胞毒試劑的濃度(ng/ml)具有a細胞毒試劑hu-IgG對照p55-TNF-R-FcLT-β-R-FcTNF 0.08＞10b0.08LT-α3 ＞1000 3LT-α1/β25 5＞200a每種細胞毒試劑在加入細胞之前先與Ig融合蛋白混合10分鐘。融合蛋白的終濃度為5μg/ml。
b沒有測試更高的濃度。
表1的數據表明可溶性LT-β-R融合蛋白(hLT-β-R-Fc)能有效地阻止LT配體(LT-α1/β2)與細胞表面LT-β受體的相互作用，因此是一種本發明的LT-β-R阻滯劑。
正如所預料的，可溶性TNF-R融合蛋白(p55-TNF-R-Fc)完全阻止了TNF誘導的生長抑制，它結合TNF并防止其與表面TNF受體相互作用。這種可溶性TNF受體不影響LT配體介導的抗增殖效應。相比之下，LT-β-R-Fc阻止LT配體而非TNF或LT-α誘導的細胞毒效應。因此，可溶性人LT-β-R融合蛋白不干擾TNF和LT-α配體活化TNF-R。
實施例4
用可溶性鼠LT-β-R-Fc阻止小鼠LT-β受體-配體相互作用用對小鼠細胞的細胞毒性實驗測試了偶聯到人IgG1 Fc區域的可溶性小鼠LT-β受體(mLT-β-R-Fc，見實施例2)阻止小鼠中LT-β受體-配體相互作用的能力(圖2)。這個細胞毒性實驗在WEHI164細胞上進行，所用方法與實施例3所述的用于HT29細胞實驗的基本相同(也可參見Browning和Ribolini免疫學雜志，143，pp.1859-67(1989))。
圖2顯示了mLT-β-R-Fc在小鼠WEHI 164細胞中對配體誘導的LT-β-R信號傳導的效應。正如該實驗所表明的，用大約1到100ng/ml濃度的LT-α/β配體處理，WEHI 164細胞被殺死了。可溶性mLT-β-R-Fc(10μ/ml)阻止了LT配體激活的細胞死亡。加入可溶性小鼠p55-TNF-R-Fc融合蛋白或IgG對照抗體(每種10μ/ml)對阻止細胞死亡有很小的或沒有作用。這些數據顯示mLT-β-R-Fc融合蛋白能有效地與表面LT-β-R分子競爭結合LT配體。這些數據也顯示了LT-α/β誘導的細胞毒作用是LT-β-R介導的并能被可溶性mLT-β-R-Fc抑制，根據本發明它可作為LT-β-R阻滯劑。
實施例5用抗人LT-β-R抗體阻止LT-β受體-配體相互作用抗人LT-β受體的小鼠單克隆抗體(mAb)的制備是把來自CHO細胞的hLT-β-R-Fc融合蛋白連到A蛋白瓊脂糖珠上，在不存在佐劑的情況下反復腹膜內免疫RBF小鼠。最后用可溶性hLT-β-R-Fc腹膜內和靜脈內加強注射動物，經經典方法融合脾細胞，用ELISA篩選雜交瘤上清液(Ling等，干擾素和細胞因子研究(J.Interferon andCytokine Res)，15，pp.53-59(1995))。在細胞淘選實驗中進一步篩選能阻止活化的II-23雜交瘤細胞-它表達表面LT-α1/β2-結合覆蓋在板上的LT-β-R-Fc的雜交瘤上清液。用蛋白A瓊脂糖凝膠(Pharmacia)純化來自培養上清的IgG，制備純的mAb。
為了確定是否抗LT-β受體的mAb能阻止始于結合可溶性LT的LT-β-R信號傳導，用WiDr人癌細胞進行了腫瘤細胞細胞毒性實驗。在這個實驗中，在96孔板上制備0.05ml的LT-α1/β2系列稀釋液，加入10μl 100μg/ml的含有對照的小鼠IgG1 mAb或抗LT-β受體mAb的溶液。然后每個孔加5000個胰蛋白酶消化的WiDr細胞(ATCC)，其0.05ml的培養基中含有50U/ml(活性單位)的hu-IFN-γ。四天之后，如下測量染料MTT的線粒體還原加入10μl MTT，3小時后用0.09ml含10mM HCl的異丙醇稀釋，在550nm測O.D.值。紫色的量與細胞生長量成比例。
圖3顯示抗LT-β-R mAb BDA8可作為一種本發明的LT-β-R阻滯劑。當IFN-γ和可溶性LT-α1/β2配體(大約0.05到50ng/ml)存在時人WiDr癌細胞停止生長。IgG1對照抗體(10μg/ml)對這種生長抑制沒有影響。相比之下，抗LT-β-R mAb BDA8(10μg/ml)使WiDr細胞在存在可溶性LT-α1/β2配體的情況下恢復生長能力。
實施例6用抗人LT-β抗體阻止受體-配體相互作用抗人LT β mAb的制備是先用CFA中的含有大約1-2μg人重組LT-β的A蛋白瓊脂糖凝膠-9E 110-rLT-β珠免疫RBF小鼠，然后用IFA中的同樣材料加強注射一次。最后一次加強注射8周之后，靜脈內給小鼠30μg純化的可溶性rLT-β(用酸從9E10樹脂上洗脫下來)，2天后又給予20μg同樣的可溶性物質。第二次靜脈內加強注射后一天，用經典方法融合脾細胞，產生mAb。直接用ELISA或PMA活化的II-23細胞的FACS染色篩選雜交瘤上清液。通過A蛋白瓊脂糖凝膠快速流動純化來自培養上清的IgG，制備純的mAb(Pharmacia)。
FACS實驗用來選擇能有效阻止可溶性LT-α/β配體結合細胞表面的LT-β受體-這樣模擬體內兩個細胞的相互作用-的抗LT-β抗體。在這個實驗中，讓可溶性人LT-β-R-Fc(2μg/ml)在遞增濃度的試驗抗LT-β mAb存在下(0.02-20μg/ml)結合PMA-活化的II-23細胞上的表面LT配體(Browning等，免疫學雜志，154，pp.33-46(1995))。洗細胞。通過與藻紅蛋白標記的驢抗人IgG反應檢測結合的LT-β-R-Fc。用FACS分析確定所結合的熒光標記量，計算出平均熒光強度。
圖4顯示了測量抗LT-β mAb B9阻止LT-β受體-配體相互作用能力的FACS實驗結果，如上所述。這個實驗表明抗LT-β mAbB9(0.02-5μg/ml)能特異地、有效地與可溶性LT-β-R融合蛋白(2μg/ml)競爭結合細胞表面LT配體，因此能作為本發明的一種LT-β-R阻滯劑。
實施例7用抗小鼠LT-α/β抗體阻止受體-配體相互作用可溶性小鼠LT-α/β復合體的制備同上述的人可溶性LT-α/β復合體。可溶性小鼠LT-β亞單位的制備建立在原先描述的序列信息基礎上(Lawton等，免疫學雜志，134，pp.239-46(1995))。可溶性小鼠LT-α/β復合體用桿狀病毒/昆蟲細胞表達體系表達，用親和層析分離出來，所用的人p55 TNF-R和LT-β-R柱基本上與上述用于表達、純化人LT-α/β復合體的一樣。Armenian倉鼠用純化的可溶性小鼠LT-α/β復合體免疫，與實施例6所描述的基本一樣。倉鼠的脾細胞與小鼠P3X雜交瘤細胞系融合，如已有方法(Sanchez-Madrid等.，酶學方法(Methods of Enzymology)，121，pp.239-44(1986))。根據雜交瘤結合LT-α/β復合體或只結合LT-α的特性分類，分別為抗mLT-β或抗mLT-α。雜交瘤細胞被擴增，抗體用A蛋白親合層析(Pharmacia)從培養上清中純化出來。
為了估計倉鼠抗小鼠LT-α和LT-β mAb是否能阻止LT配體結合mLT-β-R，我們用TIMI-4細胞(ATCC)-一個PMA活化7小時后能表達表面LT配體的小鼠T細胞系。倉鼠抗mLT-α或抗mLT-β mAb與這種細胞在4℃預溫育30分鐘，然后洗兩次。洗過的細胞與1μg/ml mLT-β-R-Fc在4℃溫育。30分鐘后，洗去未結合的mLT-β-R-Fc，然后細胞與10μg/ml藻紅蛋白標記的驢抗人IgG一起溫育30分鐘，檢測結合的mLT-β-R-Fc。用FACS分析確定結合的熒光標記的量，計算出平均熒光強度。
用這種分析發現倉鼠抗mLT-β mAb可以有效地阻止可溶性LT-β受體結合T細胞表面的LT配體。結果顯示在表2中。
表2抗小鼠LT-β單克隆抗體抑制m LT-β-R-Fc結合小鼠表面LT配體的能力抗mLT-β抗mLT-α(BB.F6)(AF.B3)mAb濃度MFCIb％InhcMFCIb％Inhc(μg/ml)0a6 - 6 -0850 8500.01 71188420.03 67238600.1 51448600.3 36628421.0 29718903.0 178688010.0 119495030.0 1095940100.08 98920a.不加受體b.平均熒光通道數目c.抑制百分數實施例8LT-β-R阻滯劑在小鼠中抑制Th1介導的接觸型超敏反應20g雌Balb/c小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)初次致敏是用25μl在4∶1v/v丙酮∶橄欖油中的0.5％2，4-二硝基氟苯(DNFB)涂在每只后腳的底部。初次致敏24小時后，我們再次用25μl的同樣溶液致敏每只小鼠。管制住未麻醉的小鼠進行致敏。第五天(初次致敏后120小時)，我們用90∶10mg/kg氯胺酮∶甲苯噻嗪(腹內)麻醉小鼠，用亞刺激劑量的10μl 0.2％DNFB涂到左耳的背面和腹面。右耳類似地涂上4∶1v/v丙酮∶橄欖油載體。
攻擊免疫應答4小時后，我們給小鼠靜脈注射含于0.1ml磷酸緩沖鹽水(PBS)中的濃度遞增的m LT-β-R-Fc(0.08-5.0mg/kg；實施例2)。單獨注射PBS緩沖液或20mg/kg的人IgG融合蛋白(LFA3-Fc)(Miller等，實驗醫學雜志178，pp.211-22(1993))作為陰性對照。注射8mg/kg的一種抗VLA4特異性mAb(PS/2 mAb；Chisolm等，歐洲免疫學雜志.23.pp.682-88(1993))-已知它能阻止T細胞流入攻擊部位而抑制CHS-作為陽性對照。每種濃度的抗體實驗了4到8只小鼠。
攻擊后24小時，再次用氯胺酮∶甲苯噻嗪麻醉小鼠，用工程用測微器測量兩只耳的厚度，精確到10-4英寸。每只小鼠的耳腫大反應是在對照和DNFB攻擊的耳厚度之差。典型的未抑制的耳腫大反應是95-110×10-4英寸。通過比較處理組與陰性對照組判斷耳腫大反應。處理組中差異的統計學顯著性用方差的單向分析、接著用p＜0.05計算Tukey-Kramer Honestly顯著性差異而求出(JMP，SAS Institute)。
圖5顯示給予遞增濃度的m LT-β-R-Fc與未抑制的DNFB處理的對照動物(PBS和LFA-Fc)相比，DNFB處理小鼠的耳腫大反應明顯降低了。可溶性LT-β-R(大約1-5mg/kg)能與抑制劑抗-VLA4特異性mAb一樣有效地阻止這種接觸型·DTH反應。耳腫大實驗中不被抑制的部分可能產生于“非特異性”粒細胞浸潤。
實施例9硫酸葡聚糖溶液(DSS)IBD模型如圖例說明中所表明的那樣，用hLFA3-Ig處理小鼠，即腹膜內注射對照Ig融合蛋白或mLT β R-Ig。當天，飲用水變為5％硫酸葡聚糖溶液，持續一周。一周后，即開始DSS服用兩周后，殺死小鼠，測量體重變化和大腸長度(從肛門到盲腸)。圖顯示了各種處理后的體重變化和腸長度。腸縮短和體重減少是IBD的指示。可見，mLT β R-Ig處理戲劇性地防止了結腸變短和體重減輕，說明有效。
圖6飲用水中開始加DSS 14天后，接著進行各種處理所觀察到的體重變化。Veh＝載體，LTBr和LFA3指mLT β R-Ig和hLFA3-Ig融合蛋白，它們的使用方式是在加PSS一周前、服用DSS時和一周后腹膜內注射100μg(即三次注射分別在-1、0和1周)。每組10個動物。
圖7服用DSS14天后，接著進行6中所述的各種處理的結腸長度。
實施例10IBD的CD 45RBhi/Scid模型用過去描述的磁性珠技術從C.B-17雌小鼠中分離出CD4陽性T細胞(F.Powrie等，國際免疫學51461-1471，1993)。除去CD8陽性T細胞、 B細胞和單核細胞的CD4細胞用熒光活化的細胞分類法分為CD45RBhigh和CD45RBlow群，也如上所述。5×105CD45RB細胞靜脈注射到雌C.B-17Scid小鼠中，接著測量小鼠體重。可以看出，接受CD45RBlow細胞的動物體重增長正常。與之相比，接受CD45RBhigh細胞的動物結果重量減輕，10周后死亡。當對照小鼠失去了大約20％的初始體重時，處死這些小鼠，對器官進行組織學分析。典型的生病小鼠看上去是惡病質的、有腹瀉現象，具有變得很大的結腸和盲腸。如圖所示用hLFA3-Ig處理的動物類似于未被處理的動物，然而用mLT β R-Ig處理的動物未丟失體重，具有相對正常大小的結腸，缺少通常在結腸中觀察到的大量炎性滲透液。圖8顯示了用各種方法處理的注射了CD45RBhigh的動物體重減輕的時間過程。圖9顯示了注射8周后的體重。mLT β R-Ig在兩個不同IBD操型即CD45RB和DSS模型中的效能為這種治療對免疫系統的深遠作用提供了有力證據。
圖8注射CD45RB CD4陽性T細胞給小鼠后體重的時間變化過程。每條曲線代表一個動物，方框中的題字指注射了哪種細胞即CD45RBhigh或CD45RBlow及處理的性質。每周用100μg蛋白腹膜內注射處理動物。處理開始于注射細胞前二周，實驗過程中繼續進行。
圖9移植10周后各種處理所觀察到的體重的均值和標準偏差(每組5-6個動物)。
實施例11遲發型超敏反應的SRBC模型皮下注射2×107個PBS中的洗過的綿羊紅血球(SRBC)以致敏雌balb/c小鼠。5天之后，注射1×108個PBS中的SRBC至小鼠的右腳墊(亞植入注射)來攻擊小鼠。注射腳墊后的不同時間用測徑器測量腳墊厚度。圖10顯示了用mLT β R-Ig腹膜內注射處理的小鼠的腳墊腫大反應。在致敏時或在致敏與攻擊兩個階段用mLT β R-Ig處理抑制了SRBC誘導的DTH反應。
圖10顯示了用SRBC注射攻擊后18小時所測得的腳墊厚度的增加。處理是陰性對照注射PBS；陽性對照是抗體PS/2，它能阻止VLA4相互作用及所引起的細胞運輸；mLT β R-Ig 100μg皮下注射，在皮下注射SRBC致敏前即刻、攻擊時或兩個時刻都進行。
序列表(1)一般信息(i)申請人BROWNING，Jeffrey L.
BENJAMIN，Christopher D.
HOCHMAN，Paula S.
(ii)發明題目作為免疫疾病治療劑的可溶性淋巴毒素-β受體和抗淋巴毒素受體及配體的抗體(iii)序列數目1(iv)通訊地址(A)收件人James F.Haley，Jr.
(B)街道1251 Avenue ofthe Americas(C)城市紐約(D)州紐約(E)國家美國(F)郵政編碼10020(v)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容的(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)當前申請資料(A)申請號(B)申請日(C)分類(vii)在先申請資料(A)申請號US 08/505,606(B)申請日1995年7月21日(viii)律師/代理人信息(A)姓名HALEY，Jr.，James F.
(B)注冊號27,794
(C)案卷號B191CIP PCT(ix)電訊信息(A)電話(212)596-9000(B)傳真(212)596-9090(C)電傳14-8367(2)SEQ IN NO1的信息(i)序列特征(A)長度197氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Ser Gln Pro Gln Ala Val Pro Pro Tyr Ala Ser Glu Asn Gln Thr Cys1 5 10 15Arg Asp Gln Glu Lys Glu Tyr Tyr Glu Pro Gln His Arg Ile Cys Cys20 25 30Ser Arg Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Val Ser Ala Lys Cys Ser Arg Ile35 40 45Arg Asp Thr Val cys Ala Thr Cys Ala Glu Asn Ser Tyr Asn Glu His50 55 60Trp Asn Tyr Leu Thr Ile Cys Gln Leu Cys Arg Pro Cys Asp Pro Val65 70 75 80Met Gly Leu Glu Glu Ile Ala Pro Cys Thr Ser Lys Arg Lys Thr Gln85 90 95Cys Arg Cys Gln Pro Gly Met Phe Cys Ala Ala Trp Ala Leu Glu Cys100 105 110Thr His Cys Glu Leu Leu Ser Asp Cys Pro Pro Gly Thr Glu Ala Glu115 120 125
Leu Lys Asp Glu Val Gly Lys Gly Asn Asn His Cys Val Pro Cys Lys130 135 140Ala Gly His Phe Gln Asn Thr Ser Ser Pro Ser Ala Arg Cys Gln Pro145 150 155 100His Thr Arg Cys Glu Asn Gln Gly Leu Val Glu Ala Ala Pro Gly Thr165 170 175Ala Gln Ser Asp Thr Thr Cys Lys Asn Pro Leu Glu Pro Leu Pro Pro180 185 190Glu Met Ser Gly Thr19權利要求
1.淋巴毒素-β受體阻滯劑用于制備抑制動物中Th1細胞介導的免疫反應的藥物組合物的用途。
2.根據權利要求1的用途，其中淋巴毒素-β受體阻滯劑含有與一個或多個異源蛋白結構域融合的可溶性淋巴毒素-β受體。
3.根據權利要求1的用途，其中淋巴毒素-β受體阻滯劑包括含有選自SEQ.ID.NO.1的氨基酸功能序列的可溶性淋巴毒素-β受體。
4.根據權利要求2或3的用途，其中可溶性淋巴毒素-β受體含有一個能選擇性結合表面淋巴毒素配體的配體結合結構域，所述配體含有至少一個淋巴毒素β亞基。
5.根據權利要求2或3的用途，其中可溶性淋巴毒素-β受體包含淋巴毒素-β受體的胞外結構域。
6.根據權利要求2或3的用途，其中可溶性淋巴毒素-β受體是人淋巴毒素-β受體。
7.根據權利要求2的用途，其中異源蛋白結構域含有人免疫球蛋白Fc區域。
8.根據權利要求3的用途，其中可溶性淋巴毒素-β受體還含有人免疫球蛋白Fc區域。
9.根據權利要求1的用途，其中淋巴毒素-β受體阻滯劑包括針對淋巴毒素-β受體的抗體。
10.根據權利要求1的用途，其中淋巴毒素-β受體阻滯劑包括針對包含至少一個淋巴毒素β亞基的表面淋巴毒素配體的抗體。
11.權利要求9或10的用途，其中抗體是重組抗體。
12.權利要求9或10的用途，其中抗體是人源化抗體。
13.權利要求9或10的用途，其中抗體是單克隆抗體。
14.根據權利要求13的用途，其中單克隆抗體包括由雜交瘤細胞系B9.C9.1，ATCC保藏號11962，產生的抗人淋巴毒素-β受體單克隆抗體B9。
15.根據權利要求13的用途，其中單克隆抗體含有由雜交瘤細胞系BD.A8.AB9，ATCC保藏號HB11798，產生的抗人淋巴毒素-β受體的單克隆抗體BDA8。
16.根據權利要求1的用途，其中Th1-細胞介導的免疫應答參與動物中IV型遲發型超敏反應。
17.根據權利要求16的用途，其中IV型遲發型超敏反應是結核菌素型超敏反應。
18.根據權利要求16的用途，其中IV型遲發型超敏反應是肉芽腫反應。
19.根據權利要求1的用途，其中Th1細胞介導的免疫應答參與動物接受組織移植后體內組織的細胞排斥反應。
20.根據權利要求1的用途，其中Th1細胞介導的免疫應答參與動物接受器官移植后體內的器官排斥反應。
21.根據權利要求1的用途，其中Th1細胞介導的免疫應答參與動物體內的自身免疫疾病。
22.根據權利要求21的用途，其中自身免疫疾病選自牛皮癬、類風濕性關節炎、胰島素依賴性糖尿病、多發性硬化、交感性眼炎和葡萄膜炎。
23.根據權利要求21的用途，其中自身免疫疾病是類風濕性關節炎。
24.根據權利要求21的用途，其中自身免疫疾病是多發性硬化。
25.根據權利要求21的用途，其中自身免疫疾病是牛皮癬。
26.根據權利要求21的用途，其中自身免疫疾病是是胰島素依賴性糖尿病。
27.根據權利要求1的用途，其中Th1細胞介導的免疫應答參與動物中的慢性炎癥疾病。
28.根據權利要求27的用途，其中慢性炎性疾病為炎癥腸疾病。
29.根據權利要求27的用途，其中慢性炎性疾病為Crohn氏病
30.根據權利要求27的用途，其中慢性炎性疾病為潰瘍性結腸炎。
31.根據權利要求1的用途，其中以足以包被淋巴毒素-β受體陽性細胞的量施予組合物1-14天。
32.根據權利要求1的用途，其中Th1細胞介導的免疫應答被抑制，而不抑制Th2細胞依賴性免疫應答。
33.與一個或多個異源蛋白結構域融合之可溶性淋巴毒素-β受體用于制備治療或減輕動物中Th1細胞相關自身免疫疾病的發展、嚴重性或缺陷的藥物組合物的用途。
34.權利要求33的用途，其中可溶性淋巴毒素-β受體含有能選擇性結合到表面淋巴毒素配體之配體結合結構域。
35.權利要求33的用途，其中異源蛋白結構域含有人免疫球蛋白Fc結構域。
36.權利要求33-35中任一項的用途，其中Th1細胞相關的自身免疫疾病為類風濕關節炎。
37.權利要求33-35中任一項的用途，其中Th1細胞相關的自身免疫疾病為多發性硬化。
38.權利要求33-35中任一項的用途，其中Th1細胞相關的自身免疫疾病為胰島素依賴性糖尿病。
39.一種選擇權利要求39的組合物中淋巴毒素-β受體阻滯劑的方法，包括以下步驟a)在存在有效數量的至少一種淋巴毒素-β受體激活劑和一種推定的淋巴毒素-β受體阻滯劑的情況下培養腫瘤細胞；b)確定推定的淋巴毒素-β受體阻滯劑是否降低了淋巴毒素-β受體激活劑的抗腫瘤活性。
全文摘要
本發明涉及包括“淋巴毒素－β受體阻滯劑”的組合物和方法，其阻礙淋巴毒素－β受體的信號傳導。淋巴毒素－β受體的阻滯劑用于治療淋巴細胞介導的免疫疾病，特別是阻礙Th1細胞介導的免疫應答。本發明涉及淋巴毒素－β受體胞外結構域的可溶形式，這一結構域可作為淋巴毒素－β受體的阻滯劑。本發明也涉及抗淋巴毒素－β受體或其配體表面淋巴毒素的抗體的應用，它可作為淋巴毒素－β受體的阻滯劑。本發明還提供了選擇可溶性受體、抗體和其它阻礙LT－β受體信號傳導的試劑的一種新的篩選方法。
文檔編號A61P21/00GK1607005SQ200410007059
公開日2005年4月20日 申請日期1996年7月19日 優先權日1995年7月21日
發明者J·L·布朗寧格, C·D·本扎明, P·S·霍克曼 申請人:拜奧根有限公司