專利名稱：：高水平表達活性淋巴毒素-β受體免疫球蛋白嵌合蛋白的方法以及它們的純化方法高水平表達活性淋巴毒素-(3受體免疫球蛋白嵌合蛋白的方法以及它們的純化方法本申請是申請日為1999年12月16日、申請號為99815695.7、發明名稱為"高水平表達活性淋巴毒素-p受體免疫球蛋白嵌合蛋白的方法以及它們的純化方法，，的發明專利申請的分案申請。背景TNF家族由稱之為TNF家族配體和TNF家族受體的配體和它們的特異受體對組成(Bazzoni和Beutler，1996;Aggarwal和Natarajan,1996)。象TNF這樣的配體一M現是細胞表面上的膜結合形式，或者在某些情況下它們從細胞表面選擇性裂解并分泌出來。配體與特異受體結合并且這種結合作用使得兩個或多個受體聚集。這些受體的胞內區域可以以某種方式感覺這種變化并且將該信息通過信號轉導機制發送給細胞內。免疫系統以及可能其它非免疫系統的調節中涉及該家族。所述調節經常以"主開關"水平，使得TNF家族信號可以導致大量的繼發TNF最佳代表的作用。TNF可以引發生物體對外來侵襲的一般保護性炎癥反應，其涉及細胞運輸中涉及的附著分子的改變的表現，驅動特異細胞1特異區室的趨化因子產生和各種效應細胞的引導。因此，這些途徑的調節具有臨床潛力。TNF受體家族是一般由胞外結構域，跨膜結構域和胞內信號結構域組成的相關蛋白質的集合。胞外結構域由緊密二硫鍵結構域的2—6個拷貝構成，并且在半胱氨酸的獨特排列的基礎上被識別(Banner等，1993)。各個受體結合相應的配體，但是一個配體可以結合幾個受體。在某些情況下，天然存在沒有跨膜結構域和/或胞內結構域的可溶形式的受體這一點是清楚的，自然中，這些受體的平截本可以具有直接的生物調節作用。osteoprotegerin系統提供該方法的實施例。Osteoprotegerin是一種分泌的TNF家族受體，其阻斷引發破骨細胞活化的由RANK-L(也稱之為TRANCE)和/或TRAIL至受體的信號。通過阻斷這些受體，大多數可能的RANK受體,骨吸收受到阻礙并且骨質增加(Bucay等，1998)。很清楚，病毒利用了該方法來在它們的宿主生物體中抑制TNF活性(Smith等,1994)。這些受體可以對很多作用發出信號，包括細胞分化，細胞死亡或細胞成活信號，細胞死亡信號在Fas和TNF受體的情況下經常通過與caspase蛋白水解酶的級聯相對直接連接而引發。TNF受體是解釋生物學途徑的有力工具，因為它們容易轉化為具有長血清半壽期的免疫球蛋白融合蛋白。二聚體可溶受體形式可以是天然分泌的或表面結合的配體介導作用的抑制劑。通過與這些配體結合，這些融合蛋白阻止該配體與細胞相關的受體相互作用并且抑制相關的信號。這些受體-Ig融合蛋白在實驗意義上是有用的，并且也成功地在臨床上使用，例如TNF-R-Ig已經被用來治療腸炎，類風濕性關節炎和伴隨OKT3給藥的急性臨床綜合癥(Eason等，1996;Feldmann等，1997;vanDullemen等，1995).由TNF家族受體傳遞信號的很多作用的操作可以在治療以免疫為基礎的疾病以及寬范閨的具有由于涉及免疫系統的病理后遺癥的人疾病中應用。例如最近描迷的一種可溶形式的受體，osteoprotegerin,已經證明阻斷骨質的損失(Si咖onet等，1997)。閎此，TNF家族受體傳遞信號控制的作用比必要限制免疫系統調節.針對受體的抗體可以阻斷配體結合并且因此也具有臨床用途。這樣的抗體壽命經常非常長，并且具有超過可溶性受體-Ig融合蛋白的優點，可溶性受體-Ig融合蛋白在血液中具有更短的半壽期'抑制受體介導的途徑代表這些受體的最輝煌的治療應用，最初是TNF受體的激活表現出有臨床前景(Aggarwal和Natarajan,1996)。TOF受體的激活可以引發把細胞中細胞死亡，并且因此對腫瘤的應用還是具有吸引力的(Eggermont等，1996).通過給與受體，即自然途徑，或者通過給與可以與所述受體交聯的抗體,都可以激活該受體.抗體對于治療例如癌癥，可能是有利的，罔為抗體與配體相反可以在血液中保持長時間，而配體在血液中具有短的壽命.拮抗抗體是治療癌癥的有力武器，西為在腫瘤中受體可以更具有選擇性地^達，或者它們在腫瘤中只對細胞死亡或分化發出信號，同樣，通過TNF家族受體介導很多正免疫學作用，例如宿主炎癥反應,抗體產生等，因此拮抗劑抗體在其它非癌癥應用中具有有益效果。反常規地，一個途徑的抑制在治療腫瘤中也可以具有臨床利益.例如，一些腫瘤表達Fas配體，并且該表達可以導致Fas陽性淋巴細胞的死亡，這樣有利于腫瘤避開免疫系統的能力。在這種情況下，Fas系統的抑制然后使得免疫系統以現在有可能評價的其它途徑與肺瘤反應(Green和Ware,1997)。該受體家族中的一員，淋巴毒素-P受體(LTPR)結合表面淋巴毒素(LT)，而表面淋巴毒素由淋巴毒素-a和P鏈的三聚體復合物構成(Crowe等，1994)。在外周免疫系統的發育和成熟免疫系統中淋巴結和脾中作用的調節中涉及這種受體-配體對(Ware等，1995;Mackay等，1997;Rennert等，1996;Rennert等，1997;Clmplin和Fu,19卵)'LTpR和IgG之間可以形成淋巴毒素-p受體-免疫球蛋白融合蛋白(LTPR-Ig),其阻斷表面LT配體和受體之間傳遞信號，并且對小結樹突細胞的功能狀態有影響Ofeckay和Browning1998)。這種阻斷在嚙齒類動物模型中還能導致減少的自身免疫疾病(Mackay等，1998，1995年7月21日申請的U.S.S.N.08/505606和1996年10月26曰申請的U.S.S.N.60/029060)。該受體家族的笫二個成員稱之為皰奢病毒^V介體的HVEM,其結合稱之為Light的配體Ofeuri等，1998)以及herteromericLT配體。目前不知道該受體的功能，但是HVEM-Ig融合蛋白可以用于免疫疾病的治療，并且已經證明該構建體體外影響免疫功能測定(Harrop,J.A.，等，1998)。盡管如上所述TNF家族成員具有臨床上的進步，但是仍然有對于獲得期望產率的適合在臨床條件下使用的受體Ig融M的方法的需要。例如，當在猴COS細胞或者在中國倉鼠卵巢細胞中表達時，LTPR-Ig蛋白可以變成兩種形式。一種形式以高親和性結合配體而另一種則不是這樣。閎此，有對于產生更高產率的以高親和性結合的形式同時使較低親和性形式的存在最小化的方法的需要，發明概迷本發明涉及通過在低溫下在培養系統中培養編碼期望的融合體的DNA轉化的宿主從而使錯折疊或錯橋接蛋白形式的量最小化的具有結合其配體的高親和性的蛋白質-Ig融合體形式，本文稱為"活性"形式的高產率表達方法。在各種實施方案中，本發明涉及通過在大約27"至大約35TC的溫度下培養轉化宿主而在哺乳動物表達系統中表達高產率的方法。優選地，在大約27t:至大約32*C的溫度下培養哺乳動物宿主。在其它實施方案中，本發明涉及在低溫下在酵母表達系統中通過培養轉化宿主表達高產率活性融合蛋白的方法，當在酵母中表達期望的蛋白質時，優選的溫度是大約101C至大約25TC,更優選大約15TC至大約201C。在權利要求保護的本發明一些方法中，蛋白質-Ig融合體包括TNF受體家族的一員，例如淋巴毒素-[5受體或者其片段。或者，權利要求保護的方法可以包括在低溫度下在任何表達系統例如昆蟲或細菌系統中表達期望的融合蛋白。在其它實施方案中，權利要求保護的本發明包括通過權利J^求保護的方法獲得的活性蛋白質-Ig融合體,含有它們的藥物組合物，在另外的實施方案中，本發明涉及制備藥物制劑的方法，包括在大約27C至大約35"C，優選大約27C至大約32"C的低溫下在培養系統中培養編碼期望的蛋白質-Ig融合體的DNA轉化的宿主，高產率表達活性融合蛋白，從培養系統回收活性蛋白質融合體,并且將回收的活性融合蛋白與藥學可接受載體組合。在優選的實施方案中，所述蛋白質-Ig融M包括淋巴毒素-p或者其片段,或HVEM^或者其片段。在其它實施方案中，權利要求保護的本發明涉及應用描述的方法獲得的藥物組合物.權利要求保護的本發明在不同的實施方案中涉及哺乳動物表達系統，以及其它表達系統,例如酵母，細菌系統，或昆蟲系統。在一些實施方案中，本發明涉及通過在大約ion至大約25t;,更優選大約15t:至大約20x:的低溫下培養而在酵母中高水平表達活性融合蛋白的方法，也涉及通過在酵母中該表達方法獲得的活性融合體,和含有這些活性融合體的藥物組合物.本發明中涉及的制M有活性蛋白質-Ig融合體的藥物制劑的方法包括在低溫下,優選大約10C至大約25TC,更優選大約15TC至大約20n下，培養編碼期望的融合體的DNA轉化的酵母細胞.在本發明所有的組合物和方法的最優選的實施方案中，蛋白質-Ig融*包括淋巴毒素-P受體，HVEM或者其片段。附圖的簡要描述圖l:受體-免疫球蛋白嵌合蛋白的圖示。左圖表示典型的IgG分子的圖，Fc結構域以黑色表示，重鏈可變區為灰色，輕鏈是白色，中圖是包括胞內(深灰色)和胞外(淺灰色)結構域的LTPR分子的示意圖。右圖是LTPR-Ig融^^蛋白的示意圖。圖2:概念性圖示表示死亡的LTPR-Ig形式中可能的缺陷，盡管沒有筌定實際錯折疊或錯橋接的氛基酸。圖3:用PNGaseF處理之前和之后人LTPR-Ig的SDS-PAGE分析.第1和2泳道含有使用蛋白質A親和性色譜從37t:下生長的CHO細胞培養上清液中純化的人LTPR-Ig。第3泳道表示用PNGaseF處理去除所有的N"交聯S^之后的相同的制劑，第1泳道是在非還原條件下展開的，第2和3泳道是在還原條件下展開的。通過用考馬斯亮藍將亂歐染色使蛋白質泳帶可以目測。圖4:是通過AGH1親和柱泳道流出的蛋白質和用pH3.5磷酸緩沖液洗脫的蛋白質的非還原SDS聚丙烯酰胺劍歐分析。該劍眨右側的泳il^示親和純化之前的該蛋白質。通過用考馬斯亮藍將亂歐染色使蛋白質泳帶可以目測，圖5:來自AGH1親和柱的流過(下)和洗脫(上)級分結合表面淋巴毒素的能力。從所述FACS分析得到平均熒光強度。右側表示FACS曲線的實施例，其中LTPR-Ig與對照LFA-3-Ig蛋白質的結合相比較.困6:使用POROS醚柱和遞減的疏酸銨梯度的人LTPR-Ig的分析HIC色譜.第1峰代^ALTPR-Ig的下面的失活形式，第2峰M人LTPR-Ig的較大的活性形式。分別集中相應于第1和2^級分并且在4-20%SDS-PAGE皿上分析(插入的一組).標記"1"的泳道含有來自HIC層析譜第l峰的"失活"材料,第2泳道是來自HIC層析譜第2峰的"活性"材料.起始材料在泳道"L"中給出。標記"M"的泳道含有分子量標記物。圖7:使用PharmaciaSourcel5PHE柱的人LTPR-Ig的制備HIC(疏水相互作用層析)。用5MNaCl將含有人LTPR-Ig的蛋白質A洗脫液調節至1.5MNaCl,20mM磷酸鈉，pH7.0的終濃度，并且加載到柱子上。用5體積的1.5MNaCl,20mM磷酸鈉，pH7.0沖洗柱子并且用20mM磷酸鈉，pH7.0洗脫。X-軸代表以分鐘表示的時間，Y-軸代表280咖的吸光度。插入的圖中所示是用流過(FT)和洗脫(E)集合液的考馬斯亮藍將非還原4-1096SDS-PAGE,染色顯影.箭頭指示"活的"和"死的"形式的遷移位置。圖8:從不同溫度下培養的CHO細胞分泌的人LTPR-Ig的SDS-PAGE/蛋白質印跡分析。通過4-20%梯度凝膠通過非還原SDS-PAGE電泳之后使用蛋白質印跡，重復一次分析在指定培養溫度下培養的含有人LTPR-Ig的OIO細胞上清液，國9:培養溫度對從哺乳動物細胞分泌的人LTPR-Ig的總量中死的物質的百分比的影響。在指定溫度下培養雙份含有分泌重組人LTPR-Ig的CHO細胞的燒瓶,并且通過蛋白質A(ProteinA)親和層析純化分泌的人LTPR-Ig.利用分析HIC層析雙，價人LTPR-Ig的"失活"形式的百分比。X-軸代表培養溫度,Y-軸表示以細胞分泌的人LTPR-Ig的總量的百分比表示的"失活"物質的量。圖10:28,32和37X:下制備的HVEM-Ig的非還原SDS-PAGE分析。從28，32和37t:下培養的細胞衍生的HVEM-Ig的蛋白質A純化制劑與非還原SDS-PAGE樣品緩沖液混合并且在預制4-10%SDS-PAGE皿上電泳。用考馬斯藍染色觀察蛋白質泳帶。箭頭標記的泳帶代表未聚集的HVB1-Ig。M上可見的較高分子量的泳帶相應于聚集形式。圖11:37"對32X:產生的HVM-Ig與表面Light和/或LTa/p結合的FACS分析。A).作為濃度的函數的HVEM-Ig與用人LIGHT轉染的293細胞的結合床明32"C下產生的物質結合比37t:下產生的物質更好。B).2fig/ml濃度下HVEM-Ig與LIGMT轉染的293細胞結合觀察到的FACS曲線的實例。C).32"下產生的HVEM-Ig與表現LIGHT和表面淋巴毒素-a/pdTa/p)復合物兩者的II-23T細胞雜交瘤系的表面的改進結合的另一個實例.固12:LIGHT或淋巴毒素-a(LTa)配體與BIA核芯片固定的三個不同溫度下產生的HVM-Ig結合的BIAcore分析。每一條曲線表現出一個配體濃度下的結合作用，使用了下面的濃度:30,15,7.5,3.75，1.87,0.93,0.47,0.23，0.11和O.Ong/ml。每一個芯片加載到相同RU水平，表明結合了相同量的受體-Ig。詳細描述現在對于權利要求保護的本發明詳細地給出參考。本發明涉及產生高水平的TNF家族中受體的免疫球蛋白融合蛋白的功能或活性形式的能力。利用受體-Ig融合蛋白成功予以臨床干涉要求長期存在和長期治療的能力或在疾病期間新病突發最小化。理想的是，用于人用的這些融合蛋白的制劑沒有任何聚集,失活或錯折疊形式，因為它們的存在將降低藥效,并且改變的結構將氣l抗體反應，而這有利于清除藥物從而降低其藥效。此外，抗受體抗體可以與細胞表面上的天然受體直接交聯從而激活它們，即Browning等1996,JEM中描述的那些對抗抗體(agonisticantibody)。對抗抗體激活該系統，因此進一步的受體-Ig治療可能效果更小甚至不利的.所謂"免疫球蛋白融合蛋白"指攜帶免疫球蛋白恒定區的任何部分例如CH1，CH2或CH3結構域或者它們的組合的多肽的胞外結構域的任何功能部分的任何融合體.優選地，所述多肽是TNF家族受體的一員。Ig分子的部分可以從各種免疫球蛋白同種型衍生，包括，例如IgGl，IgG2，IgM，IgA等.所謂"TNF家族受體"指無論天然膜結合的或分泌的(osteoprotegerin情況下)具有規范的TNF家族半胱氨酸橋接模式的任何受體，或者與TNF家族配體的確定成員結合的任何受體(例如Banner等，1993).在其它實施方案中，權利要求保護的本發明涉及通過這里討論的方法獲得的TNF家族受體-Ig融合體，以及涉及^含有它們的藥物制劑.LTPR-Ig蛋白質在猴COS細胞或中國倉鼠印巢細胞中以兩種方式表達.一種形式，"活性"形式，以高親和性結合配體，而另一種"失活"形式則不是如此。對于任何TNF受體-Ig融合蛋白以前沒有描迷過活的和死的形式的混合物，然而，失活形式的本質還不清楚.通過SDS-PA促分析中存在兩條泳帶發現這兩種形式，表達出的物質包含相當量的糖基化異質性;但是，該異質性最可能不導致這里描迷的功能問題。例如，當受體表達為沒有跨膜結構域和免疫球蛋白Fc結構域的可溶性單體形式時，發現非-，單-和二-N-連接的糖基化形式。BDA8可以將單和雙糖基化形式兩者免疫沉淀，BDA8是只識別功能形式的抗體。此外，親和性純化形式具有類似的糖基化異質性。更可能地,我們推測非膜固定形式的表達導致一些導致受體-Ig二聚體的兩個臂之間不適當交聯的異常二硫鍵連接。TNF家族受體一般在胞外配體結合部分3-4重復區，每個區有大約3個二硫橋。可以想得到不適當的折疊將導致不正確模式的二硫鍵或者缺少二硫鍵的一些形成(圖2圖示說明)，在受體-Ig融合蛋白的情況下，看來Fc結構域的早期折疊使得^著進行帶來兩個LTBR鏈，即兩個受體臂緊密鄰近的二聚合。如果受體區還沒有完成它們的折疊，則存在兩個臂之間自由蔬基配對的可能性，即臂之間橋接.這樣的不正確的折疊可能會發生，或者在導致折疊錯誤的兩種情況下與已經形成的二疏鍵緊鄰的自由巰基之間可能產生二硫鍵混亂。也可能在一個臂內發生不正確折疊，即臂內折疊錯誤，盡管這樣的錯誤可能不導致最后分子的根本不同的形狀。在這種情況下，利用常規區分大小方法不容易拆分活性和失活形式。最終證實，當受#^^達為一種Ig融合蛋白時，在受體中，第四區，即與跨膜區最近的區對于配體結合是關鍵的(Marsters等，1992).該區對于很多TNF受體可能是關鍵的，對TNFR55的另一項研究表明其只是對于Ig融合蛋白的角M關鍵的，并且沒有第四區的膜形式在結合TNF配體中是完全活性的(Corcoran等，1994),但是，最近，結晶學分析指出與第四區相關的可能的關鍵功能(Naismith等，1996)。該第四區在還缺少與配體直接接觸的兩個物種之間是相對保守的(Banner等，1993).緊鄰鉸合區和CH2《H3FC區的兩個第四區之間的該區中臂間橋接可能不會明顯地改變該分子的球形，并且西此在以大小為基礎的分離方法中可能是不顯的.不管怎么說,該分子將表現出損傷的配體結合。只具有三個區的受體以相似方式表現，在細胞培養中降低溫度導致分泌的錯折疊的較小形式(即失活形式)的明顯減少.該改進大概是由于在將受體-Ig融合蛋白組裝為期望的二聚體形式之前使得更多的時間折疊LTPR部分的各個區的降低的多肽的折疊速度。將折疊過程減慢需要的絕對溫度是宿主依賴性的。對于哺乳動物細胞(即CHO),權利要求保護的方法優選在大約27TC至大約35TC的溫度下發生，更優選地，該溫M大約27TC至大約32*C。酵母培養系統需要在大約IOX:至大約25TC,優選大約15C至大約20t:的溫度下生長來實現顯著的效益。權利要求保護的本發明的利用使活性蛋白Ig融合體正確折疊。在某些情況下可能需務使細胞在例如大約37"C至大約43TC較高溫度下生長，在這期間只發生非常低水平的克隆基因的表達。期望的生長期之后，融合體可以在低溫下表達，產生提高的活性融合體的產率。如上面所討論的，在哺乳動物系統中的低溫度優選是大約271C至大約35*C,更優選大約27tl至大約32*0下。因此，通過降低蛋白質-Ig融合體表達的溫度的權利要求保護的方法使M域技術人員調節蛋白質和期望的蛋白質的Ig部分兩者的折疊。另外,利用包括親和性和/或常規層析技術的權利要求保護的方法，現在人們可以純化活性級分足以使用該嵌合蛋白來阻斷各種臨床環境中的免疫功能。另外,利用低溫度(即對于CHO小于等于32"C;對于酵母小于等于25t:)細胞培養條件的權利要求保護的方法，現在有可能制備培養上清液，其高度富集較大的活性形式的人LTPR-Ig。此外，該家族受體的其它成員有著相似問題是有可能的。例如，對于TNFR55-Ig(也稱之為p55或p60TNFR)我們在非還原SDSPAGE上觀察到兩條類似的泳帶。類似地，通過在低溫下分泌改進了稱之為HVH1I的另一個TNF家族受體的性質。因為不同溫度下生成的物質沒有明顯的大小差別，所以該受體可以構成一個臂內折疊錯誤的實例。無論怎樣，不考慮機理，權利要求保護的方法導致降低的分泌溫度下TNF家族的這些成員和其它成員的制劑中更具活性融合蛋白的更高百分比.實施例實施例1.特異性識別人LTPR-Ig的活性形式的mAb使用標準蛋白質A基親和性層析方法可以純化用質粒轉染的COS或CHO細胞分泌的LTPR-Ig蛋白質(圖1)。這種純化的蛋白質由非還原SDS丙烯酰胺^上大約100kDa處兩條小間距的泳帶組成(圖3)。兩條泳帶表觀大小大約5kDa差異。當蛋白質被還原時，基本上在大約5OkDa處拆分從異源糖基化得到的兩個泳帶(圖3)。但是，從給出這對還原泳帶的糖基化區別并不能直接得出在非還原條件下觀察到的這兩條泳帶。使用一組對人LTPR的單克隆抗體,我們證明來自第I組的抗體即AGH1和BDA8只識別該受體的大的MW形式(表I;除了上泳帶和下泳帶選擇性的所有的數據均從Browning等處得到，1996)。來自該組的抗體直接與配體結合區結合,這一點由BDA8的Fab片段仍然被封閉的發現所證實。第II組mAbs也可以阻斷配體結合,但是,在生物學測試中，這些mAbs表現出混合的激動劑和拮抗劑行為.當人們從這些mAbs(這些實驗中使用的AGH1)制備親和柱并且應用LTPR-Ig的大形式和小形式的混合物時，較小形式的受體流過而較大形式粘著柱基質.低pH洗脫得到純的大形式制劑(圖4)。對這兩個級分分析它們結^^表面佛波醇醋激活的II-23T細胞雜交瘤細胞即表達淋巴毒素復合體的細胞的能力(如Browning等，1995所述)，只有結合mAb的級分能結合表面淋巴毒素。流過(flowthrough)的級分，即較低分子量泳帶完全是失活的(圖5)。具體地說，來自LTPR-Ig構建體穩定轉染的CHO細胞的上清液通過蛋白質A柱分離該蛋白質。用pH2.8的25mM磷酸鈉緩沖液洗脫純蛋白質，并且用1/10體積p朋.6的0.5M磷酸鈉中和含有這些級分的蛋白質。在0.25亳升體積中用g的LTPR-Ig和4ng的抗-LTPRmAb進行免疫沉淀，接著用只識別小鼠mAb上的K鏈而不識別人Fc區的KappaLock瓊脂糖小3^l獲mAb。離心去除小球并且用蛋白質A瓊脂糖從上清液去除殘留的免疫球蛋白。用SDSPAGE樣品緩沖液(沒有還原劑)處理小球并且將該緩沖液加載到SDS-PAGE皿上.展開皿并且轉移到Hybond上，并且用與辣根itft化物酶偶聯的抗-人IgGFc片段進行蛋白質印跡(LTPRmAb，接著用抗-小鼠IgG-HRP并且對HRP進行化學熒光檢測(Amersham)為了利用AGH1專識別LTPR:Ig的活性形式的能力，^L據制備商的說明用CNBr-激活的瓊脂糖(Pharmacia^Piscataway,NJ)制備AGH1親和柱。用PBS充分沖洗該柱子，并且應用蛋白質A純化的LTPR-Ig,并且收集流出液。用PBS沖洗該柱子，然后用pH2的25mM磷酸鈉洗脫。如上所迷立即中和含有洗脫液的級分。設定10D溶液等于1亳克/亳升，在280nm處通過吸光度測定蛋白質濃度。通過所述FACS分析對含有LTPR-Ig的流出和洗脫合并液測試結合(Browning等，1995)。流過的級分表現出對表達表面LT的細胞沒有FACS染色，而洗脫的合并液保留了完全的結合活性。實施例2.人LTPR-Ig的活性和失活成分的常規色譜分離在使用常規色譜步驟的分離方法設計中利用了上面鑒定的大和小MW成分之間潛在的結構差異。作為一個實例，通MPBS中a過濾可以以大小分離該蛋白質來獲得較大和較小形式的部分分離。然后可以將這些制劑再次施用給相同的柱子來獲得9096以上富集各成分的人LTPR-Ig的較大和較小形式的制劑。或者，可以利用疏水作用層析(HIC)來實現相同的結果。用硫酸銨稀釋蛋白質混合物，加載到HIC柱上，并且用遞減的鹽梯度差異洗脫大的和小的成分。在這些條件下，獲得這兩種人LTPR-Ig成分的基線分離(圖6)。這些方法以及上述免疫親和方法對制備亳克量的人LTPR-Ig的大和小制劑是有用的，但是對于制備大量的用于醫藥應用的這些成分還存在很多期望。發明人發明了一種新的方法，將樹脂用于HIC方法，該樹脂可以大量獲得并且已鑒定允許小形式的人LTPR-Ig物質流過柱子而大成分保留的色譜條件，并且可以選擇性洗脫(圖6)。使洗脫出的物質進行最后步驟,例如大小排阻層析或離子交換層析，來去除聚集的物質和其它雜志，并且其在配制成合適的生理緩沖液之后可以用于體內工作。下面第一個實施例(A)描述了用來分析評價LTPR-Ig制劑中失活物質的量的具體條件。第二個實施例(B)描述了產生高度富集活性成分的LTPR-Ig的制劑的制備純化過程.A).分析性疏水作用層析(HIC)可以用作評價失活LTPR-Ig的量的定量分析在用1.5M硫酸銨平衡并且接著以遞減梯度的硫酸銨洗脫的Pers印tiveBiosystemsPorosether/m柱(4.6X100咖，編號No.P091M526)上實現重組人LTPR-Ig的較小的失活成分和較大的活性成分的基線拆分。將該LTPR-Ig制劑稀釋到0.1毫克/亳升的濃度，并且制備成1.5M硫酸銨,20mM磷酸鈉，pH9(緩沖液A)的最終緩沖液組合物。將一部分(含有100微克蛋白質的1亳升)加載到Porosether/m柱上。用8.3亳升緩沖液A沖洗該柱子。用線性梯度(總梯度體積16.6亳升)從100%緩沖液A至100條沖液B(20inM磷酸鈉，pH9)。差別洗脫活性和失活成分,接著用緩沖液B16.6亳升洗脫。以214咖吸光復脧測柱子洗出液。全部過程在室溫下進行,使用1亳升/分鐘的柱流速.圖5給出了代表性分析HIC層析的洗脫曲線。1峰含有LTPR-Ig的失活級分，2峰是LTPR-Ig的活性成分。為了定量確定兩種形式的相對分布，利用Pers印tiveinstrumentsVison積分軟件將峰面積積分，B).人重組LTPR-Ig的制備性純化條件培養基的澄清和濃縮利用死端式過濾通過5n聚丙烯5sqft.Calyx過濾膠嚢(Micros印arationsInc,Westborogh,MA)，接著通過0.2|i0pticap4英寸過濾柱(MilliporeCorp.,Bedford,MA)從自分泌重組LTPR-Ig的CHO細胞收獲的10升條件培養基去除細胞碎屑。使用串J^接的三個S1Y30SpiralUltrafiltration柱(Amicon，Beverly,MA)通過超濾將澄清的培養基濃縮至大約1升。蛋白質A親和層析:4"C下濃縮的條件培養基以重力通過10毫升蛋白質A瓊脂糖快速流過(Pharmacia)柱.用50亳升PBS，50亳升含有0.5M氯化鈉的PBS和50亳升PBS沖洗柱子。為了去除雜質牛IgG，用50亳升p肪.5的25mM磷酸鈉沖洗柱子'以3亳升級分，用25mM磷酸鈉，lOOmM氯化鈉，pH2.8,通過重力洗脫結合的LTPR-Ig,并且立即用0.3亳升p朋.6的0.5M磷酸鈉中和.通過吸收光譜法鑒定含有蛋白質的級分，合并并且在-70t:下保存。疏水作用層析用40亳升3M氯化鈉，40mM磷酸鈉pH7和20亳升1.5M氯化鈉，20mM磷酸鈉pH7(所有的溶液均在室溫下)稀釋蛋白質A洗脫集合液(40亳升,2.5亳克/亳升的濃度)。將稀釋的合并^載到10X100亳米(7.8亳升)SourcePH15(Pharmacia,PiacatawayNJ)，以2亳升/分鐘的流速洗脫。以20亳升/分鐘的流速，用79亳升1.5M氯化鈉，20mM磷酸鈉pH7沖洗該柱子。以2亳升/分鐘的流速，用20mM磷酸鈉pH7沖洗結合的蛋白質。在280nm下監測流出液的吸光度并且收集9亳升級分。用UV吸收光譜鑒定含有蛋白質的洗脫級分，合并并且在-7or;下保存。圖7代表典型的HIC洗脫曲線。在這些條件下，失活的材料流過該柱而活性材料結合到該樹脂。圖7中的插入分別含有流過和洗脫匯集液的考馬斯亮藍染色的NRSDS-PAGE分析的掃描。大小排阻層析:使用centripr印30濃縮器通過超濾將含有LTpR-Ig的活性成分的HIC洗脫合并液大約100亳升(1.3亳克/亳升)濃縮至9亳升(Amicon,Beverly,MA).將該濃縮液加栽到在PBS中平衡的丄6X100cmSuperose-6prep分級(Pharmacia^Uppsala,Sweden)柱上，以1亳升/分鐘的流速洗脫.以3毫升級分收集流出液。通過UV吸收光譜筌定含有蛋白質的級分。使用NRSDS-PAGE劂歐電泳以3微克/泳道的載量對選擇的級分分析聚集物含量。合并最小可見聚集物的級分并且在-70TC下保存。在該方式中，可以制備LTPR-Ig,其含有最小量的粗培養基中存在的失活LTPR-Ig成分。實施例3.在細胞培養階段富集人LTPR-Ig的大的活性成分的低溫發酵條件在常規哺乳動物細胞培養條件下，以大約50%小和50%大成分的混合物分泌人LTPR-Ig。使用表達相同蛋白質的桿狀病毒感染的細胞導致大大降低水平的小的形式。在28X:培養昆蟲細胞時，我們研究了從低溫下培養的哺乳動物細胞分泌的人LTPR-Ig是否會具有改變的大的和小的形式的比例。圖8所示的是蛋白質印跡分析的28n，30X:，33t:，35X:和37"下T形瓶中培養的分泌人LTPR-Ig的CHO細胞的上清液.在33TC,35TC和37TC下的培養物中存在大的和小的形式(箭頭所示).含有在30"C和28TC下生長的細胞的培養上清液的泳道中幾乎看不到小形式的證據。因此,在細胞培養過程中降低溫度大大減少小的失活形式的人LTPR-Ig的量。為了定量確定細胞培養溫度和富集的較大的活性形式的人LTPR-Ig的程度之間的關系，以1TC的間隔在28C-37X:范圍的溫度下設立兩套培養瓶并培養。通過分析HIC層析對蛋白質A親和純化的人LTPR-Ig樣品進行分析來定量測定從不同溫度下生長的細胞衍生的制劑中存在的人LTPR-Ig的小的和大的成分的比例。如圖9所示，當培養溫度從37TC降低至32TC時，下面泳帶的量快速減少大約5倍。將培養溫度降低至28TC減少下面形式的量但是以小得多的顯著方式。這些結果表明只是從371C降低幾度降低培養溫度就大大減少較小分子量成分的量，因jft^高了人LTPR-Ig的較大活性成分的產率。以這些數據為基礎，對選擇的32€和28TC的培養溫度測試這些發現是否在適合制備使用適合在懸浮液中培養的OIO細胞分泌重組人LTPR-Ig的條件下以大規模重復。對于這些實施方案，在371C下將細胞培養到大約2X10e細胞/亳升的密度，用大約4體積的生長培養基將培養物稀釋，并且在32TC下培養直到細胞成活率降低到低于80%。在生產期間將溫度降低至28C也導致最終收獲中明顯降低水平的失活成分。令人感興趣地注意到在28*€或32TC下生產期間細胞數目不增加得非常快時,在收獲的條件培養基中獲得超過37TC下專門生長的培養基幾倍的增加的生產滴度。下面描述32TC和28t:過程中使用的具體條件。原始數據提示在其它宿主系統例如酵母中降低培養溫度導致類似的好處。令人感興趣的是，在酵母中，在比哺乳動物細胞中低得多的溫度下發現低溫度生產的有益效果。在30"下培養酵母占優勢產生失活形式，在25t:下培養的培養基含有大約相等失活和活性形式的混合物，而在16t:下發酵的培養物占優勢產生活性形式的人LTPR-Ig。這些發現提示低溫發酵將導致在任何分泌宿主系統中明顯更高產率的人LTPR-Ig的活性成分.^域技術人員容易確定每一種系統的最佳生產溫度,這里我們提供了該方法如何應用于LTPR-Ig的生產的詳細實施例.開發了兩種細胞培養方法，它們吸收了降低細胞培養溫度明顯減少從宿主細胞分泌的LTPR-Ig中存在的失活成分的量這一事實的好處。另外，當與36-37X3下進行的傳統發酵循環相比較時，低溫發酵的出人意料的好處是滴度的幾倍的改進，表II總結了用兩種不同的用糖基化程度不同的不同LTPR-Ig構建體轉染的細胞系獲得的失活LTPR-Ig成分的對比產率和相對量(插入該實施例不適切)。32t:細胞培養方法:在補充有10%FBS，140亳克/升的鏈霉素和50亳克/升的慶大霉素的DME/HAM，sF-12培養基中培養用來在懸浮液中生長的分泌人LTPR-Ig的CHO細胞(見下面的表III)。對于擴大比例，以大約2X105細胞/亳升在培養基中接種兩個750亳升-旋轉瓶。在5%C02氣氛下在37匸下將培養物培養到大約3X10e細胞/亳升的密度。合并兩個旋轉培養的細胞懸浮液來接種擴大規模的含有大約10升培養基的生物反應器。以11%02氧化培養物并且在37C下培養三天至大約2X106細胞/毫升的密度。使用該培##來接種含有6.4X105細胞/毫升密度的33升培養基的生產生物反應器。然后在32X:有利溫度下氧itX速度設置在11%02下將該生產生物反應器培養8天。在收獲那天(第8天)細胞密度大約是2X106細胞/亳升，成活率大約60%。在這些條件下，實現了12亳克/升LTPR-Ig的滴度,這比傳統的37t:溫度下培養的相同細胞高兩倍。LTPR-Ig制劑中失活成分的相對量是17%,這代表當與37*€培養獲得的產物相比時多于60%的減少。28"細胞培養方法:在補充有10%FBS,140毫克/升的鏈霉素和50亳克/升的慶大霉素的DME/HAM，sF-12培養基中培養用來在懸浮液中生長的分泌人LTPR-Ig的CHO細胞(見下面的表III).對于擴大比例，以大約2乂105細胞/亳升在培養基中接種兩個800毫升-旋轉瓶。在5%002氣氛下在37t:下將培養物培養到大約3.5X10e細胞/亳升的密度。合并兩個旋轉培養的細胞懸浮液來接種擴大規模的含有大約10升培養基的生物反應器。以11%02氧化培養物并且在下培養2天至大約1.7X106細胞/毫升的密度。使用該培養物來接種起始細胞密度2.5-3叉105細胞/毫升的兩個40升和一個10升的生產生物反應器，分裂比例是1:9.然后在37TC下培養該生產生物反應器并且以11%02氧化，直到達到大約是2X106細胞/毫升的細胞密度(兩天).在第二天結束后,將生物反應器溫度降低至28C，并且再將該生物反應器培養5天.在第7天，細胞密度大約是3X106細胞/亳升并且細胞成活率大于75%,收獲生物反應器，并且如上所述處理條件培養基。在這些條件下，實現了大約20毫克/升LTPR-Ig的最后滴度，這比37t:培養的相同細胞獲得的滴度高3.3倍失活成分的相對比例是10%,這代表比37C制備的物質減少了80%。實施例4:在生產期間使死的形式最小化的Fc區中的改變以我們對為什么死的分子產生這些制劑的假設解釋為基礎，人們會預見縮短Fc區二聚合之前的時間將增加正確折疊的受體區的級分.我們開發幾種方法來實現該結果.不同IgFc區以不同的速率折疊是可能的，但是IgGl區改變為IgG4區不改變活性失活比。第二，通過誘變從IgGlFc區去除交聯兩個肽鏈的鉸鏈區中的兩個半胱氨酸殘基。在不存在鉸合二硫鍵形成下Fc區可以很好地二聚合，但是在其不存在下其速度可能會減緩。丙氨酸置換兩個半胱氨酸導致減少量的死的形式，這一點通過SDS-PAGE和HIC層析定量測定,使得其中野生型LTPR-Ig在37和28X:下含有50和5%失活形式，IgGl鉸合部中缺失半胱氨酸導致當在各溫度下生產時20和5%失活形式。因此,通過置換兩個半胱氨酸的鉸合部修飾可以提高制劑的質量，此外，只置換一個半胱氨酸會具有有益效果也是可能的。這樣的基因修飾會降低依賴于低溫生產方法的死的形式的百分比。實施例5:胱氨酸橋的缺失解決折疊問題一般情況下，確定蛋白質采取的以達到最終正確形式的折疊途徑是非常困難的。不管怎樣，TNF家族受體中一些二疏橋是不通常的并且對于最后的折疊狀態可能是不需要的，這些橋是誘變的好的候選者。通過常規的將101和108位半胱氨酸定點誘變為丙氨酸來去除LTPR-Ig的第三區中一個這樣的橋(使用Ware等，1995中定義的序列編號)導致改進的失活/活性物質的比例，這一點由SDS-PAGE證實。野生型LTPR-Ig—般證明，當分別在37和28TC下生產時存在50和5%失活形式.缺失一個半胱氨酸二蘇橋的突變形式當在這些溫度下生產時具有20和諷的失活形式。實施例6:較低溫度的使用？UiHVM-Ig制劑的質量疾瘆病毒itA介體(HVmO是與LTPR相關的TOF家族受體，并且與LIGHT配體緊密結合,與淋巴毒素-a受體OLTa)弱結合(Mauri等，1998).通過將胞外結構域進行PCR擴增并且與人IgGlCH2和CH3區融合，以Ig融合蛋白形式制備人HVEM,如對于LTPR-Ig所述(Crowe等，1994)。將該構建體插入到稱之為CH269的載體中(Chich鄰ortiche等，1997),用于在人胚胎腎細胞系293中瞬時表達，使用EBNA系統(293-E細胞)高拷貝載體表達。收集上清液，并且使用蛋白質A親和層析和低pH洗脫純化HVEM-Ig。如所迷(Browning等，1996a)從昆蟲細胞系制備重組LTcx。通過使用來自激活的1123的RNA對全cDNA進行PCR擴增來制備重組可溶性人LIGHT，得到Mauri等，1998描述的序列的編碼區，LIGHT的受體結合區通過PCR擴增并且融合到a配對因子前導序列上并且和對于其它相關蛋白質所述一樣(Browning等，1996)基本被表達。在前導序列和受體結合區之間插入FLAG標記物和(G4S)3間隔臂氨基酸序列，使得分泌的LIGHT會具有一個N-末端FLAG序列'該構建體編碼下面的分子"MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPE"SNSTNNGLLFINTTIAS工AAKEEGVSIiEKR..EADYKDDDDNGGGSGGGSGGGSKELNPAAHI/TGANSSLTGSGG'PLLWETQLGLAFIiRGLSYHDGALWTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGWHLEAGEEVWRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMV"其中兩個點表示成熟蛋白質預期的N-末端，其可以通過去除下面接著的兩個氨基酸(EA)而進一步被處理.通過對抗-FLAGmAb柱的親和層析并且用低pH或鈣螯合作用洗脫從上清液純化該蛋白質。如所迷(Chich印ortiche等，l卵7)，也將全長LIGHT插入到載體OI269中用于在193-E細胞表面上的表達。曾描迷過用于受體-Ig與細胞表面檢測的FACS結合方法和用于測定可溶性配體與閨定化受體-Ig的結合的BIAcore方法(Mackay等，1997).BIAcore技術獲得蛋白質與芯片(即受體)結合的真實時間測定。使用補充有10%FBS的培養基在旋轉瓶中在37X3下^達HVEM-Ig的CHO細胞生長至匯合。當細胞達到匯合時，用新鮮培養基置換用過的培養基，并且在37，32和28TC下溫育培養物。一個星期收獲一次28和321C的培養物,每4天收獲371C的培養物.如所述利用蛋白質A親和層析純化分泌出的HVEM~Ig分析之前將純化過的制劑在-70TC下保存，當在28,32和37tJ下生產并純化HVEM"Ig時,所有的制劑在SDS-PAGE分析上行為類似(圖IO),提示蛋白質中沒有發生大的改變.因此，如果發生異常折疊/二硫橋接,則其要么在臂內要么接近Fc區的鉸鏈區發生，即臂間橋接，罔此不會有利地影響分子SDS-PAGE中總的形狀。在FACS結合測試中評價受體-Ig與293-E細胞上表達的LIGHT或激活的1123細胞上的LIGHT結合的能力(圖11)。在兩個細胞類型中，HVEM-Ig結合細胞表面配體的能力比32X:下表達提高了大約2-3倍。應用BIAcore技術，發現當用HVEM-Ig以類似水平加載BIAcore芯片時(RUM映芯片上蛋白質的量)，較低溫下產生的HVEM-Ig比較高溫度下產生的蛋白質結合更多的配體(圖12)。不管LIGHT或LToc是配體都獲得該結果。BIAcore結合曲線表明結合作用開始和結束的真實時間，并且可以看到不管生產溫度，結合作用是類似的。因此，一部分制劑被有效失活，并且較低生產溫度使該比例最小化。我們得出結論較低溫度糾正了異常折疊問題并且提高了活性分子的百分比，盡管我們不能直接觀察失活分子的級分.上述親和層析技術可以用來在通過降低生產溫度和/或在鉸合部或受體本身中誘變各種半胱氨酸優化制劑防止不正確折疊之后拆分活性/失活形式。實施例7:使其它TNF-家族受體-Ig融合蛋白失活形式最小化的基因方案將大多數TNF家族受體制備成具有免疫球蛋白-Fc區的融合蛋白構建體參考p55TNF-R(Loestcher等，1991，Marsters等，1992;Ashkenazi等，1991)p75TNF-R(Mohler等，1993)LTp~R(Crowe等，1994)Fas(Suda等，1993)CD27(Goodwin等.1993)CD30(Smith等，1993)CD40(Fanslow等，1992)Ox40(Baum等，1994)—IBB(Alderepiv等:，1994)HVEM(Mauri等11998)在一些情況下，最特別地，Fas-Ig和CD40-Ig,例如Fanslow等，1992，嵌合體相對于兩個TNF受體的可溶性Fc形式來說活性不好。這些制劑中的一些是各種比例的活性和失活形式的混合物是可能的。失活形式只是指以大大低于(10-1000倍)活性形式的親和性結合的分子，即其可能不是完全沒有結合活性，而是相對于天然細胞上發現的高親和形式來說對于配體具有降低的親和性。異常的受體臂間或受體臂內二硫鍵可能會發生，導致較小活性的蛋白質。使用這些受體或者其它還沒有鑒定的受體，通過常規技術可以制備一組抗-受體mAbs。這些抗體能阻斷配體與受體的結合，這一點優選使用與細胞表面天然受體的配體結合測試來評價(^(a是也可以使用重組受體形式的其它方法)，使用這些抗體來構成親和柱。活性和失活-Fc形式的混合物的制劑將通過柱子并且收集流出液，用低pH緩沖液(一般pH2.5至4.0)洗脫與柱子結合的物質，并立即中和.兩個級分會與FACS結合測試(或者任何其它標準結合版本)中的細胞結合或者與不同蛋白質濃度下的配體結合。這些mAbs中的一些將選擇性結合活性形式，并且可以看到流出液對洗出液的50%結合需要的濃度之間的差異。該結果標記著ioAb是分界mAb。洗出液與流過液中蛋白質的比例表示制劑中活性形式百分比。因此這些筌定的mAbs可以用來親和純化活性形式。此外，它們在各種免疫測試版本中的應用可以用來優化期望的受體-Fc形式的正確形式的表達。該測試可以另外在與其它常規純化方法的結合中使用來發現純化受體的活性形式而不用親和技術分離的方法。使用這些Abs畫出活性和失活形式，培養溫度可以優化并且采用層析方法來富集活性形式。或者，可以利用HIC柱方法來分開活性和失活形式，并且使用該方法，可以優化培養條件。類似地，這些測定可以形成受體部分半胱氨酸誘變的基礎，來確定有問題的二硫鍵，去除有問題的二^后得到功能活性物質.因為這些受體中很多具有作為人疾病的治療藥物的用途，并且人們希望只將正確折疊形式對患者施用，所以確定制劑和去除不好的結合形式的這些方法具有實用性.不超出本發明的精神或范閨在本發明方法中進行各種修飾和改變對于本領域技術人員是顯而易見的.因此，本發明覆蓋本發明的修飾和改變，前M它們在后面的權利要求書及其等價物的范圍內。表I:抗-LT-b-RmAbs的總結<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>'評價抗體是否阻斷可溶性受體與激活的11-23的結合的測試.Nd-沒有lb山羊抗-小鼠Fc包被平板,捕獲的抗-受體mAb,HT29s加IFNg.c阻斷d加強e可變的，在一些測定中一些部分抑制，在其它中則沒有.f使用mAb加KappalLock系統沉淀的受體形式.在該表中的數據和使用BIAcore技術所做的表位圖的基礎上確定的組.表II:在不同培養溫度下培養的CHO細胞中LTPR-Ig構建體的表達<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>a使用蛋白質A親和層析評價表達水平.b蛋白質A親和純化后使用分析HIC方法評價LTPR-Ig制劑中存在的失活成分的量.表III:DME/HAM，sF-12培養勤卜充物<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>a成分與基礎培養^除末混合，然后將體積調至1升.用50%的鹽酸將培養基的pH調節到7.20至7.25.參考文獻Aggarwal,B.和Natarajan,K.(1996)歐州細胞因子研究(Eur.CytokineRev.)7:93Alderson,M.R,等(1994)歐州免疫化學雜志(EurJImmunol)24,2219-27Ashkenazi，A.等(1991)美國國家科學院院刊(ProcNatlAcadSciUSA)88,10535-9Banner,D.W.等(1993)細胞(Cell)73,431-445Baum，P.R-等(1994)EmboJ13,3992-4001Bazzoni,F.和Beutler,B.(1996)新英國藥學雜志(NewEnglandJ.Med.)334:1717.Browning,J.L.等(1995)免疫學雜志(J.Immunol.)154，33-46Browning,J.等(1996)實驗藥物雜志(J.E鄰.Med.)183;867-878Browning,J.L.等(1996a)生物化學雜志，(J.Biol.Chem.)271,8618-8628Bucay,N.等(1998)基罔與JL艮(GenesandDevelopment)12:1260Chaplin,D.和Fu，Y-X.(1998)免疫學最新觀點(CurrentOpinioninImmunology)10,289-297Chiceportiche,Y.等(1997)美國國家科學院院刊(J.Biol.Chem.)272,32401-32410Corcoran,A.等(1994)歐州生物化學雜志(Eur.J.Biochem.)223,831-840Crowe,P.D.等(1994)科學(Science)264,707-10Eason,J\D.等(1996)移植(Transplantation)61:224.Eggermont,AJl等(1996)臨床癌癥雜志(J.Clin.Oncology)14:2653Fanslow，W.C.等(1992)免疫學雜志(JImmunol)149，655-60Feldmann,E等(1997)免疫學年筌(Ann.Immunol.)64:283-350.Goodwin,R.G.等(1993)細胞(Cell)73,447-56Green,D.和Ware，C.F.(1997)美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.SciUSA)94:5986Harrop,.T.A.,等(1998)生物化學雜志(T.Biol.Chem.)273:27548.Loetscher，H.等(1991)生物化學雜志(JBiolChem)266,18324-9Mackay，F.等(1998)胃腸病學(Gastroenterology)115:1484-1475Mackay，F和Browning,J.(1998)自然(Nature)395:26Mackay，F.等(1997)歐州免疫學雜志(EurJImmunol)27，2033-42Marsters，S.等(1992)生物化學雜志(J.Biol.Chem.)267，5747-5750Mauri,D.N.等(1998)免疫學(Immunity)8，21-30Mohler,等(1993)免疫學雜志，(JImmunol)151，1548-61Naismith,J.等(1996)分子識別雜志(J.Mol.Recognition)9,113-117Rennert,P.D.等(1996)實驗藥物雜志(JExpMed)1S4,1999~2006Rennert,P.D.,Browning,J.L.,和Hochman，P.S.(1997)國際免疫學(IntImmunol)9,1627-39Simmone仁W.S.等(1997)細胞(Cell)89:309.Smith,C.A.,Farrah,T.，和Goodwin,R.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