專利名稱：9β－乙酰基閉鞘姜內酯作為抗癌劑的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學，具體地說是化合物9β-乙酰基閉鞘姜內酯(9β-acetoxystunolide，又名9β-乙酰基閉鞘姜內酯，自編號為CP-C)作為抗癌劑的應用。
背景技術：
癌癥是威脅人類生命的第二大殺手，每年奪去約700萬人的生命，是國際上急待攻克的難題。手術、化療、放療綜合治理迄今仍是治療癌癥的主要手段。但是化療、放療在殺死癌細胞的同時，也殺死宿主的正常細胞，產生嚴重的副作用，破壞了機體的免疫功能，使免疫系統難以對抗入侵的細菌和病毒。現行的抗癌藥物缺乏對癌細胞的特異性、選擇性、不能有效對抗腫瘤細胞的惡變及手術后的癌轉移、擴散。對癌細胞的多藥抗藥性也束手無策。這種現狀促使藥物化學家開辟新思路，尋找、研制新結構、新活性作用機理的抗癌活性成分。
從天然藥物中尋找抗癌劑或先導物是新藥研究的重要途徑，而體外活性篩選則是待研藥物必經的第一關卡。化療藥物主要是細胞毒類藥物，就是用國際通用的癌細胞系進行體外細胞毒試驗，藥物細胞毒活性達到國際標準(IC50≤4μg/ml)，則認為具有細胞毒活性。細胞毒藥物是通過干擾與細胞的生長、死亡、分化及功能相關的機制，抑制癌細胞生長甚至殺死癌細胞。細胞毒類藥物引起細胞死亡有兩種機制，一種是細胞生長受到抑制，誘導細胞程序性死亡(凋亡)，第二種是細胞處于(藥物)劇烈損傷條件下引起細胞壞死。
本發明人的在先發明專利公開了從杯菊中提取化合物9β-乙酰基閉鞘姜內酯及其分離提純的方法，并通過實驗發現了該物質具有抗癌活性。其結構式為
發明內容本發明的目的是提供一種從天然藥物杯菊中獲得天然產物化合物9β-乙酰基閉鞘姜內酯作為抗癌劑的應用。
本發明是將具有細胞毒活性的9β-乙酰基閉鞘姜內酯作為抑制五種癌細胞的細胞毒型抗癌劑。它對五種癌細胞具有選擇性，能有效殺死L1210(小鼠白血病)、CCRF-CEM(人類白血病)、KB(人鼻咽癌)、MCF-7(人乳腺癌)、LS174T(人結腸癌)等五種癌細胞。其中IC50(半數殺傷率濃度)分別是0.89、0.65、0.25、1.28、0.63μg/ml。
9β-乙酰基閉鞘姜內酯(CP-C)對L1210細胞毒活性，是細胞毒類型，直接作用于細胞膜，抑制有絲分類，限制核苷摻入細胞的DNA中，其機理與抑制微管蛋白有關，引起細胞壞死，而不是引起細胞凋亡。
9β-乙酰基閉鞘姜內酯(CP-C)對L1210等五種癌細胞的作用規律是隨著藥物濃度增加及作用時間延長，L1210細胞生長率越低。
以下是本發明的實驗方法和實驗數據1.細胞毒試驗樣品9β-乙酰基閉鞘姜內酯的細胞毒試驗用錐蟲蘭染料排除法測定細胞毒活性，同時用生長曲線法測定藥物對癌細胞生長抑制作用，并推算IC50。
實驗數據9β-乙酰基-閉鞘姜內酯對L1210、CCRF-CEM、KB、MCF-7及LS174T五種癌細胞具有選擇性細胞毒活性，IC50分別為0.89、0.65、0.25、1.28、0.63μg/ml。
對L1210細胞系活細胞生長影響低濃度下(0.1，1.0μg/ml)對活細胞無抑制作用；在細胞毒濃度下(＞1.0μg/ml)隨作用時間延長，活細胞數減少，48小時后癌細胞全部被殺死。見表1及圖1。
表1CP-C濃度及作用時間對體外L1210細胞生長的影響表1藥物濃度24h 48h(ug/ml)細胞數細胞生長率細胞數細胞生長率對照組 0 7.22±0.40 14.9±0.07CP-C 0.16.80±0.2194.0 13.3±0.8089.30.36.11±0.8284.6 10.7±0 1071.81.05.00±0.1469.3 7.29±2.1048.93.01.10±0.6415.2 0.36±0.302.510.0 0.40±0.135.5 0.00±0.000.02.細胞毒類活性作用機理試驗1)用微量滴定克隆測定法(Microtitration clonogenic assays)和菌落形成試驗(Colony formation assays)測定細胞毒活性是細胞毒類活性(cytotoxic)還是生長抑制活性(cytostatic)。結果見表2、圖2。
表2用微量滴定克隆測定法，CP-C作用于L1210細胞2、6、24小時后，對L1210細胞菌落形成的影響。
表2不同藥物濃度相對于對照組的L1210細胞菌落形成率(％)(ug/ml)2h 6h 24h對照組0 100100 100CP-C 0.180.4±4.1 72.6±6.767.9±3.70.368.1±3.6 67.0±5.060.0±7.51.044.3±3.2 45.0±7.036.2±10.23.022.2±5.0 12.3±3.20.1±0.110.0 10.5±4.4 5.8±1.5 0.1±0.1結果表明9β-乙酰基閉鞘姜內酯(CP-C)抑制菌落形成取決于藥物作用的時間和濃度，作用時間為2h時，隨濃度增加，菌落形成逐漸降低；作用24h時，細胞毒性明顯增加。結論細胞毒性比細胞生長抑制活性更敏感。
2)氚代脫氧胸腺嘧啶核苷摻入試驗([3H]-thymidine incoporation)，研究CP-C對L1210細胞核酸代謝作用的影響。結果見表3、圖3。
表3CP-C作用于L1210系2、6、24小時后，對氚代-胸苷摻入L1210細胞的影響。
表3不同藥物濃度相對于對照組對[3H]-thymidine的摻入率(％)(ug/ml)2h 6h 24h對照組0 100 100100CP-C 0.194.1±2.6 90.9±3.8 89.8±6.50.387.9.1±3.2 82.0±2.1 79.0±11.01.079.9±4.6 65.9±4.1 53.7±5.03.048.1±17.8 33.9±8.9 2.3±1.710.0 36.9±15.6 16.1±3.1 0.1±0.1結果表明CP-C隨著時間和濃度的變化明顯抑制氚代脫氧胸苷摻入L1210細胞的DNA中。當作用2h時，3H胸苷摻入L1210細胞的百分比開始下降，隨著時間的增加，抑制增強，24h時，濃度增至10ug/mL，抑制作用最強。結論①隨CP-C濃度及作用時間增加，抑制氚代-胸苷摻入L1210細胞內的作用增強；②CP-C細胞毒性與抑制DNA合成有關。
3)用流式細胞術測定CP-C對L1210細胞周期分布的影響。
表4、圖4是CP-C對L1210細胞系細胞周期分布的作用。圖5是CP-C處理后，L1210的流式細胞法矩形圖。
由表和圖可見，CP-C阻斷L1210細胞于G2/M相，推測細胞生長抑制率及菌落形成與細胞有絲分裂作用有關。
表4CP-C作用于L1210細胞系2、6、24、48小時后，對各時相細胞周期分布的影響。
表4溫育時間濃度 細胞周期分布百分率(％)(ug/mL) HD*G0/G1SG2/MPP*對照組0h00.7±0.139.1±1.330.2±1.226.0±1.54.2±1.1CP-C 2h 01.0±0.540.0±1.828.4±3.025.7±1.35.0±2.20.1 1.2±0.640.8±1.528.0±1.426.5±2.13.5±1.40.3 1.1±0.439.1±1.229.8±3.025.1±1.34.9±2.11.0 1.5±0.636.9±3.430.6±1.827.4±0.93.6±0.93.0 1.8±0.730.6±2.527.4±3.835.3±4.84.9±0.710.0 2.0±0.926.7±2.727.6±2.538.9±2.33.9±2.16h 01.9±1.439.2±1.430.0±2.226.8±1.02.1±0.50.1 1.2±0.240.6±4.729.3±4.126.5±1.43.3±1.60.3 1.1±0.442.0±1.325.7±1.828.1±1.13.1±0.91.0 1.2±0.840.9±1.418.8±2.635.8±1.53.3±1.23.0 2.1±0.525.2±4.626.1±2.945.6±3.23.0±0.510.0 2.8±2.421.9±5.826.3±4.148.3±4.14.7±1.524h 00.8±0.343.8±1.328.5±1.423.5±1.73.4±0.90.1 1.7±2.144.4±4.728.1±5.422.2±0.93.6±1.20.3 0.6±0.142.0±1.328.6±1.824.9±2.53.9±1.81.0 0.6±0.233.2±2.324.3±4.333.9±1.811.0±0.33.0 13.6±6.5 16.9±2.719.5±9.728.0±3.022.0±3.610.0 18.1±7.8 19.9±9.822.2±1.825.2±3.415.0±4.348h 05.9±0.342.3±0.328.8±0.219.4±1.40.1±0.50.1 2.3±0.442.9±0.226.3±0.824.1±0.13.2±0.90.3 2.4±1.145.2±0.425.6±0.923.1±0.93.2±1.31.0 2.2±0.130.2±1.324.4±0.221.5±0.921.1±1.93.0 19.8±4.7 22.7±7.513.7±2.425.2±0.919.1±0.710.0 66.5±0.0 10.3±4.79.6±2.3 6.1±0.5 7.6±7.24)DNA斷裂分析(DNA fragmentation assay)見圖6，經48小時藥物作用后，L1210細胞系中提取DNA瓊脂糖膠電泳圖。由圖表明CP-C未出現DNA“梯子”型標準的斷裂現象。說明CP-C是細胞毒型的抗癌劑，它引起的細胞毒是使細胞壞死，而不是誘導細胞凋亡。
本發明的有益效果是1.從對9β-乙酰基閉鞘姜內酯的系統的藥理研究提供充分的依據，證實9β-乙酰基-閉鞘姜內酯的抗癌活性是屬于細胞毒類型，其活性作用機理與抑制微管蛋白有關，引起細胞壞死。9β-乙酰基閉鞘姜內酯細胞毒活性較強，具有選擇性，能有效殺死L1210、CCRF-CEM、KB、MCF-7及LS174T五種癌細胞，半數殺傷率濃度IC50分別為0.41、0.59、0.16、0.92、0.53μg/ml，遠遠超過國際標準，9β-乙酰基閉鞘姜內酯是優良的細胞毒類抗癌劑。
2.植物杯菊中珊9β-乙酰基閉鞘姜內酯含量較高，不同季節的原料，其含量是十萬分之一左右，該植物可以人工培植，能得到充足的原料。
3.從杯菊原料中提取9β-乙酰基閉鞘姜內酯，分離提純簡單易行。
圖1是本發明的CP-C濃度和作用時間對L1210細胞生長的影響。
圖2是本發明的用微量滴定測定法CP-C作用于L1210細胞2、6、24小時后對L1210細胞系菌落形式的影響。
圖3是本發明的CP-C作用于L1210細胞系2、6、24小時后，對氚代一胸苷摻入L1210細胞的影響。
圖4是本發明的CP-C(3μg/ml)作用于L1210細胞2、6、24小時后，G、S、G2/M、HD、PP各時相細胞分布的百分率(％)。
圖5是本發明的L1210細胞經CP-C處理后，CP-C對L1210細胞周期分布的流式細胞術矩形圖，濃度和作用時間對細胞生長的影響。
圖6是本發明的DNA斷裂實驗，藥物作用48小時后，L1210的DNA提取物的瓊脂糖膠電泳譜圖。
具體實施例方式
實施例化合物9β-乙酰基閉鞘姜內酯作為抗癌劑的應用。
1.化合物9β-乙酰基閉鞘姜內酯按以下方法分離提純1)將杯菊全株干燥粉碎后，取粉碎樣10千克，用95％乙醇浸泡30天，提取浸膏，得浸膏CP0≈800克；
2)取此浸膏800克，與硅藻土按1∶1比例混合，用95％乙醇攪拌混合均勻，在水浴上炒干，稱重，W樣＝710克，用1L索式提取器，分別用石油醚、氯仿∶乙酸乙酯＝3∶1、乙酸乙酯、丙酮、甲醇依次萃取，得粗組分CP1(120克)、CP2(100克)、CP3(100克)、CP4(130克)、CP5(150克)。
3)用L1210細胞分別對CP1～CP5進行細胞毒活性篩選，結果，抗癌活性大小依次為CP2＞CP3＞CP1＞CP4＞CP5。
4)對CP2進行柱層析，用40～63μm硅膠作吸附劑，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇作洗脫劑，濕法裝柱，分得11個組分，經細胞毒活性試驗測定，得到三個活性組分(用A4、A5、A7表示)。
5)對活性組分A4用TLC級硅膠作吸附劑，用正己烷-乙酸乙酯-甲醇作洗脫劑，真空柱層析，重結晶，得純晶體CP-C。
6)用L1210癌細胞系對粗提物對組分和純晶體CP-C進行抗癌活性篩選，得9β-乙酰基-閉鞘姜內酯抗癌活性成分。(可參考發明專利申請02128070.3的公開說明書)2.用染料排斥法測9β-乙酰基閉鞘姜內酯細胞毒活性及細胞生長抑制作用，來確定9β-乙酰基閉鞘姜內酯抗癌活性與濃度(使用量)的關系①樣品處理稱取9β-乙酰基閉鞘姜內酯樣品1mg，溶于二甲亞砜(DMSO)中，溶解后，每個培養槽中加4μL，把等體積的(4μL)無藥樣的二甲亞砜單獨加在對照組槽中每個槽中，樣品濃度計算如下表
②選用對數生長期的腫瘤細胞，用10％小牛血清的RPM11640培養基，(在24槽的培養基內，對L1210細胞系)配成5×104個細胞的懸浮液，溫育24小時內，細胞不受損。然后，分裝在上述不同濃度的實驗組的24孔槽中。在37℃溫箱中培養48至72小時。
③取等體積的(0.4ml)0.2％錐蟲蘭與細胞懸浮液混合后，在室溫下作用5分鐘，在15分鐘內用血細胞計數儀在相對比顯微鏡(Phase-contrastmicroscopy)下計數200個細胞，未顯色的是活細胞，呈藍色的是死細胞。
④上述細胞生長試驗重復3次，實驗結果是三次實驗的平均值。
3.結果評定 (對照組活細胞率應在90％以上)以L1210活細胞百分率為縱坐標，以CP-C濃度的對數為橫坐標作圖，得細胞生長率曲線，推算半數殺傷率濃度IC50。
由圖得出結論9β-乙酰基閉鞘姜內酯對L1210、CCRF-CEM、KB、MCF-7及LS174T五種癌細胞的IC50分別為0.89、0.65、0.25、1.28、0.63μg/ml。可以作為抗癌劑使用(本抗癌劑是制備成最終抗癌藥的中間產品)9β-乙酰基閉鞘姜內酯還可溶于丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有機溶劑中。
其他癌細胞的濃度配制CCRF-CEM癌細胞配成1×105/槽；KB、MCF-7、LS174T細胞系濃度為4×104/槽；操作與L1210一樣。
4.根據上述測定的9β-乙酰基閉鞘姜內酯抗癌活性與濃度(使用量)的關系，針對不同的癌細胞，不同的應用領域，按本領域技術人員公知的方法，配制成不同溶劑、不同濃度的CP-C抗癌劑溶液。
權利要求
1.化合物9β-乙酰基閉鞘姜內酯作為抑制五種癌細胞小鼠白血病、人類白血病、人鼻咽癌、人乳腺癌、人結腸癌的細胞毒型抗癌劑的應用。
全文摘要
本發明是從天然藥物中獲取的化合物9β－乙酰基閉鞘姜內酯(9β－acetoxystunolide)作為細胞毒型抗癌劑的應用。它對L1210、CCRF－CEM、KB、MCF－7及LS174T等五種癌細胞具有選擇性。9β－乙酰基閉鞘姜內酯對上述五種癌細胞的IC50分別為0.89、0.65、0.25、1.28、0.63μg/ml，抗癌活性與藥物濃度及作用癌細胞的時間有關，濃度越大、作用時間越長，細胞毒活性越強。對L1210癌細胞的細胞毒活性，屬于細胞毒型(cytotoxic)而不是細胞生長抑制活性(Cytostatic)，它殺死癌細胞的機理與抑制微管蛋白有關，使癌細胞壞死而不是使細胞凋亡。是一種優良的抗癌劑。
文檔編號A61P35/00GK1634035SQ20041007956
公開日2005年7月6日 申請日期2004年11月17日 優先權日2004年11月17日
發明者李祖強 申請人:云南大學