免疫原性組合物及方法

專利名稱：免疫原性組合物及方法
技術領域：
本發明部分由來自美國政府的基金所資助(國立衛生研究院，資助號NIH NO1-AI 05397和NIH NO1-AI 25458)。因此美國政府對本發明享有某些權利。
背景技術：
為了增強免疫原性組合物的有效性，業已報道了多種免疫原性組合物及方法，使用了蛋白質組合物、基于質粒的組合物以及重組病毒構建體作為免疫原性組合物。之前研究已表明基于質粒的免疫原性組合物，在全身應用上，使全身免疫系統對使用諸如蛋白質或重組病毒的常規抗原的二次全身免疫接種更具易感性(參見，如，Xiang等，1997Springer Semin.Iiiimunopathol.，19257-268；Schneider，J.等，1998Nature Med.，4397；以及Sedeguh，M.等，1998 Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，957648；Rogers，W.O.等，2001 Infec.& Immun.，69(9)5565-72；Eo，S.K.，等，2001 J.Immunol.，166(9)5473-9；Ramshaw I.A.和Ramsay，A.J.，2000 Immunol.Today，21(4)163-5)。
一種經常使用DNA初免/活載體的加強療法，其包括使用痘苗病毒來加強免疫。最近文獻中的例子包括了對人類免疫缺陷病毒(HIV)進行的上述免疫接種(Hanke T.等，2002 Vaccine.20(15)1995-8；AmaraR.R.等，2002 Vaccine.20(15)1949-55；Wee E.G.等，2002 J.Gen.Virol.，83(Pt 1)75-80；Amara R.R.等，2001 Science.292(5514)69-74)。初免-加強(prime-boost)免疫接種使用DNA和修飾的痘苗病毒載體表達抗原，諸如單純皰疹病毒-2糖蛋白D、嬰兒利什曼原蟲(Leishmania infantum)P36/LACK抗原、惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)TRAP抗原、HIV/SIV抗原、鼠結核病抗原和流行性感冒抗原，業已報道了該免疫接種能誘發特異性抗體和細胞因子應答(參見，例如Meseda C.A.等，2002 J.Infect.Dis.，186(8)1065-73；Amara R.R.等，2002 J.Virol.，76(15)7625-31；Gonzalo R.M.等，2002 Vaccine，20(7-8)1226-31；Schneider J.等，2001 Vaccine，19(32)4595-602；HelZ.等，2001 J.Immunol.，167(12)7180-91；McShane H.等，2001 Infec.& Immun.，69(2)681-6和Degano P.等1999 Vaccine，18(7-8)623-32流行性感冒和瘧疾模型)。
最近，業已報道了質粒腺病毒初免加強的基因免疫接種療法能誘導α-胎蛋白特異性腫瘤免疫并保護豬不患豬霍亂(參見，例如，MengW.S.2001 Cancer Res.，61(24)8782-6；Hammond，J.M.等，2001 Vet.Microbio.，80(2)101-19及美國專利號6,210,663)。
業已報道了其它DNA質粒病毒初免加強的療法。參見，例如，Matano T.等，2001 J.Virol.，75(23)11891-6(DNA初免/仙臺病毒載體加強免疫)。已報道用重組痘病毒初免加強的DNA可用于HIV-1治療(參見，例如，Kent，S.J.等，1998 J.Virol.，7210180-8；Robinson，H.L.等，1999 Nat.Med.，5526-34；和Tartaglia，J.等，1998 AIDSRes.Human Retrovirus.，14S291-8)。
盡管評價了許多DNA初免/病毒加強療法，但目前所述的免疫接種療法仍具有一些缺點。例如，在受試者中一些上述提及的病毒會產生疾病癥狀；另有一些可能會導致體內重組。一些病毒難以制備和/或接納外源基因的能力有限。還有一些病毒不利之處在于會引發人體中大量預先存在的載體免疫性，以及其它的安全考慮。
這些需要本領域新的和有用的免疫接種療法，對所討論的抗原產生增強的細胞和體液免疫應答水平并符合安全、容易制備及在加強免疫接種時克服哺乳動物宿主對載體的天然免疫應答的要求。
發明概述本發明提供了一種新的方法、組合物和試劑盒，通過初免/加強療法用于在哺乳動物受試者中誘導抗病原抗原或其它抗原的免疫應答，與單獨施用DNA質粒組分或重組病毒組分所獲得的結果相比，針對所述抗原顯示了令人驚奇的細胞免疫應答協同刺激作用。
在一個實施方案中，本發明提供了一種在哺乳動物受試者中誘導抗原特異性免疫應答的新方法。該方法包括施用于受試者有效量的第一組合物，所述第一組合物包括含有編碼抗原的DNA序列的DNA質粒，所述編碼序列受指導其通過DNA質粒在哺乳動物細胞中進行表達的調控序列調控。該方法還包括施用于受試者有效量的第二組合物，所述第二組合物包括含有編碼抗原核酸序列的重組水泡性口膜炎病毒(rVSV)，所述編碼序列受下述調控序列的調控，該調控序列調控上述編碼序列在哺乳動物細胞中通過rVSV進行表達。在一個實施方案中，所述重組VSVA是減毒、可復制的病毒。在另一個實施方案中，所述重組VSV是不復制的病毒。可以按任何順序施用所述第一和第二組合物。此外，本發明考慮在多次施用其中一種組合物后再多次施用另外一種組合物。在一個實施方案中，優選共施用細胞因子。
在本發明另一個實施方案中，提供了一種用于在哺乳動物受試者中誘導對抗原產生抗原特異性免疫應答的免疫原性組合物。所述免疫原性組合物包括含有編碼所述抗原的DNA序列的DNA質粒的第一組合物，所述編碼序列受下述調控序列的調控，該調控序列調控上述編碼序列通過DNA質粒表達。該組合物也包括至少一種可復制組分，重組水泡性口膜炎病毒(VSV)，其包含編碼相同抗原的核酸序列，所述編碼序列受指導其通過重組VSV表達的調控序列所調控。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種在哺乳動物受試者中誘導增強水平的抗原特異性免疫反應的治療或預防方法中所使用的試劑盒。該試劑盒包括，其中，至少一種第一組合物，其包括含有編碼所述抗原的DNA序列的DNA質粒，所述編碼序列受調控其在哺乳動物中表達的調控序列的調控；至少一種第二組合物，其包括一種可復制組分，其包含編碼所述抗原的核酸序列的重組水泡性口膜炎病毒(rVSV)，所述編碼序列受調控其在哺乳動物中表達的調控序列的調控；和實施上述方法的說明書。
在另一個實施方案中，本發明提供了上述免疫原性組合物或其組分在制備誘導動物對該組合物中所使用的抗原產生免疫反應的藥物中的用途。
本發明的其它方面和實施方案公開于下列的詳細描述中。
附圖簡述

圖1A是編碼猴免疫缺陷病毒(SIV)gag p37蛋白的示例性質粒DNA示意圖。該圖顯示了該質粒含有操縱gag蛋白表達的人巨細胞病毒(HCMV)啟動子/增強子，牛生長激素多腺苷酸化位點(BGH polyA)，復制起點序列(ori)和卡那霉素抗性(kanR)標記基因。
圖1B是編碼恒河猴白介素12的p35和p40亞基的示例性雙順反子質粒DNA示意圖。p35亞基受HCMV啟動子所調控并具有SV40polyA位點。p40亞基受猿猴巨細胞病毒(SCMV)啟動子所調控、具有BGH polyA位點并反向轉錄。該質粒也含有ori序列和kanR基因。
圖2是顯示在通過本發明初免/加強療法所免疫動物未分級外周血單核細胞(PBMC)中VSV N特異性γ干擾素(IFN-γ)ELISpot應答的柱狀圖。最左邊的黑條代表用編碼SIV gag蛋白DNA質粒免疫接種，并用表達流行性感冒紅血球凝聚素(flu HA)蛋白的VSV載體加強的方案。淺灰條代表涉及用DNA gag質粒初始免疫接種后再用表達HIV gag和env蛋白的VSV加強的本發明方案。白條代表涉及用空或對照的DNA質粒(con DNA)初始免疫接種后再用表達HIV gag和env蛋白的VSV免疫接種的方案。最右邊的黑條代表涉及con DNA質粒初始免疫接種后再用表達flu HA蛋白的VSV免疫接種的方案。每組所代表的結果來自5只動物。
圖3是顯示通過本發明初免/加強療法所免疫動物未分級PBMC中HIV env 6101特異性γ干擾素(IFN-γ)ELISpot應答的柱狀圖。最左邊的淺灰條代表用編碼SIV gag蛋白的DNA質粒免疫接種并用表達fluHA蛋白的VSV載體加強的方案。斑紋條代表涉及用DNA gag質粒初始免疫接種后再用表達HIV gag和env蛋白的VSV加強的本發明方案。方格條代表涉及用空的對照DNA質粒初始免疫接種后再用表達HIV gag和env蛋白的VSV免疫接種的方案。打點的條代表涉及用conDNA質粒初始免疫接種后再用表達flu HA蛋白的VSV加強免疫接種的方案。每組所代表的結果來自5只動物。星號表示產生統計學上顯著差異，p＝0.0001。
圖4是顯示通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)本發明初免/加強療法免疫動物血清抗SIV gag p27抗體效價的圖。在第0天、第4周和第8周施用質粒DNA并在第15和第23周分別施用VSV(Indiana G血清型)和VSV(Chandipura G血清型)加強。用編碼SIV gag蛋白的DNA質粒免疫接種并用表達flu HA蛋白的VSV載體加強的方案表示為(◆)。涉及用DNA gag質粒初免免疫接種后再用表達HIV gag和env蛋白的VSV加強的本發明方案表示為(■)。涉及用空的對照DNA質粒初始免疫接種后再用表達HIV gag和env蛋白的VSV免疫接種的方案表示為(▲)。涉及用對照DNA質粒初始免疫接種后再用表達fluHA蛋白的VSV免疫接種的方案表示為(●)。每組所代表的結果來自5只動物。各組間統計學上顯著差異表示為p＝0.0073(*)；p＝0.5941(#)或p＝0.0027(￥)。
圖5是顯示通過ELISpot測定法評價用本發明初免/加強療法免疫接種的動物每百萬細胞中SIV gag特異性斑點形成細胞的圖。在第0天、第4周和第8周施用質粒DNA并在第15和第23周分別施用VSV(Indiana G血清型)和VSV(Chandipura G血清型)加強。用編碼SIV gag蛋白的DNA質粒免疫接種并用表達flu HA蛋白的VSV載體加強的方案表示為(◆)。涉及用DNA gag質粒初始免疫接種后再用表達HIV gag和env蛋白的VSV加強的本發明方案表示為(■)。涉及用空的對照DNA質粒初始免疫接種后再用表達HIV gag和env蛋白的VSV免疫接種的方案表示為(▲)。涉及用對照DNA質粒初始免疫接種后再用表達flu HA蛋白的VSV免疫接種的方案表示為(●)。每組所代表的結果來自5只動物。各組間統計學上顯著差異通過方括號表示為p＝0.0001和p＝0.0002。
圖6是顯示通過初免/加強結合引發的加強的免疫應答的圖，所示符號如圖5，導致增加的AIDS保護作用，通過在激發后幾天內測定CD4T細胞損耗減少來確定。
圖7是顯示通過初免/加強結合引發的加強的免疫應答的圖，所示符號如圖5，導致增加的AIDS保護作用，通過在激發后幾天內測定血漿內循環病毒(病毒拷貝數/ml)減少來確定。
發明詳述本發明提供了一種在哺乳動物受試者或脊椎動物受試者中誘導抗原特異性免疫應答的新方法，通過結合使用現有技術中所描述的免疫原性組合物的某些組分，并優化組分以產生令人驚奇和協同的效果。一般而言，該方法包括施用于受試者有效量的組合物，所述組合物包括含有編碼所述抗原的DNA序列的DNA質粒，所述編碼序列受指導其在哺乳動物或脊椎動物細胞中通過DNA質粒表達的調控序列的調控。該方法也包括施用于受試者有效量的組合物的步驟，所述組合物包括一種可復制組分，重組水泡性口膜炎病毒(rVSV)。該rVSV包括編碼抗原核酸序列，所述編碼序列受指導其在哺乳動物和脊椎動物細胞中通過rVSV表達的調控序列的調控。
這兩種免疫原性組合物中先施用的組合物稱為初免組合物(primecompositon)。再施用的免疫原性組合物稱為加強組合物(boostingcomposition)。即可以DNA組合物作為初免組合物施用，將VSV載體組合物作為加強組合物施用，反之亦然。在一個實施方案中，在VSV載體作為加強組合物施用之前施用于受試者至少一次或多次初免組合物。其后，施用于受試者至少一次或多次加強組合物。此外，本發明考慮在多次施用其中一種組合物后多次施用另一種組合物。該方法進一步考慮施用有效量的細胞因子作為該方法的一步驟。
業已驚奇地發現與單獨施用DNA質粒或重組VSV相比，實施該方法能誘導哺乳動物受試者產生增強的免疫應答，包括在CD8+T細胞中對抗原的應答。事實上，正如下面的實施例所示，免疫應答較這兩種免疫原性組合物相加組合所預期的還要強。因此，該新方法所誘導的免疫應答在細胞和/或抗體抗抗原反應中具有驚人和協同性增強。參見，如，下表1和圖4和5，其中對HIV-1 gag的抗原特異性細胞應答的峰值是單獨施用DNA質粒免疫原性組合物應答的3倍多，或幾乎是單獨施用rVSV免疫原性組合物應答的9倍。
盡管所述哺乳動物受試者是靈長類的，優選是人，但本發明并不僅限于鑒定為哺乳動物的受試者。該方法的組分詳述如下，關于所引證的文獻在此并入作為參考，以供本領域技術人員詳細了解。
A.DNA質粒免疫原性組合物本發明的免疫原性組合物包括DNA質粒，所述DNA質粒包含編碼有待針對其產生免疫應答的選定抗原的DNA序列。在該質粒中，選定抗原受指導其在哺乳動物或脊椎動物細胞中表達的調控序列所調控。該質粒自身組分是常規的。
可用于本發明中的非病毒質粒載體含有分離的和純化的DNA序列，所述的DNA序列含有編碼所述選定免疫原性抗原的DNA序列。該DNA分子可源自病毒或非病毒，如業已設計用于編碼外源或異源核酸序列的細菌。這樣的質粒或載體包括來源于病毒或噬菌體的序列。許多非病毒載體為本領域所知并可包括但不僅限于，質粒、細菌載體、噬菌體載體，“裸”DNA和用陽離子脂質或聚合物凝聚的DNA。
細菌載體的例子包括，但并不限于，源自卡介苗(bacille CalrnetteGuérin)(BCG)、沙門氏菌(Salmonella)、志賀菌(Shigella)、大腸桿菌(E.coli)和李斯特菌(Listeria)等的序列。合適質粒載體包括，例如，pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pK37、pKC101、pAC105、pVA51、pKH47、pUB110、pMB9、pBR325、ColE1、pSC101、pBR313、pML21、RSF2124、pCRl、RP4、pBAD18和pBR328。
合適的可誘導的大腸桿菌表達載體的例子包括pTrc(Amann等，1988 Gene，69301-315)、阿拉伯糖表達載體(如，pBAD18，Guzman等，1995 J.Bacteriol.，1774121-4130)和pETIId(Studier等，1990Methods in Enzymology，18560-89)。pTrc載體靶基因的表達依賴于從雜合的trp-lac融合啟動子開始的宿主RNA聚合酶轉錄。pETIId載體靶基因的表達依賴于從T7 gn10-lac融合啟動子開始的轉錄，其為共表達的病毒RNA聚合酶T7 gn1所介導。該病毒聚合酶提供自宿主菌BL21(DE3)或HMS I 74(DE3)，來源于在lacUV5啟動子轉錄調控下的居民(resident)原噬菌體所含有的T7 gn1基因。PBAD系統依賴于為araC基因所調控的可誘導的阿拉伯糖啟動子。該啟動子在阿拉伯糖存在條件下被誘導。
所述啟動子和其它調控序列操縱抗原在所需哺乳動物或脊椎動物宿主中表達，可類似地選自一系列已知可用于該目的的啟動子。許多這樣的啟動子描述如下。在一個實施方案中，免疫原性DNA質粒組合物描述如下，可用的啟動子是人巨細胞病毒(HCMV)啟動子/增強子(描述于，如美國專利號5,168,062和5,385,839中，于此并入作為參考)和SCMV啟動子/增強子。
本發明核酸序列，分子或載體中所包含的附加調控序列包括，并不限于，增強子序列、聚腺苷酸化序列、剪切供體序列和剪切受體序列、分別位于要被翻譯的多肽開始和末端的轉錄起始和終止位點、用于轉錄區翻譯的核糖體結合位點、表位標記、核定位序列、IRES元件、Goldberg-Hogness“TATA”元件、限制性酶切位點、選擇性標記物等。增強子序列包括，如，SV40 DNA的72bp串聯重復序列或逆轉錄病毒長末端重復或LTRs等，用于增加轉錄效率。
在DNA質粒中可用其它元件，包括，如復制起點、聚腺苷酸化序列(如BGH polyA、SV40polyA)、藥物抗性標記(如卡那霉素抗性)等可也選自許多已知序列，包括那些實施例中所描述的和如下所特別提及的。
啟動子和其它常用載體元件的選擇是常規的，其可獲得許多這樣的序列，以用于設計本發明的質粒。參見，如Sambrook等，MolecularCloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork，(1989)及其所引證的參考資料，例如，3.18-3.26頁和16.17-16.27頁及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，New York(1989)。本領域技術人員可容易地從本領域已知原料中選擇所有在本發明中可使用的質粒組分，并可獲得自制藥工業。質粒組分和調控序列的選擇無需考慮對本發明的限制。
在下面公開的專利中詳細描述了用于免疫原性組合物的合適的DNA質粒構建體的例子，所公開的內容在此并入作為參考，如，國際專利公開號WO98/17799、WO99/43839和WO98/17799；以及美國專利號5,593,972、5,817,637、5,830,876和5,891,505等。
類似地，所選定抗原可以是如下討論中所鑒定的抗原。在本文免疫原性組合物的一個實施方案中，所述選定抗原是HIV-1抗原，諸如通過gag、pol、env、nef、vpr、vpu、vif和tat其中之一所表達的。優選所述抗原序列和DNA質粒的其它組分得到優化，例如通過選擇合適于目的宿主的密碼子并通過去除任一抑制性序列，如下也討論了關于抗原的制備。
因此這種免疫原性組合物包括編碼用于在宿主中表達單一選定抗原的一種質粒。根據本發明的方法，所述質粒組合物也包括一種DNA質粒，所述DNA質粒含有編碼多于一拷貝的所述相同選定抗原的DNA序列。或者，所述組合物可包含表達多個選定抗原的一種質粒。每種抗原受各自的調控元件或組分所調控。或者，每種抗原可受相同的調控元件所調控。在另一個實施方案中，所述DNA質粒組合物可含有多個質粒，其中每個DNA質粒編碼相同或不同的抗原。
在另一個實施方案中，所述DNA質粒免疫原性組合物可進一步包含，作為單個DNA質粒的組分或作為含有抗原的DNA質粒的一部分，編碼所需細胞因子、淋巴因子或其它基因佐劑的核苷酸序列。核酸序列可獲得自的上述合適佐劑的宿主確定如下。在本發明所例證的一個實施方案中，與本發明DNA質粒組合物一起施用的所需細胞因子是白介素-12。
所述DNA質粒組合物期望在藥學上可接受的稀釋液、賦形劑或載體中施用，例如那些如下所討論的。盡管所述組合物可以任何可選擇的給藥途徑施用，但在一個實施方案中期望的給藥方法是包含所述質粒和作為促進劑的布比卡因肌內注射共施用，描述如下。
在本發明方法的一個實施方案中，其中所述DNA組合物是初免組合物，該方法包括在施用rVSV之前施用至少一次DNA質粒，所述質粒包含編碼以誘導所需免疫應答的抗原的序列。在另外一個實施方案中，所述DNA初免組合物還含有第二質粒，所述質粒編碼所選擇的細胞因子。還在另外一個實施方案中，如下所例證，所述DNA初免組合物包括三種質粒，一種質粒表達第一抗原，第二種質粒表達第二種不同的抗原以及第三種質粒表達所選擇的細胞因子佐劑。正如實施例中所詳述的，DNA初免組合物的一個實施方案包括三種優化的質粒，(1)編碼RNA優化的SIV gag p37基因的質粒(見圖1A)；(2)編碼兩種恒河猴IL-12亞基p35和p40的質粒，分別在兩種啟動子的調控下(見圖1B)和(3)編碼HIV-1 gp160 env基因的質粒。
當作為初免組合物時，所述DNA質粒組合物在rVSV加強組合物之前施用一次或優選地，多于一次。當用作為加強組合物時，該DNA質粒組合物在rVSV初免組合物之后施用一次或優選地，多于一次。
B.rVSV免疫原性組合物用于本發明方法和組合物的另一種免疫原性組合物是能復制的、活的、減毒的水泡性口膜炎病毒(VSV)遞送載體。該重組VSV包括編碼選定抗原的核酸序列，所述編碼序列受指導其在哺乳動物或脊椎動物細胞中表達的調控序列所調控。在本發明的方法中，用于DNA質粒組合物的抗原與用于rVSV免疫原性組合物的抗原相同。
VSV是一種牛病毒，其是分類學上稱為單分子負鏈RNA病毒目的一員，包含11kb非節段的，負鏈RNA基因組，編碼四個內部結構蛋白和一個外部跨膜蛋白。從3′-5′順序，基因編碼的蛋白稱為核殼體(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、跨膜糖蛋白(G)和聚合酶(L)。使用本領域已知技術可分離并“拯救”活的VSV。參見，如美國專利號6,044,886、6,168,943和5,789,299；國際公開專利號WO99/02657；Conzelmann，1998，Ann.Rev.Genet.，32123-162；Roberts和Rose，1998，Virol.，2471-6；Lawson等，1995 Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 924477-4481。另外，例如，VSV(Indiana)的基因組序列在NCBI數據庫的登記號為NC001560。其它VSV序列，包括VSV(Chandipura)序列，可在該數據庫中獲得，例如，參見登記號Ay382603、Af128868、V01208、V01207、V01206、M16608、M14715、M14720和J04350等。VSV毒株，例如New Jersey和Indiana等都可從保藏中心獲得，例如美國典型培養物保藏中心、Rockville、Maryland(參見，如登記號VR-1238和VR-1239。在該說明書全文中所引證的文件中描述或參考了其它序列。在該說明書中所引證的所有文獻在此并入作為參考。)。
業已顯示VSV基因組能容納多于一個的外源基因，至少達三千個堿基。這些病毒的基因組非常穩定，不會發生重組，幾乎很少發生顯著的突變。此外，因為它們的復制是細胞質復制，所以它們的基因組含有RNA，它們不會整合到受感染宿主細胞的基因組。同樣，這些負鏈RNA病毒具有相對簡單的轉錄調控序列，可以容易地操縱用于插入有效的外源基因。最后，可以通過改變外源基因相對于病毒轉錄起始子的位置以調節外源基因表達的水平。3′-5′基因表達梯度反映了轉錄病毒聚合酶沿著基因組模板前進時可成功越過所遇到的每個基因內基因終止/基因起始信號的可能性減少了。因此，位于接近3′端轉錄起始啟動子的外源基因可充分表達，而那些插入在基因組更遠側位置的外源基因則表達較少。
VSV可在許多不同的細胞型中復制達高效價，并大量表達病毒蛋白。這不但意味著VSV可作為一種有效的功能性外源基因的遞送載體，而且在批準用于生產人類生物制品的細胞系中相應的rVSV可達到的生產水平。
rVSV具有出色的將編碼關鍵的保護性免疫原的外源基因從病毒病原體遞送至許多不同的細胞型的能力，隨后引起真正成形的免疫原性蛋白大量表達(Haglund，K.，等，2000 Virol.，268112-21；Kahn，J.S.等，1999 Virol.，25481-91；Roberts，A.等，1999 J.Virol.，733723-32；Rose，N.F.等，2000 J.Virol.，7410903-10和Schlereth，B.等2000 J.Virol.，744652-7)。如此表達的該免疫原可同時引起高持久的病毒中和抗體反應和保護性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)(Roberts，A.等，1998 J.Virol.，724704-11)。
除了rVSV的功效，該活的病毒基因遞送載體是安全的，因為在健康人中野生型VSV基本上不會引起的疾病癥狀或病理，甚至在大量病毒復制時亦然(Tesh，R.B.等，1969 Am.J.Epidemiol.，90255-61)。此外，人類受其感染并因此預先存在對VSV的免疫性是罕見的。假如進一步減毒，這些rVSV組合物適用于免疫受損的或并亞健康的受試者。在該方法中使用VSV載體的顯著優點是存在著許多VSV血清型，這是由于VSV病毒附著蛋白G的交換或修飾所致。因此，攜帶相同異源抗原的不同血清型VSV載體可重復施用以避免宿主免疫系統產生任何針對VSV G蛋白的中和抗體反應的干擾。
使用本領域之前描述的技術可設計重組VSV，其攜帶所選定抗原及插入到在病毒轉錄啟動子調控下的VSV任何位置的調控序列。在一個實施方案中，所述編碼選定抗原的異源基因插入到VSV的G和L編碼區之間。在另外一個實施方案中，異源基因可融合至G蛋白位點。在另一個實施方案中，異源基因融合或鄰接至任一其它VSV基因位點。
在另一個實施方案中，基因在基因組不同位置‘改組’。具體而言，將基因組中N基因‘改組’至不同位置。克隆產生所述改組的重組cDNA序列包括修飾起始VSV質粒主鏈(pVSV-XN1)。該起始載體的三個變體包括偏離正常基因順序(3′-N-P-M-G-L-5′)的質粒，如下所示i)3′-P-N-M-G-L-5′；ii)3′-P-M-N-G-L-5′；和iii)3′-P-M-G-N-L-5′。用于產生這些質粒的克隆策略所采用的方法描述于Ball，L.A.等1999 J.Virol.，734705-12中。該技術利用了這一事實，即發現在每一編碼序列之間的基因末端/基因起始信號幾乎是一樣的，因此允許基因重排構建而無需導入任何核苷酸取代。或者，可將一些關鍵點突變導入非編碼序列以在附近產生有助于基因組重排的限制性酶切位點。
還在這些載體的另一個實施方案中，G基因細胞質區29個氨基酸的羧基末端編碼序列通過缺失G基因5′C末端的氨基酸而被截短。或者，完全缺失G基因。在一個實施方案中，除去G基因完整的細胞質區。在另一個實施方案中，除去細胞質區至少28個氨基酸。在另一個實施方案中，缺失細胞質區的約20個氨基酸。在另一個實施方案中，缺失細胞質區的約10個或更少的氨基酸。
據報道，改組基因組方法和G蛋白修飾方法都會產生部分生長缺陷(Flanagan，E.B.，等2001 J.Virol.756107-14；Schnell，M.J.等，1998 EMBO J.，171289-96)。可以預計VSV這樣的修飾可產生更多的減毒表型或甚至產生非復制型VSV，可用于本發明各種實施方案中。參見，如Johnson，J.E.等，1998 Virol.，251244-52.37；Johnson，J.E.，等.，1997 J.Virol.，715060-8。
類似地，所選定抗原可以是如下討論所確定的抗原。在本文所述的免疫原性組合物的一個實施方案，所選定抗原是一種進化枝B病毒隔離群的HIV-1 gag和/或env(gp160)基因。還在一個實施方案中，所述抗原是一種HIV-1 pol、nef、vpr、vpu、vif或tat基因。優選地所述抗原序列得到優化，例如通過選擇合適于目的宿主的密碼子和/或通過去除任一抑制性序列，如下也討論了關于抗原的制備。
為了克服在連續施用中任何潛在的載體復制效率降低的問題，設計了類似的一組載體，各自攜帶不同VSV血清型的G基因，可進行成功的加強免疫接種。來自VSV Indiana、New Jersey和Chandipura的G蛋白的一級氨基酸序列基本上趨異，使得對某種預先存在的免疫性并不排除其它種的感染和復制。因此，通過rVSV(Indiana)產生的中和抗體反應應當無法干擾rVSV(New Jersey)或rVSV(Chandipura)的復制。可通過用來自VSV Chandipura或VSV New Jersey的趨異同系物取代VSV Indiana G基因形成三種截然不同的免疫活性載體，以制備可允許成功進行連續免疫接種的載體組。
因此，該rVSV免疫原性組合物可包括一種編碼單一選定抗原的rVSV，用于在宿主中表達。根據本發明的方法，所述rVSV免疫原性組合物包括一種rVSV，其含有編碼多于一個拷貝的相同選定抗原的核酸序列。或者，該組合物可包括表達多種選定抗原的一種rVSV。每種抗原可受各自的調控元件或組分所調控。或者，每種抗原可受相同的調控元件所調控。在另一個實施方案中，所述rVSV組合物可包括多種rVSV，其中每種rVSV編碼相同或不同的抗原。
在另一個實施方案中，所述rVSV免疫原性組合物可進一步包含或與細胞因子、淋巴因子或基因佐劑施用。細胞因子可以蛋白形式施用，或在上述質粒中施用或在重組VSV中通過插入細胞因子編碼序列的插入物所編碼。例如，所述細胞因子編碼序列可以插入到VSV基因組任何位置并從病毒轉錄起始子處開始表達。可獲得核酸序列的合適佐劑的宿主確定如下。在本發明所例證的一個實施方案中，與本發明rVSV組合物一起施用的所需細胞因子是白介素-12。
所述rVSV組合物期望在藥學上可接受的稀釋液、賦形劑或載體中施用，例如那些如下所討論的。盡管所述組合物可以任何可選擇的給藥途徑施用，在一個實施方案中期望的施用方法為鼻內注射。
在本發明方法的一個實施方案中，其中所述rVSV組合物是加強組合物，該方法包括在施用DNA免疫原性初免組合物后施用至少一次rVSV。該rVSV組合物表達與初免組合物相同的抗原。在一個實施方案中，rVSV組合物包括附加的編碼所選細胞因子的重組病毒。在另一個實施方案中，rVSV包括表達細胞因子的序列，如IL-12存在于表達所述抗原的相同的rVSV中。在另一個實施方案中，多種rVSV組合物作為后期加強物施用。在一個實施方案中，至少兩種rVSV組合物在初免組合物之后施用。在另一個實施方案中，至少三種rVSV組合物在初免組合物之后施用。
理想地，如上所討論，每一后繼的rVSV組合物具有不同的血清型，但具有相同的抗原編碼序列。所述不同的血清型選自已知天然存在的血清型和通過操縱VSV G蛋白提供的任一合成血清型。在已知方法中，用于改變rVSV G蛋白的技術描述于國際公開號WO99/32648和Rose，N.F.等，2000 J.Virol.，7410903-10中。
在另一個實施方案中，每種rVSV具有不同的抗原編碼序列，但具有相同的VSV G蛋白。在另一個實施方案中，每種rVSV具有不同的抗原編碼序列及不同的VSV G蛋白。正如實施例中所詳述，一系列rVSV加強組合物的一個實施方案中包括兩種優化的rVSV，其含有HIV-1 gp160 env基因，其中一種rVSV是Indiana血清型，另一種是Chandipura血清型。
根據本

發明內容
，該rVSV免疫原性組合物在施用具有相同抗原的初免DNA免疫原性組合物之后，可作為加強組合物施用于宿主。在本發明方法的任一實施方案中，在第一rVSV組合物施用之后，第二和任一附加的rVSV可作為加強物施用。在一個實施方案中，所述附加的rVSV加強物是具有相同抗原的相同血清型。或者，所述附加的rVSV加強物具有不同的血清型，在施用加強的DNA免疫原性組合物之前連續施用。業已表明施用至少三種加強物是有用的。當作為加強組合物時，所述rVSV組合物在初免DNA免疫原性組合物之后連續施用。當作為初免組合物時，所述rVSV組合物施用一次或優選地施用多次。在一個實施方案中，所述附加的rVSV加強物是具有相同抗原的相同血清型。或者，所述附加的rVSV加強物具有不同的血清型，在施用加強的DNA免疫原性組合物之前連續施用。
能在體內表達HIV-1蛋白的合適的rVSV構建體的例子詳述于如下實施例和公開出版物中，如，Rose等，2000 Virol.，268112-121；Rose等，2000 J.Virol.，7410903-10910；Rose等2001 Cell，106539-549；Rose等，2002 J.Virol.，762730-2738；Rose等，2002 J.Virol.，767506-7517，于此并入作為參考。附加的rVSV載體可進一步減毒，可通過漸進地截短VSV G蛋白或如上所述改組的VSV結構基因來進行。根據本發明的內容，非復制型VSV也可得到使用。rVSVs顯示了減毒和免疫活性之間所期望的平衡，預計能用于本發明中。
如下實施例中所例示的幾種示例性rVSV構建體例子具有重組基因組(1)3′N-P-M-G-HIV env-L-5′(2)3′N-P-M-G-HIV gag-L-5′(3)3′N-P-M-G-SIV gag-L-5′在一個實施方案中，本發明的方法和免疫原性組合物采用了這些rVSV構建體中的一種。在另一個實施方案中，本發明的方法和免疫原性組合物采用了rVSV-HIV env和rVSV-HIV gag。后者的免疫原性組合物同時誘發對真正成形的gp160有效的體液免疫應答，及能殺死HIV-1病毒感染的細胞的CTL(對于Env和Gag)。在該方式中所表達的HIV-1 gp160與CD4/共同受體結合并經歷與受體結合相關的構像改變。正確的gp160/受體相互作用暴露了存在于gp160上的隱藏的病毒中和決定子，其是誘導抗體介導的免受感染的保護作用所必需的(參見，如LaCasse，R.A.等，1999 Science.283357-62)。
C.本發明免疫原性組合物中所使用的抗原在本發明方法和組合物中，抗原性或免疫原性組合物可用于增強脊椎動物宿主對所選定抗原的免疫應答。所選定抗原，當通過質粒DNA或VSV表達時，可以是源自致病病毒、細菌、真菌或寄生蟲的蛋白、多肽、肽、其片段或融合物。或者，所選定抗原可以是源自癌細胞或腫瘤細胞的蛋白、多肽、肽、其片段或融合物。在另一個實施方案中，所選定抗原可以是源自過敏原的蛋白、多肽、肽、其片段或融合物，使得干擾IgE的產生以便調節對過敏原的變態性應答。在另一個實施方案中，所選定抗原可以是源自宿主(自身分子)以一種非期望方式、數量或位置所產生的那些分子或其片段的蛋白、多肽、肽、其片段或融合物，例如那些來自淀粉狀前蛋白的，以便預防或治療脊椎動物宿主中具有淀粉狀沉積特征的疾病。在本發明一個實施方案中，所選定抗原可以是源自HIV-1的蛋白、多肽、肽或片段。
本發明也涉及用于增強免疫原性組合物能力的方法，所述免疫原性組合物包括所選定抗原，其源自(1)誘發脊椎動物宿主免疫應答的致病病毒、細菌、真菌或寄生蟲，或(2)癌細胞或腫瘤細胞的癌抗原或腫瘤相關抗原，其可在脊椎動物宿主中誘發治療性或預防性的抗癌作用，或(3)過敏原，使得干擾IgE的產生以便調節對過敏原的變態性應答，或(4)宿主(自身分子)以一種非期望方式、數量或位置所產生的那些分子或其部分，以便減少上述非期望作用。
在另一個實施方案中，使用本發明初免/加強療法的所需的病毒免疫原性組合物包括涉及預防和/或治療由如下病毒所引發的疾病的那些，所述病毒為不限于，人類免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、1-3型副流感病毒、流感病毒、單純皰疹病毒、人巨細胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳頭狀瘤病毒、脊髓灰質炎病毒、輪狀病毒、嵌杯樣病毒，麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、德國麻疹病毒、腺病毒、狂犬病毒、犬瘟熱病毒、牛瘟麻疹病毒、人偏肺病毒、禽肺病毒(以前稱為土耳其鼻氣管炎病毒)、Hendra病毒，Nipah病毒，冠形病毒、細小病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、貓白血病病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、鳥傳染性粘液囊病病毒、新城雞瘟病毒、馬萊克(氏)病毒、豬呼吸和生殖綜合病癥病毒、馬傳染性動脈炎病毒和各種腦炎病毒。
在另一個實施方案中，使用本發明初免/加強療法的所需的細菌免疫原性組合物包括涉及預防和/或治療由如下細菌所引發的疾病的那些，所述細菌為不限于，流感(嗜血)桿菌(Haemophilus influenzae)(分型和不可分型的)、睡眠嗜血桿菌(Haemophilus somnus)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、腦膜炎奈瑟(氏)菌(Neisseriameningitidis)、淋病奈瑟(氏)菌(Neisseria gonorrhoeae)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)、鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci)、百日咳桿菌(Bordetellapertussis)、Alloiococcus otiditis、傷寒沙門菌(Salmonella typhi)、沙門氏菌(Salmonella typhiumrium)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、志賀氏桿菌(Shigella)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、白喉桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)，鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)-胞內分枝桿菌復合物(Mycobacteriumintracellulare complex)、奇異變形菌(Proteus mirabilis)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、破傷風桿菌(Clostridiumtetani)、問號鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)、博氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、溶血性巴斯德(氏)菌(Pasteurellahaemolytica)、出血敗血性巴斯德(氏)菌(Pasteurella multocida)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)和雞敗血支原體(Mycoplasma gallisepticum)。
在另一個實施方案中，使用本發明初免/加強療法的所需的抗真菌致病原免疫原性組合物包括涉及預防和/或治療由如下真菌致病原所引發的疾病的那些，所述真菌致病原為不限于，曲霉菌屬(Aspergillis)、芽生菌屬(Blastomyces)、念珠菌屬(Candida)、球孢子菌屬(Coccidiodes)、隱球菌屬(Cryptococcus)和組織胞漿菌屬(Histoplasma)。
在另一個實施方案中，使用本發明初免/加強療法的所需的抗寄生蟲免疫原性組合物包括涉及預防和/或治療由如下寄生蟲所引發的疾病的那些，所述寄生蟲為不限于，碩大利什曼原蟲(Leishmania major)、蛔蟲(Ascaris)、鞭蟲屬(Trichuris)、賈第蟲屬(Giardia)、血吸蟲屬(Schistosoma)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)、毛滴蟲屬(Trichomonas)、鼠弓形體(Toxoplasma gondii)和卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)。
在另一個實施方案中，使用本發明初免/加強療法所需的免疫原性組合物包括使用癌抗原或腫瘤相關抗原的那些，所述組合物在脊椎動物中誘發預防性或治療性抗癌作用，所述抗原包括，不限于，前列腺特異抗原、癌胚抗原、MUC-1、Her2、CA-125和MAGE-3。
上述所列已知抗原的核苷酸和蛋白序列可很容易地為公眾通過諸如NCBI的數據庫所獲得，也可獲得自其它來源，如美國典型培養物保藏中心或大學。
在脊椎動物宿主中用于調節對過敏原應答的所需免疫原性組合物，其使用了本發明的初免/加強療法，包括那些含有過敏原或其片段的。上述過敏原的例子描述于美國專利號5,830,877和國際專利公開號WO99/51259中，在此并入作為參考。上述過敏原包括，不限于，花粉、昆蟲毒液、動物毛發、真菌孢子和藥物(如盤尼西林)。這些免疫原性組合物干擾IGE抗體的產生，是過敏原反應的已知原因。
在脊椎動物宿主中用于調節對自身分子反應的所需免疫原性組合物，其使用了本發明的初免/加強療法的，包括那些含有自身分子或其片段的。上述自身分子的例子包括糖尿病所涉及的β-鏈胰島素、胃食管返流疾病中所涉及的G17分子和在疾病中下調節自體免疫反應的抗原，所述疾病如多發性硬化癥、狼瘡和類風濕性關節炎。也包括β淀粉狀肽(也稱為Aβ肽)，其是淀粉狀前蛋白(APP)內的39-43個氨基酸片段，是通過β或γ分泌酶處理APP產生的。Aβ1-42肽具有如下序列SEQ ID NO1Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr GluVal His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn LysGly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala。
在選擇和使用抗原序列用于設計本發明的DNA質粒和rVSV構建體中，也需要改變所選定抗原編碼基因序列以及DNA質粒所要插入的位置所采用的密碼子，和/或除去其中的抑制序列，可通過使用如下所詳述的技術除去抑制序列美國專利號5,965,726、5,972,596、6,174,666、6,291,664和6,414,132及國際專利公開號WO01/46408，于此并入作為參考。簡單地描述，該技術包括在所選定基因中突變所確定的抑制子/不穩定序列，優選進行多重點突變。
在如下所例證的一個具體實施方案中，本發明免疫原性質粒和rVSV組合物期望使用一種或多種優化序列來編碼HIV-1抗原，如gag，、pol和nef抗原，或其免疫原性片段或融合物。嵌合的猴-人免疫缺陷病毒(SHIV)(89.6P)的gag和env基因可用于制備rVSVs，以便保護其免受病毒感染并減輕病毒負荷以及可在獼猴疾病模型中所證實的疾病。如下例子證明了使用SHIV類似物，即SIV gag和HIV 89.6Penv。
D.免疫原性DNA質粒或rVSV構建體中使用的啟動子用于本發明任何組分的合適的啟動子，可容易地選自于構成型啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子等之中。編碼本發明抗原的核酸分子所采用的以及具有非特異性活性的構成型啟動子的例子包括，不限于，逆轉錄勞斯氏肉瘤病毒(RSV)啟動子、逆轉錄LTR啟動子(任選地帶有RSV增強子)、巨細胞病毒(CMV)啟動子(任選地帶有CMV增強子)(參見，如Boshart等，1985 Cell，41521-530)、SV40啟動子、二氫葉酸鹽還原酶啟動子、β-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子和EF1α啟動子(Invitrogen)。為外源性補充化合物所調控的誘導型啟動子包括，不限于，阿拉伯糖啟動子、鋅誘導羊金屬硫蛋白(MT)啟動子、地塞米松(Dex)誘導的小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動子系統(WO98/10088)、蛻皮激素昆蟲啟動子(No等，1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，933346-3351)、四環素阻遏系統(Gossen等，1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895547-5551)、四環素誘導系統(Gossen等，1995 Science，2681766-1769，也參見Harvey等，1998 Curr.Opira.Chern.Biol.，2512-518)、RU486誘導系統(Wang等，1997 Nat.Biotech.，15239-243和Wang等，1997 Gene Ther.，4432-441)以及雷帕霉素誘導系統(Magari等，1997 J.Cliva.Invest.，1002865-2872)。
可用于本文中的其它類型的誘導型啟動子是那些為特異性生理狀態所調控的，如，溫度或急性期或僅在復制細胞中。有用的組織特異性啟動子包括源自編碼骨骼β肌動蛋白、肌球蛋白輕鏈2A、抗肌萎縮蛋白、肌肉肌酸激酶的基因啟動子，以及較天然存在的啟動子具更高活性的合成的肌型啟動子(參見Li等.，1999 Nat.Biotech.，17241-245)。已知的組織特異性啟動子的例子有對肝而言(白蛋白，Miyatake等.1997 J.Virol.，715124-32；肝炎B病毒核心啟動子，Sandig等.，1996 Gene Ther.，31002-9；α胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等，1996 Hum.Gene Ther.，71503-14)；對骨而言(骨鈣蛋白，Stein等，1997 Mol.Biol.Rep.，24185-96；骨唾液蛋白，Chen等.，1996 J.Bone Miner.Res.，11654-64)；對淋巴細胞而言(CD2，Hansal等，1988 J.Immunol.，1611063-8；免疫球蛋白重鏈；T細胞受體α鏈)；對神經元而言(神經元-特異性烯醇化酶(NSE)啟動子，Andersen等，1993 Cell.Mol.Neurobiol.，13503-15；神經絲輕鏈基因，Piccioli等，1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，885611-5；神經元特異性ngf基因，Piccioli等，1995Neuron，15373-84)等。參見，如國際專利公開號WO00/55335所另外列出的已知啟動子可用于本文中。
E.本發明免疫原性組合物所使用的載體、賦形劑、佐劑和配方可用于本發明中的免疫原性組合物，無論是DNA質粒還是rVSV組合物，還包括免疫學上可接受的稀釋劑或藥學上可接受的載體，例如無菌水或無菌等滲鹽水。所述抗原組合物也可與上述稀釋劑或載體以常規方式混合。本文中所用的術語“藥學上可接受的載體”意在包括任何和所有的溶劑、分散介質、包被物、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲的和吸收延遲劑等等，適用于對人或其它脊椎動物宿主所進行的給藥。所述合適的載體對于本領域技術人員而言是顯而易見的，主要取決于給藥途徑。
仍可在本發明免疫原性組合物中存在的附加組分有佐劑、防腐劑、表面活性劑以及化學穩定劑、懸浮劑或分散劑。通常而言，對穩定劑、佐劑和防腐劑優化以確定在目標人或動物中有效的最佳配方。
1.佐劑當與免疫原或抗原共同施用時，佐劑是一種能增強免疫應答的物質。業已證實了許多細胞因子或淋巴因子具免疫調節活性，因此可作為佐劑，包括，但不限于，白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(參見，如美國專利號5,723,127)、13、14、15、16、17和18(及其突變型)，干擾素α、β和γ，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(參見，如美國專利號5,078,996和ATCC登記號39900)，巨噬細胞集落刺激因子，粒細胞集落刺激因子，GSF，以及腫瘤壞死因子α和β。還可用于本發明的其它佐劑包括趨化因子，包括但不限于，MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES。黏附分子，如選擇蛋白，例如，L-選擇蛋白、P-選擇蛋白和E-選擇蛋白也可用作為佐劑。其它還可用的佐劑包括，不限于，粘蛋白類分子，如CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1，整聯蛋白家族成員，例如LFA-1、VLA-1、Mac-1和pl50.95，免疫球蛋白超家族成員，如PECAM、ICAMs，例如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3，CD2和LFA-3，共刺激分子，如CD40和CD40L，生長因子，包括血管生長因子、神經生長因子、成纖維細胞生長因子、上皮細胞生長因子、B7.2、PDGF、BL-1和血管內皮生長因子，受體分子，包括Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6。其它佐劑分子還包括半胱天冬酶(ICE)。也參見國際專利公開號WO98/17799和WO99/43839，于此并入作為參考。
用于增強免疫應答的合適佐劑包括，不限于，MPLTM(3-O-脫酰單磷酰脂質A；Corixa，Hamilton，MT)，其描述于美國專利號4,912,094中，于此并入作為參考。也適合用作為佐劑的是合成的脂質A類似物或氨烷基葡糖胺磷酸化合物(AGP)，或其衍生物或類似物，可獲得自Corixa(Hamilton，MT)，其描述于美國專利號6,113,918中，于此并入作為參考。一種上述的AGP是2-[(R)-3-是十四酰基氧基是十四酰基氨基]乙基2-去氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基-氨基]-b-D-吡喃型葡萄糖苷，也稱為529(以前稱為RC529)。該529佐劑以水溶液形式或穩定的乳劑形式配制。
其它佐劑還包括礦物油和水乳劑，鋁鹽(明礬)，如氯化鋁、磷酸鋁等，Amphigen，Avridine，L121/角鯊烯，D-交酯-聚交酯/糖苷，聚醚型多元醇(pluronic polyols)，胞壁酰二肽，滅活的博德特氏菌屬(Bordetella)，皂苷類，如StimulonTMQS-21(Antigenics，Framingham，MA.)，描述于美國專利號5,057,540中，于此并入作為參考，以及其中產生顆粒的如ISCOMS(免疫刺激復合物)，結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)，細菌脂多糖，合成的聚核苷酸，如含有CpG基序的寡核苷酸(美國專利號6,207,646，于此并入作為參考)，百日咳毒素(PT)，或大腸桿菌熱不穩定毒素(LT)，特別是LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129；參見，如國際專利公開號WO93/13302和WO92/19265，于此并入作為參考。
也可用作為佐劑的是霍亂毒素及其突變體，包括在國際專利公開號WO00/18434中所描述的(其中在氨基酸第29位的甘氨酸為其它氨基酸(除天冬氨酸外)所取代，優選為組氨酸)。相似的CT毒素或突變體，描述于國際專利公開號WO02/098368中(其中在氨基酸第16位的異亮氨酸為其它氨基酸所取代，單獨取代或同時在氨基酸第68位的絲氨酸為其它氨基酸所取代，和/或其中在氨基酸第72位的纈氨酸為其它氨基酸所取代)。其它的CT毒素描述于國際專利公開號WO02/098369中(其中在氨基酸第25位的精氨酸為其它氨基酸所取代，和/或在氨基酸第49位插入一個氨基酸，和/或在氨基酸第35和36位插入兩個氨基酸)。
在如下所例證的一個實施方案中，所需的佐劑是IL-12，其表達自質粒。參見，如美國專利號5,457,038、5,648,467、5,723,127和6,168,923，于此并入作為參考。將該IL-12表達質粒摻入包含免疫原性DNA質粒的實施例的初免組合物。然而，應當注意在初免和加強組合物之間，該質粒可單獨或與rVSV組合物(或通過rVSV表達的)一起施用于哺乳動物或脊椎動物宿主。在一個實施方案中，細胞因子可作為蛋白質來施用。在一個優選的實施方案中，細胞因子可作為包含編碼細胞因子的DNA序列的核酸組合物施用，所述編碼受指導其在哺乳動物細胞中表達的調控序列所調控。在一個有用的實施方案中，細胞因子表達質粒與DNA組合物一起施用。在另一個實施方案中，可在施用初免物和加強組合物之間施用細胞因子。還在另一個步驟中，細胞因子在加強步驟施用。在另一個實施方案中，細胞因子可與初免組合物和加強組合物一起施用。
其中所述初免組合物是DNA質粒組合物，如下列實施例，質粒組合物可包括編碼細胞因子的DNA序列，所述編碼序列受調控其在哺乳動物中表達的調控序列的調控。在某些實施方案中，細胞因子編碼序列所存在的DNA質粒與抗原編碼序列所存在的DNA質粒相同。在另一個實施方案中，細胞因子編碼序列所存在的DNA質粒與編碼抗原的DNA質粒不同。
2.促進劑或輔劑除上述載體外，免疫原性組合物包括所需的多聚核苷酸分子，其含有任選的多聚核苷酸促進劑或輔劑，如局部麻醉劑，肽，脂質，包括陽離子脂質、脂質體或油脂顆粒，聚陽離子，如多聚賴氨酸，分支的三維聚陽離子，如樹枝狀聚合物(dendrimer)，碳水化合物，陽離子兩親物，去污劑，芐銨基表面活性劑，或其它有助于多聚核苷酸轉移至細胞的化合物。上述促進劑包括局部麻醉劑布比卡因或丁卡因(參見美國專利號5,593,972、5,817,637、5,380,876、5,981,505和6,383,512和國際專利公開號WO98/17799，于此并入作為參考)。上述用于本發明的促進劑或輔劑的其它非專有例子描述于美國專利號5,703,055；5,739,118；5,837,533；和國際專利公開號WO96/10038，公開于1996年4月4日；以及國際專利公開號WO94/16727，公開于1994年8月8日，于此并入作為參考。
最優選地，所述局部麻醉劑以能與所述核酸分子形成一種或多種復合物的量存在。當所述局部麻醉劑與本發明的核酸分子或質粒混合時，可形成多種包裹著DNA的小復合物或顆粒，并且是均一的。因此，在本發明免疫原性組合物的一個實施方案中，通過將局部麻醉劑與本發明至少一種質粒混合以形成所述復合物。該混合所形成的任何單一復合物可包含多種不同的質粒組合。或者，在本發明組合物的另一個實施方案中，局部麻醉劑可與每種質粒分別預先混合。如果所有質粒要以單個大丸藥給藥方式施用，則接著將不同的混合物與單一組合物結合以確保在單一免疫原性組合物中存在所需比率的質粒。或者，所述局部麻醉劑可與每種質粒獨立混合并獨立施用以獲得所需比率。
其中，在下文中，術語“復合物(complex)”或“一種或多種復合物”或“復合物(complexes)”用于定義免疫原性組合物的實施方案，應當理解為該術語包含一種或多種復合物。每種復合物含有質粒混合物，或分離形成復合物的化合物。每種復合物可僅含有一種類型的質粒或復合物，或質粒或復合物的混合物，其中每種復合物含有多順反子DNA。優選地，所述復合物直徑在約50至約150nm。當局部麻醉劑用作為促進劑時，優選布比卡因，優選的量約為多聚核苷酸組合物總重量的約0.1重量百分比至約1.0重量百分比。參見，國際專利公開號WO99/21591，于此并入作為參考，其教導可將芐銨基表面活性劑作為輔劑摻入，優選以約0.001-0.03重量％的量施用。根據本發明的內容，局部麻醉劑的量以對所述核酸分子的一定比率存在，為1-10μg/ml核酸的0.01-2.5％w/v量的局部麻醉劑。另一上述范圍為100μg/ml-1mg/ml核酸的0.05-1.25％w/v量的局部麻醉劑。
3.免疫原性組合物的其它添加劑在本發明免疫原性組合物中可包括其它添加劑，包括防腐劑、穩定成分，表面活性劑等。
適合的防腐劑例子包括三氯叔丁醇、梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對羥苯甲酸酯、乙基香草醛、丙三醇、苯酚和對氯酚。
可使用的適合的穩定成分包括，例如，酪蛋白氨基酸、蔗糖、明膠、酚紅、N-Z胺、磷酸二氫鉀(monopotassium diphosphate)、乳糖、乳清蛋白水解產物和奶粉。
適合的表面活性劑包括，不限于，福氏不完全佐劑、醌類似物、十六胺、十八胺、十八烷氨基酸酯類、溶血卵磷脂、溴化二甲基雙十八烷基銨、甲氧基十六烷基甘油和聚醚型多元醇；多胺，例如吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC(poly IC)、聚羧乙烯；肽，例如胞壁酰肽和二肽、二甲基甘氨酸、促吞噬肽；油乳膠；和礦物凝膠，例如磷酸鋁等以及免疫刺激復合物(ISCOMS)。質粒和rVSVs也可摻入脂質體用作為免疫原性組合物。所述免疫原性組合物也可包含其它適用于所選擇組合物給藥方式的添加劑。本發明的組合物也可包括凍干的多核苷酸，可與其它藥學上可接受的賦形劑一起制成粉末、液體或懸浮液劑型。參見，如RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第2卷，第19版(1995)，如第95章Aerosols以及國際專利公開號WO99/45966，其教導于此并入作為參考。
這些免疫原性組合物可含有適合通過任何常規給藥途徑施用的添加劑。在某些優選的實施方案中，本發明的免疫原性組合物可以如下形式制備用于施用人，例如，液體、粉末、氣溶膠、片劑、膠囊、包有腸溶衣的片劑或膠囊，或栓劑。因此，所述免疫原性組合物也可包括，但不限于，懸浮液、溶液、在油性或水性溶劑中的乳劑、糊劑、以及可植入的持續釋放或生物可降解形式。在一個用于腸胃外給藥配方的實施方案中，活性成分以固體形式(即粉末或顆粒)提供，在腸胃外施用重建組合物之前用于與合適的載體(如滅菌注射用水)重建。其它可用于腸胃外給藥的配方包括那些以微晶形式、以脂質體制備物或作為生物可降解聚合物系統組分來包含活性成分的。用于持續釋放或植入的組合物可包含藥學上可接受的聚合物的疏水物質，例如乳劑、離子交換樹脂、微溶聚合物或微溶鹽。
本發明的免疫原性組合物并不僅限于上述常規選擇的，生理可接受的載體、佐劑或其它可用于藥物制備物的成分。這些藥學上可接受的組合物的制備物，來自上述組分，具有合適的pH等滲性、穩定性和其它本領域公知的常規特性。
F.本發明免疫原性組合物的給藥劑量和途徑一般來說，對于本發明免疫原性組合物組分而言，合適的“有效量”或劑量選擇取決于免疫原性組合物中所使用抗原的特性，以及受試者身體條件，特別是包括被免疫受試者的常規健康、年齡和體重。給藥方法和途徑以及在免疫原性組合物中附加組分的存在也影響著劑量以及質粒和rVSV組合物的量。上述選擇以及對有效量的上調或下調亦為本領域公知常識。誘導免疫應答，優選保護性應答，或在患者中產生外源效果而無明顯的副作用所需要的質粒和rVSV的量可隨著這些因素的變化而變化。合適的劑量易于為本領域技術人員所確定。
施用人或非人的脊椎動物的本發明抗原或免疫原性組合物可通過許多種途徑施用，包括但不僅限于，鼻內、口、陰道、直腸、腸胃外、皮內、經皮(參見，如國際專利公開號WO98/20734，于此并入作為參考)、肌內、腹膜內、皮下、靜脈內和動脈內。合適途徑的選擇取決于所使用的免疫原性組合物特性，以及主治醫師對患者年齡、體重、性別和常規健康的評估，以及免疫原性組合物中所存在的抗原和類似因素。
在下列提供的實施例中，所述免疫原性DNA組合物通過肌內注射(i.m.)施用。在一個實施方案中，需要的是鼻內施用rVSV組合物，而非肌內注射。然而，劑量和給藥途徑的選擇并不為本發明所限制。
類似地，免疫原性組合物給藥順序和在每次給藥之間的時間間隔的選擇可由主治醫師或本領域技術人員根據健康狀況和宿主對該方法應用的明確反應而確定。上述優化對于本領域技術人員而言是公知常識。
G.試劑盒組分還在另外一個實施方案中，本發明提供了一種藥用試劑盒，用于準備施用產生免疫性、預防性或治療性療法，所述療法可用于治療任一上述疾病或病癥，是對抗原免疫應答所需的。該試劑盒被設計用于在哺乳動物或脊椎動物受試者中誘導高水平抗原特異性反應的方法中。所述試劑盒包含至少一種免疫原性組合物，所述組合物包括編碼抗原的DNA序列的DNA質粒，所述編碼序列受指導其在哺乳動物或脊椎動物細胞中表達的調控序列所調控。優選地，在試劑盒中提供了用于多次給藥的DNA免疫原性組合物的多次預包裝劑量。該試劑盒也包含至少一種免疫原性組合物，所述組合物含有可復制的重組水泡性口膜炎病毒(rVSV)，其包含編碼相同抗原的核酸序列，所述編碼序列受指導其在哺乳動物或脊椎動物細胞中表達的調控序列所調控。優選地，在試劑盒中提供了用于多次給藥的rVSV免疫原性組合物的多次預包裝劑量。
其中上述免疫原性組合物并不包含表達諸如IL-12的細胞因子的DNA質粒和/或rVSV，該試劑盒也任選地包含單獨的細胞因子組合物或用于多次給藥的細胞因子組合物的多次預包裝劑量。這些細胞因子組合物通常是核酸組合物，其包含編碼所選定細胞因子的DNA序列，所述編碼序列受指導其在哺乳動物或脊椎動物細胞中表達的調控序列所調控。
所述試劑盒也包含本文中所描述的初免/加強方法中指導免疫原性組合物使用的說明書。該試劑盒也包括用于實施某些分析的說明書、多種載體、賦形劑、稀釋劑、佐劑和上述的等等，以及用于施用所述組合物的裝置，例如注射器、噴霧裝置等。其它組分可包括一次性手套、消毒的說明書、敷藥棒或容器以及其它組合物。
為了更好地理解本發明，提供了下列實施例。所述實施例目的僅在于例證而不限定本發明的范圍。在下列實施例中所引用的所有文獻、公開出版物和專利于此并入作為參考。
正如下列實施例所證明的，在免疫受試者中本發明初免/加強方案對抗原特異性細胞和體液免疫應答的誘導具有令人驚奇的協同作用。事實上，當通過本發明初免/加強方案誘導這些反應時，與僅施用多次初免組合物或施用多次加強組合物的結果相比，本發明組合物對應答的協同作用是非常明顯的。在施用表達所需抗原的DNA質粒后再施用rVSV加強劑的結合，在免疫受試者中產生了增加的抗原特異性T細胞，即相當于超過任一的加成反應。類似地，在使用DNA質粒和rVSV免疫原性組合物的免疫接種方案中，在所需抗原的體液應答中所證實的T細胞增加出乎意料的高。參見，如下表1和圖4和5。
實施例1DNA質粒的制備該實施例描述了用于本發明一個實施方案中的示例性質粒，如實施例2和3所述。這些質粒并不受本發明所限，但業已被優化用于下列試驗中。使用標準重組DNA技術設計下列DNA免疫原性組合物。表達HIV或SIV gag基因的DNA主鏈載體使用了HCMV啟動子、BGHpoly A終止序列、ColE1細菌復制起點(ori)和用于選擇的卡那霉素抗性基因。
A.SIV gag p37 DNA質粒質粒WLV102是一種細菌質粒，其表達免疫應答所需的選定抗原SIV gag p37。質粒WLV102(4383bp)由源自SIV的RNA優化截短的gag基因(p37)(Qiu等，1999J.Virol.，739145-9152)插入DNA質粒表達載體WLV001中所組成。gag基因通過失活抑制序列以優化RNA，因此容許gag基因高水平的Rev不依賴型表達，使用了在下述專利所詳細討論的技術美國專利5,965,726、5,972,596、6,174,666、6,291,664和6,414,132以及國際專利公開號WO01/46408，于此并入作為參考。
所述WLV102質粒主鏈由三個遺傳單位組成。第一組分是真核基因表達單位，其含有來自HCMV立即早期啟動子/增強子(Boshart等.1985，上述的)和BGH聚腺苷酸化信號(Goodwin EC和Rottman FM，1982 J.Biol.Claefn.26716330-16334)的遺傳元件。該gag基因克隆在SalI和EcoRI位點之間。第二組分是嵌合卡那霉素抗性(kmr)基因、磷酸腺苷4′-核苷酸轉移酶1a型(參見美國專利號5,851,804)。該基因業已被設計賦予有限量的氨基糖甙類抗性，直至其能選擇包含該質粒的細菌。第三個組分是ColE1細菌復制起點，其對于質粒在細菌發酵時的增殖是必需的。該質粒如圖1A所示。
B.編碼細胞因子-rIL-12DNA質粒恒河猴IL-12WLV104質粒是一種雙重啟動子構建體，其表達異源二聚體形式的恒河猴IL-12。質粒WLV103是一種雙重啟動子表達質粒，由編碼人IL12蛋白p35和40的兩個基因組成。該質粒總共具有6259個核苷酸。WLV103中的每個順反子含有兩個白介素12亞基中的一個，p35或p40，其受獨立的調控元件所調控。p35亞基受HCMV啟動子/增強子和SV40聚腺苷酸化信號所調控(克隆在SalI和MluI位點之間)。p40亞基受SCMV啟動子和BGH聚腺苷酸化信號所調控(克隆在XhoI位點)。
該質粒主鏈由幾個組分組成。第一組分是真核基因表達單位，其含有源自HCMV立即早期啟動子/增強子和SV40聚腺苷酸化信號(Fitzgerald M和Shenk T.，1981 Cell，24251-260)遺傳元件。第二組分是真核基因表達單位，用SCMV啟動子(Jeang等，1987 J.Virol.，611559-1570)和BGH聚腺苷酸化信號組成。第三組分是嵌合卡那霉素抗性(kmr)基因，磷酸腺苷4′-核苷酸轉移酶1a型。第四組分是ColE1細菌復制起點，其對于質粒在細菌中的增殖是必需的。
通過限制性酶切消化分析所產生的質粒載體SIV gag/HIV gag和IL-12DNA。將質粒瞬間轉染入橫紋肌肉瘤細胞，在添加10％小牛血清(FCS)和抗菌素的DMEM培養基中培養。接著使用HIV gag特異性單克隆抗體(ABI)和SIV gag恒河猴多克隆血清(源自SIV感染的動物)進行蛋白質印跡來分析這些細胞適當表達的病毒蛋白。在上清液中用檢測p70蛋白的ELISA試劑盒(R&D Systems)檢測到了IL-12。
在轉化的DH10B細胞中擴增所述質粒載體，在添加卡那霉素的LB培養基中培養，根據制造商說明書，使用Qiagen試劑盒純化。接著在瓊脂糖凝膠上進行電泳，依據已知標準分析DNA。
在0.25％布比卡因配制用于下列試驗的每種質粒，濃度為2.5mg/mL，總體積為4.0cc。
實施例2重組VSV載體的制備A.VSV基因組cDNA克隆用于VSV基因組cDNA操作的遺傳背景是pVSV-XN1(Schnell，M.J.，等1996 J.Virol.，702318-23)。該克隆包含一種VSV Indiana株(VSVI)cDNA序列的修飾型。所述修飾包括添加兩種獨特的限制性內切酶識別位點(XhoI和NheI)，并添加VSV基因起始和VSV基因終止信號的拷貝。當諸如HIV-189.6penv gp160或SIV gag p55或HIV-1 gag的外源基因合適地插入XhoI和NheI位點之間時，其所處位置適合于在VSV轉錄調控信號調控下表達。VSV cDNA序列通過順式作用的DNA序列側接，所述序列是活病毒復制拯救所必需的。T7 RNA聚合酶啟動子指導整個病毒cDNA的初級轉錄物的轉錄。在T7 RNA聚合酶中止轉錄后，核酶剪切所述初級轉錄物以形成RNA基因組末端。
最初，通過在G和L基因之間插入gag基因(HIV進化枝B)修飾rVSVi基因組克隆(pVSV-XN1)，產生了質粒prVSVi-gag。類似地，制備含有HIV env基因(基因組克隆prVSVi-env)的分離的rVSVicDNA克隆。通過擴增來自含有HIV HXBc2 gag基因或HIV 6101株env基因的質粒模板的編碼區序列，將制備的gag和env cDNA序列插入pVSV-XN1。用于PCR擴增的引物含有適于進行下一步克隆的限制性酶切位點；5′引物含有XhoI位點，3′引物含有NheI位點。所擴增的編碼區序列被分別插入到pVSV-XN1中以產生含有gag的克隆和含有env的克隆。
所述插入pVSV-XN1中的env基因是編碼HIV Env/VSV G融合蛋白的修飾型。如果使用拼接PCR(overlap PCR)方法將Env細胞質尾部用更短的VSV G蛋白細胞質尾部來取代，則在用rVSV-HIV Env載體感染之后，顯示了細胞表面增強的Env表達(參見，如Johnson，等，1998上述的；Johnson等，1997，上述的)。根據公開的技術，通過將Indiana G基因改變為Chandipura或New Jersey血清型，改變了這兩種質粒的載體主鏈。通過利用M基因中獨特的MluI位點和改造入VSVcDNA克隆中的XhoI位點來完成G基因的交換。
PCR擴增來自Chandipura或New Jersey株的VSV G基因編碼序列，使用5′引物在M基因中延伸過MluI位點。所用3′引物含有與G基因3′末端同源的序列以及相應于基因-終止/基因-起始信號和XhoI位點的附加末端序列。在其業已用MluI和XhoI從質粒主鏈酶切后，這些引物所擴增的G基因編碼序列可用于取代最初的Indiana G基因。
B.拯救來自cDNA克隆的rVSV在被導入細胞后，基因組cDNA質粒或轉錄自基因組cDNA質粒的RNA并不足以啟動病毒復制循環。病毒基因組RNA其自身并不是可用于翻譯或復制的有效模板。因此，重組病毒必須從各種VSV基因組cDNA構建體中得到拯救。本領域公知的拯救方法有可能用于拯救來自克隆的DNA的病毒。成功的病毒拯救需要細胞中存在VSV基因組RNA和包覆病毒基因組RNA的VSV N蛋白，以及P和L蛋白，其形成病毒mRNA合成和基因組復制所需的病毒RNA-依賴型RNA聚合酶。通過共轉染VSV基因組cDNA的質粒和編碼VSV N，、P和L蛋白的表達質粒，在培養細胞中產生所有這些病毒組分。
所有這些質粒被設計用于通過噬菌體T7 RNA聚合酶的轉錄；相應地也用表達噬菌體聚合酶(MVA/T7或VTF7-3)的重組痘苗病毒感染轉染的細胞。用于VSV拯救的標準方法描述于Lawson等，1995，上述的；和Schnell等，1996 J.Virol.，702318-23中。對該方法進行改良以更有效地用于拯救高度減毒的病毒，也可使該方法與管理機構的準則相一致。簡言之，該方法如下所述。
利用磷酸鈣轉染方法用rVSV基因組克隆和編碼VSV N、P和L基因的輔助質粒轉染在12.5cm2燒瓶中合格的Vero細胞。在染開始時，加入足夠量檢定的MVA/T7以提供每一細胞有2個空斑形成單位的多次感染。在轉染開始3小時后，對細胞進行3小時熱休克步驟以提高幾種負鏈RNA病毒的拯救效率(Parks，C.L等，1999 J.Virol.，733560-6)。在轉染48-72小時后，將細胞和培養基轉移到更大的燒瓶中，該燒瓶含有移植生長的單層Vero細胞，隨后溫育一天或多天以容許拯救的病毒擴增。在該擴增步驟后收獲的病毒進行過濾以除去大多數污染的MVA/T7，并用于rVSV菌株的克隆分離。
通過共有測序(consensus sequencing)方法分析RNA病毒基因組，以測定病毒基因組RNA的核苷酸序列。簡言之，純化的病毒RNA逆轉錄產生cDNA，接著使用基因特異性引物通過PCR擴增基因組的重疊區。使用凝膠純化PCR產物，接著使用熒光染色終止劑進行循環測序。純化測序反應產物并在自動測序儀上進行分析。
C.實施例中所使用的特異性構建體為了生產用于下列實驗的特異性重組VSV載體，將表達HIV-189.6P gp160的重組VSVs融合至VSV G蛋白跨膜區(rVSV HIV-1envG)，并與SIVmac239 gag p55(rVSV SIVgag)混合用作為實驗免疫原性組合物。表達流行性感冒血球凝集素蛋白(rVSV fluHA)的rVSV用作為對照組合物。如前所述，使用編碼插入至VSV G和L轉錄單位之間的所需抗原的基因來制備重組VSV載體(Rose等，2000 J.Virol.7410903-10)。下述構建參見Rose等，同上。
1.質粒構建體Cleveland Clinic的Amiya Banerjee博士友好地提供了含有Chandipura糖蛋白[G(Ch)]基因的質粒(Masters，P.S.，1989 Virol.，171285-290)。為了構建含有G(Ch)基因取代Indiana糖蛋白[G(I)]基因的VSV載體，首先使用寡核苷酸指導的誘變從G(Ch)基因中除去XhoI位點，使用了互補引物5′-CCCCTAGTGGGATCTCCAGTGATATTTGGAC(SEQ ID NO2)和5′-GTCCAAATATCACTGGAGATCCCACTAGGGG(SEQ ID NO3)以及Stratagene QuikChange誘變試劑盒。CTCGAG(SEQ ID NO4)突變為CTCCAG(SEQ ID NO5)除去了XhoI位點，但不影響G(Ch)蛋白的氨基酸序列。接著使用Vent DNA聚合酶(New EnglandBiolabs)通過PCR擴增該基因。正向引物是5′-GATCGATCGAATTCACGCGTAACATGACTTCTTCAG(SEQ IDNO6)，對于G(Ch)蛋白而言，ATG起始密碼子上游含有MluI位點(下劃線)。反向引物是5′-GAACGGTCGACGCGCCTCGAGCGTGATATCTGTTAGTTTTTTTCATATCATGTTGTTGGGCTTGAAGATC(SEQ ID NO7)，含有SalI和XhoI位點(粗體)，然后是VSV轉錄起始和終止信號(下劃線)，接著是G(Ch)3′編碼序列的互補序列。
PCR產物用MluI和SalI消化并克隆到pVSVXN-1載體中(Schnell，等1996 J.Viral.702318-2323)，該載體事先用MluI和XhoI消化以去除VSV G(I)編碼序列(SalI和XhoI留下可相容的末端用于連接)。該方法所制備的質粒稱為pVSV(GCh)XN-1并含有外源基因表達位點，通過獨特的XhoI和NheI位點側接在G(Ch)基因和L基因之間。
使用一種與上述方法相同的方法產生包含來自質粒pNJG(Gallione，C.J.，和J.K.Rose.1983 J.Tirol162-169)的G(NJ)蛋白基因的載體。正向引物是5′-GATCGATCGAATTCACGCGTAATATGTTGTCTTATCTAATCTTTGC(SEQ NO8)，反向引物是5′-GGAACGGTCGACGCGCCTCGAGCGTGATATCTGTTAGTTTTTTTCATATTAACGGAAATGAGCCATTTCCACG(SEQ NO9)。用于上述Chandipura構建的位點表示為粗體字母和下劃線序列，隨后的克隆步驟也如上所述。最終得到的載體稱為pVSV(GNJ)XN-1，其含有外源基因表達位點，通過獨特的XhoI和NheI位點側接在G(NJ)基因和VSV L基因之間。
為了制備含有HIV Env 89.6G基因的載體，用XhoI和NheI酶切pVSV-89.6gp160G獲得編碼帶有VSV G細胞質尾部的89.6包膜蛋白的基因(Johnson等1997，上述的)，并克隆入載體pVSV(GNJ)XN-1或pVSV(GCh)XN-1的XhoI和NheI位點之間。該gp160G基因編碼所有的gp120和gp41胞外區和跨膜區，并具有融合至VSV G胞質區的26C-末端氨基酸的89.6 Env胞質區的4個氨基酸(N-R-V-R)(SEQ ID NO10)，以序列I-H-L-C(SEQ ID NO11)為起點。
2.重組病毒的恢復使用已建立的方法(Lawson等1995上述的)恢復重組VSVs。簡言之，在10-cm培養板上，培養幼侖鼠腎(BHK)細胞至約60％融合。然后用vTF7-3，一種表達T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒，多次感染細胞，感染(MOI)為10，(Fuerst等1987 Mol.Cell.Biol.72538-2544)。1小時后，用3μg pBS-N、5μg pBS-P、1μg pBS-L和10μg編碼上述三種全長重組體之一的質粒轉染每一培養板的細胞。轉染使用了含有二甲基三十六烷基溴化銨和磷脂酰乙醇胺二油醇酯的陽離子脂質體試劑(Rose等，1991 Biotechniques 10520-525)。細胞在37℃溫育48小時。將細胞上清液通過0.2μm濾膜除去大多數的痘苗病毒，然后將其應用于新鮮的BHK細胞，在37℃下再溫育48小時。對于某些恢復而言，包含有4微克/平板的編碼VSV G的附加質粒(pBS-G)以及N、P和L輔助質粒。通過掃描BHK細胞單層以獲得VSV細胞病理結果來證實感染病毒的恢復。接著在BHK細胞上分離病毒空斑，通過將來自單個空斑的病毒添加至10cm直徑的BHK細胞培養板上，進行來自單個空斑的病毒母液的培養。然后將這些母液保存在80℃。凍融后，獲得自VSV(GI)-89.6G、VSV(GCh)-89.6G和VSV(GNJ)-89.6G的效價都在107-108PFU/ml范圍內，該過程減少了大約3倍的VSV效價。
為了在下列實驗中使用，每一rVSV構建體都用無菌DME稀釋至終體積為0.8cc。
實施例3初免/加強免疫接種療法A.免疫接種方案通過肌內注射5mg編碼恒河猴IL-12p35和IL-12p40的雙順反子DNA質粒、5mg表達SIV gag p37多肽的DNA質粒(1和2組)或10mg空的DNA質粒(3和4組)來免疫恒河猴(每組5只)。所有這些DNA質粒及其配方詳述于實施例1中。DNA免疫接種時間表規定在第0天進行初始免疫接種，在第4周和第8周進行第一次和第二次的加強免疫接種。使用針頭和注射器在三角肌和四頭肌的4個部位進行注射，每個部位1cc。
接著在第15周加強恒河猴，通過鼻內注射(0.4cc/鼻孔，使用手提式吸量管)Indiana(I)血清型的重組水泡性口膜炎病毒(rVSV)，其基于實施例2中含有HIV-1 gp160 env基因的載體(5×106pfu)，以及含有SIV gag p55基因的第二種rVSV(I)(5×106pfu)(2和3組)，或含有流行性感冒血凝素基因的rVSV(I)(1×107pfu)(1和4組)。在第23周再次加強恒河猴，通過鼻內注射(0.4cc/鼻孔，使用手提式吸量管)rVSV(Chandipuri血清型，Ch)，其基于實施例2中含有HIV-1gp160 env基因的載體(5×106pfu)，以及含有SIV gag p55基因的第二種rVSV(Ch)(5×106pfu)(2和3組)，或含有流行性感冒血凝素基因的rVSV(Ch)(1×107pfu)(1和4組)。
密切監測恒河猴外周血中細胞和體液免疫應答的誘導，以及在各種粘膜表面的抗體反應。該監測包括對γ干擾素和SIV gag p55肽庫進行酶聯免疫點測定(ELISpot)、對γ干擾素和HIV-1 env 6101肽庫進行ELISpot測定以及對γ干擾素和VSV N肽庫進行ELISpot測定。該ELISpot測定檢測PBL中的細胞免疫應答。
可通過ELISA評估血清(圖4)、鼻洗液、直腸分泌物和唾液(數據未顯示)抗-SIV gag p27 IgG效價及抗-HIV-1 gp160 env效價(數據未顯示)以檢查體液免疫應答。對于血清來說，ELISA中所使用的抗體是嵌合病毒SHIV89.6和SHIV89的天然抗體。
B.ELISpot測定法檢測分泌細胞因子的鼠和人細胞濾膜免疫空斑測定也稱為酶聯免疫點測定(ELISpot)，最初開發是用于檢測和定量單個分泌抗體的B細胞。最初，該技術是為常規空斑形成細胞測定法提供一種快速和通用的補充方法。近來，對ELISpot測定法的改進已提高了其的靈敏度，使得少到細胞每秒產生100個特定蛋白分子都能得到檢測。這些測定法利用了在分泌蛋白細胞周圍環境中相對高濃度的已知蛋白(如細胞因子)。使用高親和力抗體可捕獲并檢測這些細胞產物。
ELISpot測定法利用了抗同一細胞因子分子上不同表位的兩種高親和力細胞因子特異性抗體；或兩種單克隆抗體或一種單克隆抗體和一種多價抗血清的組合。在比色反應基礎上，ELISpot產生斑點，檢測單個細胞分泌的細胞因子。該斑點代表最初的細胞因子所產生細胞的“足跡”。斑點(即斑點形成細胞或SFC)是永久的，可通過目視、顯微鏡或用電子儀器定量。
ELISpot測定法進行如下用1μg/ml濃度的鼠抗人γ干擾素(hIFN-γ)單克隆抗體(clone 27，BD-Pharmingen，San Diego CA)包被96孔平底ELISpot板(Millipore，Bedford，MA)過夜，用添加有0.25％Tween-20的1x PBS洗滌10次，并用含5％小牛血清(FBS)的PBS封閉2小時。通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心，從新鮮提取的肝素化全血中分離恒河猴外周血淋巴細胞(PBLs)，并重懸于含50μg/ml PHA-M(Sigma)或跨越了整個SIV gag開放閱讀框的重疊了11個氨基酸的15氨基酸肽庫(最終肽濃度為1μM)的完全培養基(RPMI 1640培養基，添加有5％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100單位/mL盤尼西林、100μg/ml硫酸鏈霉素、1mM丙酮酸鈉、1mM HEPES、100μM非必需氨基酸)中，或僅在培養基中重懸。
在10μL/孔中放入細胞的數目為2×105PBLs并在兩個孔中分析。在37℃溫育細胞16小時，然后通過首先用去離子水洗滌，再用添加0.25％Tween-20的1x PBS洗滌10次將細胞從培養板上洗下。其后，用兔多抗抗-hIFN-γ生物素化檢測抗體(0.2μg/孔，Biosource，Camarillo，CA)處理培養板，該抗體用含1％BSA的1xPBS稀釋并在室溫下溫育2小時。接著用添加0.25％Tween-20的1xPBS洗滌培養板10次，并用100μl/孔的抗生物素蛋白鏈菌素堿性磷酸酶綴合物(Southern Biotech，Birmingham AL)處理，該綴合物用含5％FBS和0.005％Tween-20的1x PBS稀釋至1∶500并在室溫下再溫育2.5小時。通過使用添加0.25％Tween-20的1x PBS洗滌培養板10次除去未結合的綴合物。然后，添加顯色底物(100μL/孔，1-step NBT/BCIP，Pierce，Rockford，IL)，3到5分鐘后用水沖洗，風干培養板，用倒置解剖顯微鏡對產生的斑點目視計數。
本發明ELISpot測定的進行是為了測定在本發明初免/加強免疫接種方法應答中所誘導產生的CD8+T細胞(CTLs)和CD4+T細胞數目，其是通過γ干擾素的生成來測定的。該評估直至對上述恒河猴進行處理后的第25周(在3次DNA初免和2次VSV加強后)。
C.結果在DNA初始免疫接種后，在10只SIV gag/rIL-12DNA免疫的恒河猴(平均254SFC/106細胞)中有8只可容易檢測到SIVgag-特異性IFN-γELISpot應答。在第二次SIV gag/IL-12DNA免疫后，10只免疫的恒河猴(平均1133SFC/106細胞)都顯示了高水平的ELISpot應答，并用1/3劑量的gag/IL-12DNA加強了大多數動物中的gag-特異性ELISpot應答(平均1506SFC/106細胞)。在第一次rVSV HIVenv/rVSVSIVgag加強后，與僅接受單次rVSV HIVenv/rVSV SIVgag免疫接種相比(平均386SFC/106細胞)，平均SIV gag ELISpot應答明顯提高(3772 SFC/106細胞)。這些結果支持了細胞因子可用于增強DNA初免以增加rVSV免疫接種的免疫原性。
這些結果記錄于下表1和圖2、3、4和5中。圖2顯示了在來自這些免疫25周后動物的未分級外周血單核細胞(PBMC)中rVSV N-特異性IFN-γELISpot應答。圖3顯示了相同樣品中HIV env 6101特異性IFN-γELISpot應答。星號表示產生統計學上顯著差異，p＝0.0001。圖4顯示了通過ELISA測定的血清抗體抗-SIV gag p27IgG和抗-HIVgp160 env的效價。用編碼SIV gag蛋白的DNA質粒免疫接種并用表達flu HA蛋白的VSV載體加強的方案表示為(◆)。涉及用DNA gag質粒初免免疫接種后再用表達HIV gag和env蛋白的VSV加強的本發明方案表示為(■)。涉及用空的對照DNA質粒初始免疫接種后再用表達HIV gag和env蛋白的VSV免疫接種的方案表示為(▲)。涉及用對照DNA質粒初始免疫接種后再用表達flu HA蛋白的VSV免疫接種的方案表示為(●)。每組所代表的結果來自5只動物。各組間統計學上顯著差異表示為p＝0.0073(*)；p＝0.5941(#)或p＝0.0027(￥)。
圖5顯示了相同樣品中的SIV gag特異性IFN-γELISpot應答的平均數。用編碼SIV gag蛋白的DNA質粒免疫接種并用表達flu HA蛋白的VSV載體加強的方案表示為(◆)。涉及用DNA gag質粒初始免疫接種后再用表達HIV gag和env蛋白的VSV加強的本發明方案表示為(■)。涉及用空的對照DNA質粒初始免疫接種后再用表達HIV gag和env蛋白的VSV免疫接種的方案表示為(▲)。涉及用對照DNA質粒初始免疫接種后再用表達flu HA蛋白的VSV免疫接種的方案表示為(●)。每組所代表的結果來自5只動物。各組間統計學上顯著差異通過方括號表示為p＝0.0001和p＝0.0002。
表1以列表形式記錄了相同的結果。
表1SIV gag/恒河猴IL-12DNA初免和rVSV-SIV gag/rVSV-HIVenv加強免疫接種后的SIVgag-特異性IFN-γELISpot應答平均數

a在最初DNA免疫接種25周后記錄的SIVgag-特異性ELISpot應答平均數。
這些測定結果證明了與僅施用多次初免組合物及多次加強組合物的結果相比，本發明的初免/加強療法具有令人驚奇協同作用。在施用表達所需抗原的DNA質粒后再施用rVSV加強劑的結合，在免疫受試者中產生了增加的抗原特異性T細胞，即相當于超過任一的加成反應。類似地，在使用DNA質粒和rVSV免疫原性組合物的免疫接種方案中，在所需抗原的體液應答中所證實的T細胞增加出乎意料的高。
實施例4用于抗HIV免疫接種的恒河猴模型使用實施例3中的初免/加強策略以及根據相同方案所描述的質粒和VSV載體來免疫恒河猴(Rh)。在首次施用初免組合物后約32周，用330 50％猴感染劑量(MID50)的病原性SIV/HIV重組病毒SHIV89.6P激發恒河猴(Reimann等，1996 J.Virol.，703198-3206；Reimann等1996 J.Virol.，706922-6928)。
激發后約50-70天，檢測動物疾病。在每次免疫接種前、一周和兩周后立即監測動物細胞介導的誘導和抗體反應。在激發前和激發后2、4、6、8和12周收集的血清用于測試對HIV-189.6、89.6P、6101和其它的進化枝B初始分離物的中和抗體反應。在試驗的免疫接種階段，激發前和激發后每兩周立即監測CD4/CD8計數。激發前和激發后每一周，通過分支DNA分析立即測定血清中病毒負荷。也檢查動物的其它體液(陰道、直腸、鼻分泌物及唾液)的細胞和體液免疫應答。
使用幾種最合適的基于細胞的測定法分析對所需抗原的細胞介導的免疫應答，包括51Cr-釋放CTL測定法、可溶性MHC I型四聚體染色、ELISpot測定法和細胞內細胞因子分析。通過ELISA技術評估粘膜抗體反應，優化用于粘膜樣品。通過標準的ELISA技術亦可評估血清抗體反應。另外，測定來自所有免疫動物的血清，以確定對HIV Env6101和其它初始進化枝B分離物的中和抗體反應。圖6闡明了通過本發明初免/加強結合引發了加強的免疫應答，導致增加的AIDS保護作用，通過在激發后至少250天內測定CD4T細胞損耗減少來確定。
除監測免疫原性組合物引發的免疫應答外，還通過檢測其釋放水平和持續時間來評估活病毒載體的傳播潛能。在每次免疫接種后開始三周內按一定間隔頻繁獲取鼻洗液以測定活病毒存在。也檢測質粒病毒負荷用于確定存在的活病毒拷貝。圖7顯示了通過初免/加強結合引發的加強的免疫應答，通過在激發后至少250天內測定血漿內循環病毒的減少來確定。
與對照動物相比，上述檢測的結果很有可能表明根據本發明免疫的動物中具有非常高的抗原特異性CD8+和CD+T細胞。應當預料到根據本發明初免/加強療法免疫的動物在HIV暴露后仍保持健康，而未免疫的動物則患AIDS。
與其它已知初免/加強療法方案的結果相比，即與僅一次或多次DNA初免組合物免疫接種或僅一次或多次rVSV載體免疫接種所提供的結果相比，可預計本發明方法具有對免疫動物安全和能印發較高水平的抗-HIV CTLs和抗體。根據本發明的重復的初免/加強可能具協同作用，并因此對預暴露受試者具預防作用，對已感染HIV的受試者具有治療作用。
所有上述本說明書中的引用文獻于此并入作為參考。本發明方法和組分的各種變體及較小變化對于本領域技術人員而言是顯而易見的。
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<223>互補引物<400>2cccctagtgg gatctccagt gatatttgga c 31
<210>3<211>31<212>DNA<213>人工<220>
<223>互補引物<400>3gtccaaatat cactggagat cccactaggg g 31<210>4<211>6<212>DNA<213>人工<220>
<223>互補引物<400>4ctcgag 6<210>5<211>6<212>DNA<213>人工<220>
<223>互補引物<400>5ctccag 6<210>6<211>36<212>DNA<213>人工<220>
<223>正向引物<400>6gatcgatcga attcacgcgt aacatgactt cttcag 36<210>7<211>70<212>DNA<213>人工<220>
<223>反向引物
<400>7gaacggtcga cgcgcctcga gcgtgatatc tgttagtttt tttcatatca tgttgttggg60cttgaagatc 70<210>8<211>46<212>DNA<213>人工<220>
<223>正向引物<400>8gatcgatcga attcacgcgt aatatgttgt cttatctaat ctttgc 46<210>9<211>73<212>DNA<213>人工<220>
<223>反向引物<400>9ggaacggtcg acgcgcctcg agcgtgatat ctgttagttt ttttcatatt aacggaaatg60agccatttcc acg 73<210>10<211>4<212>PRT<213>HIV Env 89.6G基因<400>10Asn Arg Val Arg1<210>11<211>4<212>PRT<213>VSV G細胞質尾部<400>11Ile His Leu Cys權利要求
1.一種在哺乳動物受試者中誘導抗原特異性免疫應答的方法，所述方法包括入如下步驟(a)對所述受試者施用有效量的第一組合物，所述第一組合物包括含有編碼所述抗原DNA序列的DNA質粒，所述編碼序列受指導其通過所述DNA質粒表達的調控序列所調控；和(b)對所述受試者施用有效量的第二組合物，所述第二組合物包括含有編碼所述抗原的核酸序列的重組水泡性口膜炎病毒(VSV)，所述編碼序列受指導其通過所述重組VSV表達的調控序列所調控。
2.根據權利要求1的方法，其中所述VSV具有復制能力。
3.根據權利要求1的方法，其中所述VSV不復制。
4.根據權利要求1的方法，其中在所述第二組合物施用前對所述受試者施用至少一次所述第一組合物。
5.根據權利要求4的方法，其中對所述受試者施用至少一次所述第二組合物。
6.根據權利要求1的方法，其中在所述第一組合物施用前對所述受試者施用至少一次所述第二組合物。
7.根據權利要求6的方法，其中對所述受試者施用至少一次所述第一組合物。
8.根據權利要求1的方法，步驟(a)還包括施用所述哺乳動物有效量的細胞因子。
9.根據權利要求8的方法，其中所述細胞因子作為核酸組合物施用，所述核酸組合物包括含有編碼所述細胞因子的DNA序列的DNA質粒，所述編碼序列受指導其通過所述DNA質粒表達的調控序列所調控。
10.根據權利要求9的方法，其中所述細胞因子選自IL-12、IL-15、GM-CSF及其組合。
11.根據權利要求9的方法，其中所述細胞因子編碼序列與所述抗原編碼序列存在于相同質粒上。
12.根據權利要求9的方法，其中所述細胞因子編碼序列與所述抗原編碼序列存在于不同質粒上。
13.根據權利要求1的方法，步驟(b)還包括施用所述哺乳動物有效量的細胞因子。
14.根據權利要求13的方法，其中所述細胞因子以蛋白形式施用。
15.根據權利要求14的方法，其中所述細胞因子選自IL-12、IL-15、GM-CSF及其組合。
16.根據權利要求1的方法，其中所述抗原是蛋白、多肽、肽、其片段或融合物，其中所述蛋白來源于選自下述的成分細菌、病毒、真菌、寄生蟲、癌細胞、腫瘤細胞、過敏原和自身分子。
17.根據權利要求16的方法，其中所述病毒是人或猴免疫缺陷病毒。
18.根據權利要求17的方法，其中所述抗原選自gag、pol、env、nef、vpr、vpu、vif和tat，以及其免疫原性片段或融合物。
19.根據權利要求1的方法，其中所述第一組合物包括含有編碼多于一個拷貝的相同或不同的所述抗原DNA序列的DNA質粒。
20.根據權利要求1的方法，其中所述第一組合物包括多于一個DNA質粒，其中每個DNA質粒編碼相同或不同的抗原。
21.根據權利要求1的方法，其中所述免疫應答包括較僅施用所述DNA質粒或重組VSV，對所述抗原的CD8+T細胞應答增強。
22.根據權利要求1的方法，其中所述免疫應答包括較僅施用所述第一或第二組合物，在對所述抗原的抗體應答中具有協同增強作用。
23.根據權利要求1的方法，其中所述哺乳動物受試者是靈長類。
24.根據權利要求23的方法，其中所述哺乳動物受試者是人。
25.根據權利要求1的方法，步驟(a)還包括在施用所述重組VSV前施用至少兩種所述DNA質粒，每種質粒包含編碼不同抗原的序列。
26.根據權利要求1的方法，步驟(b)還包括施用至少兩種所述重組VSV。
27.根據權利要求26的方法，其中每種所述重組VSV具有不同的VSV G蛋白和不同的VSV血清型，但具有相同的抗原編碼序列。
28.根據權利要求26的方法，其中每種所述重組VSV具有不同的抗原編碼序列，但具有相同的VSV G蛋白。
29.根據權利要求26的方法，其中每種所述重組VSV具有不同的抗原編碼序列，和不同的VSV G蛋白。
30.根據權利要求26的方法，其中第二和任一附加的重組VSV在所述第一重組VSV施用后作為加強劑施用。
31.根據權利要求30的方法，還包括施用至少三次所述加強劑。
32.根據權利要求1的方法，其中所述DNA質粒組合物在藥學上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體中施用。
33.根據權利要求32的方法，其中所述賦形劑包括布比卡因。
34.根據權利要求1的方法，其中所述rVSV組合物在藥學上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體中施用。
35.一種用于在哺乳動物受試者中誘導針對抗原的抗原特異性免疫應答的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包括(a)一種第一組合物，包括含有編碼所述抗原DNA序列的DNA質粒，所述編碼序列受指導其通過所述DNA質粒表達的調控序列所調控；和(b)至少一種重組水泡性口膜炎病毒(VSV)，包括編碼所述抗原的核酸序列，所述編碼序列受指導其通過所述重組VSV表達的調控序列所調控。
36.根據權利要求35的組合物，其中所述VSV具有復制能力。
37.根據權利要求35的組合物，其中所述VSV不復制。
38.根據權利要求35的免疫原性組合物，還包括細胞因子組合物。
39.根據權利要求38的免疫原性組合物，其中所述細胞因子組合物包括含有DNA質粒的核酸組合物，所述DNA質粒包括編碼所述細胞因子的DNA序列，所述編碼序列受指導其通過所述DNA質粒表達的調控序列所調控。
40.一種用于在哺乳動物受試者中誘導抗原特異性免疫應答的方法中的試劑盒，所述試劑盒包括至少一種第一組合物，包括含有編碼所述抗原的DNA序列的DNA質粒，所述編碼序列受指導其通過所述DNA質粒表達的調控序列所調控；至少一種第二組合物，包括含有編碼所述抗原的核酸序列的重組水泡性口膜炎病毒(VSV)，所述編碼序列受指導其通過所述重組VSV表達的調控序列所調控；和用于實施權利要求1方法的說明書。
41.根據權利要求40的試劑盒，其中所述VSV具有復制能力。
42.根據權利要求40的試劑盒，其中所述VSV不復制。
43.根據權利要求40的試劑盒，還包括細胞因子組合物。
44.根據權利要求43的試劑盒，其中所述細胞因子組合物包括含有DNA質粒的核酸組合物，所述DNA質粒包括編碼所述細胞因子的DNA序列，所述編碼序列受指導其通過所述DNA質粒表達的調控序列所調控。
45.下述組合物在制備在動物中誘導對所述抗原免疫應答的藥物中的應用，所述組合物是(a)一種第一組合物，包括含有編碼所述抗原DNA序列的DNA質粒，所述編碼序列受指導其通過所述DNA質粒表達的調控序列所調控；和(b)至少一種重組水泡性口膜炎病毒(VSV)，包括編碼所述抗原的核酸序列，所述編碼序列受指導其通過所述受重組VSV表達的調控序列所調控。
全文摘要
一種在哺乳動物受試者中誘導抗原特異性免疫應答的方法，包括步驟對所述受試者施用有效量的第一組合物，所述第一組合物包括含有編碼所述抗原的DNA序列的DNA質粒，所述編碼序列受指導其在哺乳動物或脊椎動物細胞中表達的調控序列所調控。該方法也包括對所述受試者施用有效量的第二組合物，所述第二組合物包括含有編碼抗原核酸序列的重組水泡性口膜炎病毒(rVSV)，所述編碼序列受指導其在哺乳動物或脊椎動物細胞中表達的調控序列所調控。在一個實施方案中rVSV具有復制能力。用于免疫接種和疾病治療的試劑盒，包括用于實施該方法的組分和說明書。
文檔編號A61K39/21GK1764474SQ200480007818
公開日2006年4月26日 申請日期2004年3月23日 優先權日2003年3月26日
發明者J·H·埃爾德里奇, Z·R·伊斯拉埃爾, M·A·伊根, S·A·烏德姆 申請人:惠氏公司