專利名稱：免疫原性組合物及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及免疫原性組合物，其中抗原通過靜電相互作用與樹突細胞配體聯系。 本發明進一步涉及所述組合物用于誘導受試者免疫應答的用途。
背景技術：
人們對于可用于提高人類和其它動物免疫應答特別是預防疾病的組合物的開發有著日益增長的興趣。在產生免疫應答的過程中，抗原與樹突細胞相遇是必要的。樹突細胞是免疫細胞并且構成哺乳動物免疫系統的一部分。其主要功能是處理抗原材料并將其呈遞在免疫系統其它細胞的表面上，因此其作為抗原呈遞細胞發揮功能。之前已經認真思考過抗原對于樹突細胞的靶向性并已證明樹突細胞上的Toll樣受體(Toll-like rec印tor)會對包括脂質的脂肽引起強烈的免疫應答(W0 2004/014956 & WO 2004/014957，將其公開并入本文以作參考)。對于能夠誘導有效的抗體應答的任何肽，其必須包含特殊的氨基酸序列(被稱為可被免疫系統識別的表位)。特別地，對于抗體應答，表位需要被B淋巴細胞表面存在的特異性免疫球蛋白(Ig)受體識別。正是所述細胞最終分化為能夠產生對于所述表位的抗體特異性的漿細胞。除了所述B細胞表位，免疫原還必須包含表位，所述表位通過抗原呈遞細胞(APC)向輔助T淋巴細胞上存在的特異性受體呈遞，對于提供信號必不可少的所述細胞需要所述B細胞以分化為抗體產生細胞。在病毒感染的情況下以及在癌癥的許多情況下，抗體包含在恢復中有限的益處以及對于能夠殺死所述病毒感染細胞或癌癥細胞的細胞毒性T細胞(CTL)產生應答的所述免疫系統。如同輔助T細胞，CTL首先通過與APC(攜帶其呈遞于所述表面上的特異性肽表位)的相互作用被激活，此時與MHC I級分子而不是II分子聯系。一旦激活所述CTL就可以吸引攜帶相同肽/I級復合體的靶細胞并導致其溶解。愈發明顯的是，輔助T細胞在所述過程中發揮作用；在所述APC能夠激活所述CTL之前，其必須首先接收來自所述輔助T細胞的信號以上調必需的共刺激分子的表達。輔助T細胞表位通過存在于APC表面上的分子結合，所述APC通過所述主要組織相容性復合體(MHC)的II級基因編碼。然后，所述II級分子復合體和肽表位通過T輔助淋巴細胞表面上的特異性T細胞受體(TCR)識別。通過這種方法，在MHC分子前體下的以抗原表位呈遞的T細胞可以被激活并提供對于B淋巴細胞分化所必需的信號。然后一般而言，免疫原必須包含能夠被輔助T細胞識別的表位，除非所述表位會被B細胞或細胞毒性T細胞識別。顯然所述類型的表位可能完全不同。對于B細胞表位， 由于B細胞受體直接結合于天然免疫原，因此構象是重要的。相反地，被T細胞識別的表位不依賴于表位的構象完整性，并且由大約九個氨基酸的短序列構成CTL以及由稍微較長的序列(對于長度的限制較少)構成輔助T細胞。對于所述表位的唯一要求是其能夠分別被安置在所述I級或II級分子的結合裂縫中，并且所述復合物然后能夠吸引所述T細胞受體。II級分子的結合位點是兩端開放的，其允許肽鏈長度的極大變化(Brown，J. H.，T. S. Jardetzky, J. C. Gorga, L. J. Stern, R. G. Urban, J. L. Strominger 禾口 D. C. Wiley. 1993. Three-dimensional structure of the human class II histocompatibility antigen HLA-DRl. Nature 364 33)盡管已經報道了短如8個氨基酸殘基的表位(Fahrer, A.M.， Geysen, H. Μ. , White, D. 0. , Jackson, D. C.禾口 Brown, L. Ε. Analysis of the requirements for class II-restricted T_cell recognition of a single determinant reveals considerable diversity in the T_cell response and degeneracy of peptide binding to I-ED J. Immunol. 1995. 155 :2849_2857)。
發明內容
本發明人已經開發了包含抗原和樹突細胞靶向組分的免疫原性組合物，其中所述抗原與所述樹突細胞靶向組分靜電聯系。第一方面，本發明提供包含抗原和樹突細胞靶向組分的免疫原性組合物，其中所述抗原包含帶負電區域，并且其中所述樹突細胞靶向組分包含共價結合于樹突細胞配體的帶正電基團，并且其中所述抗原的帶負電區域與所述樹突細胞靶向組分靜電聯系。第二方面，本發明提供包含抗原和樹突細胞靶向組分的免疫原性組合物，其中所述抗原包含帶正電區域，并且其中所述樹突細胞靶向組分包含共價結合于樹突細胞配體的帶負電基團，并且其中所述抗原的帶正電區域與所述樹突細胞靶向組分靜電聯系。第三方面，本發明提供提高受試者免疫應答的方法，所述方法包含為受試者施用本發明的第一或第二方面的免疫原性組合物。
在下文中，OVA =卵清蛋白；HEL =雞蛋清溶菌酶；R4(S2Pam2Cys)=圖5中1處顯示的構造；E4(S2Pam2Cys)=圖5中2處顯示的構造；CFA =完全弗氏佐劑。圖1由接種R4(S2Pam2Cys-OVA)復合物引起的抗體和細胞介導的應答。㈧對成組的BALB/c小鼠接受皮下接種單獨的25 μ g OVA、在CFA中乳化的OVA或者與等摩爾的或 5倍摩爾過量的R4 (S2Pam2Cys)混合的0VA。26天后，動物接受第二次相同劑量的抗原。在第一次接種抗原27天后(〇)和第二次接種抗原13天后(·)從血液中獲取血清。通過 ELISA測定抗體水平，并且單獨的抗體滴度與由橫棒表示的平均值一同展示。(B)在第50 天給小鼠第三次接種并在7天后獲得脾臟。對脾細胞進行細胞內細胞因子染色以檢測產生 SIINFEKL-特異性IFN-γ的⑶8+T細胞的存在。數據以三份樣品的平均值和標準偏差表示。圖2由接種陽離子和陰離子脂肽_蛋白質復合物引起的OVA和HEL特異性抗體應答。BALB/c小鼠接受皮下接種單獨的25 μ g HEL(A)或OVA(B)、在CFA中乳化的所述HEL 或OVA或已與所述抗原混合的等量WR4(S2Pam2Cys)或E4 (S2Pam2Cys。在最初(〇)接種后 28天對小鼠采血，在第32天強化免疫并在第46天(·)再次取血。然后通過ELISA測定抗體水平。單獨的動物滴度與由橫棒表示的平均值一同展示。圖3卵清蛋白-脂肽復合物的沉降。將遞增量的支鏈R4(S2Pam2Cys)或直鏈 Pam2Cys-SK4脂肽與Inmol的卵清蛋白(OVA)在平底96-孔平板中的總體積為100 μ 1的PBS 中混合。然后通過測定溶液于450nm處的光密度以測量所述溶液的濁度。圖4卵清蛋白-R4 (S2Pam2Cys)脂肽溶液的HPLC分析。在含有(A) IOOnmol支鏈R4(S2Pam2Cys)脂肽、(B)Inmol卵清蛋白(OVA)或(C)離心(1.2X IO5G)后在總體積為 100 μ 1的PBS中的R4(S2Pam2Cys)脂肽和卵清蛋白混合物的溶液的上清液中進行HPLC分析。(D)將由含有所述脂肽和OVA 二者的所述混合物得到的沉淀物材料溶解在50%丙酮的水溶液中，然后通過HPLC分析。在所有含有R4(S2Pam2Cys)的樣品中，對應于所述脂肽的峰的確認通過質譜來驗證。圖5在末端位置包含帶正電的(精氨酸，R;賴氨酸，K)或帶負電的(天冬氨酸，D; 谷氨酸，Ε)氨基酸以使其各自的靜電荷展示于環境中的支鏈的(構造1-5)和直鏈的(構造 6-8)免疫原性組合物的一些實例的示意圖。每個免疫原性組合物還含有二棕櫚酰-S-甘油基半胱氨酸(Pam2Cys)，其是Toll樣受體2的配體。兩個絲氨酸殘基(Ser)也包含在內。 在構造2的情況下所述肽結構以N — C的方向組裝，圖中所示的所有其它結構均以C — N 組裝。正性和負性靜電電荷以2-、2+、1-、1+等顯示，其取決于電荷的大小。Ac=在谷氨酸位于N-末端的情況下用于抑制α氨基正電荷的乙酰基。發明詳述本發明發現共價結合于樹突細胞靶向基團的帶電部分與抗原靜電聯系以構成免疫原性復合物，所述免疫原性復合物可用于提高免疫應答。因此，本發明提供了包含抗原和樹突細胞靶向組分的免疫原性組合物，其中所述抗原包含帶負電區域，并且其中所述樹突細胞靶向組分包含與樹突細胞配體共價結合的帶正電基團，并且其中所述抗原的帶負電區域與所述樹突細胞靶向組分靜電聯系。 在本發明的這個方面，重要的是所述抗原包括能夠與所述帶電靶向組分發生靜電相互作用的帶負電區域或領域。然而，所述抗原具有整體的負電荷不是必不可少的，盡管是優選的。通過加入帶負電基團還可能增加所述抗原的負電荷。例如，對于多肽抗原而言，天冬氨酸或谷氨酸殘基鏈可以被加入到所述多肽中。優選地，所述帶正電基團包含至少一個帶正電氨基酸。還優選地，所述帶正電基團是支鏈的或直鏈的肽，優選為支鏈的。在多種實施方案中，所述肽包括至少一個精氨酸、組氨酸、鳥氨酸或賴氨酸殘基或其組合。優選地，所述肽包含至少四個精氨酸殘基和/或至少四個賴氨酸殘基。特別優選地，所述帶正電基團包含支鏈肽，所述支鏈肽包含至少4個精氨
酸殘基。第二方面，在本發明提供了包含抗原和樹突細胞靶向組分的免疫原性組合物，其中所述抗原包含帶正電區域，并且其中所述樹突細胞靶向組分包含共價結合于樹突細胞配體的帶負電基團，并且其中所述抗原的帶正電區域與所述樹突細胞靶向組分靜電聯系。在本發明的這個方面，重要的是所述抗原包括能夠與所述帶電靶向組分發生靜電相互作用的帶正電區域或領域。然而，所述抗原具有整體的正電荷不是必不可少的，盡管是優選的。通過加入帶正電基團還可能增加所述抗原的正電荷。例如，對于多肽抗原而言，賴氨酸、精氨酸或組氨酸殘基鏈可以被加入到所述多肽中。優選地，所述帶負電基團包含至少一個帶負電氨基酸。還優選地，所述帶負電基團是支鏈的或直鏈的肽，優選為支鏈的。在多種實施方案中，所述肽包括至少一個天冬氨酸或谷氨酸殘基或其組合。優選地，所述肽包含至少四個天冬氨酸殘基和/或至少四個谷氨酸殘基。特別優選地，所述帶正電基團包含支鏈肽，所述支鏈肽包含至少4個谷氨酸殘基。在本發明的優選實施方案中，所述抗原不是核酸。還優選地，所述抗原與所述樹突細胞靶向組分僅通過靜電相互作用聯系。可在本發明中使用的一系列樹突細胞配體列舉在表1中。然而，優選地，所述樹突細胞配體是TLR配體。所述TLR配體可包含脂質或肽聚糖或脂蛋白或脂多糖。特別地，所述TLR配體可包含棕櫚酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基、月桂酰基、辛酰基或癸酰基。優選地， 所述 TLR 配體選自 Pam2Cys、Pam3Cys、Ste2Cys、Lau2Cys 和 0ct2Cys。在某個實施方案中，所述TLR配體結合TLR-2，所述TLR配體可與TLR-I或TLR-6 聯系。第三方面，本發明提供了提高受試者免疫應答的方法，所述方法包含為受試者施用根據本發明的第一或第二方面的免疫原性組合物。
權利要求
1.一種免疫原性組合物，其包含抗原和樹突細胞靶向組分，其中所述抗原包含帶負電區域并且其中所述樹突細胞靶向組分包含與樹突細胞配體共價連接的帶正電基團并且其中所述抗原的帶負電區域與所述樹突細胞靶向組分靜電聯系。
2.根據權利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述抗原具有整體負電荷。
3.根據權利要求1或權利要求2所述的免疫原性組合物，其中所述帶正電基團包含至少一個帶正電的氨基酸。
4.根據權利要求1至3任一項所述的免疫原性組合物，其中所述帶正電基團是支鏈的或直鏈的肽。
5.根據權利要求3所述的免疫原性組合物，其中所述肽包含至少一個精氨酸或賴氨酸殘基。
6.根據權利要求3或權利要求4所述的免疫原性組合物，其中所述肽包含至少四個精氨酸殘基和/或至少四個賴氨酸殘基。
7.一種免疫原性組合物，其包含抗原和樹突細胞靶向組分，其中所述抗原包含帶正電區域并且其中所述樹突細胞靶向組分包含與樹突細胞配體共價連接的帶負電基團并且其中所述抗原的帶正電區域與所述樹突細胞靶向組分靜電聯系。
8.根據權利要求7所述的免疫原性組合物，其中所述抗原具有整體正電荷。
9.根據權利要求7或權利要求8所述的免疫原性組合物，其中所述帶負電基團包含至少一個帶負電的氨基酸。
10.根據權利要求7至9任一項所述的免疫原性組合物，其中所述帶負電基團是支鏈的或直鏈的肽。
11.根據權利要求10所述的免疫原性組合物，其中所述肽包含至少一個天冬氨酸或谷氨酸殘基。
12.根據權利要求10或權利要求11所述的免疫原性組合物，其中所述肽包含至少四個天冬氨酸殘基和/或至少四個谷氨酸殘基。
13.根據權利要求1至12任一項所述的免疫原性組合物，其中所述抗原不是核酸。
14.根據權利要求1至13任一項所述的免疫原性組合物，其中所述抗原與樹突細胞靶向組分僅通過靜電相互作用聯系。
15.根據權利要求1至14任一項所述的免疫原性組合物，其中所述樹突細胞配體是 TLR配體。
16.根據權利要求15所述的免疫原性組合物，其中所述TLR配體包含脂質或肽聚糖或脂蛋白或脂多糖。
17.根據權利要求15或權利要求16所述的免疫原性組合物，其中所述TLR配體包含棕櫚酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基、月桂酰基、辛酰基或癸酰基。
18.根據權利要求15至17任一項所述的免疫原性組合物，其中所述TLR配體選自 Pam2Cys λ Pam3Cys、Ste2Cys、Lau2Cys 禾口 Oct2Cys0
19.根據權利要求15至18任一項所述的免疫原性組合物，其中所述TLR配體結合 TLR-l、TLR-2 或 TLR-6。
20.根據權利要求15至19任一項所述的免疫原性組合物，其中所述TLR配體結合 TLR-2。
21. 一種提高受試者免疫應答的方法，所述方法包含為受試者施用根據權利要求1至 20任一項所述的免疫原性組合物。
全文摘要
本發明提供包含抗原和樹突細胞靶向組分的免疫原性組合物。帶電基團共價連接于樹突細胞配體并與樹突細胞靶向組分靜電聯系。
文檔編號A61K38/38GK102448485SQ200980159611
公開日2012年5月9日 申請日期2009年4月16日 優先權日2009年4月9日
發明者B·Y·L·蔡, D·C·杰克遜, W·曾 申請人:墨爾本大學