位點特異性蛋白質偶聯物的制備方法

專利名稱：位點特異性蛋白質偶聯物的制備方法
技術領域：
本發明涉及比非偶聯的蛋白質具有更優良性質的化學修飾的蛋白質偶聯物(conjugate)。特別的是，本發明涉及一種大為簡化的、節約成本的并可擴大規模的以親水聚合物修飾蛋白質的方法。更特別的是，本發明涉及用聚乙二醇進行位點特異性修飾特定的蛋白質，例如胰島素。本發明還涉及基于生物可降解聚合物的藥物遞送制劑，其包含了經親水性蛋白質位點特異性修飾的蛋白質。
相關技術的說明許多生產PEG化的胰島素衍生物的方法都是已知的。Davis等(美國專利No.4179337)中記載了應用三氯-s-三嗪(氰尿酰氯)作為PEG和蛋白質之間的連接物，合成一種PEG-胰島素構建物。在他們的合成路線中，大量過量(50×)的氰尿酰氯活化的PEG(2000Da)與胰島素在硼酸鹽緩沖液(pH9.2)中反應2小時。發明人能夠制備部分(～50％)有活性的非免疫源的和非抗原的PEG-胰島素偶聯物。Obermeier等(加拿大專利No.1156217)發現根據上述Davis的專利中實施例X制備PEG-胰島素偶聯物時產生了一種不均一的偶聯物混合物，其中包含約50％三-PEG-胰島素偶聯物，以及其它在PheB1殘基上未取代的可能的PEG-胰島素衍生物的組合(單和二-PEG-胰島素)。
Obermeier等(加拿大專利No.1156217)闡述了一種在PheB1殘基上特異性修飾的PEG-胰島素偶聯物的合成。他們的發明的主要內容涉及在堿性條件下的有機溶劑(例如DMF、DMSO、吡啶等)中，用四丁基氧羰基(t-boc)或甲基磺酰乙氧羰基(Msc)保護GlyA1和LysB29殘基上的反應性胺。利用常規的色譜技術，從(單、二和三)保護的胰島素的復合混合物中分離出NαA1，NεB29-雙保護的胰島素種類。分離后，純的NαA1，NεB29-雙保護的胰島素與一種活化(鹽酸或異氰酸酯)的PEG衍生物反應，隨后利用肽化學常用技術除去保護基團。發明人發現GlyA1和LysB29上的氨基在堿性條件下比PheB1的氨基的反應性強。他們認為他們的位點特異性mpEG(1500)-B1-胰島素偶聯物在降低兔血糖水平時具有100％的胰島素活性(根據摩爾數計算)。
Geiger等(參見D.Branderburg和A.Wollmer(eds.)，InsulinChemistry，Structure，and Function of Insulin and RelatedHormones，Walter de Gruyter & Co.，New York，pp.409-415，1980)和Ehrat等(Biopolymers，22，569-573，1983)描述了利用與Obermeier等描述的多步驟方法相似的一種保護/偶聯/去保護方法制備的在PheB1殘基上特異性修飾的PEG-胰島素加成物。Geiger等和Ehrat等發現PEG(1500)-B1-胰島素偶聯物比原來的胰島素抗原性小得多，穩定得多(對于肝酶)。其它的PEG-胰島素制劑(Caliceti等，STP Pharma Sci，9，107-113，1999；Uchio等Advanced DrugDelivery Reviews，35，289-306，1999；Hinds等，Bioconj.Chem.11，195-201，2000；Hinds等，Advanced Drug Delivery Reviews，54505-530，2002)是1)將重點放在上述基本的三步保護/偶聯/去保護方法，2)導致胰島素分子的非特異性修飾，或者3)不產生最有效的偶聯物，其稱之為PEG-B1-胰島素。
Liu等(美國專利No.6323311B1)描述了一種有效的合成PEG-B1-胰島素偶聯物的方法。該方法是Obermeier三步保護/偶聯/去保護方法的擴展，但是不需要分離步驟之間反應中間產物(即一鍋合成)。這樣，胰島素在GlyA1和LysB29殘基上保護，立即與PEG反應，隨后在任何種類的分離前去保護。發明人宣稱他們的一鍋反應可以生產高達50％的正確位置的異構體(即PEG-B1-胰島素)，30％未反應的胰島素能夠循環用于隨后的衍生化。如果迅速進行制備這些構建物，需要至少五天完成。此外，該發明需要大量過量的PEG反應物來達到可接受的結果。雖然該發明的產物可能是有效的，它們的制備仍然需要蛋白質在不利于蛋白質的環境(高和低pH)中長時間經歷三個反應步驟。
通過提供一種一步反應簡便地制備在胰島素B鏈(PheB1)的氮末端特異性PEG化的高純度胰島素衍生物的方法，本發明克服了現有技術中PEG化胰島素方法的缺點。與表明在PheB1的PEG化是可能性最小的反應產物的現有技術(例如Caliceti等，1999，supra)相比，本發明的方法采用了特定的控制pH條件，使用金屬離子鰲合劑以及加入有機溶劑加強PheB1氨基末端的相對反應性，使之成為PEG化的主要位點。基于通過在PheB1殘基上位點特異性PEG化賦予胰島素的大量有益性質(例如降低的免疫源性/抗原性；提高的蛋白水解、化學和物理穩定性；提高的循環半衰期；提高的水/有機溶劑溶解性；完整的生物活性)，一種實現上述成果的簡便的、節約成本的、可簡便升級的方法成為本領域中一項顯著的進步。
發明概述本發明是基于一步制備蛋白質-聚合物偶聯物的方法的發現。本發明還涉及基于生物可降解的聚合物的藥物遞送制劑，其包括具有用親水性蛋白質位點特異性修飾的蛋白質。在一個特別實施方案中，本發明提供一種一步合成PEG化胰島素衍生物的方法，其中取代的位置主要是PheB1殘基(B鏈的氮末端)。本領域所熟知的是，這種衍生物比天然胰島素在物理性質上和酶學上更穩定。此外，衍生物比胰島素更易溶于水/有機溶劑系統。此外，這些衍生物已經顯示出較低的免疫源性，具有延長的循環半衰期。
本發明的一個顯著的優點是反應在接近中性的條件下進行，不需要的副反應(例如脫酰胺化，轉酰胺化，氧化等)可以忽略。另一個優點是使用相對較小量的聚合物(例如PEG試劑)，這樣節省成本。得到的蛋白質聚合物偶聯物(例如PEG化胰島素)可以單獨使用，例如用于人類的治療，或將其包封在緩釋給藥載體中，例如美國專利申請2002/0155158中所記載的。
相應的，在一個實施方案中，本發明提供一種用于制備蛋白質-聚合物偶聯物方法，其是通過在至少一種有機溶劑和至少一種金屬鰲合劑存在下，在蛋白質和聚合物形成偶聯物的條件下，將胰島素蛋白和親水聚合物接觸而進行的。然后可應用多種常規技術分離偶聯物，例如柱色譜。
在本發明的一種特別的情況中，親水聚合物選自聚乙二醇、聚乙二醇/聚丙二醇共聚物、聚氧乙基化甘油、以及它們的線狀、分支狀和氨基反應性衍生物。適合的氨基反應性衍生物包括，例如，乙醛、PEG羧酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯、PNP碳酸酯以及苯并三唑末端的親水聚合物衍生物。典型的是，親水聚合物和胰島素蛋白以約10∶1-1∶1的摩爾比例存在。
用于本發明的適合的有機溶劑包括許多種已知的溶劑，包括但不限定于，易溶于水的有機溶劑，例如乙醇、甲醇、DMSO、二噁烷、DMF和NMP。典型的是，有機溶劑以約0.1-10％的濃度存在。
用于本發明的適合的金屬鰲合劑也包括許多已知的化合物，包括但不限定于，多價(例如二價)金屬離子鰲合劑，例如EDTA、去鐵敏(DEF)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和雙(氨基乙基)乙二醇醚N，N，N’，N’，-四乙酸(EGTA)。通常，鰲合劑存在的濃度約0.1-10mM。
在本發明的一個特定實施方案中，胰島素蛋白和親水聚合物(例如PEG)在以重量計的蛋白濃度為約0.1-5％的水溶液中接觸(反應或偶聯)。在本發明另一個實施方案中，胰島素蛋白和親水聚合物在pH為約5.0-7.5，優選約7.0的水溶液中接觸。這就得到含量高達50％的胰島素-聚合物偶聯物的正確位置的異構體。在另一種特殊的實施方案中，親水聚合物和胰島素蛋白在約4℃-50℃，優選在15℃-25℃的溫度下接觸。
蛋白質-聚合物偶聯物一旦形成后，將其與不需要的副反應產物和未反應的胰島素蛋白分離。這可通過多種現有技術完成，例如色譜。在一種特別的情況下，使用離子交換色譜。
在另一種實施方案中，本發明的方法進一步包含在分離偶聯產物之前結束胰島素蛋白和親水聚合物的反應(例如偶聯)的步驟。在一種特別的實施方案中，這是通過降低反應的pH值至約1-4完成的。
本發明的方法制備的特別的蛋白-聚合物偶聯物包括，例如，胰島素-聚合物偶聯物，優選胰島素-PEG偶聯物(PEG化胰島素)。這包括任何胰島素或胰島素相關的蛋白質，例如具有SEQ ID NO1所示序列的人胰島素以及相關的家族成員。在一個特別實施方案中，胰島素在PheB1殘基上特異性反應(PEG化)，在GlyA1和LysB29殘基上無明顯反應。得到的PEG化胰島素能夠通過現有技術熟知的任何適合的劑型給藥治療。在一種特別的實施方案中，偶聯物是通過例如在給藥前將偶聯物包封在生物可降解的聚合物中得到的緩釋劑型給藥的。
本發明其它的實施方案在如下的詳細說明和實施例中將會更清楚。
附圖簡述

圖1A和1B是說明給正常大鼠靜脈注射PEG-胰島素偶聯物后，位點取代(圖1A)或聚合物分子量(圖1B)影響的體內藥效學的圖。
圖2A和2B是說明不同分子量胰島素-PEG偶聯物的物理聚合造成的可溶性胰島素的損失，這些偶聯物具有相同的聚合物連接位點(圖2A)，以及相同分子量PEGF的不同的聚合物連接位點造成的可溶性胰島素的損失(圖2B)。
圖3為說明兩個mPEG(5000Da)胰島素位置異構體的化學穩定性的圖。
圖4為說明P5000(PEG-胰島素)從PGLA微球上體外釋放的累積的圖。
圖5為說明糖尿病大鼠皮下注射給藥后F5000(PEG-胰島素)微球的體內藥效學的圖。
圖6為說明糖尿病大鼠皮下注射給藥后F5000(PEG-胰島素)微球的體內藥物代謝動力學的圖。
詳細說明本發明涉及一種快速有效的一步制備蛋白質-聚合物偶聯物的方法。該方法包括在至少一種有機溶劑和至少一種金屬鰲合劑存在下，在接近中性的條件下將蛋白和親水聚合物反應。本發明的特別的蛋白-聚合物偶聯物包括應用最少的PEG試劑和溫和的條件，在PheB1氨基末端PEG化的胰島素。然而以前的研究表明PheB1通常是胰島素的最小反應性氨基，其傾向占據大空間的大分子試劑(參見，例如Caliceti等，1999，supra)。出人意料的是，本發明的方法產生了這樣的條件，在此條件下，PheB1是可用親水聚合物修飾的最有反應性的基團。這使得在簡便的一步反應中，在PheB1上PEG化的胰島素的產量最高，并能從其它的偶聯物和未反應的胰島素中分離出來。根據需要后者可以循環用于進一步的偶聯。血糖監控表明PEG化的PheB1胰島素偶聯物保留全部活性，并保留蛋白質的原有的結構。
親水聚合物術語“親水聚合物”是指任何水溶的線性的、分支的、叉狀的、分支叉狀的、樹枝狀的、多臂的、或者星形的聚合物，包括但不限定于聚乙二醇和聚乙二醇/聚丙二醇共聚物、聚氧乙基化甘油、以及相似的聚合物。優選聚合物的分子量從約500道爾頓至約50000道爾頓變化。本發明所用的典型的親水聚合物具有至少一個反應性基團，其通過氨基、羧基、巰基、磷酸根或羥基官能團與目標生物活性分子連接。用于本發明的親水聚合物，例如聚乙二醇，能夠根據常規方法制備，其中一個末端用甲氧基封端，另一個末端被活化以便于與生物活性分子上的活性基團連接。例如，美國專利US6113906記載了使用在聚乙二醇的U形(例如分支的)上的琥珀酰亞胺基琥珀酸酯或琥珀酰亞胺基碳酸酯反應性基團與蛋白質的氨基反應。美國專利US5650234記載了使用聚乙二醇的N-羥基苯并三唑碳酸酯、2-羥基嘧啶碳酸酯、以及N-羥基-2-吡咯啉酮碳酸酯衍生物與蛋白質的氨基反應形成一個穩定的脲鍵。美國專利US5672662記載了琥珀酰亞胺丙酸酯和琥珀酰亞胺丁酸酯取代的聚乙二醇與蛋白質的氨基反應形成一個穩定的酰胺鍵。美國專利US5446090記載了使用聚乙二醇的乙烯砜衍生物與蛋白質的巰基反應形成穩定的硫醚鍵。美國專利US5880255記載使用乙二醇的tresyl(2，2，2-三氟乙烷磺酰基)衍生物與蛋白質的氨基反應形成一個簡單的、穩定的仲胺鍵。美國專利US5252714記載了使用聚乙二醇的丙醛衍生物與蛋白質的氨基反應得到一個穩定的仲胺鍵。這些親水聚合物與生物活性分子連接得到的鍵能夠被有意識的設計成穩定的或不穩定的(例如可逆的)。此外，本發明使用的親水聚合物可以根據常規方法制備，其中有兩個相似的(例如同型雙功能的)或不相似的(例如異型雙功能的)功能基團用于與生物活性分子上的活性基團偶聯。例如，WO126692A1記載了異型雙功能的聚乙二醇衍生物在蛋白質修飾中的應用。這些專利的全部內容在此引用作為參考。
在一種實施方案中，親水聚合物是聚(乙烯二醇)(PEG)。PEG是指一種線性的或分支的中性聚醚，其化學式為HO(CH2CH2O)n-H。PEG極易溶于水和許多有機溶劑(例如二氯甲烷、乙醇、甲苯、丙酮和氯仿)，各種大小(分子量)和功能性的結構(例如氨基、羧基以及巰基末端的)均容易得到。已知PEG無毒，經FDA批準用于藥品(腸胃外給藥、局部給藥、栓劑、鼻腔噴霧)，食品和化妝品。PEG在溶液中是一種高度水合的聚合物，其中每一個單體(乙烯氧單元)能結合多達三分子的水。此外，PEG具有影響更松散聯系的水合水分子的幾個分子層結構的能力。對水中與單表面結合的鏈的行為進行分子模擬表明，聚合物表現出很大程度的分段彈性。這樣就推測聚合物在水性環境中占據了大的流體動力體積。這些發現能夠解釋PEG在PEG存在時排斥其他聚合物(天然的和合成的)存在的原因。其它聚合物被排斥主要原因是PEG具有排斥蛋白質，與其它合成聚合物形成兩相系統，使該聚合物具有非免疫源性和非抗原性。當PEG以共價鍵結合到蛋白質上，其通常將許多聚合物的有益特性轉移到形成的偶聯物中。因為上述的許多有益的特性，PEG非常適合用于蛋白質的修飾。
如此處所述，術語“PEG”包括任何PEG聚合物，包括PEG的氨基反應性衍生物(“PEG試劑”)。許多用于蛋白質偶聯的PEG試劑是已知的。一種典型的PEG試劑是線性的PEG聚合物，其具有一個醚鍵封端(0-甲基)，以及另一個反應性基團功能化的末端。其它的PEG試劑是分支的或樹狀的，再將非反應性末端和反應性功能基相結合連接到蛋白質上。可選擇的是，帶有相似的或不相似的反應性功能基相結合的相同或不同的雙功能PEG試劑可用于連接蛋白質。PEG試劑的例子包括，但不限定于，乙醛、N-羥基琥珀酰亞胺碳酸酯、N-羥基琥珀酰亞胺丙酸酯、對-硝基苯基碳酸酯或者苯并三唑碳酸酯封端的一類或者其它氨基反應性活化的PEG種類。
PEG聚合物的分子量可以在，例如500-50000Da的范圍內。反應性功能基團可以通過連接基團從PEG鏈中分離出來。任選地，聚合物的PEG和連接基團之間的內部鍵是可任意降解的。相應的，在本發明的一種實施方案中，PEG聚合物上的反應性基團可以被親電性活化用于與蛋白親核試劑反應。親電基團的例子為n-羥基琥珀酰亞胺碳酸酯，tresyl和醛功能團。具有這些功能的PEG試劑將發生反應與蛋白質的氨基形成共價連接。優選的用于PEG偶聯到蛋白質氨基上的PEG試劑是一種丙酸連接子的mPEG琥珀酰亞胺活化酯mPEG-SPA。另一種優選的PEG試劑是單甲氧基PEG醛(mPEG-Ald)。
胰島素-聚合物偶聯物自從75年以前發現胰島素以來，胰島素制劑的腸道外給藥一直作為用于治療胰島素依賴型糖尿病(IDDM)的主要治療方法。導致現有的治療存在不足的許多因素是胰島素分子固有的內在缺點。特別是胰島素面臨著許多蛋白質類藥物的典型問題，包括物理和化學穩定性差，對蛋白水解敏感，免疫源性和抗原性以及相對較短的血漿半衰期。
蛋白質PEG化已經被用于改善重組人蛋白質的治療效果。通過網狀內皮系統(RES)、腎臟、脾臟和肝臟，大多數腸道外給藥的蛋白質從體內快速清除掉。PEG連接到蛋白質影響其分子大小、電荷以及受體結合能力，能夠用來降低偶聯物的總清除率。
此外，酶對蛋白質的代謝導致治療性蛋白質的生物活性迅速喪失。通過空間屏蔽對導致蛋白水解的因素敏感的蛋白質結構域，PEG降低了導致生物活性喪失的蛋白質水解。
此外，重組人蛋白質在重復使用后還引起免疫反應。通過空間屏蔽治療性蛋白質的免疫源性和抗原性決定區，PEG連接通常形成了非免疫源性和非抗原性的偶聯物。相應的，通過PEG化導致了腸道外蛋白質性質的變化，其結果提高了血漿半衰期和對蛋白水解降解的抗性，降低了得到的PEG蛋白構建物的免疫源性和抗原性。
胰島素蛋白這里使用的術語“胰島素蛋白”是指任何天然形成的或重組的胰島素蛋白或者相關能夠在例如殘基PheB1上被偶聯的蛋白質。相應的，本發明使用的胰島素蛋白包括，例如胰島素類似物、等同物和衍生物。來自任何適合的物種的胰島素都能夠使用，例如人、豬、牛、狗、大鼠、小鼠、綿羊、或者猴子。在一個優選的實施方案中，胰島素為人胰島素。
人胰島素是一種眾所周知的蛋白質，可從許多商業來源方便的獲得，其中包括但不限定于，Sigma Chemical Company和Novo Nordisk。天然形成人胰島素是一種分子量約5500道爾頓，包括約51個氨基酸的蛋白質。由于生產商不同，胰島素根據分子量活性略有差別。然而，以單位確定的胰島素的活性是標準的。具有不同程度生物活性的胰島素是商業上可獲得的。例如，可以購買緩慢、中間的、快速起作用的胰島素種類。具有與胰島素相似活性或者提高胰島素受體的非胰島素降血糖試劑包括但不限定于，磺酰脲(例如格列本脲、甲磺吡脲、格列甲嗪、格列波脲、氯磺丙脲、甲磺氮草脲、乙酰苯磺酰環己脲以及glimopride)，噻唑烷二酮(例如曲格列酮和吡格列酮)，α-葡萄糖苷酶抑制劑(例如阿卡波糖和米格列醇)以及第三代胰島素釋放劑(例如KAD1220、etoxomir以及瑞格列奈)。
胰島素分子由兩個多肽鏈，A鏈和B鏈組成。人胰島素的氨基酸序列在此由SEQ ID NO1提供。A鏈由21個氨基酸組成(A1-A21)，長B鏈由30個氨基酸組成(B1-B30)。這兩個鏈通過殘基A7和B7之間以及A20和B19之間的兩個鏈間二硫鍵連接，然而另一個鏈內二硫鍵連接殘基A6和A11。兩個鏈的氨基酸殘基之間還有許多非共價相互作用，用來穩定胰島素形成三維結構。
有三個反應性氨基用于修飾(例如通過PEG)，它們定位在A鏈和B鏈的N末端(分別為A1和B1)以及定位臨近B鏈C末端(B29)的一個賴氨酸。
胰島素蛋白還包括相關的蛋白質，例如胰島素樣生長因子(I和II)，以及來源于生長激素/泌乳素類的蛋白質。
胰島素蛋白與親水聚合物偶聯根據本發明，在至少一種有機溶劑和至少一種金屬鰲合劑存在下，在促進蛋白質和聚合物形成偶聯物的條件下，胰島素蛋白和親水聚合物相接觸(例如反應或偶聯)。在一種特殊的實施方案中，使用最小量的PEG試劑和溫和的條件，在胰島素蛋白的PheB1氨基末端PEG化胰島素蛋白。PheB1的氨基通常是胰島素上的3個可用的氨基功能基中反應性最小的(Caliceti等，1999，supra)。在本發明中，發現了賦予使PheB1氨基具有與PEG試劑最大反應性的條件。因此這些反應條件形成在PheB1上單獨PEG化成為主要的反應產物。
在本發明一個特殊的實施方案中，胰島素蛋白和親水聚合物在蛋白質濃度為約0.1-5％(w/y)，優選從0.5-1.5％，pH調節為5.0-7.5，優選為6.5-7.2的范圍內的水溶液中相接觸。pH可以通過加入緩沖鹽、加入有機酸/堿，或者加入普通的無機酸/堿來控制。水溶液中進一步包含至少一種水溶性有機溶劑，其可以選自包括乙醇、甲醇、DMSO、二噁烷、DMF、NMP等的組。在另一方面，有機溶劑優選二噁烷，存在的濃度(v/v)為0-25％，優選2-20％，更優選5-15％。
用于本發明的適合的金屬鰲合劑包括許多種已知的鰲合劑，包括例如氨基聚羧酸，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、N-2-乙酰氨基-2-亞胺二乙酸(ADA)、二(氨基乙基)乙二醇醚、N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)、反二氨基環己烷四乙酸(DCTA)、谷氨酸和天冬氨酸；羥基氧氨基羧酸，例如N-羥基氧乙基亞胺基二乙酸(HIMDA)、N，N-雙-羥基氧乙基甘氨酸(N-二(羥乙基)甘氨酸)和N-(三羥基氧甲基甲基)甘氨酸(N-三(羥乙基)甘氨酸)；N-取代甘氨酸，例如甘氨酰甘氨酸。其它適合的鰲合劑包括2-(2-氨基-2-oxocthyl)氨基乙烷磺酸(BES)和去鐵敏(DEF)。本發明的方法中使用的適合的鰲合劑包括，例如，結合溶液中的金屬離子使之不能與可獲得的氧氣反應，從而最小化或避免形成OH自由基，其與蛋白質自由反應并降解蛋白質。這些鰲合劑能夠降低或避免在缺少鰲合劑保護時造成的蛋白質的降解。
本發明使用的鰲合劑以其鹽的形式存在，例如羧酸或前述鰲合劑的其它酸性功能基。這些鹽的例子包括與鈉、鉀、鈣或者其它弱結合金屬離子形成的鹽。如本領域所知曉的，鹽的性質和待中和的電荷數量有賴于存在的羧基基團的數量以及穩定螯合劑提供的pH。本領域所知的，鰲合劑與特定的目標離子結合的能力不同。通常，重金屬離子比與它們相似荷電的低分子量對應物結合得更強。
本發明的方法中使用的鰲合劑也可以選自EDTA、EGTA以及其它本領域已知的多價陽離子鰲合劑。根據本發明的方法，金屬鰲合劑，優選EDTA，存在的濃度為0.1-10mM，優選從1-5mM，更優選從1-3mM。
用于本發明的適合的親水聚合物包括許多種已知的聚合物，包括例如聚乙二醇、聚丙二醇、及其線性的、分支的和氨基反應性衍生物。在本發明的另一個方面中，氨基反應性衍生物選自由乙醛、N-羥基琥珀酰亞胺、PNP碳酸酯，以及苯并三唑封端的親水聚合物衍生物。在本發明一種特殊實施方案中，親水聚合物，例如PEG試劑，優選PEG的琥珀酰亞胺酯，更優選mPEG-SPA，與胰島素以約10∶1至1∶1，優選3∶1至1.2∶1，更優選1.7∶1至1.5∶1的摩爾比接觸。在另一種實施方案中，親水聚合物和胰島素蛋白在約4℃至50℃，優選約15℃至25℃下接觸。
在另一種實施方案中，本發明進一步包括在分離偶聯物之前中止偶聯反應的步驟。這是通過例如降低pH至約1-4，優選約2-3，更優選約2.4-2.6完成的。然后通過常規技術進行偶聯物的分離，例如離子交換(例如陽離子交換)色譜，將目標偶聯物收集、濃縮、脫鹽以及干燥。
偶聯的生物活性劑在控釋給藥制劑中的用途偶聯的生物活性劑，例如PEG化的胰島素蛋白，可以事先包封在基于生物可降解的聚合物的給藥制劑中。包封在藥物給藥制劑中的PEG化生物活性劑要比相應的非PEG化的生物活性劑的濃度高。PEG化的生物活性劑從生物可降解聚合物給藥制劑中釋放表明其與相應的非PEG化生物活性劑相比較少爆發(burst)。生物可降解聚合物給藥制劑中的PEG化的生物活性劑比相應的非PEG化生物活性劑的物理和化學穩定性高，抗原性和免疫源性低。
本申請中生物可降解的聚合物包括，但不限定于，聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(d，l-丙交酯-共聚-乙交酯)、聚己內酯、聚原酸酯、聚酯和聚醚的共聚物、聚(丙交酯)和聚(乙烯二醇)的共聚物等。
因此，本發明蛋白質-聚合物(例如PEG化的胰島素)的偶聯物被有利地引入的生物可降解的聚合物給藥制劑包括，例如，聚(d，l-丙交酯-共聚-乙交酯)(PLGA)微粒。與非偶聯的蛋白質相比，其中包封更多的蛋白偶聯物，也降低了爆發(釋放超過第一個24小時)。此外，與親水聚合物偶聯，例如PEG，使偶聯物溶于某種有機溶劑，簡化了形成PLGA微球的過程。
實施例I.通過一步法的位點特異性PEG-胰島素的制備和表征實施例1Nαβ1-甲氧聚(乙烯二醇)-胰島素偶聯物的制備將1克(172μmol)胰島素(Zn2+-胰島素，Intergen公司)在室溫下溶解于100mL含有2mM EDTA的水中，使用稀HCl將溶液的pHapp調節至7。在另一個容器中，將1.4g(相對于胰島素的1.6mol的等同物)的一種活化的PEG衍生物[單甲氧基聚(乙烯二醇)琥珀酰亞胺丙酸酯，mPEG-SPA，Shearwater公司]在室溫下溶解于10mL二噁烷。然后，通過直接注射將mPEG-SPA溶液加入胰島素溶液中，反應在室溫下進行2小時。然后通過HCl酸化(pHapp2.5)中止反應，用0.02％的碳酸氫銨對混合物進行完全過濾[配備YM3(3000MWCO)膜的Amicon8200超濾器]。再用1M乙酸/7M脲/0.01M NaCl對反應混合物進行完全過濾，純化前濃縮至10mL。使用配備SP瓊脂糖(AmershamBioscience)離子交換柱的FPLC系統，將mPEG-PheB1-胰島素衍生物與其它反應的副產物(mPEG-GlyA1-胰島素、mPEG-LysB29-胰島素、二-mPEG-胰島素以及三-mPEG-胰島素)分離。用包含0.04M NaCl的1M乙酸/7M脲在流速為5mL/min平衡柱，使用NaCl梯度(0.04M-0.12M)溶液洗脫結合蛋白超過80分鐘。收集在280nm檢測時主要的峰對應的洗脫液。用0.02％的NH4HCO3進行完全過濾以除去任何低分子量的雜質，然后在鑒定之前凍干并在-20℃下保存。
同樣的方法還被用于制備一種帶有連接在PheB1氨基上的一種低分子量線性聚合物(即mPEG-SPA，Mr＝2000Da)偶聯物，以及兩種高分子量分支聚合物(即mPEG-SPA，Mr＝10000Da)偶聯物。這兩種獨特的偶聯物可以根據下述的技術進行表征。結果證實該方法能夠成功的用于制備許多種PEG-PheB1-胰島素偶聯物，其差別僅在于連接在PheB1上的聚合物的結構(例如線性的或分支的)或大小(例如分子量)。
實施例2應用FPLC/HPLC分析偶聯物的純度使用分析型陽離子交換柱(MonoS 5/5，Amersham Bioscience)，在與上述分離步驟中相同的條件下，分析mPEG-PheB1-胰島素的純度，使用的流速為1.0mL/min。一種正交技術(反相HPLC)也被用于檢驗偶聯物的最終純度。Waters Alliance HPLC系統配備一種Waters 996光電二極管陣列檢測器(PDA)和一個Symmetry 300(C18，5μm粒徑，4.6×250mm)反相柱。流動相A由含有0.1％的TFA(三氟乙酸)的MilliQ優質水組成，流動相B由含有0.1％的TFA的95/5ACN(乙腈)/水組成。使用30-60％B的線性梯度超過15分鐘(2％B/分鐘)，在276nm下監測化合物的洗脫。mPEG-胰島素的純度大于95％。
實施例3N-末端蛋白質測序(Edman降解)證明偶聯物的同一性根據Edman降解反應在任何共價結合PEG的N-末端氨基上無法進行的原理，利用N-末端蛋白質測序分析確定PEG偶聯的位點。使用Applied Biosystem 477A蛋白質測序儀(Pasadena，CA)通過三個降解循環分析所有的樣品。[GlyA1/PheB1]的N末端氨基酸的摩爾比例≈1表明在殘基LysB29上連接(或者根本不連接)，[GlyA1/PheB1]≈0表明在殘基GlyA1上連接，[GlyA1/PheB1]≈30表明在殘基PheB1上連接。結果證明取代的位置約95％為PheB1。
實施例4基質輔助激光解吸離子化(MALDI)鑒定偶聯物的分子量選擇這種分析性的鑒定技術是因為它是一種“軟離子化”方法，其不會造成PEG-偶聯物在分析中降解。設備的輸出值為每個樣品的質/荷比的定量值；因此根據偶聯物和未修飾的胰島素的分子量的完全不同，能簡便的確定連接到胰島素上的PEG鏈的數量。所有的樣品在Perceptive Biosystem型DERP MALDI/TOF質譜上以線性模式檢測，并檢測陽離子。所有的樣品的本底為α-氰基-4-羥基肉桂酸，使用最后的光譜平均至少為64shot的337nm的氮激光線。單體胰島素的分子量計算值為5807.2Da，偶聯反應使用的mPEG(5000)-SPA的數均分子量為5129Da。mPEG(5000)-胰島素的質譜與只有一個mPEG鏈連接到胰島素的結論吻合。此外，每個離子峰都相差44Da(乙烯氧化物單體單元的分子量)。這些結果證明在所有制備的偶聯物中只有一個mPEG連接在胰島素上，它們的多分散度只歸因于PEG固有的多分散度。
實施例5在將PEG偶聯到胰島素B1的氨基末端時仲胺的形成通過帶有末端醛基的活化的mPEG與蛋白質的反應制備F5000PEG-胰島素。該反應在希夫氏堿介質中進行，隨后通過硼氫化氰鈉還原，在聚合物和蛋白質之間形成一種穩定的仲胺鍵。反應按下列步驟進行制備2mM EDTA/25mM磷酸緩沖液，用磷酸調節pH值為6.0。將5.5mg/mL(總體積2mL)的胰島素溶于加入440μL二噁烷的磷酸緩沖液中。胰島素一經溶解，加入2mL的含有10mM NaCNBH3的水溶液，然后加入過量的5倍摩爾的mPEG(5000)-乙醛(干粉狀，ShearwaterCorporation，Huntsville，Alabama)。反應混合物中共含有約12.5mM磷酸(pH6)，1mM EDTA，10％二噁烷，5mM NaCNBH3，2.5mg/mL的胰島素，以及10mg/mL的mPEG-乙醛。反應進行過夜，第二天pH為約5.5。加入乙酸至pH為約2時中止反應。使用RP-HPLC對少量代表性試樣進行分析。反應產物主要種類確定如下約70％的反應產物是單PEG化(r.t.12.5min)，剩下約10％的未反應的胰島素(r.t.9.8min)以及9％雙PEG化胰島素(r.t.13.8min)。收集單PEG化的組分，用0.02％的NH4HCO3透析并凍干。MALDI-TOF分析顯示出一個對應于PEG-5000鏈連接到胰島素的單分子質譜。Edman降解分析表明約95％的單PEG化種類在PheB1殘基上取代，剩余的單PEG化種類(～5％)很可能是在GlyA1殘基上取代，這是因為在此使用的反應條件下，LysB29的氨基中99.99％被質子化(因此未反應)。
II.制備位點特異性PEG-胰島素偶聯物的可選擇的方法實施例6使用傳統的多步驟方法將PEG-5000連接到B鏈氨基末端(F5000)使用一種雙叔丁氧羰基保護的中間體將重組人胰島素(IntergenCo.)在PheB1位置上PEG化。根據Liu等1997(Liu等Bioconj.Chem.8(5)664-672，1997)合成雙NuA1，NεB29-t-叔丁氧羰基-胰島素(雙叔丁氧羰基胰島素)。根據前述Hind等，2000的方法制備mPEG(5000)-PheB1-胰島素偶聯物。
根據反相HPLC和離子交換FPLC的色譜峰面積，通過FPLC分離的目標組分純度大于98％。純化的產物進一步通過MALDI-TOF質譜和氨基酸序列分析表征，其顯示單取代的PEG在B鏈氨基末端，PheB1。根據該方法制備和純化的mPEG(5000)-PheB1-胰島素偶聯物(F5000)與根據本發明的較簡單和耗時少的方法制備的同種偶聯物是等同的(實施例1)。
實施例7PEG-5000連接B鏈Lys29(K5000)根據前述Hind等，2000的方法在B鏈的Lys29上特異性PEG化重組人胰島素。根據反相HPLC和離子交換FPLC的色譜峰面積，目標FPLC組分純度大于98％。純化的產物進一步通過MALDI-TOF質譜和氨基酸序列分析鑒定，其顯示在B鏈倒數第二個氨基酸LysB29上單取代的PEG。同樣的方法還用于制備在LysB29的氨基上連接有一個低分子量線性聚合物(例如mPEG-SPA，Mr＝2000Da)和兩個高分子量分支的聚合物(例如mPEG2-SPA，Mr＝10000或2000Da)的偶聯物。根據上述技術鑒定這三個不同的偶聯物。結果證明該方法能夠被成功用于制備許多種PEG-Lys-胰島素偶聯物，它們僅僅在連接到LysB29的聚合物的結構(例如線性的或分支的)和大小(分子量)上不同。
III.位點特異性PEG胰島素的構象、活性和穩定性的表征實施例8對經過位點特異性PEG化的胰島素的構象完整性的評價在遠紫外范圍內的圓二向色性光譜被用于檢測胰島素的構象。通常評價兩個反向最小值的大小，即在水相環境下，在208nm(α-螺旋)和223nm(β-片層)下分析胰島素的構象。在208nm遠紫外CD譜帶主要來源于由B10-B19，A2-A6以及A13-19之間的殘基形成的α-螺旋，而β結構是造成在223nm下遠紫外CD譜帶的主要因素。樣品的CD圖譜的特點證明mPEG連接在胰島素的PheB1或LysB29殘基上。與Zn2+-胰島素相比，偶聯物的完整構象(二級)不會改變。
實施例9PEG胰島素偶聯物的藥物動力學對PEG化對胰島素藥效學的作用進行了研究。這些研究結果用于評價包含不同取代位置(位置異構體)或PEG分子量的PEG胰島素的偶聯物制劑的體內生物活性(降低血清葡萄糖的能力)，并與商業上可獲得的胰島素制劑(Humulin R，Lilly)相對比。向禁食的Sprague-Dawley大鼠靜脈注射F5000、K2000、K5000、K10000、或者HumulinR后測量血中的葡萄糖水平。將0.3IU/kg(基于蛋白濃度并對PEG重量作適當校正；假定25IU/mg蛋白)等量物溶解于普通生理鹽水中，尾靜脈注射給藥。每組N＝6。在被測物注射之前以及注射后超過6小時的間歇抽血。通過常規的流程分離血清，使用Accucheck Advantage(Beringer Igelheim)葡萄糖儀測試葡萄糖水平。
圖1A和1B中的結果表明當以正常人胰島素的等量劑量使用時，F5000、K2000和K5000都能有效的降低正常大鼠的血糖水平。有趣的是，K10000偶聯物降低血糖水平的程度達不到其它被測物的水平，但是發現該偶聯物的作用時間超過6小時。因此K10000偶聯物可以被開發成一種可溶的傳統的基本胰島素懸浮液的替代物，用來長效降低糖尿病病人的血糖。
實施例10典型的PEG胰島素偶聯物的物理穩定性使用一種加速振蕩試驗方法來測試七種PEG-胰島素偶聯物(F2000、F5000、F10000、K2000、K5000、K10000以及K20000)和鋅胰島素的物理穩定性。該試驗通常在現有技術中有記載，它能夠以快速的方式準確測試胰島素制劑的物理穩定性。對于該實驗，制備四份蛋白質(偶聯物)的水溶液(1mg/mL，磷酸緩沖鹽，pH7.3，0.02％的疊氮化鈉)，在37℃下水平振蕩(頻率100/min)。在預定的時間點將樣品撤下，過濾(除去不溶性聚集物)，通過PR-HPLC分析量化保留在溶液中的蛋白(偶聯物)組分。圖2顯示當每一種胰島素衍生物作為時間的函數時，可溶性蛋白減少。
這些數據證實了最近的報道，在PheB1-氨基取代的胰島素衍生物具有實質上更高的(36-40×)物理穩定性，LysB29胰島素在某種程度上比天然的肽更穩定(4-8×)。最近的研究顯示PheB1胰島素對纖維化的抗性提高是由于兩種互補的效應。第一個效應是通過mPEG偶聯，在B鏈的N末端形成的特殊空間位阻，導致阻止該表面參與胰島素原纖維生長所需的疏水相互作用。第二個有助于PheB1-胰島素提高物理穩定性的效應是非特異性和具有的天然的空間構象，并且根據聚合物的分子量成比例增加。所有的LysB29-胰島素都表現出相對于天然多肽更高的物理穩定性，但是達不到在PheB1上取代的偶聯物的程度，直到聚合物的分子量超過10kDa。這能夠由LysB29沒有參與纖維化反應，存在著通過參與纖維化的分子間相互作用的非特異性空間位阻造成的穩定化效應來解釋。
實施例11典型的PEG胰島素偶聯物的化學穩定性文獻中廣泛記載了胰島素(或胰島素類似物)在水溶液中經歷多種化學分解反應。例如根據脫酰胺作用機制，胰島素A鏈的C末端天門冬氨酸分解是在酸性條件下通過一個環狀中間體完成的。根據轉氨基作用反應機制，這種高反應性環狀中間體還能夠通過與不同胰島素分子的N末端氨基中的一個反應而分解。
胰島素偶聯物F5000和K5000在37℃下含有0.02％疊氮化鈉的PBS中水平振蕩孵育。在規定的時間點(0、6、12、28和36天)，撤下每個樣品并通過RP-HPLC分析來確定脫酰胺作用的程度，和通過分子排阻色譜來確定共價二聚作用的程度。
IV.PEG-胰島素生物可降解聚合物緩釋制劑的制備、鑒定和藥物動力學實施例12將PEG-胰島素包封在PLGA微球中將PEG-胰島素F5000(50mg)溶解于1ml二氯甲烷中。將溶液加入體積為1ml的含有150mg PLGA45∶55(lac∶gly)，0.15dl/g帶有酸末端基團的IV的二氯甲烷。二氯甲烷溶液加入置于15ml離心管中的含有1％聚(乙烯醇)的5ml水中，漩渦混合以形成乳液。將乳液加入100ml含有0.3％聚(乙烯醇)的100ml水中，攪拌3小時蒸發二氯甲烷。使用Whatman#1濾紙真空過濾收集硬化的微球，并干燥。
實施例13PEG-胰島素PLGA微球的鑒定通過掃描電子顯微鏡和激光散射顆粒大小分析分別觀察PEG-胰島素微球的表面形態和顆粒大小分布。分析型反相HPLC用于對包封在聚合物微球中的PEG-胰島素偶聯物定量。在HPLC分析之前，一定量的微球溶解于一定體積的乙腈中，加入等體積的0.1％的TFA水溶液中沉淀聚合物，將偶聯物萃取到水溶液中。也使用這種方法將K2000、K5000、K10000、K20000和F5000-A包封。這些實驗的結果列在表1中，其中列出了總微球的PEG-胰島素的百分含量(w/w)和包封效率，是由包封的PEG-胰島素的重量/最初加入的PEG-胰島素的重量表示。所得的相對高的藥物含量高達28.3％，包封效率達100％，由于降低了所需的總劑量使得產物可用于臨床，由于起始原料損失少使得產物具有商業前景。此外，使用不同的丙交酯∶醣脂比例(50∶50和72∶25)，分子量(6.5-24kDa)，固有粘度(0.09-0.27dL/g)，或者末端酯基團(甲基或月桂基)的聚合物在大的裝藥量范圍(5-35wt％)內制備微球。
表1典型的PEG-胰島素微球制劑的鑒定
用PLGA(45∶55L∶G，0.15dL/g，酸末端基團)制備微球，達到25wt％的名義上的核心載量。
實施例14用于動物試驗的PEG-胰島素微球制劑的體外釋放將15mgF5000PEG-胰島素微球(14.1％的藥物含量，PLGA45∶55；0.15dL/gIV，酸末端基團)樣品混懸在1.5ml磷酸緩沖鹽(pH7.4，0.02％疊氮化鈉和0.02％Tween20)中，在37℃下孵育。間隔棄去上清液，用RP HPLC分析釋放的PEG-胰島素。用新鮮的PBS取代緩沖液，繼續孵育。將累計釋放作為孵育時間的函數來分析數據(圖4)。在第一天中PEG-胰島素釋放低于1.0％，在18天內釋放超過95％。低爆發釋放，高的總釋放以及超過約兩周時間的持續釋放都是緩釋釋放胰島素制劑非常希望具備的特點。
通過實施例12的方法使用F5000與不同的生物可降解的聚合物，以及還使用K5000PEG-胰島素與F5000-A偶聯物制備的其它制劑也得到了在0和7.5％之間的一天釋放值，緩釋持續時間達到60天。
實施例15F5000PEG-胰島素PLGA微球的體內藥效學和藥物代謝動力學將由PLGA 45∶55，0.15dl/g IV，酸末端基團(14.1％核心載量)組成的微球中的F5000PEG-胰島素進行血糖抑制實驗，對F5000在糖尿病大鼠中進行藥物代謝動力學實驗。在待測物給藥前一天，通過皮下注射40mg/kg溶于等滲的檸檬酸鹽緩沖液(10mM，pH4.5)中的鏈脲菌素(Sigma，St.Louis，MO)使雄性SD大鼠(～250g)產生糖尿病(Junod，A.等，J.Clin.Invest.，482129-2139，1969)。然后使用懸浮于2.5％無菌羧甲基纖維素(CMC)或生理鹽水(陰性對照)中的PEG-胰島素微球(～11mg/大鼠，相當于3mg胰島素/kg體重)對動物進行治療，在預定的時間點抽血并分離血清，隨后分析血糖(PD)和F5000(PK)水平。圖5和6顯示超過13天時間內血清葡萄糖水平和血清PEG-胰島素水平(數據是平均+/-SE的形式)。圖5顯示正如預期的一樣，在整個試驗中對照糖尿病大鼠的血糖水平為100％或者更高(在測量誤差范圍內)。對于PEG-胰島素微球治療的糖尿病大鼠，三天后血糖水平降低至治療前水平的60％以下，并再保持7天的抑制。
圖6顯示在微球注射后(t＝1小時)很快檢測到一個可以忽略的最初的爆發釋放(Cmax＝0.62ng/ml)。注射后開始的24小時，治療組的PEG-胰島素水平穩定上升2天至治療水平(～1-3.5ng/mL)并持續約7天，而陰性對照組F5000血清水平在任何時候低于檢測限。這些數據共同顯示在微球形成過程中偶聯物保持生物活性，并在微球注射后一周長的釋放時間內保持。重要的是，在體外(圖4，第一天釋放＜0.5％)和體內(圖6，AUC0-1d/AUC0-13d＝0.7％實驗)都發現與最初PEG-胰島素爆發釋放相近的量。此外，圖5和6所示的數據的分析表明在該實施例中藥物代謝動力學/藥效學(PK/PD)相關聯。
等同物通過使用不超越常規的實驗，本領域技術人員認知或者能夠確認許多與在此描述的本發明的特定實施方案的等同物。這些等同物應被下述的權利要求所包括和覆蓋。
序列表<110>PR PHARMACEUTICALS，INC.et al.
<120>位點特異性蛋白質偶聯物的制備方法<130>PRJ-013PC<150>60/462,364<151>2003-04-11<160>1<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>51<212>PRT<213>人<400>1Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1 5 10 15Glu Asn Tyr Cys Asn Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu20 25 30Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr35 40 45Pro Lys Thr50
權利要求
1.一種制備蛋白質-聚合物偶聯物的方法，其包括(a)將胰島素蛋白和親水聚合物在至少一種有機溶劑和至少一種金屬螯合劑存在下，在促進蛋白質和聚合物形成偶聯物的條件下接觸；以及(b)分離偶聯物。
2.權利要求1所述的方法，其中胰島素蛋白包括人胰島素。
3.權利要求1或2所述方法，其中親水聚合物選自聚乙二醇、聚乙二醇/聚丙二醇共聚物、聚氧乙基化甘油，以及它們的線狀的、分支狀的和氨基反應性的衍生物。
4.權利要求3所述的方法，其中氨基反應性衍生物選自乙醛、N-羥基琥珀酰亞胺、PNP-碳酸酯，以及苯并三唑封端的親水聚合物。
5.前述任意權利要求所述的方法，其中親水聚合物和胰島素蛋白以約10∶1-1∶1的摩爾比例接觸。
6.前述任意權利要求所述的方法，其中有機溶劑選自由乙醇、甲醇、DMSO、二噁烷、DMF和NMP組成的組。
7.前述任意權利要求所述的方法，其中有機溶劑存在的濃度為約0.1-10％。
8.前述任意權利要求所述的方法，其中胰島素蛋白和親水聚合物以約0.1-5.0％的蛋白濃度相接觸。
9.前述任意權利要求所述的方法，其中胰島素蛋白和親水聚合物在pH約5.0-7.5下相接觸。
10.前述任意權利要求所述的方法，其中螯合劑選自由多價金屬離子螯合劑、EDTA、去鐵敏(DEF)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)，以及雙(氨基乙基)乙二醇醚N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)組成的組。
11.前述任意權利要求所述的方法，其中螯合劑以約0.1-10mM的濃度存在。
12.前述任意權利要求所述的方法，其中胰島素蛋白和親水聚合物在約4-50℃下接觸。
13.前述任意權利要求所述的方法，其中該方法進一步包括在分離偶聯物之前中止偶聯物形成的步驟。
14.權利要求13所述的方法，其中通過降低pH至約1-4來中止反應。
15.前述任意權利要求所述的方法，其中使用色譜技術進行分離。
16.權利要求15所述的方法，其中色譜技術包括離子交換色譜。
17.前述任意權利要求所述的方法，其進一步包括將偶聯物包封在生物可降解的聚合物中的步驟。
18.一種制備胰島素-PEG偶聯物的方法，其包括(a)將胰島素和PEG在至少一種有機溶劑和至少一種金屬螯合劑存在下，在促進胰島素和PEG形成偶聯物的條件下接觸；以及(b)分離偶聯物。
19.權利要求18所述方法，其中胰島素包括人胰島素。
20.權利要求18或19所述方法，其中PEG包括選自由乙醛、N-羥基琥珀酰亞胺、PNP-碳酸酯，以及苯并三唑封端的親水聚合物組成的組中的氨基反應性PEG衍生物。
21.權利要求18-20任一項所述方法，其中PEG和胰島素以約10∶1-1∶1的摩爾比例接觸。
22.權利要求18-21任一項所述方法，其中PEG和胰島素在約0.1-5.0％的蛋白濃度相接觸。
23.權利要求18-22任一項所述方法，其中PEG和胰島素在pH約5.0-7.5下相接觸。
24.權利要求18-23任一項所述方法，其進一步包括在分離偶聯物之前中止偶聯物形成的步驟。
25.權利要求24所述方法，其中通過降低pH至約1-4來中止反應。
26.權利要求18-25任一項所述的方法，其中使用離子交換色譜進行分離。
27.權利要求18-26任一項所述的方法，其進一步包括將偶聯物包封在生物可降解的聚合物中。
全文摘要
本發明涉及一種快速有效的制備蛋白質－聚合物偶聯物，包括胰島素－聚合物偶聯物的一步方法。根據本發明的方法，蛋白質和親水聚合物在至少一種有機溶劑和至少一種金屬螯合劑存在下，在促進蛋白質和聚合物形成偶聯物的條件下接觸。因此本發明涉及用聚乙二醇在PheB1殘基上對特定的蛋白質，例如胰島素，進行位點特異性修飾。本發明還提供一種將偶聯物包封在生物可降解的聚合物中的藥物制劑。
文檔編號A61K38/28GK1777440SQ200480009722
公開日2006年5月24日 申請日期2004年4月8日 優先權日2003年4月11日
發明者K·海因茲, D·路易斯, P·施密德特, K·M·坎貝爾 申請人:Pr藥品有限公司