專利名稱：偶聯生物分子及其制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及偶聯生物分子以及由聚合物如聚乙二醇的新型化學官能化衍生物制 備該偶聯生物分子。
背景技術：
許多治療活性分子不具有在臨床醫學應用上實現功效所需要的性質。例如，目前 生物制藥工業和遺傳工程正在不斷地發現和生產具有治療活性的蛋白質和多肽。盡管目前 在美國市場上存在至少80種蛋白質基藥物，并且還有至少350種蛋白質基藥物正在進行臨 床試驗(Harris J， Chess R :Effect of Pegylation on pharmaceuticals. Nature Review Drug Discovery, 2003， 2， 214-221)，但是大多數天然蛋白質并沒有制出好藥物，這是因為 在向患者施用時存在幾個固有缺陷，包括(1)蛋白質被存在于血液或組織中的許多內肽酶 和外肽酶所消化，(2)許多蛋白質在一定程度上是免疫原性的，以及(3)蛋白質可以通過腎 超濾作用被快速排泄。醫藥中用作活性治療劑的、具有全身毒性或缺乏最佳生物利用度和 藥代動力學的其它分子包括有效劑量受到毒性限制的低分子量分子。這種分子常用于治療 由于癌變、感染和自身免疫疾病而導致的炎癥和病癥。 水溶性的合成聚合物，尤其是聚亞烷基二醇，用于偶聯治療活性分子如蛋白質。已 經表明，這些治療偶聯物通過延長循環時間和降低清除率來有利地改變藥代動力學、降低 全身性毒性，并在一些情況下表現出臨床藥效的提高。使聚乙二醇PEG共價偶聯至蛋白質 上的方法通常稱作"聚乙二醇化(PEGylation)"，不過許多不同的聚合物也已被作為偶聯聚 合物進行研究。 許多用于偶聯的聚合物試劑包括水解不穩定的偶聯化學官能團。水解不穩定的聚 合物偶聯劑的實例是活化酯，例如包括聚環氧烷-N-琥珀酰亞胺碳酸酯(Zalipsky美國專 利No. 5， 122， 614)。這些試劑在水性介質中具有較短的半壽期，所述水性介質包括血液或血 漿。這導致需要加入化學計量上大量過量的偶聯聚合物試劑。試劑的水解穩定性是重要的， 因為對于蛋白質偶聯加入化學計量上過量的要求需要大量的努力和成本，以從反應混合物 中純化聚合物-蛋白質偶聯物。此外，這些水解不穩定的試劑傾向于優選與蛋白質中的胺 化學官能團進行反應，尤其是賴氨酸殘基的e-胺。由于大多數相關的蛋白質具有多于一 個賴氨酸殘基，并經常具有許多賴氨酸殘基，因此偶聯傾向于在蛋白質上的許多殘基位點 上發生，而不是特異的。可以純化偶聯反應混合物以分離與一個聚合物分子偶聯的蛋白質， 但是不能以合理的成本分離全部與蛋白質上相同胺基偶聯的聚合物-蛋白質偶聯物。非特 異偶聯通常導致蛋白質功能的削弱。例如，通過賴氨酸殘基隨機結合聚環氧烷的抗體和抗 體片段導致修飾型抗體(或修飾型抗體片段)能夠以降低的親和性、親抗原性或特異性結 合目標抗原。另外，胺特異性聚合物偶聯劑需要選擇確保蛋白質上的胺不被質子化的偶聯
5反應條件。這些條件需要適當高pH的介質(8-10)，這使得胺基具有足夠的活性與聚合物 偶聯劑反應。高PH條件通常對蛋白質是有害的，引起蛋白質的結構變化和變性。這些過程 導致蛋白質功能的削弱。胺特異性聚合物偶聯劑傾向于結合至蛋白質上可接近的胺位點。 這些試劑可以稱為動力學試劑(kinetic reagent)。它們是不穩定的，與蛋白質上最可接 近的氨基親核位點反應。通過胺酰化作用偶聯的胺特異性聚合物偶聯劑導致蛋白質上氨 基酸殘基的胺基團上正電荷的丟失，所述正電荷通常在生理條件下存在于未偶聯蛋白質。 胺特異性聚合物偶聯劑的這些特征通常導致蛋白質功能的部分削弱。包含在聚合物中、用 于偶聯至蛋白質、胺特異性的并且通常水解不穩定的其他偶聯功能基團包括異氰酸酯(WO 94/04193)和碳酸酯(WO 90/13540)。 確保每個蛋白質上偶聯聚合物分子的數目相同并且每個聚合物分子特異性地共 價偶聯至每個蛋白質分子中相同的氨基酸殘基上，這對于最佳功效和確保劑量之間一致性 來說是尤其相關的。沿著蛋白質分子上位點處的非特異性偶聯導致偶聯產物散布，并經常 導致未偶聯蛋白質而得到一種復雜混合物，要純化所述復雜混合物是困難的、繁重的且昂 貴的。 已經開發了蛋白質的硫醇特異性聚合物偶聯劑，它們致力于解決以下限制與偶 聯至蛋白質的反應形成競爭的偶聯劑水解反應的傾向性、蛋白質中不同氨基酸殘基處的非 特異性聚合物偶聯和對高pH偶聯反應條件的需要。可以在接近于中性的pH值時使用硫醇 特異性聚合物偶聯劑，此時蛋白質氨基酸殘基上的胺官能基團被質子化，并因此不能在偶 聯反應中與聚合物偶聯劑有效競爭。與前述胺特異性試劑相比，更加水解穩定的硫醇特異 性聚合物偶聯劑可以在較小的化學計量過量下使用，因此降低了聚合物_蛋白質偶聯物純 化過程中的成本。對硫醇基團具有廣泛選擇性的偶聯官能基團包括碘乙酰胺、馬來酰亞胺 (WO 92/16221)、乙烯砜(WO 95/13312和W0 95/34326)、乙烯基妣啶(WO 88/05433)以及丙 烯酸酯和甲基丙烯酸酯(WO 99/01469)。這些硫醇選擇性偶聯基團在聚合物之間產生單一 的硫醚偶聯鍵。 大多數蛋白質不具有自由巰基(sulfhydral)，因為這些巰基與蛋白質內的二硫橋 進行重排和混雜(scrambling)反應，導致蛋白質功能削弱。對于具有自由巰基的蛋白質來 說，這些巰基通常對于蛋白質功能而言是至關重要的。通常，在蛋白質中，巰基的數目少于 胺基的數目(例如賴氨酸或組氨酸(histadine))。由于可以使得與蛋白質的偶聯特異性 發生在硫醇基團，并且由于蛋白質通常不具有自由的硫醇基團，因此存在通過突變引入用 于結合PEG的硫醇位點而對蛋白質進行定點修飾的實例。但是，這種修飾大大增加了成本。 所引入的自由巰基會具有上述工程蛋白質中蛋白質混雜和蛋白質二聚化的相似局限性。而 且，例如，突變過程和由細菌源制備修飾蛋白質通常導致自由巰基被束縛在與谷胱甘肽的 二硫鍵中。例如，白介素-2已經被突變修飾用半胱氨酸替換蘇氨酸殘基，從而使得可以進 行PEG的位點特異性結合。[Goodson RJ， Katre NV ;Bio/Technology (1990) 8， 343-346]。
本領域中已知，偶聯參數必須與相關治療活性分子在聚合物形態、分子量特征、化 學功能性方面進行最優匹配。盡管聚合物蛋白質偶聯物可以表現出安全、有效的醫藥應用 所需要的很多有利和必需的性質，但是聚合物偶聯對于蛋白質活性和穩定性的影響對于性 能來說是至關重要的。與偶聯位置和數目相關的偶聯變量以及聚合物特性必須與生物和物 理化學性質最優相關。
目前我們已經發現一系列新型試劑，它們可用于與來源于蛋白質中兩個半胱氨酸 殘基的兩個硫原子偶聯以提供新型硫醚偶聯物。首先本發明的目的是偶聯形成天然蛋白質 中天然二硫橋的兩個硫原子。二硫鍵發現于醫藥相關的蛋白質中，具體是在分泌性蛋白、溶 酶體蛋白和膜蛋白的胞漿外結構域。該技術提供了相對于將聚合物偶聯至蛋白質的已知技 術的明顯優點。 本發明提供具有下列通式的化合物
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其中，X和X'之一代表聚合物，另一個代表氫原子；
每個Q獨立地代表連接基團； W代表吸電子基團或可由吸電子基團還原而得的基團；或者，如果X'代表聚合 物，那么X-Q-W-可以共同代表吸電子基團；另外，如果X代表聚合物，那么X'和吸電子基 團W與居間原子可以共同形成環； Z1和Z2各自獨立地代表來源于生物分子的基團，每一個通過親核基團連接到A和 B ; 或者Z1和Z2共同代表來源于生物分子的單一基團，通過兩個親核基團連接到A和 B ; A是(V5亞烷基或亞烯基鏈；并且
B是鍵或(V4亞烷基或亞烯基鏈。 例如聚合物X或X'可以是聚亞烷基二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酸酯如聚 丙烯酰嗎啉、聚噁唑啉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酰胺如聚羧甲基丙烯酰胺或者 HPMA共聚物。另外，X或X'可以是易于酶促或水解降解的聚合物。例如，這種聚合物包括 聚酯、聚縮醛、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚亞氨基碳酸酯和聚酰胺如聚氨基酸。聚合物X或X' 可以是均聚物、無規共聚物或結構限定的共聚物如嵌段共聚物。例如X或X'可以是衍生 自兩種或多種環氧烷或者衍生自聚環氧烷與聚酯、聚縮醛、聚原酸酯或聚氨基酸的嵌段共 聚物。可以使用的多官能聚合物包括二乙烯基醚_馬來酸酐和苯乙烯_馬來酸酐的共聚 物。也可以使用天然產生的聚合物，例如多糖如殼多糖、葡聚糖、糊精、脫乙酰殼多糖、淀粉、 纖維素、糖原、聚唾液酸(poly(sialylic adic))及其衍生物。也可以使用聚合物如聚谷氨 酸，以及衍生自天然單體如糖類或氨基酸和合成單體如環氧乙烷或甲基丙烯酸的雜化聚合 物(hybrid polymer)。 如果聚合物是聚亞烷基二醇，那么優選含有C2和/或C3單元的聚亞烷基二醇，尤 其是聚乙二醇。聚合物尤其是聚亞烷基二醇可以包含單一線性鏈，或者它可以具有由許多 或大或小的鏈組成的支化形態。所謂的Pluronie是一類重要的PEG嵌段共聚物。這些衍 生自環氧乙烷和環氧丙烷嵌段。可以使用取代的聚亞烷基二醇例如甲氧基聚乙二醇。在本 發明的優選實施方案中，單鏈的聚乙二醇由合適的基團例如烷氧基如甲氧基、芳氧基、羧基或羥基引發，并在所述鏈的另一端連接至連接基團Q。 聚合物X或X'可以任選地以任何所希望的方式衍生或官能化。例如，具有兩個或 多個用于作為本發明主題的偶聯的化學基團的聚合物可以用于產生兩個或多個相連接生 物活性分子的偶聯物。反應基團可以連接在聚合物端基處或者沿聚合物鏈通過連接側基連 接；在這種情況下，所述聚合物例如是聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙 烯酸酯或馬來酸酐共聚物。包含一個以上生物分子的多聚體偶聯物可以導致協同和另外的 優點，所述生物分子通常是生物活性多肽或藥物。如果希望，聚合物可以利用常規方法結合 至固體載體上。 當然，聚合物的最佳分子量將取決于預定應用。優選地，數均分子量在500g/mol 至約75， OOOg/mol的范圍內。當希望通式I的化合物離開循環并滲透組織，例如用來治療 由癌變、感染和自身免疫疾病或由外傷而導致的炎癥時，使用2000-30， 000g/mo1的較低 分子量聚合物會是有利的。對于希望通式I的化合物保留在循環中的應用來說，使用例如 20， 000-75， 000g/mo1的較高分子量聚合物會是有利的。 選擇待使用的聚合物，應使得偶聯物可以溶于預定應用的溶劑介質中。對于生物 應用，尤其是對于臨床治療性給予哺乳動物的診斷應用和治療應用來說，偶聯物將可溶于 水性介質中。許多蛋白質如酶具有工業用途，例如催化化學反應。對于希望用于這種應用 的偶聯物來說，偶聯物溶于水性介質和/或有機介質會是有必要的。所述聚合物不應削弱 生物分子的預定功能。 連接基團Q例如可以是直接鍵合、亞烷基(優選(V1Q的亞烷基)或任選取代的芳 基或雜芳基，其中任意一種都可以由一個或多個氧原子、硫原子、-NR基團(其中R具有以 下給出的意義)、酮基、-0-C0-基和/或-C0-0-基封端或中斷(interrupted)。合適的芳 基包括苯基和萘基，而合適的雜芳基包括吡啶、吡咯、呋喃、妣喃、咪唑、卩比唑、噁唑、噠嗪、嘧 啶(primidine)和嘌呤。可以通過水解不穩定的鍵或通過非不穩定的鍵連接至聚合物。
可以在任選取代的芳基或雜芳基上存在的取代基例如包括選自以下的一個或多 個相同或不同取代基-CN、-N02、-C02R、-COH、-CH20H、-COR、-OR、-OCOR、-0C02R、-SR、-SOR、-S 02R、-NHC0R、_NRC0R、-NHC02R、-NR' C02R、_N0、-NH0H、-NR' 0H、_C = N_NHC0R、_C = N-NR' C 0R、-N+R3、-N+H3、-N+HR2、-N+H2R、卣素如氟或氯、-C三CR、_C = CR2和_C = CHR，其中R或R' 各自獨立地代表氫原子或烷基(優選C卜6烷基)或芳基(優選苯基)。尤其優選存在吸電 子取代基。 例如W可以代表酮或醛基C0、酯基-0-C0-或砜基_S02-，或由這種基團還原而得 到的基團，例如CH. OH基團、醚基CH. 0R、酯基CH. 0. C(0)R、胺基CH. NH2、 CH. NHR或CH. NR2、 或酰胺CH. NHC(0) R或CH. N(C(0) R)2。如果X-Q-W-共同代表吸電子基團，那么該基團例如 可以是氰基。 在該說明書的以下部分，Z1和Z2將共同稱作Z。本發明的一個優選實施方案是Z1
和Z2共同代表單一的生物分子<formula>formula see original document page 8</formula>
Z可以衍生自任何所希望的生物分子，例如蛋白質。所述蛋白質例如可以是多肽、 抗體、抗體片段、酶、細胞因子、趨化因子或受體。也可以使用通常通過二硫橋環化的約束或 環狀多肽和表位。合適的生物分子的具體實例列于下文。 優選地，將A或B連接至基團Z的親核基團衍生自硫醇基團或胺基。兩個硫醇基 團可以通過天然或工程化二硫(半胱氨酸)橋的部分還原而形成。胺基例如可以是賴氨酸 殘基。在Z1和Z2共同形成通過兩個硫醇基團連接至基團A和B的單一生物分子時，式I化
合物具有如下化學式
<formula>formula see original document page 9</formula> 本發明還提供了制備通式I的化合物的方法，包括使(i)具有通式(II)的化合物
或(ii)具有通式(III)的化合物與具有通式(IV)的化合物反應。
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^代表聚合物，另-
(II)
個代表氫原子； 在通式(II)中，X禾口X'之
Q代表連接基團； w'代表吸電子基團，例如酮基、酯基-o-co-或砜基-sa
合物，那么X-Q-W'可以共同代表吸電子基團；
A代表(V5亞烷基或亞烯基鏈；
B代表鍵或(V4亞烷基或亞烯基鏈；并且 每個L獨立地代表離去基團。
;或者，如果X'代表聚
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(III) 在通式(III)中，X、X' 、Q、W' 、A和L具有為通式II所給出的意義，另外如果X 代表聚合物，那么X'和吸電子基團W'可以與居間原子共同形成環，m代表l-4的整數。
Z(Nu)2 (IV) 在通式(IV)中，Z具有上述給出的意義，每個Nu獨立地代表親核基團，例如硫醇 或胺基團。如果Z1和Z2是相獨立的分子，那么在兩個連續步驟中相繼與分子Z、u和Z2Nu 進行反應。所述或每個離去基團L例如可以代表-SR、 -S02R、 _OS02R、 _N+R3、 _N+HR2、 _N+H2R、鹵
素或-o0,其中R具有如上給出的意義，0代表含有至少一個吸電子取代基的取代芳基，尤其是苯基，所述吸電子取代基例如-CN、 -N02 、 -C02R、 -COH、 -CH20H、 -COR、 -OR、 -OCOR、 -0C02R、-
SR、-S0R、-S02R、-NHC0R、-NRC0R、-NHC02R、-NR' C02R、_N0、-NH0H、-NR' 0H、_C = N_NHC0R、_C
=N-NR' COR、 -N+R3、 _N+HR2、 _N+H2R、卣素尤其是氯或尤其是氟、_C三CR、 _C = CR2和_C =
CHR，其中R和R'具有上文給出的意義。 其中W'和X'共同形成環的典型結構包括 每個Nu為硫醇基團的通式(IV)的化合物可以通過蛋白質的部分還原而制得，所
述蛋白質包含半胱氨酸連接，即
適當地，根據本發明的方法通過下述步驟進行原位部分還原來源于蛋白質中兩 個半胱氨酸氨基酸的二硫鍵，隨后使還原產物與式(II)或(III)化合物反應。例如可以利 用傳統方法，用二硫蘇糖醇、巰基乙醇或三羧乙基膦還原二硫化物。所述方法可以在溶劑或 溶劑混合物中進行，其中所有反應物都是可溶的。可以使得包含親核基團的生物分子(例 如蛋白質)能夠在水性反應介質中直接與式II或III化合物反應。根據親核試劑的pH要 求，該反應介質也可以是緩沖的。反應的最佳pH通常為約5.5-約8，例如約7.4，優選約 6. 0-6. 5。3-37t:之間的反應溫度通常是合適的如果在會發生分解或變性的溫度下進行偶 聯反應，那么蛋白質和其它生物分子會分解或變性而削弱功能。在有機介質(例如THF、乙 酸乙酯、丙酮)中進行的反應通常在至多室溫例如低于ot:的溫度下進行。
蛋白質可以包含一個或多個二硫橋。可以進行提供自由巰基的還原反應，以還原 蛋白質中的一個或多個二硫橋。根據二硫化物的還原程度和所使用的聚合物偶聯劑的化學 計量，可以將一個或多個聚合物分子偶聯至蛋白質。如果希望還原少于總數的二硫化物，那 么可以使用固定化還原劑，利用不同的反應條件或加入變性劑也可以進行部分還原。
作為替代方案，硫醇基團源可以是來自硫醇或半胱氨酸，它們不是最初衍生自二
(II工a)
(I工Ib)硫橋。如果硫醇基團源是二硫橋，那么其可以是鏈內的或鏈間的。 利用化學計量上等量或稍過量的試劑，生物分子可以與本發明的試劑有效偶聯， 這不同于現有技術中的許多試劑。但是，由于本發明的試劑不與使蛋白質溶劑化的水性介 質發生競爭性反應，因此可以用化學計量上過量的試劑進行偶聯反應。過量的試劑可以在 常規的蛋白質純化過程中通過離子交換層析容易地除去。 式(II)和(III)化合物是新型的，因此本發明還提供這些化合物本身。這些新型 試劑提供偶聯物技術的突破，聚合物上的化學官能團包括交叉官能化的、潛在地交叉偶聯 的、雙烷基化的基團，其對于兩個親核基團、尤其是來源于蛋白質中天然二硫鍵的兩個硫醇 具有選擇性。 根據本發明的方法的直接產物是通式I的化合物，其中W是吸電子基團。這種化 合物本身具有功用，因為本發明的方法在合適的條件下是可逆的，另外，W是吸電子基團的 通式(I)化合物可用于需要釋放自由蛋白質的應用中，例如用于直接的臨床應用中。但是 吸電子基團W可以被還原，以提供防止蛋白質釋放的基團，這些化合物也可用于許多臨床、 工業和診斷用途。 因此，例如，包含酮基的基團W可以被還原為含有CH(0H)基的基團W ;醚基CH. 0R 可以通過羥基與醚化劑的反應得到；酯基CH. O.C(O)R可以通過羥基與酰化劑的反應得到； 胺基CH. NH2、 CH. NHR或CH. NR2可以由酮或醛通過還原性胺化來制得；或者酰胺CH. NHC(O) R或CH. N(C(0)R)2可以由胺的酰化來形成。作為氰基基團的X-Q-W-可以還原為胺基。
X代表聚合物的通式(II)化合物可以通過使通式(VI)的化合物與通式(VII)的 聚合物反應來制備，
q, —w ya—l
H一Q B—L
間 通式(VI)中，Q' 、W、A、B和L具有上文給出的意義。
X-V (VII) 通式(VII)中，X代表聚合物；選擇Q'禾P V基團使得(VI)和(VII)化合物反應，
以提供所希望的通式II化合物。 作為替代方案，通式(VIII)的化合物
H-Q B—L
(VII工) 可以與通式(IX)的聚合物反應。 X-Q' (IX)
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通式(III)化合物可以通過以堿介導的從通式(II)化合物中除去一個離去基團 L來制備。 通式I化合物可以包括顯象劑，例如放射性核苷酸，從而能夠體內跟蹤化合物。合 適的是，放射性核苷酸或顯象劑I可以通過基團W結合，以提供例如下列類型的化合物
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其可以例如由下列類型的試劑制備
<formula>formula see original document page 12</formula>
例如
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聚合物 通式I的化合物有許多用途。例如，它們可以用于對患者進行直接臨床應用，并因 此，本發明還提供包含通式I化合物以及藥學上可接受的載體的藥用組合物。本發明還提 供通式I化合物用作藥劑的用途和治療患者的方法，所述治療患者的方法包括向患者施用 藥學上有效量的通式I化合物或根據本發明的藥用組合物。任何所希望的藥物效果，例如 外傷治療、酶的置換、排出毒素、抗發炎、抗感染、免疫調節、接種疫苗或抗癌癥，都可以通過 適當選擇生物分子來得到。 通式I化合物還可以用于非臨床應用。例如，許多生理活性化合物如酶能夠在有 機溶劑中催化反應，通式I化合物可以用于這些應用。此外，通式I化合物可以用作診斷工 具。 下文中提供根據所希望的用途可用于本發明的一些具體生物分子。酶包括碳水化 合物特異性的酶、蛋白酶等。通常用于工業(基于有機物的反應)和生物應用、尤其用于 治療應用的相關酶包括氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶和連接酶，如美國專利 4， 179， 337所公開。相關的特異酶包括天冬酰胺酶、精氨酸酶、腺苷脫氨酶、超氧化物歧化 酶、過氧化氫酶、胰凝乳蛋白酶、脂酶、尿酸酶、膽紅素氧化酶(bilirubin osidase)、葡萄糖 氧化酶、葡糖醛酸糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、葡糖醛酸糖苷酶、谷氨酰胺酶。
本發明的通式I化合物中所用的生物活性分子包括例如因子8、胰島素、ACTH、 胰高血糖素(glucagen)、生長激素抑制素、生長激素、胸腺素、甲狀旁腺激素、pigmentary hormones、生長調節素、紅細胞生成素、黃體生成素、下丘腦釋放因子、抗利尿素、促乳素、白介素、干擾素、集落剌激因子、血紅蛋白、細胞因子、抗體、絨膜促性腺激素、促卵泡激素、促 甲狀腺素和組織纖溶酶原激活物。 某些上述蛋白質如白介素、干擾素和集落剌激因子還以非糖基化形式存在，這通 常是通過重組蛋白質技術制備的結果。非糖基化變體可以用于本發明。 例如，對于干擾素，本發明允許制備與非偶聯的干擾素相比保留了生物活性的偶 聯物。這項非常令人驚奇的結果利用已知的偶聯技術是不可能實現的。
其它相關蛋白質是由Dreborg et all Crit. Rev. Ther即.Drug Carrier Syst. (1990)6315 365公開的變應原蛋白質，其在與聚合物如聚環氧烷偶聯時具有降低的變應原 性，并因此適于用作耐受誘導物(tolerance inducer)。在所公開的這些變應原中有豚草抗 原E、蜜蜂毒液、螨變應原等。 糖基化多肽如免疫球蛋白、卵清蛋白、脂酶、葡糖腦苷脂酶、凝集素、組織纖溶酶 原激活物和糖基化白介素、干擾素和集落剌激因子是受到關注的，比如免疫球蛋白如IgG、 IgE、 IgM、 IgA、 IgD及其片段。 尤其感興趣的是用于診斷和治療目的的臨床醫學中所用的抗體和抗體片段。抗體 可以單獨使用或者可以共價偶聯(負載有)另一原子或分子如放射性同位素或細胞毒性/ 抗感染藥物。表位可以用于接種疫苗，以得到免疫原性聚合物_蛋白質偶聯物。
本發明方法的關鍵特征在于a _亞甲基離去基團和雙鍵與用作Michael活化基 團的吸電子官能團交叉偶聯。如果離去基團易于在交叉官能試劑中消除，而不是易于直 接置換，并且吸電子基團是合適的Michael反應活化基團，那么通過連續的Michael和逆 Michael反應可以相繼發生分子內雙烷基化。離去基團用于掩蔽潛在的偶聯雙鍵，使其直 到第一烷基化發生之后才暴露，雙烷基化是相繼的、交互式Michael和逆Michael反應的結 果，如J. Am. Chem. Soc. 1979， 101,3098-3110和J. Am. Chem. Soc. 1988， 110,5211-5212.)中 所述。吸電子基團和離去基團的最理想選擇是使得可以通過相繼的Michael和逆Michael 反應發生雙烷基化。 還可以用偶聯至雙鍵或介于離去基團和吸電子基團之間的其它多重鍵制備交叉 官能烷基化劑，如J.Am. Chem. Soc. 1988， 110,5211-5212中所述。 由于上述類型的交叉官能化的雙烷基化試劑進行由Michael-逆Michael反應平 衡控制的烷基化反應，并且由于可以以有效保持三級結構的可控方式，部分減少蛋白質中1 到大于1的二硫鍵數目，因此可以使得雙烷基化在給定二硫鍵的半胱氨酸的兩個巰基中發 生。這種反應順序導致二硫橋與雙烷基化試劑的重新退火(rea皿ealling)。
通常，經生成式I化合物的偶聯形成的硫醇醚鍵在水溶液中是水解穩定的。試劑 本身也是水解穩定的。在這方面，如果在生理pH和至多45t:的溫度下，化合物不發生大量 降解，那么將該化合物視為水解穩定的。在這些條件下，經過八個小時，小于50%的降解視
為微弱的。 應該理解，本發明允許生產在端基處或沿聚合物主鏈的側鏈上具有交叉官能化的 雙烷基化官能團的聚合物試劑。 根據本發明的新型偶聯物的一些實例包括
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聚合物一o- 根據本發明的新型試劑的一些實例包括
<formula>formula see original document page 14</formula>
向250ml單頸圓底燒瓶中加入對硝基苯乙酮(16. 5g)、低聚甲醛(4. 5g)、哌啶鹽酸 鹽(12. lg)、無水乙醇(lOOmL)和磁力攪拌棒。向攪拌的非均勻混合物中加入鹽酸(37wt% 水溶液，lmL)，加熱該溶液，在氮氣條件下回流。l-2小時后再次加入低聚甲醛(3.0g)。使 該溶液回流約18h，在這期間再次加入低聚甲醛(3.0g)。使該反應溶液冷卻后，沉淀出結 晶固體，所述結晶固體在進一步回流時不溶解。過濾分離固體并使用非常熱的甲醇重結 晶，得到大的黃色晶體(10. 9g) 。 NMR(DMS0-d6) S 1. 34-1. 50 (m， 1H) ， 1. 64-1. 79 (m， 2H)， 1. 79-1. 94 (m， 4H) ， 2. 89-3. 05 (m， 2H) ， 3. 41 (q， 2H) ， 3. 51-3. 54 (m， 2H) ， 3. 82 (t， 2H) ， 8. 26 (s， 1H) ， 8. 29 (s， 1H) ， 8. 41 (s， 1H) ， 8. 44 (s， 1H)。
3-(2-羥乙基硫醇)_對_硝基苯基乙基酮 緩慢加熱對硝基-3-哌啶基苯基乙基酮鹽酸鹽(30g，0. lmol)和巰基乙醇(9. 5g， 0. 12mol)在95%乙醇(200ml)中的攪拌溶液，直至均勻。加入哌啶(1. Oml)并加熱反應混 合物，回流2h。冷卻后，旋轉蒸發除去大多數溶劑，加入乙酸乙酯(200ml)并過濾固體。相 繼使用10%的HC1水溶液、5%的NaHC03和鹽水抽提乙酸乙酯溶液，然后在Na2S04上干燥， 隨后將乙酸乙酯蒸發成油，所述油結晶，得到23. 2g所希望的產物，并在乙酸乙酯-乙醚中 重結晶。 2，2_雙(對甲苯硫代甲基)-對-硝基苯乙酮C24H23N03S2 向100ml單頸圓底燒瓶中加入對硝基-3-哌啶基苯基乙基酮鹽酸鹽(10. Og)、 4-甲苯硫醇(8. 2g)、甲醛(37% w/w的水溶液，10ml，過量)、甲醇(40ml)和磁力攪拌棒。 加熱所攪拌的非均勻混合物，直至形成黃色均相溶液(在50-6(TC下幾分鐘)。然后加入 5滴哌啶，加熱該反應溶液進行回流。15分鐘內反應物由于存在一些白/黃色固體而變得 不均勻，2h后，該固體變成深橙色。該時間后停止回流，使反應物過夜冷卻至室溫。然后再 次用另外的甲醛(37% w/w的水溶液，10ml，過量)在回流條件下加熱反應混合物。回流約 30min后，可以看見橙色油，沒有固體。攪拌停止時，所述油將沉淀至燒瓶底部。繼續回流 7h后，使混合物冷卻過夜，從而使所沉淀的油結晶。通過從加入幾滴丙酮的非常熱的甲醇中 重結晶來分離和純化結晶固體，以提供黃色晶體(10. Og) 。 ^ NMR(DMS0-d6) S 2. 31 (s，6H)， 3. 31-3. 33 (m， 4H) ， 3. 97 (五重，1H) ， 7. 14 (q， 8H) ， 7. 80 (d， 2H) ， 8. 24 (d， 2H)。
2，2_雙(對甲苯磺酰甲基)-對-硝基苯乙酮C24H23N07S2 在250ml圓底燒瓶中，將2，2-雙(對甲苯硫代甲基)_對_硝基苯乙酮(2. 5g)和 過硫酸氫鉀制劑(18.4g)在1 : 1的甲醇水(100ml)中的懸浮液攪拌16h，得到白色固 體懸浮液，向其中加入氯仿(100ml)，利用分液漏斗分離所得有機相，留下水相中的白色固 體懸浮液。向水相中加入另外的水，直至形成均勻溶液，隨后再次用氯仿(100ml)洗滌。將 所得有機相合并，用鹽水(50mLX2)洗滌，用硫酸鎂干燥，并除去溶劑，真空干燥后得到近 于純白的固體粗產物(2.5g)。所述產物從丙酮中重結晶以得到白色晶體。^ NMR(CDC13) S 3. 43-3. 62 (m， 4H) ， 4. 44 (五重，1H) ， 7. 35 (d， 4H) ， 7. 68 (d， 4H) ;7. 88 (d， 2H) ， 8. 22 (d， 2H); 對于C24H23N07S2的計算分析(實測):C， 57. 47 (57. 27) ;H， 4. 62 (4. 74) ;N 2. 79 (2. 58); MS(FAB)m/z 502([M+l]+)。 2-(2-羥乙基磺酰甲基)-對-硝基-2(z) ，4-pentadienophenone 向用氬吹掃并裝配有溫度計和滴液漏斗的火焰干燥圓底燒瓶中加入3-(2-羥乙
基硫醇)-對-硝基苯基乙基酮(0. 5g，2. Ommol)和無水四氫呋喃(50. Oml)。攪拌該溶液，并用干冰-丙酮浴冷卻，隨后通過注射器加入TiCl4(0. 23ml，2. lmmol)。移除冰浴，將溶液溫暖 至室溫，然后將溶液冷卻至-4(TC，并通過注射器加入二異丙基乙胺(1. lml)。移除冷卻浴， 將反應混合物溫暖至-15至0°C ，變成紅色。然后將反應混合物在3-5分鐘內溫暖至25°C ， 并通過滴液漏斗在30-40分鐘期間加入丙烯醛(0. 14g，2. lmmol)的無水四氫呋喃(20ml) 溶液。該放熱反應使得反應混合物的溫度提高到30-4(TC，加入乙醛之后繼續攪拌該溶液 20分鐘，然后加入乙酸乙酯(75ml)。利用薄層層析確認3-(2-羥乙基硫醇)-對-硝基苯基 乙基酮的開始出現和所希望的2- (2-羥乙基硫代甲基)_對_硝基-2 (z) ， 4-pentadienophe none(Rf " 0. 38-0. 45)的形成。在0. 29-0. 34的較低Rf下可以觀察到副產物(E-異構體)。 用10X的HC1水溶液和鹽水抽提乙酸乙酯反應混合物。將所得水層合并，并用乙酸乙酯抽 提兩次，合并所有乙酸乙酯級分并用10%的HC1水溶液、5%的NaHC03水溶液和鹽水洗滌兩 次，然后在固體化2504上干燥。旋轉蒸發除去乙酸乙酯，得到作為油的粗產物2-(2-羥乙基 硫代甲基)_對_硝基_2 (z) ， 4-pentadienophenone，其立即被氧化以合成2， 2_雙[(對甲 苯磺酰甲基)]_對_硝基苯乙酮，從而得到固體2- (2-羥乙基磺酰甲基)_對_硝基_2 (z)， 4-pentadienophenone，通過柱層析純化或在乙酸乙酯或甲醇中重結晶，然后共價結合至氨 基封端的聚乙二醇上，如本說明書中其它地方所述。 用多種醛依次進行以上反應，所述醛包括乙醛(acealdehyde)、異丁烯醛、乙基丙 烯醛(ethacrolein)、丁醛、巴豆醛、2，4-戊二烯醛、山梨醛(sorbaldehyde)、甲苯甲醛、肉 桂醛、甲基肉桂醛、氯肉桂醛、5-苯基-2 ， 4-戊二烯醛和7-苯基-2 ， 4， 6-庚三烯醛。用多種 芳基酮衍生物依次進行以上反應，所述芳基酮衍生物包括3-(對甲苯硫代甲基)-間-硝基 苯乙酮、3-(2-羥乙基硫代)-間-硝基苯基乙基酮、3-(乙基硫代甲基)-間-硝基苯基乙基 酮、3- (二甲基氨基乙基硫代)-間-硝基苯基乙基酮、3- (2-羥乙基硫代)-3-苯基苯基乙基 酮、3 (2-羥乙基硫代)-5-苯基-4 (E) -pentenophenone 、 3 (乙基硫代甲基_鄰_硝基苯基乙 基酮)、3-(乙基硫代)-苯基乙基酮、3- (2-羥乙基磺酰基)苯基乙基酮、2- (3- (2-羥乙基硫 代)-l-丙烯基)_間_2 (E) -4-pentadienophenone。還可以用脂族酮衍生物依次進行以上反 應，所述脂族酮衍生物包括4-(乙基硫代)-2- 丁酮、4-(對甲苯硫代)-2- 丁酮、4- (4-硝基 苯基硫代)_2- 丁酮、4- (2-羥乙基硫代)-2- 丁酮和甲基-3- (2-羥乙基硫代)-propanoate 。 這些前體的前述反應的最終產物可以共價結合至聚乙二醇，如本說明書中其它地方所述。
2，2_雙[(對甲苯磺酰基)甲基]-對-氨基苯乙酮鹽酸鹽CM^ClN0^
向100mL圓底燒瓶中加入2，2-雙[(對甲苯磺酰基)甲基]-對-硝基苯乙酮 (2g)、乙醇(25mL)、鹽酸(37wt^的水溶液，8mL)和磁力攪拌棒。然后向所得非均勻混合物 中加入二水合氯化錫(n)，并將該混合物在45t:的油浴中加熱2h。然后向所形成的均勻黃 色溶液中加入水，直到如果再加入水就會發生沉淀。使均勻溶液冷卻至室溫，從而結晶/沉 淀出黃色化合物，通過真空過濾將其分離。然后將所分離的產物與加熱的丙酮和甲醇混合 物(約90 : 10v/v)混合。通過真空過濾分離不溶固體，并在真空烘箱中干燥至恒定質量 (1. 4g) 。 'H NMR(DMS0-d6) S 2. 50(s，6H) ，3. 57-3. 73 (交迭m， 5H) ， 6. 27(s，2H) ，6. 39(d，2H)， 6. 96 (d， 2H) ， 7. 47 (d， 4H) ， 7. 55 (d， 4H)。 將2，2-雙[(對甲苯磺酰基)甲基]-對-氨基苯乙酮偶聯至a-甲氧基-"-氨 基聚乙二醇 向裝配有滴液漏斗和氮氣管道的lOOmL單頸圓底燒瓶中，在氮氣氣氛下加入三光
16氣(23mg)、2，2-雙[(對甲苯磺酰基)甲基]-對-氨基苯乙酮鹽酸鹽(125mg)、無水甲苯 (2.5ml)和磁力攪拌棒。分別將無水三乙胺(68iiL)和無水甲苯(2. 5mL)裝入滴液漏斗。 將丙酮/干冰浴置于圓底燒瓶下方，使其內容物冷卻。然后將三乙胺溶液在5-10min期間 逐滴加入到三光氣溶液中，同時攪拌。仍然是在氮氣氣氛中，花費幾個小時將燒瓶和干冰浴 溫暖至室溫，并且一旦到了室溫，就將反應混合物進一步攪拌約2h。然后在室溫下向反應 混合物中滴加0-(2-氨基乙基)-0'-甲基聚乙二醇2， 000(490mg)和無水三乙胺(68 y L) 的無水甲苯溶液。在室溫下將所得混合物攪拌過夜(總共約20h)。然后使反應混合物暴露 于大氣中，并在重力作用下穿過作為過濾器的帶有一片無吸收性原棉的5mL—次性注射器 來進行過濾。將均勻的洗脫液轉移至lOOmL分液漏斗中，隨后用去離子水洗滌兩次(30mL， 然后是10mL)。將水相合并，然后用二乙醚(約25mL)洗滌。然后冷凍干燥水相，得到近于 純白的固體產物(160mg)。在二乙醚和甲苯相中也發現了產物。^ NMR(CDC13) S2. 5(s)， 3. 39 (s) ， 3. 41-3. 53 (交迭m， s) ， 3. 53-3. 76 (m) ， 3. 82 (t) ， 4. 17 (五重)，7. 35-7. 39 (m， 1. 39) ，7. 46(d) ，7. 68(d)。
實施例2
A成覆A鍾翻
對羧基-3-哌啶基苯基乙基酮鹽酸鹽 向250ml單頸圓底燒瓶中加入對乙酰基苯甲酸(10g)和哌啶鹽酸鹽(7.4g)、100mL
無水乙醇和磁力攪拌棒。向攪拌的非均勻混合物中加入濃鹽酸(lmL)，并隨后加熱，在氮氣
條件下回流。向燒瓶中加入低聚甲醛(3. 7g)并繼續回流約1. 5h。形成均勻溶液，并向其中
再次加入低聚甲醛(3. 7g)。繼續加熱約6h，在這期間再次加入低聚甲醛(3. 7g)。使反應溶
液冷卻至室溫并放置l周。通過過濾冷卻的反應混合物分離出白色固體。試著在溶解于非
常熱的甲醇中后使固體結晶。通過過濾分離出不溶產物(1.96g)，從濾出液中結晶出第二產
物(0. 88g)。真空干燥后，利用紅外光譜和薄層層析分析，兩種產物表現為相同的，因此將其
合并以用于隨后的反應中。ATR-FT-IR1704， 1691， 1235,760。 4-[2，2-雙[(對甲苯硫代)甲基]乙酰基]苯甲酸C25H2403S2 向50mL單頸圓底燒瓶中加入對羧基-3-哌啶基苯基乙基酮鹽酸鹽(2. 5g) 、4-甲
苯硫醇(2.1g)、甲醛(37% w/w水溶液，2.5mL)、乙醇(10mL)、磁力攪拌棒和哌啶(約10
滴)。然后將冷凝器裝配到燒瓶上，加熱反應溶液，回流。隨后加入甲醇(5mL)。約2h后，加
入另外的甲醛(2. 5mL)，繼續加熱另外2h。然后使反應燒瓶冷卻至室溫，此時用二乙醚(約
150mL)稀釋反應溶液。然后用水(使用1N鹽酸酸化至pH2-3 ;50mLX2)、水(50mL)和鹽
水(75mL)洗滌所得有機相，隨后在硫酸鎂上干燥。過濾，隨后在旋轉蒸發器上除去揮發物，
得到固體殘余物。在加熱的同時將所述固體溶解于最小體積的主要是甲醇和丙酮的混合物
中。隨后將均勻溶液置于冰箱中過夜，得到近于純白的晶體，通過真空過濾將其分離出來，
用新鮮丙酮洗滌，然后在真空烘箱中干燥至恒定質量(2.5g) NMR(CDC13) S2.38(s，6H)，
3. 16-3. 31(m，4H)，3. 85(五重，1H)，7. 15(d，4H) ;7. 18 (d， 4H) ， 7. 64 (d， 2H) ， 8. 07 (d， 2H);對
于C25H2403S2的計算分析(實測):C， 68. 78 (68. 84) ;H， 5. 54 (5. 77)。 4-[2，2-雙[(對甲苯磺酰基)甲基]乙酰基]苯甲酸(:2黒52在250mL圓底燒瓶中，將4-[2，2-雙[(對甲苯硫代)甲基]乙酰基]苯甲酸(2g)
和過硫酸氫鉀制劑(16. 9g)在1 : lv/v的甲醇水(100ml)中的懸浮液攪拌16h，得到白
17色固體懸浮液，向其中加入氯仿(100ml)，利用分液漏斗分離所得有機相，留下水相中的白 色固體懸浮液。向非均勻水相中加入另外的水，直至均勻(約170mL)，隨后用氯仿(75ml) 洗滌水相。將有機相合并，用水(50mLX2，用幾滴lN鹽酸酸化)和鹽水(50mL)洗滌，用硫 酸鎂干燥有機相、過濾并利用旋轉蒸發器除去溶劑，以得到近于純白的固體粗產物(2. 2g)。 通過從非常熱的乙酸乙酯、丙酮和己烷中重結晶來進行進一步純化(基于lg產物)，得到 0. 6g產物,H NMR(CDC13) S 2. 51 (s， 6H) ， 3. 49-3. 72 (m， 4H) ， 4. 44 (五重，1H) ， 7. 40 (d， 4H)， 7. 73-7. 78(m，6H)，8. 13(d，2H);對于C25H2407S2的計算分析(實測):C， 59. 98 (59. 88) ;H， 4. 83(4. 78)。 將4-[2，2-雙[(對甲苯磺酰基)甲基]乙酰基]苯甲酸偶聯至a-甲氧基-"-氨 基PEG(2000g/mo1) 向50mL單頸Schlenk燒瓶中加入4-[2，2-雙[(對甲苯磺酰基)甲基]乙酰基] 苯甲酸(100mg)和磁力攪拌棒。密封燒瓶并施加強真空約15min。向燒瓶中引入氬氣氛， 并在攪拌的同時利用注射器加入氯化亞硫酰(lmL)。在5(TC加熱所得混合物2h。然后真 空除去揮發性液體以得到黃色泡沫。再次將氬氣氛引入燒瓶中，并利用注射器加入無水二 氯甲烷(5mL)，以得到均勻溶液。隨后再次真空除去揮發性液體。重復加入/除去溶劑的 過程，直至留下白色殘余物。再次向Schlenk燒瓶中加入無水二氯甲烷(5mL)以形成均勻 溶液。分別地，在裝配有隔膜和磁力攪拌棒的25mL圓底燒瓶中，在氬氣氛下，使0-(2-氨基 乙基)-0'-甲基聚乙二醇(2，000g/mo1) (0. 2g)和無水三乙胺(30 y L)溶解于無水二氯 甲烷(5mL)中。將含有雙[(對甲苯磺酰基)甲基]乙酰基]苯甲酸的反應溶液逐滴注入 含有聚乙二醇溶液的燒瓶中，立即形成一股白色氣體。在室溫下將所得溶液攪拌過夜，此 時加入另外的三乙胺(28 ii L)。再經過lh后，通過玻璃移液管將反應溶液逐滴加入到快速 攪拌的二乙醚中。為了獲得沉淀，需要向該二乙醚溶液中加入己烷，并將燒瓶置于冰浴中。 所得沉淀通過離心分離出來，并在真空烘箱中干燥至恒定重量，得到近于純白的固體產物 (230mg)。通過首先將產物溶解于二氯甲烷中并加入到冷凍的攪拌的二乙醚溶液中進行沉 淀來實現進一步純化。'HNMR(CDCl3) S 2. 51 (s) ， 3. 40 (s) ， 3. 60-3. 75 (m) ， 3. 84 (t) ， 4. 36 (五 重)，7. 39 (d) ， 7. 68 (d) ， 7. 71 (d) ， 7. 85 (d)。 將4-[2，2-雙[(對甲苯磺酰基)甲基]乙酰基]苯甲酸偶聯至a-甲氧基-"-氨 基PEG (20， 000g/mol) 向50mL單頸Schlenk燒瓶中加入4-[2，2-雙[(對甲苯磺酰基)甲基]乙酰基] 苯甲酸(100mg)和磁力攪拌棒。密封燒瓶并施加強真空約15min。向燒瓶中引入氬氣氛， 并在攪拌的同時利用注射器加入亞硫酰氯(lmL)。在5(TC加熱所得混合物2h。使燒瓶冷 卻至室溫之后，真空除去揮發性液體以得到黃色泡沫。再次將氬氣氛引入燒瓶中，并利用注 射器加入無水二氯甲烷(5mL)，以得到均勻溶液。隨后再次真空除去揮發性液體。重復加 入-除去溶劑的過程，直至留下白色殘余物。最后在氬氣氛下向燒瓶中加入無水二氯甲烷 (5mL)以形成均勻溶液。 在不同的50mL Schlenk燒瓶中，在氬氣氛下，使0-(2-氨基乙基)-0'-甲基聚乙 二醇(20， OOOg/mol) (0. 5g)溶解于4mL無水甲苯中，隨后真空蒸發該溶液至干燥狀態。所 得白色殘余物在真空中保持3h，隨后在氬氣氛下溶解于無水二氯甲烷(5mL)中。
向在冰水浴中冷卻并攪拌的聚乙二醇溶液中逐滴緩慢加入雙[(對甲苯磺酰基)甲基]乙酰基]苯甲酸的反應溶液。完全加入后，向所得溶液中逐滴緩慢加入40iiL干燥 三乙胺。當三乙胺加入完畢時，將所得溶液攪拌過夜，并溫暖至室溫。 然后通過0. 45 ii m的過濾器過濾反應溶液，從洗脫液中除去揮發性液體，得到淺 黃/橙色殘余物，并將其再次溶解于溫熱的丙酮(lOmL)中。將含有所得均勻溶液的燒瓶置 于冰水浴中，在攪拌的條件下出現沉淀。在3號燒結玻璃漏斗上分離白色沉淀物，并用冷凍 的新鮮丙酮(約30mL)洗滌。真空干燥所分離的固體，得到0.4g白色固體。^ NMR(CDC13) S 2. 42 (s) ， 3. 31 (s) ， 3. 40—3. 75 (m) ， 4. 27 (m) ， 7. 30 (d) ， 7. 59 (d) ， 7. 63 (d) ， 7. 75 (d)。
將a-甲氧基-"-4-[2，2-雙[(對甲苯磺酰基)甲基]乙酰基]苯甲酰胺聚乙 二醇偶聯劑(20， OOOg/mol) (0.4g)溶解于10mL氬吹掃的乙腈:水(24 : lv/v，2mg氫醌) 混合物，并通過0. 45 ii m的PP過濾器過濾該溶液。在氬氣氛下將洗脫液放入圓底燒瓶中， 并在攪拌的條件下加入三乙胺(50ii L)。然后將燒瓶置于3(TC的油浴中20h，同時攪拌，這 段時間之后，使燒瓶冷卻至室溫，并真空除去揮發性液體。所得殘余物溶解于溫熱的丙酮 (lOmL)中，并且一旦均勻，就將該溶液置于冰水浴中，此時在溶液攪拌的同時發生沉淀。所 述白色沉淀在3號燒結玻璃漏斗上進行分離，并用冷凍的新鮮丙酮(約30mL)洗滌。真空干 燥分離出的固體，得到0. 3g白色固體。^ NMR(CDC13) S 2. 35(s)，3. 31(s)，3. 39-3. 78(m)， 4. 28 (s) ， 5. 84 (s) ， 6. 22 (s) ， 7. 26 (d) ， 7. 65 (d) ， 7. 72 (d) ， 7. 81 (d)。
實施例3 4-甲苯硫醇和a-甲氧基-"-4-[2，2-雙[(對甲苯磺酰基)甲基]乙酰基]苯 甲酰胺聚乙二醇的反應 將聚合物偶聯劑a-甲氧基-"-4-[2，2-雙[(對甲苯磺酰基)甲基]乙酰 基]苯甲酰胺聚乙二醇(2000g/mol) (;30mg， 11 1 ii mol， leq.)和4_甲苯硫醇(;3mg， 24. 2mmol，2eq.)溶解于氖代氯仿(約0. 75mL)中。隨后向均勻溶液中加入三乙胺(1. L， 12. liimol，leq.)。攪拌反應混合物，并得到H-NMR譜圖。所得譜圖證實，發生了 4_甲苯硫
醇與聚合物偶聯劑的加成反應。用丙三醇進行相似的反應。
實施例4 聚合物偶聯至核糖核酸酶A 向15mL離心管中的核糖核酸酶A (30mg)中加入3mL 8M的尿素水溶液，然后加入 2-巰基乙醇(60i!L)。利用10X的甲胺水溶液將所得溶液的pH調整至pH8.5。然后用氮 使該反應溶液起泡約30min。還是用氮吹掃，在37t:將該管加熱5h。然后在冰_鹽水浴中 冷卻該反應混合物，并向反應溶液中加入10ml經氬吹掃的IN HC1 :無水乙醇(1 : 39v/ v)的冷凍溶液。發生沉淀，并通過離心分離沉淀物，然后用另一份10mL HC1 :無水乙醇混 合物洗滌三次，用經氮吹掃的冷凍二乙醚洗滌兩次(2X10mL)。每次洗滌之后，都通過離心 分離沉淀物。然后將所洗滌的沉淀物溶解于經氮吹掃的去離子水中，并冷凍干燥，得到干固 體。利用Ellman實驗證實并量化了核糖核酸酶A的部分還原，每個蛋白質分子中含有5. 9 個自由硫醇。 在印pendorf中，將部分還原的核糖核酸酶A(IO. 9mg)溶解于經氬吹掃的pH8的 氨水溶液(500iiL)中。在不同的印pendorf中，用聚乙二醇(2000g/mol)衍生化的的a-甲 氧基-"-4-[2，2-雙[(對甲苯磺酰基)甲基]乙酰基]苯甲酰胺聚合物偶聯劑(5mg)也 溶解于氨水溶液(250iiL)中，將所得溶液加入到核糖核酸酶A溶液中。PEG印pendorf用250 L新鮮氨水溶液洗滌，也將其加入到主反應印pendorf中。然后在氬氣氛下關閉反應 印pendorf，并在37。C加熱約24h，然后使其冷卻至室溫。然后利用十二烷基硫酸鈉凝膠電 泳(SDS-PAGE)分析冷卻的反應溶液。SDS-PAGE實驗與聚乙二醇化4-[2，2-雙[(對甲苯磺 酰基)甲基]乙酰基]苯甲酸與核糖核酸酶A的反應是一致的。
實施例5 聚合物偶聯至小鼠IgG抗體Fab片段 室溫下，在經氬吹掃的含有0. 15M磷酸鈉和0. 005M EDTA的240 y L 0. 02M 磷酸鈉P朋緩沖液中，得到0. 4mg/mL的小鼠IgG抗體Fab片段(Abeam Cat. No. AB6668)溶液，向此溶液中加入4 y L經氬吹掃的ImM硒代胱胺二鹽酸化物 (selenocystaminedihydrochloride)水溶液，然后加入12yL經氬吹掃的三(2-羧乙基) 膦鹽酸化物(TCEP)水溶液。所得溶液立即旋轉振蕩幾秒種，然后使其在室溫下靜置6min。 取兩個5 y L含有還原的Fab片段的溶液樣品以備將來分析，并使剩余的溶液在冰水浴中靜 置4min。將冰水浴冷凍的用聚乙二醇(20， OOOg/mol)衍生化的a -甲氧基-"-4_[2， 2-雙 [(對甲苯磺酰基)甲基]乙酰基]苯甲酰胺溶液(1.6iiL，50mg/ml，經氬吹掃的含有0. 15M 氯化鈉、0. 005M EDTA和O. 23mM氫醌的0. 02M磷酸鈉pH6緩沖液)立即加入到Fab溶液中; 該溶液旋轉振蕩幾秒種，然后放回到冰水浴中。以類似方式，每2分鐘加入另外的1.6iiL 偶聯劑溶液，直到總共加入了 6. 4ii L。加入完畢后，將反應溶液置于冰箱(< 5°C )中2h。 然后，取反應溶液樣品，以通過SDS PAGE進行分析。通過SEC-HPLC分析反應混合物(100 ii L注入量，superpose 12-24mL柱，Amersham
biosciences ;洗脫劑20mM磷酸鈉、0. 15M NaCl pH7. 0 ;以0. 25ml/min的流速等度洗脫
100min ;UV檢測，210nm)，顯示出了相同的對照反應混合物中不存在Fab-聚乙二醇偶聯物。
通過SDS PAGE分析從SEC-HPLC層析分離的組分，觀察到單聚乙二醇偶聯物。 實施例6 聚合物偶聯至天冬酰胺酶 用900 ii L 20mM磷酸鹽緩沖液(pH6，也含有0. 15M NaCl和5mM EDTA)稀釋5mg/ml P朋.5的天冬酰胺酶溶液(Sigma)的100 y L樣品。然后加入DL-二硫蘇糖醇(DTT， 15. 4mg)， 使所得溶液在室溫下靜置。靜置2h后，在用20mM磷酸鹽緩沖液(p朋，也含有O. 15M NaCl 和5mM EDTA)平衡過的PD-10柱(S印hadex頃'G-25M， Pharmacia Biotech)上純化該溶液。 用lmL新鮮緩沖液洗脫該柱。利用280nm處的UV光譜鑒定含有還原蛋白的兩個組分。利 用離心過濾裝置(麗CO 3， 000 ;Microcon)將這些組分濃縮至約270 y L的體積，然后用新 鮮的P朋磷酸鹽緩沖液(還含有0. 23mM氫醌)稀釋至lml。取兩個5 yl樣品，以進行后 面的SDS PAGE分析。另外，在相同的磷酸緩沖液中制備用聚乙二醇(20， OOOg/mol)衍生化 的a-甲氧基-"-4-[2，2-雙[(對甲苯磺酰基)甲基]乙酰基]苯甲酰胺偶聯劑溶液的 50mg/ml溶液，并與蛋白質溶液一起置于冰水浴中5min。然后向蛋白質溶液中加入58 yl 偶聯劑溶液，旋轉振蕩幾秒種后，將反應溶液置于冰箱(<5°C)中。還在相同的條件和規 模下進行了對照反應，但是使用未還原的天冬酰胺酶。通過用取自2h后的反應溶液樣品進 行的SDS PAGE(4-12%Bis-Tris Gel用膠體藍染色)證實聚乙二醇成功偶聯至天冬酰胺 酶。對于取自沒有使天冬酰胺酶與DTT反應的對照反應樣品的SDS PAGE，沒有觀察到偶聯 物帶。
20
實施例7 聚合物偶聯至干擾素 通過加入硒代胱胺(lmM經氬吹掃的去離子水溶液，2當量)和TCEP (lmM經氬吹掃 的去離子水溶液，5當量)，部分還原用150 ii 1緩沖溶液(磷酸鈉0. 02M ;NaClO. 15M ;EDTA 0. 005M ;p朋.0的經氬吹掃的去離子水溶液)稀釋的100 ii L干擾素a -2b溶液(Shantha Biotechnics) (lmg/ml)的溶液。將蛋白質溶液冷卻至4°C 。將用聚乙二醇(20， OOOg/mol) 衍生化的a-甲氧基-"-4-[2，2-雙[(對甲苯磺酰基)甲基]乙酰基]苯甲酰胺偶聯劑溶 解于緩沖溶液(50mg/ml)中，冷卻至4t:，并向蛋白質溶液中加入16iU。旋轉振蕩反應混 合物并在fC孵育2h。反應混合物的非離子組分通過陽離子交換層析(Hitr即SP FF 1ml 柱，Amersham biosciences)除去，使用兩種緩沖液(A) 25mM乙酸鈉，pH4. 0和(B) 25mM乙 酸鈉+0.7M NaCl，pH4.0。用緩沖液A(5.0ml)洗柱(lml/min)，隨后是緩沖液B(5. Oml)，然 后用10ml緩沖液A(10ml)平衡。將偶聯物加到柱(200 yl)上，然后加緩沖液A (500 yl) 并收集上樣組分(0. 5ml)。用5ml緩沖液A洗柱子，并收集組分。用緩沖液B (10ml)從柱 上洗脫樣品，并收集組分。利用光譜(UV，280nm)確定包含蛋白質的組分，然后通過體積排 阻層析純化這些組分得到分離的組分(100 ill注入量，superose 12_24ml柱，Amersham biosciences ;洗脫劑20mM磷酸鈉、0. 15M NaCl pH7. 0 ;以0. 25ml/min的流速等度洗脫 lOOmin ;UV檢測，210nm)。這些純化條件提供了從天然干擾素中分離聚乙二醇干擾素偶聯 物的基線分辨率。偶聯反應和聚乙二醇偶聯物的純化通過SDS-PAGE、12% Bis-Tris凝膠 (SilverQuest銀染；膠體藍染色以及0. 1M高氯酸/5% BaCl2和0. 1M I2染色)證實。向 60 ill 0. 02M磷酸鈉、0. 15M NaCl、0.005M EDTA、 p朋.0的氬吹掃水溶液中加入40 ii 1干 擾素(lmg/ml)所得的溶液，與溶解于緩沖溶液中的用聚乙二醇(20， OOOg/mol)衍生化的 a-甲氧基-"-4-[2，2-雙[(對甲苯磺酰基)甲基]乙酰基]苯甲酰胺偶聯劑(50mg/ml) 混合，冷卻至4°C ，并取16 加入蛋白質溶液中，其中沒有觀察到偶聯作用。旋轉振蕩該反 應混合物并在4t:孵育2h。 聚乙二醇干擾素偶聯物的每種純化組分的濃度通過酶免疫分析法測定。利用相同 的分析測定偶聯的天然干擾素和干擾素國際標準品NIBSC(UK)的濃度。所得的用于前述所 有形式干擾素的可重復、精確的標準曲線示于
圖1中。將A549細胞(人肺成纖維細胞)以 15，000細胞/孔鋪板于96孔平底組織培養板中。然后將來自NIBSC(UK)的干擾素、偶聯的 天然干擾素和聚乙二醇干擾素偶聯物分別加入到細胞中，設置三個重復。在37t: (5%C02) 孵育培養板24h。第二天，在DMEM/2X FCS中由-8(TC下貯存的原種病毒制備EMCV(腦心肌 炎病毒)工作溶液。除去包含干擾素或聚乙二醇干擾素偶聯物的培養基，更換為包含EMCV 的培養基。然后在37t:將組織培養板孵育lh，之后除去病毒。加入100微升DMEM/10X FCS 培養基，并在27t:將培養板孵育16-24h。從16h開始，定時讀取培養板，以確定細胞什么時 候開始死亡。然后吸出培養基，并用100iU磷酸鹽緩沖溶液洗滌細胞。然后，在室溫下，加 入50iU甲基紫溶液[即甲基紫(4%甲醛，0. 05%甲基紫2B(Sigma-Aldrich))30分鐘。 隨后用100iil水洗滌培養板，并空氣干燥。使用酶標儀(plate reader)測定570nm處的 分光光度吸收。圖2證實，用于偶聯的干擾素具有國際標準品NIBSC(UK)干擾素的同等活 性。圖3證實，用于偶聯的天然干擾素在經過除暴露于聚乙二醇偶聯劑之外的所有化學和 純化過程后保持同等的生物活性。圖4證實，用于偶聯的天然干擾素和純化的聚乙二醇干擾素偶聯物保持同等的生物活性。 測定干擾素-a2b對2' ，5' _寡聚腺苷酸合成酶(2' ，5' -OAS)和蛋白質激 酶R (PRKR)mRNA的誘導。對純化的聚乙二醇干擾素偶聯物和天然干擾素_ a 2b樣品進行評 估。在24孔組織培養板中在37t:孵育兩百萬個MOLT 4細胞/孔24h，每種干擾素樣品使 用經酶免疫分析法測定的5000pg。提取總RNA(RNA II分離試劑盒，Macheray-Nagel)，并取 200ng在20iiL最終體積中進行反轉錄(Sigma，AMV反轉錄試劑盒)。以l : 4在水中稀釋 樣品，取2 ii L每種樣品在20 ii L實時PCR定量混合物(Sigma SybrGreen ReadyMix)中進 行擴增。所用引物是 2' ，5' -OAS正向GGC TAT AAA CCT AAC CCC CAA ATC
2' ，5' -OAS反向AGC TTC CCA AGC TTC TTC TTA CAA
PKR正向ACT CTT TAG TGA CCA GCA CAC TCG
PRKR反向 TTT AAA ATC CAT GCC AAA CCT CTT 對于2' ，5' _(^5擴增來說，在941:酶活化5111111，然后進行48次循環在94t:變 性5秒鐘，在6(TC退火2秒鐘，并在72t:延伸8秒鐘。對于PRKR擴增來說，樣品在94。C活 化5min，并進行48次循環在94。C變性5秒鐘，在59。C退火2秒鐘，并在72。C延伸8秒鐘。 在擴增結束時進行產物的解鏈曲線分析。相對于對照未處理細胞，使用下列公式定量所誘 導的mNRA水平 相對增加量=2—to樣品—ct對照)
其中Ct是交換閾值。 圖5中，圖5(a)示出干擾素誘導型2' ，5'-寡聚腺苷酸合成酶(2' ，5' -OAS) 基因的實時定量RT-PCR(兩步)分析，圖5(b)示出干擾素誘導型蛋白質激酶R(PRKR)基因 的實時定量RT-PCR(兩步)分析。結果證實，聚乙二醇干擾素-a2b偶聯物剌激2' ，5'-寡 聚腺苷酸合成酶(2' ，5' -OAS)和蛋白質激酶R(PRKR)mRNA合成，達到與未聚乙二醇化的 天然干擾素_ a 2b相似的水平。 以下是本分案申請之母案申請中的權利要求書中的技術方案 1.具有下列通式的化合物，
，
X'—Q B —z2
(I) 其中，X和X'之一代表聚合物，另一個代表氫原子；
每個Q獨立地代表連接基團； W代表吸電子基團或可由吸電子基團還原而得的基團；或者，如果X'代表聚合 物，那么X-Q-W-可以共同代表吸電子基團；另外，如果X代表聚合物，那么X'和吸電子基 團W與中間原子可以共同形成環； Z1和Z2各自獨立地代表來源于生物分子的基團，每一個通過親核基團連接到A和 B ;
或者Z工和Z2共同代表來源于生物分子的單一基團，通過兩個親核基團連接到A和 B ; A是(V5亞烷基或亞烯基鏈；并且
B是鍵或(V4亞烷基或亞烯基鏈。 2.第1項所述的化合物，其中聚合物X或X'是聚亞烷基二醇、聚乙烯基吡咯烷 酮、聚丙烯酸酯、聚噁唑啉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酰胺、HPMA共聚物、聚酯、聚 縮醛、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚亞氨基碳酸酯、聚酰胺、二乙烯基醚_馬來酸酐或苯乙烯_馬 來酸酐的共聚物、多糖或聚谷氨酸。 3.第2項所述的化合物，其中聚合物是聚乙二醇。 4.第l-4項中任一項所述的化合物，其中每個連接基團Q獨立地代表直接鍵合、亞
烷基或任選取代的芳基或雜芳基，其中任意一種都可以由一個或多個氧原子、硫原子、R代
表烷基或芳基的-NR基團、酮基、-0-C0-基和/或-C0-0-基封端或中斷。 5.第l-5項中任一項所述的化合物，其中W代表酮或醛基C0、酯基-0-C0-或砜
基_S02-，或由這種基團還原而得到的基團；或者X-Q-W-共同代表氰基。 6.第1-6項中任一項所述的化合物，其中Z1和Z2共同代表單一的生物分子。 7.第1-5項中任一項所述的化合物，其中Z^PZ2各自或Z^PZ2共同代表蛋白質。 8.第7項所述的化合物，其中所述或每個蛋白質通過硫醇基團連接至A和B。 9.第8項所述的化合物，其中所述硫醇基團通過二硫橋的部分還原而形成。 10.制備第l-9項中任一項所述的化合物的方法，其包括使(i)通式(II)化合物
或(ii)通式(III)化合物與具有通式Z、u或Z2Nu的化合物或具有通式Z(Nu)2的化合物
反應
在通式(II)中，X和X'之一代表聚合物，另一個代表氫原子； Q代表連接基團； W'代表吸電子基團例如酮基、酯基-0-CO-或砜基-SO廠；或者，如果X'代表聚合
物，那么X-Q-W'可以共同代表吸電子基團； A代表(V5亞烷基或亞烯基鏈； B代表鍵或CX亞烷基或亞烯基鏈；并且 每個L獨立地代表離去基團；
x—q—w<formula>formula see original document page 24</formula> 在通式(III)中，X、X' 、Q、W' 、A和L具有為通式II所給出的意義，另外，如果X 代表聚合物，那么X'和吸電子基團W'可以與中間原子共同形成環，m代表l-4的整數；
在通式Z、u、 Z2Nu或Z (Nu) 2中，Z代表生物分子，每個Nu獨立地代表親核基團。
11.第IO項的方法，其中所述或每個離去基團1^代表_51 、-5021 、-05021 、-^1 3、-^ 眠、-N、R、鹵素或-O0，其中R代表烷基或芳基，0代表含有至少一個吸電子取代基的取代 芳基。 12.第10項或第11項中所定義的通式II或III的化合物。 13.藥物組合物，包含第l-9項中任一項所述的生理耐受的化合物，和藥學上可接 受的載體。 14.第l-9項中任一項所述的化合物用作藥物的用途。
權利要求
具有下列通式的化合物，其中，X和X′之一代表聚合物，另一個代表氫原子；每個Q獨立地代表連接基團；W代表吸電子基團或可由吸電子基團還原而得的基團；或者，如果X′代表聚合物，那么X-Q-W-可以共同代表吸電子基團；另外，如果X代表聚合物，那么X′和吸電子基團W與中間原子可以共同形成環；Z1和Z2各自獨立地代表蛋白質，各自通過親核基團連接到A和B；或者Z1和Z2共同代表單個蛋白質，其通過兩個親核基團連接到A和B，每一個所述親核基團均來源于胺基團；A是C1-5亞烷基或亞烯基鏈；并且B是鍵或C1-4亞烷基或亞烯基鏈。FSA00000053409200011.tif
2. 權利要求1所述的化合物，其中聚合物X或X'是聚亞烷基二醇、聚乙烯基吡咯烷 酮、聚丙烯酸酯、聚噁唑啉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酰胺、HPMA共聚物、聚酯、聚 縮醛、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚亞氨基碳酸酯、聚酰胺、二乙烯基醚_馬來酸酐或苯乙烯_馬 來酸酐的共聚物、多糖或聚谷氨酸。
3. 權利要求2所述的化合物，其中聚合物是聚乙二醇。
4. 權利要求1-3中任一項所述的化合物，其中每個連接基團Q獨立地代表直接鍵、亞烷 基或任選取代的芳基或雜芳基，其中任意一種都可以由一個或多個氧原子、硫原子、R代表 烷基或芳基的-NR基團、酮基、-0-C0-基和/或-C0-0-基封端或中斷。
5. 權利要求1-4中任一項所述的化合物，其中W代表酮或醛基C0、酯基-0-C0-或砜 基_S02-，或由這種基團還原而得到的基團；或者X-Q-W-共同代表氰基。
6. 權利要求1-5中任一項所述的化合物，其中Z1和Z2各自獨立地代表蛋白質。
7. 權利要求1-6中任一項所述的化合物，其中每一個所述親核基團均來源于賴氨酸殘基。
8. 制備權利要求1-7中任一項所述的化合物的方法，其包括使(i)通式(II)化合物 或(ii)通式(III)化合物與具有通式Z、u和Z2Nu的化合物或具有通式Z(Nu)2的化合物 反應，其中Z代表單個蛋白質，每個Nu獨立地代表來源于胺基團的親核基團<formula>formula see original document page 2</formula> (n)在通式(II)中，X和X'之一代表聚合物，另一個代表氫原子； Q代表連接基團；w'代表吸電子基團例如酮基、酯基-o-co-或砜基-so廠；或者，如果x'代表聚合物，那么X-Q-W'可以共同代表吸電子基團； A代表C卜5亞烷基或亞烯基鏈； B代表鍵或C卜4亞烷基或亞烯基鏈；并且 每個L獨立地代表離去基團；X—Q—W '、 _A—Lm(II工)在通式(III)中，X、X' 、Q、W' 、A和L具有為通式II所給出的含義；另外，如果X代 表聚合物，那么X'和吸電子基團W'可以與中間原子共同形成環，m代表l-4的整數。
9. 權利要求8的方法，其中所述或每個離去基團L代表-SR、-S02R、-0S02R、-N+R3、-N+HR2 、-N+H2R、鹵素或-O'0，其中R代表烷基或芳基，0代表含有至少一個吸電子取代基的取代芳基。
10. 具有下列通式的化合物，X—Q—WyA—z1人 5 X'—Q B—z2(I)其中，X和X'之一代表聚乙二醇，另一個代表氫原子； 每個Q獨立地代表連接基團；W代表吸電子基團或可由吸電子基團還原而得的基團；或者，如果X'代表聚乙二醇，那么X-Q-W-可以共同代表吸電子基團；另外，如果X代表聚乙二醇，那么X'和吸電子基團W與中間原子可以共同形成環；Z1和Z2各自獨立地代表蛋白質，各自通過親核基團連接到A和B ;或者Z1和Z2共同代表單個蛋白質，其通過兩個親核基團連接到A和B，每一個所述親核基團均來源于巰基基團； A是C卜5亞烷基或亞烯基鏈；并且B是鍵或C卜4亞烷基或亞烯基鏈。
11. 權利要求10所述的化合物，其中每個連接基團Q獨立地代表直接鍵、亞烷基或任選 取代的芳基或雜芳基，其中任意一種都可以被一個或多個氧原子、硫原子、R代表烷基或芳 基的-NR基團、酮基、-O-CO-基和/或-CO-O-基封端或中斷。
12. 權利要求IO或權利要求11中所述的化合物，其中W代表酮或醛基CO、酯 基-O-CO-或砜基_S02-，或由這種基團還原而得到的基團；或者X-Q-W-共同代表氰基。
13. 權利要求10-12中任一項所述的化合物，其中Z1和Z2各自獨立地代表蛋白質。
14. 制備權利要求10-13中任一項所述的化合物的方法，其包括使(i)通式(II)化合 物或(ii)通式(III)化合物與具有通式Z、u和Z2Nu的化合物或具有通式Z(Nu)2的化合物反應，其中Z代表單個蛋白質，每個NU獨立地代表來源于巰基基團的親核基團(工I)在通式(II)中，X和X'之一代表聚乙二醇，另一個代表氫原子； Q代表連接基團；w'代表吸電子基團例如酮基、酯基-o-co-或砜基-so廠；或者，如果x'代表聚乙:醇，那么X-Q-W'可以共同代表吸電子基團； A代表C卜5亞烷基或亞烯基鏈； B代表鍵或C卜4亞烷基或亞烯基鏈；并且 每個L獨立地代表離去基團；<formula>formula see original document page 4</formula>(III)在通式(III)中，X、X' 、Q、W' 、A和L具有為通式II所給出的含義，另外，如果X代 表聚乙二醇，那么X'和吸電子基團W'可以與中間原子共同形成環，m代表l-4的整數。
15. 權利要求14的方法，其中所述或每個離去基團L代表-SR、-S02R、-0S02R、-N+R3、-N+ HR2、-N+H2R、鹵素或-0 0，其中R代表烷基或芳基，0代表含有至少一個吸電子取代基的取代芳基。
16. 藥物組合物，其包含生理耐受的權利要求1-7或10-13中任一項所述的化合物，和 藥學上可接受的載體。
17. 權利要求1-7或10-13中任一項所述的化合物，其用作藥物。
全文摘要
通式(I)的新型生物活性化合物，其中X和X′之一代表聚合物，另一個代表氫原子；每個Q獨立地代表連接基團；W代表吸電子基團或可由吸電子基團還原而得的基團；或者，如果X′代表聚合物，那么X-Q-W-可以共同代表吸電子基團；另外，如果X代表聚合物，那么X′和吸電子基團W與居間的原子可以共同形成環；Z1和Z2各自獨立地代表來源于生物分子的基團，每一個通過親核基團連接到A和B；或者Z1和Z2共同代表來源于生物分子的單一基團，通過兩個親核基團連接到A和B；A是C1-5亞烷基或亞烯基鏈；B是鍵或C1-4亞烷基或亞烯基鏈。上述生物活性化合物通過使合適的聚合物與合適的生物活性分子經由所述分子中的親核基團、優選經由二硫橋偶聯而形成。
文檔編號C08G65/334GK101792525SQ20101013994
公開日2010年8月4日 申請日期2004年7月12日 優先權日2003年7月11日
發明者埃莉薩·佩多內, 安東尼·羅伯特·戈德溫, 崔志元, 斯蒂芬·詹姆斯·布羅基尼, 蘇尼爾·肖納克 申請人:波利泰里克斯有限公司