專利名稱：特布他林的偶聯物及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種β-興奮劑類的偶聯物及其制備方法與應用，尤其涉及一種特布他林(terbutaline)的偶聯物及其制備方法與應用。屬β-興奮劑免疫檢測領域。
背景技術：
本發明涉及的下列名稱適用于整個說明書和權利要求書牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin，簡稱BSA)Sigma公司產品卵清蛋白(簡稱OVA)Sigma公司產品磷酸緩沖液(Phosphate Buffered Saline，簡稱PBS)(0.01M，pH＝7.40)透析膜bioshorp公司產品硫酸特布他林中國藥品生物制品檢定所1，4-丁二醚(1，4-Butanediol diglycidyl ether，簡稱BDE)Sigma公司產品羥基琥珀酰亞胺(簡稱NHS)Sigma公司產品乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺(簡稱EDC)Sigma公司產品對氨基苯甲酸(4-aminobenzoic acid)Fluka公司產品β-興奮劑是一類化學合成的苯乙醇胺類衍生物，20世紀80年代至今，人工合成的β-興奮劑主要有克倫特羅(clenbuterol)、卡布特羅(carbuterol)、萊克多巴胺(ractopamine)、沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutaline)等十余種。β-興奮劑作用機理和腎上腺素、去甲腎上腺素相同，可影響營養物質在動物體內的流向和重新分配，有效促進肌肉組織生長，降低胴體脂肪含量，提高瘦肉率和增加瘦肉產量，因而曾在歐美廣泛使用。但另一方面，β-興奮劑具有類似腎上腺素的化學結構，能與細胞表面的β-受體結合而產生明顯的生理作用，如心悸、頭疼、目眩、惡心、嘔吐、戰栗、神經過敏、血管擴張、心率加快等，而且這類化合物具有口服活性，如果違法超量使用就會對人與動物的肝腎等內臟器官產生一定的毒副作用。1992年，西班牙發生40多人食用含β2-興奮劑的畜產品中毒事件；1997年，香港發生進食大陸供港豬的內臟引起人中毒事件；2006年9月上海發生鹽酸克倫特羅中毒事件。現在歐美各國均禁止其在畜牧生產上的應用，美國規定只能用于科研，我國農業部也正式發文嚴禁作為添加劑使用。但是由于經濟利益的驅使，在畜牧生產中違法使用現象較為普遍，致使藥物在動物體內殘留量過高，難以達到發達國家的要求，畜禽產品出口屢遭綠色壁壘，使貿易受阻，給整個產業造成很大的經濟損失。為了應對藥物殘留給整個產業發展和食品安全保障所帶來的挑戰，我國政府和相關部門，已加大了對藥物添加劑的檢測力度，修訂和頒布了更為嚴格的法律和規范。對畜產品生產過程進行監控和執法，一是制定最高殘留限量的標準，二是改進殘留分析方法和技術，發展快速、準確和高靈敏度的檢測手段。
在β-興奮劑藥物殘留的檢測中，常用的方法有儀器法如高效液相色譜法、氣相色譜法、液相-質譜聯用法等。這些方法準確、穩定、可靠，可以作為標準方法。但儀器法價格昂貴，費時較長，且造成有機溶劑污染，需要大型儀器設備，需要專門的技術人員，所以難于用于現場操作。酶聯免疫法(ELISA)具有靈敏、快速、特異性好、樣品量少，不需要專門人員操作等優點，這使得ELISA法成為一種理想的、可用于常規掃描的檢測方法。但是酶聯免疫檢測法需要高質量的抗體，β-興奮劑都是小分子有機化合物，不具有免疫原性，稱之為半抗原。所以必須把這些化合物轉變成能引發動物免疫系統產生抗體的免疫原(又稱之為完全抗原)。克倫特羅是作為促生長劑最常使用的一種藥物，但隨著對鹽酸克倫特羅檢測力度的加大，非法使用者開始使用其它代替品，由于特布他林與鹽酸克倫特羅的促生長作用相似，特布他林成為繼鹽酸克倫特羅之后的主要的代替品之一，國內外對特布他林的研究還比較少，因此研究特布他林的免疫原的合成及抗體制備就顯得十分必要。
發明內容
針對上述現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種能引發動物免疫系統產生針對特布他林有特異反應的抗體的免疫原，即特布他林(terbutaline)的偶聯物及其制備方法。同時，本發明還提供了所述的特布他林的偶聯物作為免疫原在制備特布他林特異反應抗體中的應用。
本發明所述特布他林的偶聯物，由特布他林半抗原與產生免疫原性的載體物質牛血清蛋白或卵清蛋白偶聯構成。
其中上述產生免疫原性的載體物質優選是牛血清蛋白。
本發明所述的特布他林的偶聯物，其結構通式如(I) 其中n為與一個牛血清蛋白分子結合的特布他林的分子數，所述n為整數1～15，cBSA為活化牛血清蛋白(Cationized Bovine Serum Albumin)，分子量范圍是66KDa～69KDa；上述偶聯物顯示出如下物化特征(1)外觀白色粉末固體；(2)紫外吸收光譜276nm。
在上述的特布他林的偶聯物中，所述n優選為整數1～10，活化牛血清蛋(cBSA)分子量范圍優選是67KDa～68KDa。
上述的特布他林的偶聯物的制備方法是將特布他林與產生免疫原的載體物質連接起來，結合為具有誘發動物免疫系統產生抗體的偶聯物，并保持該偶聯物的生物活性不變。
上述的特布他林的偶聯物的制備方法，具體由如下步驟完成1)溶液A的制備將活化的牛血清蛋白溶在pH＝10.5±0.6、濃度為50mM碳酸鹽緩沖液中，同時按牛血清蛋白與1，4-丁二醚摩爾比為1∶90～150的比例量取1，4-丁二醚也加入該溶液中，室溫反應22±2小時，得無色澄清溶液A，備用；2)溶液B的制備按特布他林與1，4-丁二醚的摩爾比為2∶1-1∶1的比例稱取特布他林溶在pH＝10.5±0.6、濃度為50mM碳酸鹽緩沖液中，然后把配好的特布他林溶液滴加到通入氮氣的A溶液中，室溫反應22±2小時，得無色澄清溶液B。
3)用pH為7.30-7.50，濃度為0.01M-0.02M的磷酸緩沖液在0-4℃下，攪拌透析溶液B 70～80小時，然后改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；4)凍干透析后的溶液，得到白色的特布他林的偶聯物。
在上述的特布他林的偶聯物的制備方法中步驟1)所述牛血清蛋白與1，4-丁二醚的摩爾比優選為1∶99。
在上述的特布他林的偶聯物的制備方法中步驟2)所述特布他林與1，4-丁二醚的摩爾數比優選為1.5∶1。
在上述的特布他林的偶聯物的制備方法中步驟3)所述磷酸溶液的pH優選為7.4，濃度優選為0.01M。
本發明所述的特布他林的偶聯物作為免疫原在制備特布他林特異反應抗體中的應用。
利用本發明的技術方案可以成功地把半抗原特布他林與載體蛋白特別是牛血清蛋白偶聯起來，從而合成了能夠在動物體內引發免疫反應，產生抗體的完全免疫原——特布他林的偶聯物。
利用本發明所述的特布他林的偶聯物作為免疫原免疫新西蘭大白兔，成功地獲得了對半抗原特布他林有特異反應的抗體。經酶聯免疫檢測實驗鑒定，利用本發明所述的特布他林的偶聯物作為免疫原制備的特布他林特異反應抗體，其抗血清效價達到1∶50,000以上，其最低檢測限為0.3ppb，IC50為9.25ppb。
上述的特布他林的偶聯物以及高效價的特布他林特異反應抗體的制備成功，為制備特布他林的酶聯免疫檢測試劑盒提供了基礎。在實際應用中，把所述制備的特布他林特異反應抗體鍍在微孔盤內，就可以用來檢驗動物源食品中特布他林的殘留。由于本發明所述方法具有簡易，快速，特異，準確的特點，所以可以用于食品檢驗檢疫中的初步掃描檢測之用。這樣不但可以節省大量的檢驗時間，還可以用于現場操作，從而彌補了儀器法費時較長，需要大型儀器設備支持，需要專門的技術人員操作，難于用于現場的不足。所以，半抗原特布他林與載體蛋白特別是牛血清蛋白偶聯物的合成及抗血清的成功制備為這種快速檢驗法奠定了基礎。
圖1紫外吸收光譜圖
其中1硫酸特布他林2cBSA 3特布他林的偶聯物具體實施方式
實施例1(1)溶液A的制備稱取50mg cBSA(0.735μmol)溶在3mL 50mM碳酸鹽(pH＝10.7)緩沖液中，然后向溶液中加入13.8μL(72.9μmol)的1，4-丁二醚(BDE)，室溫反應20小時，得無色澄清溶液A，備用；(2)溶液B的制備稱取30mg(109.4μmol)硫酸特布他林溶在1.5mL 50mM碳酸鹽(pH＝10.7)緩沖液中，把溶液A通入氮氣，隨后將硫酸特布他林溶液逐滴加入A溶液中，室溫反應20小時，得無色澄清溶液B。
(3)用pH為7.40，濃度為0.01M的磷酸緩沖液在0-4℃下，攪拌透析溶液B70～80小時，然后改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；(4)凍干透析好的溶液，得到白色的特布他林的偶聯物。
通過紫外吸收光譜確定產物的吸收峰位于276nm。
實施例2(1)溶液A的制備稱取50mg cBSA(0.735μmol)溶在3mL 50mM碳酸鹽(pH＝11.1)緩沖液中，然后向溶液中加入16.7μL(88.2μmol)的BDE，室溫反應22小時，得無色澄清溶液A，備用；(2)溶液B的制備稱取25mg(91.2μmol)硫酸特布他林溶在1.0mL 50mM碳酸鹽(pH＝11.1)緩沖液中，把溶液A通入氮氣，隨后將硫酸特布他林溶液逐滴加入A溶液中，室溫反應24小時，得無色澄清溶液B。
(3)用pH為7.50，濃度為0.01M的磷酸緩沖液在0-4℃下，攪拌透析溶液B70～80小時，然后改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；(4)凍干透析好的溶液，得到白色的特布他林的偶聯物，通過紫外吸收光譜確定產物的吸收峰位于276nm。
實施例3(1)溶液A的制備稱取60mg cBSA(0.882μmol)溶在4mL 50mM碳酸鹽(pH＝10.9)緩沖液中，然后向溶液中加入25.0μL(132.3μmol)的BDE，室溫反應24小時，得無色澄清溶液A，備用；(2)溶液B的制備稱取40mg(146μmol)硫酸特布他林溶在3mL 50mM碳酸鹽(pH＝10.9)緩沖液中，把溶液A通入氮氣，隨后將硫酸特布他林溶液逐滴加入A溶液中，室溫反應24小時，得無色澄清溶液B。
(3)用pH為7.30，濃度為0.02M的磷酸緩沖液在0-4℃下，攪拌透析溶液B70～80小時，然后改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；(4)凍干透析好的溶液，得到白色的特布他林的偶聯物，通過紫外吸收光譜確定產物的吸收峰位于276nm。
實施例4抗體的制備純化及檢測1.抗體的制備選擇上述實施例1所制備的特布他林的偶聯物作為免疫原進行動物免疫實驗以制備抗體。
取1mg/mL的特布他林的偶聯物的溶液1mL，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化后，經皮下多點注射給四只體重2kg的雄性健康新西蘭大白兔，1mL/只，15天后以同量抗原與弗氏不完全佐劑充分乳化后進行二免，二免以后，每隔15天加強免疫一次，抗原量減半，共免疫5次。最后一次免疫7天后，心臟采血，室溫靜置1小時，0-4℃過夜，13000轉/分離心15分鐘，收集血清，-20℃保存，備用。
2.抗體的純化攪拌狀態下向上述制備的抗血清中加入飽和硫酸銨至硫酸銨溶液的終濃度為體積百分比是50％，0-4℃放置過夜，有沉淀物析出；以13000轉/分離心15分鐘，棄上清液，向沉淀物中加入0.01M、pH 7.4的PBS至沉淀溶解，然后加入飽和硫酸銨溶液至硫酸銨溶液的終濃度為體積百分比是33％，0-4℃放置過夜，有沉淀物析出；以13000轉/分離心15分鐘，棄上清液，向沉淀物中加入0.01M、pH 7.4的PBS至沉淀溶解。將上述純化物用0.01M、pH 7.4的PBS，0-4℃透析，換透析液3次，然后加入質量體積百分比為0.02％的疊氮化鈉，-20℃保存，備用。
3.抗體的酶聯免疫檢測(1)效價測定方法采用常規的間接酶聯免疫吸附檢測法在96孔的酶標板上，用100μL/孔的特布他林與卵清蛋白的偶聯物(2.5μg/mL)包被，0-4℃放置過夜，然后用PBST(1000mL pH 7.4、濃度0.01M的PBS+體積百分比是0.05％Tween20)洗板四次；用250μL/孔封閉液(1000mL PBST+質量體積百分比是1％卵清蛋白)封閉，室溫放置3小時，洗板；在洗去封閉液后，加100μL/孔的抗血清，室溫放置2小時，洗板；在洗去抗血清以后，每孔加入1∶1000的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 100μL，室溫放置1小時，洗板；加入底物鄰苯二胺顯色，室溫放置10min，再加入2M HCl終止。酶標儀A492nm檢測。
經測定本發明所述特布他林的偶聯物抗體效價達1∶51，200。
效價的判定以P/N大于2∶1的血清最高稀釋倍數為該抗體的酶聯免疫檢測效價。
其中P為代測血清在某一稀釋倍數測定的吸光度值，N為陰性對照在相應稀釋倍數測定的吸光度值。
(2)特異性測定測定步驟與效價測定類似，在上述最佳的包被抗原與抗體濃度條件下，加抗體的同時加入特布他林溶液(從0.2ppb-2000ppb)，與包被抗原競爭結合有限的抗體，特布他林藥的濃度越高，抗體與包被抗原就結合得越少，從而顯色越淺，吸光度值越低。再與空白對照(只加抗體，未加特布他林藥的吸光度值)相比較，以確定抗體特異性。
通過測定抗體特異性較好，其最低檢測限可達到0.3ppb，IC50為9.25ppb。
實施例5(1)溶液A的制備稱取31.3mg(0.723μmol)OVA溶在3mL 50mM碳酸鹽(pH＝11.08)緩沖液中，然后向溶液中加入11.04μL(58.32μmol)的BDE，室溫反應24小時，得無色澄清溶液A，備用；(2)溶液B的制備稱取24mg(87.49μmol)硫酸特布他林溶在1mL 50mM碳酸鹽(pH＝11.08)緩沖液中，把溶液A通入氮氣，隨后將硫酸特布他林溶液逐滴加入A溶液中，室溫反應20小時，得無色澄清溶液B。
(3)用pH為7.4，濃度為0.01M的磷酸緩沖液在0-4℃下，攪拌透析溶液B70～80小時，然后改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；(4)凍干透析好的溶液，得到白色的特布他林的偶聯物，通過紫外吸收光譜確定產物的吸收峰位于276nm，其結構圖如下 其中上述n為與一個卵清蛋白分子結合的特布他林的分子數，所述n為整數1～15。
權利要求
1.一種特布他林的偶聯物，由特布他林半抗原與產生免疫原性的載體物質牛血清蛋白或卵清蛋白偶聯構成。
2.如權利要求1所述的特布他林的偶聯物，其中所述產生免疫原性的載體物質是牛血清蛋白。
3.如權利要求2所述的特布他林的偶聯物，其結構通式如(I) 其中 n為與一個牛血清蛋白分子結合的特布他林的分子數，所述n為整數1～15，cBSA為活化牛血清蛋白(Cationized Bovine Serum Albumin)，分子量范圍是66KDa～69KDa；上述偶聯物顯示出如下物化特征(1)外觀白色粉末固體；(2)紫外吸收光譜276nm。
4.如權利要求3所述特布他林的偶聯物，其特征是所述n為整數1～10，活化牛血清蛋白分子量范圍是67KDa～68KDa。
5.權利要求1～4中任一項所述的特布他林的偶聯物的制備方法，其特征是將特布他林與產生免疫原性的載體物質連接起來，結合為具有誘發動物免疫系統產生抗體的偶聯物，并保持該偶聯物的生物活性不變。
6.如權利要求5所述特布他林的偶聯物的制備方法，由如下步驟完成1)溶液A的制備將活化的牛血清蛋白溶在pH＝10.5±0.6、濃度為50mM碳酸鹽緩沖液中，同時按牛血清蛋白與1，4-丁二醚摩爾比為1∶90～150的比例量取1，4-丁二醚也加入該溶液中，室溫反應22±2小時，得無色澄清溶液A，備用；2)溶液B的制備按特布他林與1，4-丁二醚的摩爾比為2∶1-1∶1的比例稱取特布他林溶在pH＝10.5±0.6、濃度為50mM碳酸鹽緩沖液中，然后把配好的特布他林溶液滴加到通入氮氣的A溶液中，室溫反應22±2小時，得無色澄清溶液B；3)用pH為7.30-7.50，濃度為0.01M-0.02M的磷酸緩沖液在0-4℃下，攪拌透析溶液B 70～80小時，然后改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；4)凍干透析后的溶液，得到白色的特布他林的偶聯物。
7.如權利要求6所述的特布他林的偶聯物的制備方法，其特征是步驟1)所述牛血清蛋白與1，4-丁二醚的摩爾比為1∶99。
8.如權利要求6所述的特布他林的偶聯物的制備方法，其特征是步驟2)所述特布他林與1，4-丁二醚的摩爾數比為1.5∶1。
9.如權利要求6所述的特布他林的偶聯物的制備方法，其特征是步驟3)所述磷酸溶液的pH為7.4，濃度為0.01M。
10.權利要求1～4中任一項所述的特布他林的偶聯物作為免疫原在制備特布他林特異反應抗體中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種通式(I)的特布他林的偶聯物，由特布他林半抗原與產生免疫原性的載體物質牛血清蛋白或卵清蛋白偶聯構成。其中n為與一個牛血清蛋白分子結合的特布他林的分子數，所述n為整數1～15；cBSA為活化的牛血清蛋白，分子量范圍是66KDa～69KDa。本發明還公開了所述的偶聯物的制備方法，即將特布他林與產生免疫原性的載體物質連接起來，結合為具有誘發動物免疫系統產生抗體的偶聯物。本發明的特布他林的偶聯物通過免疫新西蘭大白兔，制備了效價達1∶50,000以上的抗血清，其最低檢測限為0.3ppb，IC
文檔編號G01N33/53GK101078725SQ20071001499
公開日2007年11月28日 申請日期2007年6月28日 優先權日2007年6月28日
發明者郗日沫, 張玉蘭, 盧圣欣, 劉圍, 趙承彪 申請人:山東大學