專利名稱：包含蛋白質和/或多肽以及膠體顆粒的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于提高多種蛋白質和多肽的半壽期、療效和穩定性的藥物制劑。
背景技術：
甲型血友病是最常見的遺傳性血凝固障礙病之一。作為血凝固系統的一種或一種以上的功能障礙的結果，甲型血友病患者易于頻繁地出血。血友病的一個原因是血液中因子VIII(FVIII)的不足。該疾病可以用因子VIII濃縮物進行治療。然而，由于在約15％的患者中存在因子VIII中和抗體(所謂的抑制物)，由此使采用因子VIII濃縮物來治療是幾乎不可能的。
在文獻中已經公開了兩種基本方法以保護因子VIII免受抑制物的作用而失活。
Hemker在WO/80/01456中公開了適于口服的藥物組合物，該藥物組合物包含有摻入由磷脂形成的0.5-1.0微米的脂質體中的FVIII。磷脂具有凈電荷，并且將FVIII摻入至脂質體層之間。據稱在50小時期間，FVIII在血漿中的水平保持高于正常值的約5％。
Horikoshi在US 4,348,384中聲稱制備了如Hemker描述的組合物，但并沒有得到滿意的結果。因此，Horikoshi將蛋白酶抑制劑連同FVIII一起摻入脂質體中，以保護其免于蛋白水解。在6小時內，得到了3％的FVIII的正常血漿水平。
Woodle在US 5,013,556中公開了用于經由血流輸送多種藥物的脂質體組合物。該脂質體包含1摩爾％～20摩爾％的用聚烷基醚衍生化的兩親性脂質。這里該藥物化合物也包埋在脂質體中。這些脂質體組合物是可商購的，名稱為Stealth囊泡(SUV′s，由磷脂和與磷脂共價結合的聚乙二醇(PEG)組成的單層小脂質體)。
該方法帶來的另一問題是直徑較大的脂質體具有較短的半壽期。因此，脂質體必須在高壓下縮小尺寸，這會影響蛋白質活性，對于凝血因子V和VIII即是如此。
在另一種方法中，Barrowcliffe，T.W.等人在(1983)J.Lab.Clin.Med.10134-43中教導了將FVIII與從人和/或動物腦中提取的磷脂混合，這在在體外為FVIII提供了有效的保護。在該方法中，磷脂與FVIII結合而不包埋FVIII。Kemball-Cook，G.和Barrowcliffe，T.W.在(1992)Thromb.Res.6757-71中教導了帶負電荷的磷脂表面是FVIII結合所必需的。已發現帶負電的磷脂酰絲氨酸和磷脂酸在與FVIII結合中活性非常高，而磷脂酰膽堿是無活性的。然而，帶負電荷的磷脂是有毒的，而且來源于腦組織的磷脂可能攜帶有病原體。
EP 689,428公開了包含脂質體的脂質體組合物，所述脂質體具有親水性聚合物鏈的外表層。在效應物偶聯之前，通過脂質錨的激活，將多肽或多糖效應分子共價結合于聚合物鏈的遠端。
發明內容
本發明的目的在于提供包含用于治療的蛋白質或多肽的藥物組合物。
本發明的另一目的在于提供在血流中具有延長的半壽期這種形式的蛋白質或多肽。
本發明的又一目的在于提供對患有血液凝固障礙病癥，特別是血友病的患者進行治療的方法。
在本發明的一個方面中，提供了用于腸胃外給藥的藥物組合物，該藥物組合物包含治療有效量的蛋白質或多肽以及膠體顆粒，所述顆粒包含用生物相容性親水聚合物衍生化的、約1摩爾％～20摩爾％的兩親性脂質，其中所述蛋白質或多肽選自(a)能在外部結合所述膠體顆粒的蛋白質或多肽；(b)能結合聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸家族的聚合物的蛋白質或多肽；或(c)包含共有序列S/T-X-L/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E的蛋白質或多肽，其中X是任意氨基酸，且S、T、L、I、V、E以及Q具有它們的標準含義。蛋白質或多肽不是包埋于所述的膠體顆粒中。
在優選的實施方案中，膠體顆粒是基本上中性的，聚合物是基本上不帶凈電荷的。在本文中，術語“基本上中性”和“基本上不帶凈電荷”是指既不帶正電荷也不帶負電荷。然而，在零的實驗誤差內所測得的非常低的電荷也包括在以上術語的含義中。
本發明基于令人驚奇并意想不到的發現含有用生物相容性親水聚合物衍生化的兩親性脂質的脂質體可用于結合蛋白質或多肽、增強它們的藥物動力學參數(半壽期和曲線下的面積)以及保護它們不受血流中抑制物的影響。由于所用的兩親性脂質是人工合成和無毒的，所以本發明顯著優于現有技術的組合物，并因此可用于體內治療。此外，由于脂質體不包埋蛋白質或多肽，所以可以使用小尺寸的脂質體，而由于小尺寸的脂質體不能被網狀內皮系統(RES)除去并且所制備的蛋白質或多肽的活性不會被減弱(體外發現的所有活性以及體內注射后的早期活性)，所以它們在體內具有較長的半壽期。與EP 689,428中公開的組合物不同，如將在以下更加詳細地描述那樣，所述蛋白質或多肽在脂質體的外表面與聚合物鏈非共價相互作用，并且沒有進行化學反應以激活聚合物鏈。
術語“能在外部結合所述膠體顆粒的蛋白質或多肽”包括諸如凝血因子VIIa(FVIIa)、凝血因子V(FV)、凝血因子IX(FIX)和凝血因子X(FX)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、γ干擾素和胰高血糖素樣肽1(GLP-1)、γ干擾素和胰高血糖素樣肽1(GLP-1)以及由4個氨基酸(L-ala、L-glu、L-lys和L-tyr)重復組成的共聚物(克帕松(Copaxone)，Teva，以色列)。如本領域技術人員所知，可憑經驗確定這些蛋白質的同一性。
正如本領域技術人員所知，本發明的藥物組合物可用于治療多種病癥。例如，包含克帕松的組合物可用于保護中樞神經系統(CNS)細胞免受谷氨酸毒性的影響并治療由谷氨酸毒性導致或加重的損傷或病癥。如美國申請專利20020037848中所描述，該組合物也可用于治療多發性硬化癥、糖尿病性神經病變、老年性癡呆、阿爾茨海默氏病、帕金森氏癥、面神經(Bell′s)麻痹、青光眼、亨廷頓氏舞蹈病、肌萎縮性側索硬化、癲癇持續狀態、非動脈炎性視神經病變，或維生素缺乏癥。
術語“能結合聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸家族的聚合物的蛋白質或多肽”包括通過任何非共價機理，例如離子相互作用、疏水性相互作用、氫鍵和范德華引力(Arakawa，T.和Timasheff，S.N.(1985)Biochemistry246756-6762；Lee，J.C.和Lee，L.L.Y(1981)J.Biol.Chem.226625-631)，能結合聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸家族的聚合物或其衍生物的蛋白質和多肽。該聚合物的優選實例是聚乙二醇(PEG)。
術語“治療有效量”可以理解為導致蛋白質或多肽水平在血流中具有所需療效的蛋白質或多肽的量。所述的量可通過施用包含不同量的蛋白質或多肽的組合物以及施用后在不同時間測量血液中的水平而用實驗確定。
用于制備膠體顆粒的兩親性脂質可從天然的或人造的來源獲得。最優選的脂質包括磷脂，例如磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺，和氨基甲酸酯(carbamate)連接的例如二硬酯酰氨基丙二醇(DS)的不帶電的脂聚合物。生物相容性親水聚合物的作用是在空間上穩定SUVs，從而防止體外囊泡的融合，并使得囊泡避免體內RES的吸附。聚合物的分子量優選為約500道爾頓至約5000道爾頓，最優選為約2000道爾頓。
膠體顆粒的平均粒徑優選為約0.03微米至約0.4微米，最優選為約0.1微米。這將增加它們的體內循環時間以及避免受到RES的吸附。兩親性脂質包括大約0.5摩爾％至約20摩爾％的顆粒，優選大約1％～6％，最優選3％。
各種已知的偶聯反應可用于制備形成囊泡的脂質，該脂質是用親水性聚合物衍生化的。例如，聚合物(如PEG)可通過氰尿酰氯基團衍生化成諸如磷脂酰乙醇胺(PE)的脂質。或者，加帽的PEG可通過羰基二咪唑偶聯劑得以活化，以形成活化的咪唑化合物。氨基甲酸酯連接的化合物可通過以下方法制備將MPEG(甲氧基PEG)的末端羥基與對硝基苯基氯甲酸酯反應，以生產對硝基苯基碳酸酯。然后將該產物與1-氨基-2，3-丙二醇反應以生成氨基甲酸酯中間物。將二醇的羥基酰化，以生成終產物。如WO 01/05873所述，利用甘油代替1-氨基-2，3-丙二醇進行類似的合成，可用于生產碳酸酯連接的產物。其它反應也是熟知并在例如上述的US 5,013,556進行了描述，其內容在此引用作為參考。
本發明的組合物通過注射得以施用，優選(iv)靜脈注射、(sc)皮下注射或(im)肌肉注射。由于注射時脂質體組合物引起的副作用，現有技術的組合物僅僅供口服使用。但是，本發明的組合物顯而易見由于尺寸小和有毒的磷脂較少，所以進行注射是無毒性的。已在大鼠中進行了PEG化的脂質體和FIII的毒理學研究一在500單位/Kg的劑量下未發現毒性。注射直到0.5g/Kg體重的量的本發明的膠體顆粒，沒有可察覺的中毒癥狀。盡管本發明中使用的游離形式的蛋白質和多肽在血管系統中具有較短的半壽期，但是將它們在本發明的組合物中進行施用預計可以將它們的半壽期提高至少1.5倍。可預見本發明的組合物在“根據需求施用”和患者的預防性治療中是有效的。
在本發明的另一個方面，發現有8個氨基酸的共有序列，該共有序列位于與本發明的脂質體結合的蛋白質的內部，但在不結合脂質體的蛋白質中則沒有。該共有序列是S/T-X-L/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E，其中X可以是任意氨基酸，且S、T、L、I、V、E以及Q具有它們的標準含義。
在本發明的另一個方面，發現與注射蛋白質分開進行PEG化的脂質體的注射可提高蛋白質的半壽期并延長療效。
在本發明的另一方面，藥物組合物中添加有膽固醇。
為了理解本發明并了解如何在實踐中實施，現參考附圖僅通過非限制性實施例來描述優選的實施方案，其中圖1顯示了PEG化的脂質體對固定化的FVIII的實時相互作用。a.PEG化的脂質體結合固定化的rFVIII，但對照POPC脂質體(PC)以及POPC∶DSPE脂質體(PC∶PE)不結合固定化的rFVIII。b.PEG化的脂質體結合固定化的rFVIII(FVIII)但不結合固定化的HSA。c.在缺乏或存在已產生抗FVIII抗體(20Bethesda單位/ml的效價)的甲型血友病患者的稀釋的(×100)血清(抑制物)時，PEG化的脂質體結合固定化的rFVIII。反應以共振單位(RU)顯示。對a～c中的反應進行對HSA包被的孔道的非特異結合的校正，該非特異結合低于PEG化的脂質體對固定化的FVIII包被的孔道的實時相互作用達到5％。
圖2.PEG化的脂質體對固定化的FIX的實時相互作用。a.PEG化的脂質體結合固定化的FIX但不結合固定化的HSA。b.PEG化的脂質體結合固定化的FIX，但對照POPC脂質體不結合固定化的FIX。反應以共振單位(RU)表示。對反應進行對HSA包被的孔道的非特異結合的校正，相對于對FIX包被的孔道的結合，該非特異結合低于PEG化的脂質體對固定化的FIX的實時相互作用的5％。
圖3.PEG化的脂質體對固定化的G-CSF的實時相互作用。a.PEG化的脂質體結合固定化的G-CSF但不結合固定化的HSA。b.PEG化的脂質體結合固定化的G-CSF，但對照POPC脂質體不結合固定化的G-CSF。反應以共振單位(RU)表示。對反應進行對HSA包被的孔道的非特異結合的校正，相對于的G-CSF包被的孔道的結合，所述非特異性結合低于PEG化的脂質體對固定化的G-CSF的實時相互作用的5％。
圖4.PEG化的脂質體對固定化的GM-CSF的實時相互作用。a.PEG化的脂質體結合固定化的GM-CSF但不結合固定化的HSA。b.PEG化的脂質體結合固定化的GM-CSF，但對照POPC脂質體不結合固定化的GM-CSF。反應以共振單位(RU)表示。對反應進行對HSA包被的孔道的非特異結合的校正，相對于對G-CSF包被的孔道的結合，所述非特異性結合低于PEG化的脂質體對固定化的GM-CSF的實時相互作用的5％。
圖5.PEG化的脂質體對固定化的γ干擾素的實時相互作用。a.PEG化的脂質體結合固定化的γ干擾素但不結合固定化的HSA。b.PEG化的脂質體結合固定化的γ干擾素，但對照POPC脂質體不結合固定化的γ干擾素。反應以共振單位(RU)表示。對反應進行對HSA包被的孔道的非特異結合的校正，相對于對γ干擾素包被的孔道的結合，所述非特異結合低于PEG化的脂質體對固定化的γ干擾素的實時相互作用的5％。
圖6.PEG化的脂質體對固定化的GLP-1的實時相互作用。a.PEG化的脂質體結合固定化的GLP-1但不結合固定化的HSA。b.PEG化的脂質體結合固定化的GLP-1，但對照POPC脂質體不結合固定化的GLP-1。反應以共振單位(RU)表示。對反應進行對HSA包被的孔道的非特異結合的校正，相對于對GLP-1包被的孔道的結合，所述非特異結合低于PEG化的脂質體對固定化的GLP-1的實時相互作用的5％。
圖7.在缺乏或存在稀釋的(×10)兔多克隆抗人FIX抗體(Sigma)(抗體)時，PEG化的脂質體結合固定化的FIX。
圖8.用于結合PEG化的脂質體的共有序列和FVIII結合位點。a.在各種蛋白質中結合PEG化的脂質體的共有序列。保守氨基酸用紅色標記而非保守氨基酸用藍色標記。b.人FVIII的結構域結構。從它的一級結構推導出的人FVIII的不連續結構域結構。黑色方框代表脂質體結合位點。用T顯示的紅色箭頭代表凝血酶激活位點。c.PEG化的脂質體或POPC脂質體(PC)與衍生自FVIII序列(1783～1796位氨基酸)的肽的結合，所述肽固定在CM5傳感器芯片上。反應以共振單位(RU)表示。
圖9.PEG化的脂質體對固定化的克帕松的實時相互作用。a.PEG化的脂質體結合固定化的克帕松但不結合固定化的HSA。b.PEG化的脂質體結合固定化的克帕松，但對照POPC脂質體不結合固定化的克帕松。反應以共振單位(RU)表示。對反應進行對HSA包被的孔道的非特異結合的校正，相對于對克帕松包被的孔道的結合，所述非特異性結合低于PEG化的脂質體對固定化的克帕松的實時相互作用的5％。
圖10.尾部切除后的血友病小鼠的存活情況。Kaplan-Meierb圖表示使用FVIII(Kogenate-FS，Bayer)或FVIII和PEG化的脂質體(1小時后注射)注射血友病小鼠。T檢驗統計分析表明各組之間具有統計學上的顯著差異(P＜0.05)。
圖11.PEG化的脂質體對固定化的FVIII的實時相互作用，所述的脂質體是由POPC∶DSPE-PEG 2000(來自Genzyme Pharmaceuticals的脂質，Liestal，瑞士)分別以97∶3的摩爾比組成的PEG化的脂質體，以及是由POPC∶DS-c-PEG 2000(來自Genzyme Pharmaceuticals的脂質，Liestal，瑞士)分別以97∶3的摩爾比組成的PEG化的脂質體。
具體實施例方式
1.實施例1～81.1材料和方法脂質體的制備。脂質體由棕櫚酰-油酰磷脂酰基-膽堿(POPC)和二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺甲基聚乙二醇2000(DSPE-PEG 2000)(GenzymePharmaceuticals，Liesatal，瑞士)(摩爾比分別為97∶3)組成，和由POPC和二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺(DSPE)(Aventi Polar Lipids，Alabaster AL，美國)(摩爾比分別為97∶3)組成，并按如下進行制備將脂質溶于叔丁醇(Reidel-de Haen，Seelze，德國)直至10％w/v(重量/體積)，冷凍并使溶液凍干。將得到的脂質干粉重懸于50mM的檸檬酸鈉緩沖液(pH 7.0)直至2％～13％(w/v)，以形成脂質體。使用LiposoFastTM-100擠壓設備(Aventin Inc.，Ottawa，加拿大)，使脂質體通過1.2μm、0.2μm和0.05μm大小的聚碳酸酯過濾器(Poetics Corp.，Livermore CA，美國)進行過濾，以形成大小為80nm～110nm的脂質體。然后使脂質體溶液穿過0.2μm的醋酸纖維素無菌過濾器(SterivexTM，Millipore Corporation，Bedford MA，美國)，并在2℃～8℃儲存。
實時相互作用——表面等離振子共振分析。使用BiacoreTM2000生物傳感儀器(Biacore AB，Uppsala，瑞典)進行結合研究。根據供應商描述，將下列蛋白質通過胺偶聯試劑盒以1500RU(約1.5ng/mm2)固定于CM5-傳感器芯片(Biacore AB，Uppsala，瑞典)上FVIII(Kogenate-FS，Bayer，Berkley CA，美國)、FIX(Benefix，Genetics Institute，Cambridge MA，美國)、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ(γ干擾素)、紅細胞生成素、人生長激素、α干擾素2a、α干擾素2b(ProSpec-Tany TechnoGene Ltd，Nes Ziona，以色列)、GLP-1、胰島素(Sigma)、克帕松(Teva Pharm，以色列)、IgG以及HSA(Omrix，Tel-Aviv，以色列)。25℃時，使用終濃度為0.2mM～2mM的PEG化的脂質體或對照脂質體，在50mM檸檬酸鈉緩沖液(pH 7.0)中，以10μl/分鐘的流速用4分鐘進行SPR分析。用1mM的NaOH以10μl/分鐘的流速將芯片洗滌1分鐘進行傳感器芯片表面的再生。用BIA評價軟件(Biacore AB，Uppsala，瑞典)來分析SPR數據的締合常數、離解常數、親合常數。
多重比對——使用MUSCA軟件(http//cbcsrv.watson.ibm.com)進行多重序列比對。下列Swiss-Prot數據庫登錄號碼可用于多重比對人(h)FVIII(P00451)、人FIX(P00740)、人G-CSF(P09919)、人GM-CSF(P04141)、人IFN-γ(P01579)以及人GLP-1(P01275)。
1.2結果蛋白質/肽對PEG化的脂質體的結合我們通過表面等離振子共振(SPR)測量法使用Biacore儀器(Biacoe，Uppsala，瑞典)來分析蛋白質和肽對PEG化的脂質體的結合。我們將蛋白質/肽固定于CM5傳感器芯片(Biacoe，Uppsala，瑞典)上，然后注射入相同大小(80nm～110nm)和濃度的PEG化的脂質體或對照脂質體，并測量和分析蛋白質/肽對流動的攝入脂質體的結合。
PEG化的脂質體由結合于FVIII的POPC和DSPE-PEG2000組成(圖1a)。由于由POPC和POPC∶DSPE組成的兩種類型的對照脂質體不結合于FVIII(圖1a)，所以結合依賴于附著于DSPE脂質的PEG聚合物。此外，結合是FVIII特異性的，因為PEG化的脂質體不結合于人血清白蛋白(HSA)(圖1b)。使用兩個位點結合的模型，對代表性曲線的結合分析(圖1a)表明PEG化的脂質體結合于FVIII上的兩個位點，其中締合速率常數(Kon)分別為3.83×105M-1S-1和3.37×106M-1S-1，解離速率常數(Koff)分別為1.72×10-3S-1和6.6×10-3S-1，以及親合常數(Kd)值分別為1.96nM和4.5nM。
多克隆抗人因子VIII抗體[產生抗FVIII抗體(抑制物)的患者的血清]與PEG化的脂質體競爭結合這兩個位點(圖1c)。對照實驗表明人總免疫球蛋白G(IgG)不與FVIII競爭結合PEG化的脂質體(數據未顯示)。這表明PEG化的脂質體與抗人因子VIII抗體特異性結合相同的蛋白質結構域。
使用另外幾個純化的重組蛋白質進行SPR測量。發現下列蛋白質結合PEG化的脂質體因子IX(FIX)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、γ干擾素和胰高血糖素樣肽1(GLP-1)(圖2-6)。此外，我們發現下列蛋白質不結合PEG化的脂質體HSA、IgG、胰島素、α干擾素2a、α干擾素2b、人生長激素和紅細胞生成素。
此外，多克隆抗人因子IX抗體(Sigma)與PEG化的脂質體競爭結合兩個位點(圖7)。這表明PEG化的脂質體與抗人因子IX抗體特異性結合相同的蛋白質結構域。
氨基酸序列分析表明8個氨基酸(S/T-X-L/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E)的共有序列位于結合PEG化的脂質體的蛋白質內部(圖8a)，但在不結合PEG化的脂質體的蛋白質內部則不存在。為檢驗共有序列和FVIII上所鑒定的結合位點，我們合成了衍生于FVIII的1783～1796位氨基酸的肽，并測量其對PEG化的脂質體的結合。該肽結合PEG化的脂質體，并具有2.25nM的Kd(圖8c)，其類似于先前發現的FVIII和PEG化的脂質體的Kd值(表1)，但該肽不結合對照POPC脂質體。
表1顯示了多種蛋白質和肽的Kon、Koff以及Kd值的匯總表。
然而，克帕松(Teva，以色列)是由4種氨基酸(L-ala、L-glu、L-lys和L-tyr)重復隨機合成的共聚物，其并不含有共有序列，但也可結合PEG化的脂質體(圖9)。
表1蛋白質/肽對PEG化的脂質體的結合的動力學參數。
如“材料和方法”中所述，評估多種蛋白質和肽對PEG脂質體的締合作用和解離作用。對于FVIII、FIX、G-CSF、GM-CSF、INF-γ(γ干擾素)，所測試的PEG脂質體濃度是18.355nM；對于GLP-1，所測試的PEG脂質體濃度為183.55pM。通過BIA評估軟件，分析所有蛋白質的所得數據以計算締合速率常數(kon)、解離速率常數(koff)以及親合常數(Kd)。
2.實施例9～102.1材料和方法PEG化的脂質體FIX以及PEG化的脂質體和G-CSF的配制。具有FIX(Octanine，Octapharma)或G-CSF(ProSpec-Tany TechnoGene Ltd，NesZiona，以色列)的PEG化的脂質體可以通過將所述蛋白質與脂質體溶液一起溶解(1ml脂質體溶液/200單位的FIX，以及1ml脂質體溶液/10μg的G-CSF)而進行配制。在室溫(20℃～25℃)將小瓶在以33轉/分鐘、16mm的振幅旋轉的SRTl旋轉式混合器(Stuart Scientific，Redhill，英國)中溫育10分鐘(G-CSF)或60分鐘(FIX)。
在小鼠中脂質體配制的G-CSF和游離的G-CSF的藥物動力學。對兩組C57黑鼠進行皮下(s.c.)注射a)用PEG化的脂質體(10μg/ml)配制的50μl的G-CSF；b)溶于50mM檸檬酸鈉緩沖液(10μg/ml)的50μl的G-CSF。注射后在不同時間將小鼠從后眼窩竇取血并放入含有檸檬酸鈉(20mM終濃度)的微型離心管中，并在4℃通過2,700×g離心10分鐘來分離血漿。根據制造商的說明書，通過ELISA(G-CSF DouSet ELISA試劑盒，R&D)測量小鼠血漿中的G-CSF濃度。
血友病小鼠中PegLip-FIX和游離的FIX的藥物動力學。將50μl的以下物質IV(靜脈注射)到三組C57BL小鼠的尾靜脈中a)200單位/ml的PegLip-FIX；b)未配制的FIX；c)緩沖液。注射后在不同時間將小鼠從后眼窩竇取血并放入含有檸檬酸鈉(20mM終濃度)的微型離心管中，并在4℃通過2,700×g離心10分鐘來分離血漿。根據制造商的說明書，通過一期凝血測定法(使用Stago試劑和ST4凝固儀)測量小鼠血漿中的FIX活性。由于C57BL小鼠在其血漿中具有內源性FIX活性，所以在處理組中從各個時間點所測量的活性中減去該內源性活性(如在對照小鼠中測量的)。
藥物動力學分析通過計算機軟件(RSTRIP，MicroMath Inc.)分析藥物動力學參數(半壽期和AUC)。
統計學分析Student′s t檢驗。
2.2結果小鼠中脂質體配制的蛋白質的藥物動力學測量小鼠中游離的與脂質體配制的FIX和G-CSF的藥物動力學參數。表2-3中所示的結果表明用PEG化的脂質體配制的蛋白質的半壽期和曲線下的面積大于游離的蛋白質的半壽期和曲線下的面積。
表2將脂質體配制的G-CSF(PegLip-G-CSF)或游離的G-CSF皮下注射到小鼠中后的藥物動力學參數
G-CSF用50mM檸檬酸鈉緩沖液pH 7重建或用PEG化的脂質體配制，并皮下注射(50μl)到小鼠中(每組6只小鼠)。通過酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測量血漿中的人G-CSF濃度(pg/ml)。計算每只小鼠的藥物動力學參數。數值以平均值±標準偏差表示。對PegLip-G-CSF和G-CSF的半壽期進行Student′st檢驗，P＜0.002。
表3將因子IX或PEG化的脂質體配制的因子IX(PegLip-FIX)靜脈注射到小鼠中后的藥物動力學參數
計算每只小鼠的藥物動力學參數。數值以平均值±標準偏差表示。對PegLip-FIX和FIX的半壽期進行Student′s t檢驗，P＜0.15。
3.實施例113.1在體內用PEG化的脂質體配制的FVIII在血友病小鼠中的藥物動力學和生物活性測量血友病小鼠中的因子VIII的藥物動力學和生物活性，所述因子VIII在注射未配制的因子VIII 1小時之后，通過注射脂質體而用PEG化的脂質體在體內進行配制。對血友病小鼠注射a)游離的(未配制的)FVIII；b)游離的FVIII，并且1小時后再注射PEG化的脂質體。注射后在多個時間對小鼠放血，并通過凝血法測量FVIII活性。為了檢驗脂質體配制的FVIII在抑制出血方面的體內功效，以及將其與游離的FVIII的功效進行比較，在注射后幾個時間切去被注射小鼠的尾部，并測量被注射小鼠的存活情況。
表4和圖10所示的結果表明用PEG化的脂質體在體內配制的凝血因子VIII的半壽期和曲線下的面積，高于游離的FVIII的值。因此，注射FVIII并于1小時后注射脂質體的小鼠存活率明顯更高。
表4對血友病小鼠注射FVIII后或注射FVIII 1小時后注射PEG化的脂質體后，因子VIII的活性(IU/ml)和藥物動力學參數
用水使重組的FVIII(Kogenate-FS，Bayer)重建，并將其注射(40μl)到血友病小鼠(每組10只小鼠)的尾靜脈中。1小時后，將PEG化的脂質體(9％脂質，w/v)靜脈注射(40μl)到其中一組小鼠中。通過一期凝血法測量混合血漿樣品在各個時間點的FVIII活性。藥物動力學參數(半壽期和AUC)通過計算機程序(RSTRIP，MicroMath Inc.)進行分析。
4.實施例12通過實時相互作用分析法，將FVIII對由POPC和氨基甲酸酯連接的不帶電荷的脂聚合物組成的脂質體的結合，與FVIII對由POPC和DSPE-PEG組成的脂質體的結合進行比較。以下顯示了氨基甲酸酯連接的不帶電荷的脂聚合物mPEG二硬酯酰氨基丙二醇(DS-c-PEG)和1，2-二硬酯酰-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-甲氧基聚乙二醇(DSPE-PEG)的示意性結構圖。
結果如圖11所示，并表明兩種類型的脂質體可以與FVIII相互作用。
5.實施例13凝血因子VIIa通常用于治療具有抑制物的血友病患者以及用于抑制創傷性出血(如，戰爭傷害、車禍)。在大鼠中測量了用PEG化的脂質體配制的因子VIIa的藥物動力學。對Sprague Dawley(SD)大鼠(180g)注射36μg/只大鼠的游離的(未配制的)FVIIa(Nova Nordisk)或用PEG化的脂質體配制的FVIIa。注射后在不同時間對大鼠放血，并通過凝血測定法(Stago)測量FVIIa活性。表5和表6所示的結果表明，用PEG化的脂質體在體內配制的因子VIIa的半壽期和曲線下的面積，高于游離的FVIIa半壽期和曲線下的面積。
表5將FVIIa或用PEG化的脂質體配制的FVIIa注射入大鼠后，凝血因子VIIa的活性(IU/ml)和藥物動力學
表6將FVIIa或用PEG化的脂質體配制的FVIIa注射到大鼠中后(混合樣品)，因子VIIa的活性(IU/ml)和藥物動力學
權利要求
1.一種用于腸胃外給藥的藥物組合物，該藥物組合物包含治療有效量的蛋白質或多肽以及膠體顆粒，所述顆粒包含用生物相容性親水聚合物衍生化的、約1摩爾％～20摩爾％的兩親性脂質，其中所述蛋白質或多肽選自(a)能在外部結合所述膠體顆粒的蛋白質或多肽；(b)能結合聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸家族的聚合物的蛋白質的多肽；或(c)包含共有序列S/T-X-L/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E的蛋白質或多肽，其中X可以是任意氨基酸，且S、T、L、I、V、E以及Q具有它們的標準含義；其中所述蛋白質或多肽不是因子VIII(FVIII)，以及其中所述蛋白質或多肽不是包埋于所述膠體顆粒中。
2.如權利要求1所述的藥物組合物，其中所述的膠體顆粒是基本上中性的，所述的聚合物基本上不帶凈電荷。
3.如權利要求1所述的藥物組合物，其中所述的膠體顆粒具有約0.03微米至約0.4微米的平均粒徑。
4.如權利要求3所述的藥物組合物，其中所述的膠體顆粒具有約0.1微米的平均粒徑。
5.如權利要求1～4任一項所述的藥物組合物，其中所述的兩親性脂質是來自天然或人造來源的磷脂。
6.如權利要求5所述的藥物組合物，其中所述的兩親性脂質是磷脂酰乙醇胺(PE)。
7.如權利要求1～4任一項所述的藥物組合物，其中所述的兩親性脂質是氨基甲酸酯連接的不帶電荷的脂聚合物。
8.如權利要求7所述的藥物組合物，其中所述的兩親性脂質是二硬酯酰氨基丙二醇(DS)。
9.如權利要求1所述的藥物組合物，其中所述的膠體顆粒還包含從天然或人造來源獲得的第二兩親性脂質。
10.如權利要求9所述的藥物組合物，其中所述的第二兩親性脂質是磷脂酰膽堿。
11.如權利要求9所述的藥物組合物，該藥物組合物中添加有膽固醇。
12.如權利要求1所述的藥物組合物，其中所述的生物相容性親水聚合物選自聚烷基醚、聚乳酸以及聚乙醇酸家族。
13.如權利要求12所述的藥物組合物，其中所述的生物相容性親水聚合物是聚乙二醇。
14.如權利要求13所述的藥物組合物，其中所述的聚乙二醇具有約500道爾頓至約5000道爾頓的分子量。
15.如權利要求14所述的藥物組合物，其中所述聚乙二醇具有約2000道爾頓的分子量。
16.如權利要求1所述的藥物組合物，其中所述的蛋白質或多肽選自凝血酶原、因子VIIa、因子X、因子V、因子IX(FIX)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、γ干擾素、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)或克帕松。
17.如權利要求16所述的藥物組合物，其中所述的多肽是克帕松，并且所述的組合物用于治療選自以下的疾病多發性硬化癥、糖尿病性神經病變、老年性癡呆、阿爾茨海默氏病、帕金森氏癥、面神經(Bell′s)麻痹、青光眼、亨廷頓氏舞蹈病、肌萎縮性側索硬化、癲癇持續狀態、非動脈炎性視神經病變或維生素缺乏癥。
18.如權利要求16所述的藥物組合物，其中所述的多肽是因子VIIa，并且所述的組合物用于治療具有抑制物的血友病患者以及用于治療創傷性出血。
19.如權利要求1所述的藥物組合物，其中所述的蛋白質或多肽包含氨基酸共有序列S/T-X-L/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E，其中X是任意的氨基酸。
20.治療血友病患者的方法，該方法包括對患者施用用于腸胃外給藥的藥物組合物，該藥物組合物包含有效治療血友病的治療有效量的蛋白質或多肽以及膠體顆粒，所述顆粒包含用生物相容性親水聚合物衍生化的、約1摩爾％～20摩爾％的兩親性脂質，其中所述蛋白質或多肽選自(a)能在外部結合所述膠體顆粒的蛋白質或多肽；或(b)能結合聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸家族的聚合物的蛋白質的多肽；或(c)包含共有序列S/T-X-L/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E的蛋白質或多肽，其中X可以是任意氨基酸，且S、T、L、I、V、E以及Q具有它們的標準含義；其中所述蛋白質或多肽不是因子VIII(FVIII)，以及其中所述蛋白質或多肽不是包埋于所述膠體顆粒中。
21.如權利要求20的方法，其中所述的患者已經產生了針對所述蛋白質或多肽的抑制物抗體。
22.膠體顆粒在制備用于治療血友病患者的腸胃外給藥的藥物組合物中的用途，該藥物組合物包含治療有效量的蛋白質或多肽以及膠體顆粒，所述顆粒包含用生物相容性親水聚合物衍生化的、約1摩爾％～20摩爾％的兩親性脂質，其中所述蛋白質或多肽選自(a)能在外部結合所述膠體顆粒的蛋白質或多肽；或(b)能結合聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸家族的聚合物的蛋白質的多肽；或(c)包含共有序列S/T-X-L/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E的蛋白質或多肽，其中X可以是任意氨基酸，且S、T、L、I、V、E以及Q具有它們的標準含義；其中所述蛋白質或多肽不是凝血因子VIII(FVIII)，以及其中所述蛋白質或多肽不是包埋于所述膠體顆粒中。
23.如權利要求22所述的用途，其中所述的患者已經產生了針對所述蛋白質或多肽的抑制物抗體。
24.膠體顆粒在制備用于腸胃外給藥的藥物組合物中的用途，所述藥物組合物包含治療有效量的蛋白質或多肽以及膠體顆粒，所述顆粒包含用生物相容性親水聚合物衍生化的、約1摩爾％～20摩爾％的兩親性脂質，其中所述蛋白質或多肽選自(a)能在外部結合所述膠體顆粒的蛋白質或多肽；或(b)能結合聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸家族的聚合物的蛋白質的多肽；或(c)包含共有序列S/T-X-L/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E的蛋白質或多肽，其中X可以是任意氨基酸，且S、T、L、I、V、E以及Q具有它們的標準含義；其中所述的蛋白質或多肽不是因子VIII(FVIII)，以及其中所述蛋白質或多肽不是包埋于所述膠體顆粒中。
25.治療患有疾病的患者的方法，該方法包括對所述患者施用用于腸胃外給藥的藥物組合物，該藥物組合物包含有效治療疾病的治療有效量的蛋白質或多肽以及膠體顆粒，所述顆粒包含用生物相容性親水聚合物衍生化的、約1摩爾％～20摩爾％的兩親性脂質，其中所述蛋白質或多肽選自(a)能在外部結合所述膠體顆粒的蛋白質或多肽；或(b)能結合聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸家族的聚合物的蛋白質的多肽；或(c)包含共有序列S/T-X-L/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E的蛋白質或多肽，其中X可以是任意氨基酸，且S、T、L、I、V、E以及Q具有它們的標準含義；其中分開施用所述的膠體顆粒和所述的蛋白質或多肽，以及其中所述蛋白質或多肽不是包埋于所述的膠體顆粒中。
26.如權利要求25的方法，其中所述的蛋白質或多肽不是因子VIII(FVIII)。
27.如權利要求25的方法，其中所述的膠體顆粒是脂質體，所述的蛋白質或多肽是因子VIII(FVIII)。
全文摘要
一種用于腸胃外給藥的藥物組合物，該藥物組合物包含治療有效量的蛋白質或多肽以及膠體顆粒。所述顆粒包含用生物相容性親水聚合物衍生化的、約1摩爾％～20摩爾％的兩親性脂質。所述蛋白質或多肽選自(a)能在外部結合所述膠體顆粒的蛋白質或多肽；(b)能結合聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸家族的聚合物的蛋白質或多肽；和(c)包含共有序列S/T－X/I/V－I/V/Q/S－S/T－X－X－X－E的蛋白質或多肽，其中X可以是任意氨基酸，且S、T、L、I、V、E以及Q具有它們的標準含義。所述蛋白質或多肽不是因子VIII(FVIII)，并且不是包埋于所述膠體顆粒中。
文檔編號A61P25/28GK1774281SQ200480010099
公開日2006年5月17日 申請日期2004年4月15日 優先權日2003年4月15日
發明者摩西·巴魯, 萊亞·卡梅爾-戈倫 申請人:奧珀百思控股公司