Cns氯化物調節及其用途的制作方法

專利名稱：Cns氯化物調節及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及中樞神經系統(CNS)神經細胞中的陰離子水平調節，尤其是涉及CNS細胞內氯化物水平的調節及其在治療、預防、診斷和預測疼痛中的用途。
背景技術：
針對疼痛治療的新的改良方法和活性劑的需求是目前醫學上的一個重要的焦點。急性疼痛，例如，與受傷或疾病有關的疼痛，可能是嚴重的且對患者的康復有關鍵的影響。而更多的關注是慢性疼痛，它影響著相當大比例的人群，不僅引起顯著的不適，還導致了自卑、沮喪、憤怒，還干擾了或完全妨礙了患者一般的日常活動。
盡管在此領域內已進行了許多研究，但對傷害感受覺中涉及的許多機制和途徑仍然了解甚微。正如在多種刺激的感覺的情況中，痛覺與神經元興奮性的改變相關。
在某些情況中，離子協同運輸被認為在某些刺激的處理中發揮了作用。例如，Howard等(28)已證實了通過定向缺失編碼KCC3輸出子(exporter)的Slcl2a6基因而產生的小鼠展示出胼胝體發育不全，包括運動缺陷、外周神經病以及感覺運動門控缺陷。據Sung等(29)報道，與野生型和雜合的(NKCC1+/-)小鼠相比，編碼NKCC1協同轉運蛋白的Slcl2a2基因被破壞的小鼠對熱刺激的敏感性大大降低。
目前仍需要更好的解釋痛覺中所涉及的機制，從而提供有關這方面治療性干預的新方法。
發明概述本發明涉及疼痛以及治療、預防、診斷和預測所述疼痛的方法。本發明還涉及與神經疼痛和CNS功能異常相關的疼痛。本發明另外還涉及降低中樞神經系統(CNS)神經細胞細胞內氯化物水平的方法。
一方面，本發明提供了在受試者中治療或預防疼痛的方法，該方法包括降低該受試者中樞神經系統(CNS)神經細胞的細胞內氯化物水平。在一個實施方案中，所述方法包括調節CNS細胞中氯化物轉運蛋白的活性或表達，從而降低氯化物水平。在另一實施方案中，氯化物轉運蛋白是KCC2，所述方法包括提高KCC2的活性或表達。在又一實施方案中，CNS神經細胞是脊髓神經細胞。在另一實施方案中，疼痛的信號源于外周神經系統(PNS)細胞或CNS神經細胞跨突觸的感覺纖維。在另一實施方案中，疼痛是神經性疼痛(neuropathic pain)，而在進一步的實施方案中，所述神經性疼痛是與神經或神經束損傷相關的疼痛或選自軀體和內臟疼痛。在另一實施方案中，疼痛選自慢性炎癥疼痛、與關節炎相關的疼痛、纖維肌痛(fibromyalgia)、背痛、癌癥相關疼痛、消化類疾病相關性疼痛、克羅恩氏病相關疼痛、自身免疫病相關疼痛、內分泌病相關疼痛、糖尿病性神經病相關疼痛、幻肢疼痛、自發性疼痛、慢性術后疼痛、慢性顳下頜疼痛、灼痛、皰疹后神經痛、艾滋病相關疼痛、I型和II型復合性區域疼痛綜合癥(complex regional pain syndrome type I and II)、三叉神經痛、慢性背痛、與脊髓損傷相關的疼痛以及周期性急性痛。
在一個實施方案中，所述方法包括對受試者施用能降低CNS細胞內氯化物水平的化合物。在另一實施方案中，所述化合物能調節CNS細胞中氯化物轉運蛋白的活性或表達。在另一實施方案中，所述氯化物轉運蛋白是KCC2，在再一個實施方案中，所述化合物能提高KCC2的活性或表達。在另一實施方案中，所述化合物是TrkB的抑制劑，諸如K-252a或抗TrkB抗體。在另一實施方案中，所述化合物是依賴AMP的激酶(PKA)的抑制物(如H-89)。在另一實施方案中，所述化合物是鈣調蛋白依賴性激酶(CAM激酶)的抑制物，更具體而言，是KN-93。在一個實施方案中，KCC2包含與選自SEQ ID NO2、4、6及其片段的序列基本上相同的氨基酸序列。
本發明的另一方面提供了用于治療或預防受試者疼痛的組合物，所述組合物包括能降低CNS神經細胞內氯化物水平的化合物和可藥用載體。在一個實施方案中，所述化合物能調節CNS神經細胞中氯化物轉運蛋白的活性或表達。在另一實施方案中，所述氯化物轉運蛋白是KCC2，更進一步的是，所述化合物能提高KCC2的活性或表達。
本發明的另一方面還提供了商業包裝，其包括本文所述組合物及其用于治療或預防疼痛的用法說明書。
本發明的另一方面提供了商業包裝，其含有能降低CNS神經細胞中細胞內氯化物水平的化合物及其用于治療或預防疼痛的用法說明書。在一個實施方案中，所述化合物能調節所述CNS神經細胞中的氯化物轉運蛋白的活性或表達。在另一實施方案中，該氯化物轉運蛋白是KCC2，且更進一步的是，該化合物能提高所述KCC2的活性或表達。
本發明的另一方面提供了本文所述組合物在治療或預防疼痛以及/或者制備用于治療或預防疼痛的藥物中的用途。
本發明的又一方面提供了將能降低CNS神經細胞細胞內氯化物水平的化合物用于治療或預防疼痛以及/或者用于制備治療或預防疼痛的藥物的用途。在一個實施方案中，所述化合物能調節所述CNS細胞中氯化物轉運蛋白的活性或表達。在另一實施方案中，所述氯化物轉運蛋白是KCC2，且更進一步的是，所述化合物能提高KCC2的活性或表達。在另一實施方案中，所述化合物是TrkB的抑制劑，且更進一步的是，它選自K-252a或抗TrkB抗體。在另一實施方案中，所述化合物是依賴cAMP的激酶(PKA)的抑制物，更具體而言，它是H-89。在另一實施方案中，所述化合物是鈣調蛋白依賴性激酶的抑制物，更具體而言，它是KN-93。
本發明的另一方面提供了鑒定或表征用于治療或預防疼痛的化合物的方法，該方法包括將受試化合物與CNS來源的細胞接觸；測定在受試化合物存在的條件下細胞內氯化物水平是否下降；其中所述下降表明受試化合物可用于治療或預防疼痛。
本發明的另一方面提供了鑒定或表征用于治療或預防疼痛的化合物的方法，該方法包括將受試化合物與表達氯化物轉運蛋白的CNS來源的細胞接觸；測定在受試化合物存在的條件下該氯化物轉運蛋白的活性或表達是否受到如此調節使得細胞內氯化物水平下降；其中所述調節表明受試化合物可用于治療或預防疼痛。在一個實施方案中，氯化物轉運蛋白是KCC2，此外，該方法包括確定在所述受試化合物存在的條件下所述KCC2的表達或活性是否提高以及該調節是增強。在另一實施方案中，通過測量以下參數來確定KCC2的活性鉀轉運、氯化物轉運、細胞內氯化物水平和陰離子逆轉電位。在另一實施方案中，疼痛包括慢性炎癥疼痛、與關節炎相關的疼痛、纖維肌痛、背痛、癌癥相關疼痛、消化系統疾病相關疼痛、克羅恩氏病相關疼痛、自身免疫病相關疼痛、內分泌病相關疼痛、糖尿病性神經病相關疼痛、幻肢疼痛、自發性疼痛、慢性術后疼痛、慢性顳下頜疼痛、灼痛、皰疹后神經痛、艾滋病相關疼痛、I型和II型復合性區域疼痛綜合癥、三叉神經痛、慢性背痛、與脊髓損傷相關的疼痛以及周期性急性痛。
本發明的另一方面提供了鑒定或表征用于治療或預防疼痛的化合物的方法，該方法包括將受試化合物與CNS來源的細胞接觸，該細胞包含了具有通常與氯化物轉運蛋白基因相關的轉錄調節元件的第一種核酸，它與含有能編碼報道蛋白的報道基因的第二種核酸有效連接；確定在受試化合物存在的條件下報道基因是否表達或報道蛋白的活性是否被調節；其中報道基因表達或報道蛋白活性的調節表明受試化合物可用于治療或預防疼痛。在另一實施方案中，所述氯化物轉運蛋白是KCC2，且在受試化合物存在的條件下所述報道基因表達或報道蛋白活性提高。
本發明的一方面提供了用于減輕受試者中傷害感受的方法，該方法包括減少受試者CNS神經細胞內的細胞內氯化物。在一個實施方案中，該方法包括調節CNS神經細胞內的氯化物轉運蛋白活性或表達。在另一實施方案中，所述氯化物轉運蛋白是KCC2，此外，該方法包括提高KCC2的活性或表達。在另一實施方案中，該方法進一步包括用能增加KCC2活性或表達的化合物接觸CNS神經細胞。在另一實施方案中，所述化合物是TrkB的抑制物，而且更進一步的是，它選自K-252a和抗-TrkB抗體。在另一實施方案中，該化合物是依賴cAMP的激酶(PKA)的抑制物，更進一步的說，是H-89。在另一實施方案中，該化合物是鈣調蛋白依賴性激酶抑制物，更進一步的說，是KN-93。在另一實施方案中，KCC2包含與選自SEQ IDNO2、4、6及其片段的序列基本上相同的氨基酸序列。
本發明的另一方面提供了用于在經歷疼痛的受試者中診斷或預測與CNS功能異常相關的疼痛的方法，該方法包括確定相對于相應的對照氯化物水平而言，被測試的CNS細胞內氯化物水平是否增加，其中增加表明該受試者正在經歷與CNS功能異常相關的疼痛。在一個實施方案中，該方法進一步包括確定相對于對照轉運蛋白活性或表達而言，CNS氯化物轉運蛋白的活性或表達是否被調節。在另一實施方案中，所述氯化物轉運蛋白是KCC2，而且，該方法包括確定KCC2的活性或表達相對于對照活性或表達而言是否降低了。在另一實施方案中，對照的細胞內氯化物水平選自已確定的標準、在較早時間測定的該受試者中相應細胞內氯化物水平、在該受試者傷害感受較輕或基本上無疼痛時測定的相應細胞內氯化物水平以及在傷害感受較輕或基本上無疼痛的對照受試者中測定的相應細胞內氯化物水平。在另一實施方案中，對照的活性或表達選自KCC2活性或表達的已確定的標準、在較早時間測定的該受試者中相應的KCC2活性或表達水平、當該受試者傷害感受較輕或基本上無疼痛時測定的相應KCC2活性或表達水平以及在傷害感受較輕或基本上無疼痛的對照受試者中測定的相應KCC2活性或表達水平。在另一實施方案中，通過測量以下參數確定KCC2的活性鉀轉運、氯化物轉運、細胞內氯化物水平和陰離子逆轉電位。在另一實施方案中，通過對受試者施用指示氯化物水平的指示劑化合物使其與受試者的CNS神經細胞接觸并評估與該指示劑化合物相關的體內信號來確定細胞內的氯化物水平。在另一實施方案中，與CNS功能異常相關的疼痛是神經性疼痛。在另一實施方案中，指示劑化合物是放射性核素，更具體而言，可選自201Tl、99Tcm-tetrofosmin、99Tcm-MIBI、99Tcm-HMPAO和36Cl。在另一實施方案中，通過成像技術評估體內信號。在另一實施方案中，所述體內信號是指示劑化合物的滯留指標。在另一實施方案中，所述成像技術選自單光子發射計算機層析X射線照相術、正電子發射層析X射線照相術和磁共振成像。在另一實施方案中，指示劑化合物指示KCC2表達，更具體而言，指示劑化合物是針對KCC2的抗體。
本發明再一方面提供了處理受試者中與CNS功能異常相關的疼痛的方法，該方法包括依照本文所說方法診斷或預測受試者中與CNS功能異常相關的疼痛并降低受試者CNS細胞中的細胞內氯化物水平。
在一個實施方案中，上述受試者是哺乳動物，在更進一步的實施方案中，上述受試者是人。
附圖簡述

圖1外周神經損傷(PNI)誘導同側表面背角(SDH)中片層I(LI)神經元內陰離子劇降。a)坐骨神經的慢性收縮損傷(n＝23)，但不是假手術(n＝11)，造成對大鼠后爪機械刺激的傷害性消除的閾值50％顯著下降(p＜0.01)。b)從首次用于實驗的(Δ)和PNI(o)大鼠LI神經元記錄的E陰離子范圍。實心符號＝平均E陰離子±SEM。c)顯示出E陰離子對PNI響應偏移的所有類型LI神經元(即具有時相性的(P)、單峰(SS)和強直性(T)峰的特性[19])。比例尺(scale bar)是50mV(y)、150ms(x)。d)響應各種Vm下所應用的GABA的首次用于實驗的(▲)和PNI(●)大鼠LI神經元中測量到的平均峰電流。水平標準誤差線代表記錄移液器偏移量時神經元之間的差異。插圖來自某一神經元的典型軌跡。比例尺是0.6nA(y)、1.0s(x)。
圖2在L1神經元中經PNI后從僅GlyR(受體)轉換成混合的GABAAR-和GlyR-介導的微型突觸后電流(mPSCs)。a)來自首次用于實驗的大鼠LI神經元的向外(左邊)和向內(右邊)微型突觸后事件原始軌跡。所有向外的mPSCs均被馬錢子堿所消除，而所有向內的mPSCs(在馬錢子堿和荷包牡丹堿的存在下記錄)均被GluR拮抗物CNQX消除。HP-保持電壓。比例尺是20pA(y)，300ms(x)。b)記錄自PNI大鼠LI神經元的向內(左)和向外(右)微型突觸后活動的原始軌跡。與在首次用于實驗的大鼠中不同，同時需要有馬錢子堿和荷包牡丹堿才能阻止所有向外的mPSCs。向內的mPSCs仍然對CNQX非常敏感。比例尺是20pA(y)、300ms(x)。c)左圖-記錄自PNI大鼠LI神經元的疊加的單個mPSCs。僅GlyR和僅GABAAR以及混合GABAAR/Glyr-介導的類型可通過它們對馬錢子堿和/或荷包牡丹堿的靈敏度而清楚地鑒別。右圖-記錄自PNI大鼠LI神經元的大于100的GlyR-和GABAAR-介導mPSCs的平均值。比例尺是15pA(y)，20ms(x)。d)從首次用于實驗的(N；對于GlyR而言n＝10；對于GluR而言n＝5)和PNI(P；對于GlyR而言n＝9；對于GluR而言n＝8)LI神經元記錄的mPSCs平均峰電導。P(B)顯示了0mV時在荷包牡丹堿存在條件下記錄的PNI大鼠神經元(n＝12)中GlyR介導的mPSC。e)首次用于實驗的大鼠(n＝6)中GlyR介導的mPSC攜帶的凈電荷，PNI大鼠[PNI(Bic)；n＝4]中用荷包牡丹堿分離的GlyR介導的mPSC所攜帶的凈電荷，以及PNI大鼠LI神經元(PNI；n＝12)中混合GABAAR/GlyR-介導mPSCs所攜帶的凈電荷。f)描述首次用于實驗的LI神經元中僅GlyR mPSC事件間間隔(I.E.I.)和PNI大鼠LI神經元[PNI(Bic)]中荷包牡丹堿分離的僅GlyR mPSC事件間間隔之間差異的累積概率圖，均在E陰離子＝0mV的條件下記錄。GABAAR介導的mPSCs(PNI)的加入補償了僅GlyR mPSC頻率的減少。插圖-PNI對GluR介導的mPSC的頻率無影響。
圖3與PNI同側的SDH片層I神經元中PNI-誘導的KCC2下調導致了GlyR/GABAAR-介導的興奮。a)短暫的GABA應用(每次加壓30ms)引起來自PNI大鼠fura-2-am(Ca2+指示劑)負荷切片的LI神經元中[Ca2+]i的河豚毒素(TTX)和荷包牡丹堿敏感性提高。b)應用KC1但不應用GABA(每次最長施壓250ms)不會引起首次用于實驗的大鼠LI神經元內[Ca2+]i的改變。在存在KCC2特異拮抗劑DIOA的情況下，GABA的應用不會引起首次用于實驗的大鼠LI神經元內[Ca2+]i的升高。比例尺為0.02(y)、10s(x)。c)展示出GABA-引起的[Ca2+]i增加的LI神經元的百分數。該比例該PNI大鼠中(x2矯正值＝3.91)以及首次用于實驗的大鼠中存在DIOA情況下(x2矯正值＝4.43)顯著較高。d)證實外源GABA能在薄層I神經元內反復引起動作電位的代表性軌跡。上方的比例尺是5mV(y)，200ms(x)。下方的比例尺是30mV(y)，4s(x)。插圖-響應去極化脈沖證實其為單峰值神經元(19)。比例尺為20mV(y)，300ms(x)。e)類似地，主要刺激(focal stimuli)(在存在谷氨酸鹽受體阻斷劑的情況下)引起荷包牡丹堿敏感性單突觸去極化突觸后電位，其會引起PNI大鼠片層I神經元中動作電位。比例尺是5mV(y)，250ms(x)。插圖-響應去極化脈沖證實其為相位神經元(19)。比例尺為20mV(y)，300ms(x)。f)左圖-免疫印跡顯示KCC2水平在腰部SDH平躺的PNI位點同側(Ipsi)但不是對側(Con)有所下降。右圖-從如左圖(參照Con歸一化lpsi)的免疫印跡(n＝4)測量的KCC2蛋白(對肌動蛋白歸一化)的平均強度(±SEM)。
圖4選擇性封閉或擊倒(knock down)SDH中的突觸后KCC2輸出子顯著降低了傷害感受閾值。a)鞘內注射DIOA(n＝5)或載體(n＝3)后觸覺傷害感受消退閾值作為時間的函數。b)鞘內注射DIOA(n＝3)或載體(n＝3)后熱傷害感受消退潛伏期作為時間的函數。消退時，大鼠還經常舔它們的爪子，表明有傷害感受。c)在DIOA存在或缺失條件下用CsCl(氯化銫)移液器(用于在0mV時夾住E陰離子)記錄的LI神經元內自發的mPSC。比例尺是20pA(y)，300ms(x)。d)累積概率圖(n＝4個神經元X50mPSCs)，其證實DIOA既不會影響突觸事件峰電導(p＞0.5)，也不會影響GABA所引起的反應(n＝5；p＞0.5，插圖)并因而不作用于GlyR也不作用于GABAAR。G峰＝峰電導。e)與接受合成的寡脫氧核苷酸的大鼠(n＝7)相比，局部腰椎(鞘內)施用KCC2反義寡脫氧核苷酸(各12小時)導致首次用于實驗的大鼠(n＝8)中觸覺傷害感受消退閾值的顯著降低。插圖，經反義(AS，12小時或36小時)或合成的(S，36小時)寡脫氧核苷酸處理后脊髓KCC2蛋白質水平(用免疫印跡測量)下降。f)與SDH相比，在首次用于實驗的大鼠背根神經節(DRG)中KCC2免疫反應性缺乏。g)電子顯微鏡照片顯示在SDH樹突(D)而不在突觸小結(B)中KCC2的選擇性表達(定量細節參閱圖6)。箭頭指向突觸。比例尺為0.2μm。
圖5體內突觸狀況的計算機模擬證實了片層I神經元的感受性以E陰離子偏移的函數發生。a)左圖-利用模型神經元(參閱實施例)進行的計算機模擬論證GlyR-和GABAAR介導的PSC[PNI(GlyR+GABAAR)]的PNI誘導的改變怎樣以GluR介導的PSC頻率的函數影響LI神經元輸出發放頻率的。此外還顯示了在只考慮GlyR-介導的[PNI(僅GlyR)]或GABAAR-介導的[PNI(僅GABAAR)]突觸事件的影響時PNI后LI神經元中的結果。右圖-顯示了與左圖相同的數據，按照發放頻率比率表達，計算為以特定數據集除以無抑制數據集(即，數據集的發放頻率等價于無抑制)。盡管正常超極化GlyR介導的PSCs(在首次用于實驗的大鼠中平均E陰離子＝-72.8mV)對輸出發放頻率(fout)具有凈抑制作用，但是去極化GlyR-介導的PSCs(在PNI大鼠中平均E陰離子＝-49.0mV)則與無抑制作用的預期結果相比fout增加，證明了凈興奮作用。由于GABAAR-介導的PSC攜帶電荷增加而摻入GABAAR組分時，此刺激作用更占優勢。b)左圖-不同E陰離子值(超出我們研究中所觀察的范圍)對PNI后LI神經元發放頻率的影響。右圖-以發放頻率比率表示的與左圖同樣的數據(如上)。
圖6KCC2輸出子的表達局限于背角神經元而非感覺纖維。盡管KCC2水平低于通過免疫印跡從DRG檢測的水平(圖4f)，但我們證實了KCC2是否會優先從細胞體穿梭至初級神經末端的中央末端。a)電鏡照片顯示了在背角片層I的樹突(D)上存在KCC2。此外還顯示了片層I神經元胞體(S)上的膜界定免疫金染色(箭頭)。相比，在所檢測的任一隨機選擇的突觸圖(n＝171)中均未觀察到KCC2免疫染色。b)在明確相應于初級神經末端的中央末端(A-和C-纖維[34，35])的片層I和II(I類CI，左圖；II類CII，右圖；箭頭指示了興奮突觸；D樹突)中突觸神經纖維球的中心小結(n＝42個隨機選定的中心小結)內也缺乏KCC2免疫反應性。比例尺a2μm；b0.5μm(左圖)，0.2μm(右圖)。
圖7從首次用于實驗的和PNI大鼠的片層I神經元記錄的多種處理對陰離子(碳酸氫鹽和氯化物)逆轉電位(E陰離子)的影響。
圖8鞘內施用受體酪氨酸激酶抑制劑K-252a(6nM)導致觸覺傷害感受消退閾值的提高。
圖9人KCC2的DNA(SEQ ID NO1)和多肽(SEQ ID NO2)序列。
圖10小鼠KCC2的DNA(SEQ ID NO3)和(SEQ ID NO4)序列。
圖11大鼠KCC2的DNA(SEQ ID NO5)和多肽(SEQ ID NO6)序列。
圖12從采集自灌注了BDNF、NGF或常用的人造腦脊髓液的首次用于實驗的大鼠的切片中從片層I神經元測量的陰離子(氯化物和碳酸氫鹽)逆轉電位(E陰離子)的比較(ACSF；圖中的“對照”)。PNI-外周神經損傷。
圖13含片層I神經元的切片中測量的E陰離子比較，所述神經元采集自通過水浴應用(bath application)用針對TrkB(P/TrkBIgG)、H-89(P/H89)、K-252a(P/K252a)和KN-93(P/KN93)的抗體處理的PNI大鼠。PNI-外周神經損傷。
圖14用轉導BDNF(■)的腺病毒處理的大鼠和用轉導綠色熒光蛋白(○)的腺病毒處理的大鼠的觸覺刺激的傷害感受閾值之間的比較。
圖15用人重組NGF(10μg/天x×天)(■)和用鹽水載體(○)處理的大鼠的觸覺刺激的傷害感受閾值之間的比較。
圖16用中和性抗-TrkB抗體(抗-TrkB-IgG 12μg/2hrs×3)(■)處理的大鼠和只用載體處理的大鼠(○)的觸覺刺激的傷害感受閾值之間的比較。
圖17用PKA抑制劑H-89(380nmol)處理的大鼠(■)和只用載體處理的大鼠(○)的機械刺激的傷害感受閾值之間的比較。
發明詳述本文所述是外周神經損傷后去抑制的新機制。它涉及表面背角(SDH)片層(lamina)I神經元中陰離子體內穩態的跨突觸破壞，這是主要的脊髓傷害感受輸出途徑之一(7)。此處顯示了由此產生的跨膜陰離子梯度變化通常導致抑制性陰離子突觸電流興奮，基本上升高了片層I神經元的凈興奮性。正如此處所顯示的，外周神經損傷是通過信號跨突觸傳遞導致中樞神經系統(CNS)神經元中細胞內氯化物水平升高而被感知。此外，此處所述研究證實了降低CNS神經氯化物水平可逆轉此現象，正如通過完整大鼠中脊髓KCC2輸出子的局部阻斷或擊倒顯著降低了傷害感受閾值所顯示的，證明已報道過的片層I神經元中陰離子體內穩態的破壞足以引起神經性疼痛。
因此，本文描述的實驗通過研究外周神經損傷后的下游事件研究了傷害感受覺的機制。同樣的，本文還證明了所述事件是跨突觸傳遞的，例如，通過外周神經系統(PNS細胞或感覺纖維)傳遞至中樞神經系統(CNS)，在一個實施方案中，傳遞至脊髓神經元。此處進一步的研究證明了傷害感受信號的傳遞和疼痛的感覺最終受到CNS組織中細胞內氯化物水平調節的影響(例如，受諸如氯化鉀協同轉運蛋白KCC2的氯化物轉運蛋白調節)。KCC2(參閱綜述(37))是已在大鼠、小鼠和人中鑒定的氯化鉀協同轉運蛋白(對于人KCC可參閱2003年2月6日公布的Mount等人的美國專利申請序號20030027983)。小鼠中KCC2基因的純合和雜合破壞的研究揭示癲癇發作表型，提示KCC2在癲癇癥中的可能作用(38)。KCC2在CNS功能中的準確作用尚未完全了解。
申請人在此證明了CNS細胞或組織中細胞內氯化物水平(如，根據諸如KCC2等氯化物轉運蛋白的活性/表達)與傷害感受覺之間的相關性。正如以下實施例中所證明的，外周神經損傷(PNI)導致了CNS神經元(例如，脊髓，例如表面背角(SDH)片層I(L1)神經元)的興奮過度或敏化。這樣的興奮過度是跨突觸發生的(即，在受損外周神經元的下游)，這是在本文申請人的研究之前未描述的現象。這樣的興奮過度導致傷害感受閾值的降低。
正如此處所顯示的，上文提及的興奮過度與SDH中細胞內氯化物水平的提高相關(例如，氯化物轉運蛋白[諸如KCC2]的調節[例如，減少])。在這點上KCC2的作用通過將KCC2阻斷劑DIOA或KCC2反義寡核苷酸施用于脊髓組織發現二者均導致疼痛靈敏度閾值迅速降低來證實。因此，KCC2活性和/或表達的降低，如果導致了CNS神經元氯化物水平提高，就可能導致疼痛靈敏度閾值的降低，而且，相反的，KCC2活性和/或表達的增加或誘導，如果導致CNS神經元氯化物減少，就可能導致疼痛靈敏度閾值提高，從而起到了預防和治療疼痛的作用。另一方面，據報道，在某些病理生理條件下，例如，當[K+]o升高時，KCC2可能在神經元中積聚Cl-，從而提高神經元的興奮性(42)。在這樣的情況下，可預想KCC2對CNS神經元氯化物具有相反作用，從而導致CNS神經元氯化物的增加并又降低了傷害感受閾值并提高了疼痛的敏感性。同樣的，KCC2的活性和/或表達的調節可能取決于氯化物離子流動的方向性，促進或減輕疼痛感受。
因此，第一方面，本發明涉及治療疼痛的方法和材料，所述方法和材料基于CNS細胞內氯化物水平的調節以及氯化物轉運蛋白(例如KCC2氯化鉀協同轉運蛋白)活性和/或表達的進一步調節。用于此處時，“氯化物轉運蛋白”被定義為細胞膜結合的多肽/蛋白質或它們的復合體，所述轉運蛋白能實現氯化物陰離子穿過細胞膜。“輸出(輸出子)”指從細胞內向細胞外的凈穿過，“輸入(輸入子)”指從細胞外向細胞內的凈穿過。
因此，在一個實施方案中，本發明涉及通過降低例如CNS神經細胞等細胞的細胞內氯化物水平來治療疼痛的方法。在另一實施方案中，氯化物轉運蛋白(例如，KCC2)的調節劑可用于降低細胞內的氯化物水平。在一個實施方案中，本發明涉及以全身或局部應用降低CNS神經細胞中氯化物細胞內水平的化合物或藥物作為減輕疼痛的方法。為了達到此效果，上述化合物或藥物可調節CNS神經元中氯化物轉運蛋白(如，KCC2協同轉運蛋白)的功能或表達。在另一實施方案中，所述化合物或藥物可增加氯化物轉運蛋白或KCC2的表達或活性。
在一個實施方案中，其中細胞內氯化物水平正被調節的CNS神經細胞可定位于表面背角或脊髓。此外，所述細胞還可是外圍神經細胞或感覺纖維跨突觸的，疼痛信號來源于所述外圍神經細胞或感覺纖維。
在一個實施方案中，本發明還涉及急性和慢性疼痛的治療，更具體而言涉及神經性疼痛的治療。“神經性疼痛”(neuropathic pain)用于此處時指與神經損傷(例如，在神經擠壓、橫斷或壓縮后或疾病導致的神經衰退后)相關的慢性疼痛。在一個實施方案中，神經性疼痛是與神經或管道損傷相關的。在另一實施方案中，神經性疼痛是與內臟和/或軀體疼痛相關的。本發明還涉及降低CNS神經元氯化物的水平(例如，通過調節氯化物轉運蛋白[諸如KCC2]活性和/或表達)以減輕傷害感受。“傷害感受”用于此處指疼痛的感覺成分。疼痛可能是多種刺激的結果，所述刺激包括但不局限于，壓力、損傷、熱刺激或化學(例如，離子的)刺激。在實施方案中，所述疼痛可能與許多疾病相關，諸如慢性炎癥疼痛、與關節炎相關的疼痛、纖維肌痛、背痛、癌癥相關疼痛、消化系統疾病相關疼痛、克羅恩氏病相關疼痛、自身免疫病相關疼痛、內分泌病相關疼痛、糖尿病性神經病相關疼痛、幻肢疼痛、自發性疼痛、慢性術后疼痛、慢性顳下頜疼痛、灼痛、皰疹后神經痛、艾滋病相關疼痛、I型和II型復合性區域疼痛綜合癥、三叉神經痛、慢性背痛、與脊髓損傷相關的疼痛和/或周期性急性痛。本發明還涉及用于評估與CNS功能異常相關性疼痛的診斷和預測方法。在一個實施方案中，所述診斷/預測可在本文所述治療方法之前或在治療方案期間進行，以便進一步表征疼痛的特性或其發展，從而提供信息，其可用于，例如，根據從此類診斷/預測得到的結果選擇此類疼痛的治療方案。用于此處時，“與CNS功能異常相關的疼痛”涉及CNS組織中離子(例如，陰離子)體內穩態改變所引起的傷害感受。在一個實施方案中，所述陰離子是氯離子。在另一實施方案中，所述改變是CNS細胞中細胞內氯化物水平的提高。在另一實施方案中，當受試者經受CNS功能異常相關性疼痛時，氯化物轉運蛋白的活性或表達可被調節(例如，KCC2活性或表達可被調節[例如，下降])。
“KCC2”用于此處指表達于神經元的特定類型氯化鉀協同轉運蛋白。在實施方案中，KCC2包含SEQ ID NOs2(人KCC2；參閱圖9)、4(小鼠KCC2；參閱圖10)或6(大鼠KCC2；還參閱圖11)的多肽的序列、它們的片段或基本上與它們相同的序列。在另一實施方案中，KCC2由能編碼SEQ ID NO2、4或6的多肽或其片段的核酸序列或與它們基本上相同的序列或根據雜交標準相關的序列編碼(見下文)。在另一實施方案中，此類核酸序列包含SEQ ID NO1(人KCC2DNA；參閱圖9)、3(小鼠KCC2DNA；參閱圖10)或5(大鼠KCC2DNA；參閱圖11)、其片段或基本上與其相同的序列或根據雜交標準相關的序列(見下文)。
“氯化物轉運(蛋白)活性”用于此處指通過細胞膜轉運氯化物。這樣的轉運活性可用本領域已知的多種方法通過直接或間接的方式測量，其例子在本文中描述。“KCC2活性”用于此處指與KCC2相關的任何可檢測表型。在一個實施方案中，KCC2活性包括，但不局限于鉀運輸、氯化物運輸，它們可用例如膜片鉗方法、氯化物/鉀敏感染料(參閱例如Haugland，R.P.，Handbook of Fluorescent Probes and Research Products，第九版，2002，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，USA)電極等使用例如，逆轉電位測量評估出入細胞內和/或外的鉀和/或氯化物水平(直接或間接)來測定。此外，KCC2活性還可影響神經細胞的陰離子逆轉電位(E陰離子)。陰離子逆轉電位可用，例如，短桿菌肽穿孔的膜片鉗記錄來測定。
“氯化物轉運蛋白表達”(例如，KCC2表達)涉及氯化物轉運蛋白轉錄物(例如，KCC2轉錄物)或氯化物轉運蛋白多肽或蛋白質(例如，KCC2多肽或蛋白質)的產生。因此，在實施方案中，氯化物轉運蛋白的表達(例如，KCC2的表達)可通過直接評估蛋白質水平(例如，通過免疫組織化學和/或蛋白質印跡分析)確定或利用例如逆轉錄酶聚合酶鏈式反應[RT-PCR]方法、基于微陣列的方法或RNA印跡分析等測定編碼氯化物轉運蛋白的核酸的水平(例如，氯化物轉運蛋白編碼核酸，如氯化物轉運蛋白mRNA水平)。
能降低CNS神經細胞中細胞內氯化物水平的化合物可，例如，調節氯化物轉運蛋白活性和表達(例如，KCC2活性和表達)。在實施方案中，氯化物轉運蛋白活性或表達(例如，KCC2活性或表達)可增加。在一個實施方案中，這些化合物可以以使其接觸CNS組織或CNS細胞的方式施用。可應用的化合物包括，但不局限于，直接或間接改變蛋白質活性的化合物以及調節所述蛋白質產量和/或穩定性(例如，在轉錄、翻譯、成熟、翻譯后修飾、磷酸化和降解水平)的化合物。
一類所述化合物是通過調節KCC2上一個或多個位點起作用的化合物。據報道，克隆KCC2(20)時，KCC2不包含與PKA共有的磷酸化位點，但包含5個與PKC共有的磷酸化位點(Thr34、Ser728、Thr787、Ser940和Ser1034)。對酪氨酸蛋白磷酸化鑒定的一個共有位點(Tyr1081)在羧基末端。此酪氨酸激酶共有磷酸化作用位點不存在于KCC1或KCC4同種型中，但保留于KCC3蛋白質中(21)。同樣的，能上調或增加KCC2活性的化合物包括，但不局限于，蛋白質激酶抑制物(例如，N-乙基馬來酰亞胺(23-25)、星形胞菌素(29)和諸如K-252a的受體酪氨酸激酶抑制劑)；針對某些激酶或KCC2上激酶磷酸化位點產生的抗體或抗體片段；或者較直接(例如，能競爭KCC2上磷酸化位點的寡肽)或較不直接(例如，調節激酶活性和或表達的化合物)干擾KCC2磷酸化的化合物。在一個實施方案中，所述化合物可在介導磷酸化的信號途徑水平發揮作用并最終影響KCC2的磷酸化。在另一實施方案中，可調節TrkB以影響KCC2磷酸化并最終調節KCC2活性。因而，在一個實施方案中，抑制TrkB活性的化合物可，例如，應用于這一方面。這樣的化合物可包括，但不局限于，K-252a(可購自Calbiochem)或針對TrkB的中和抗體(抗-TrkB抗體[例如IgG](可購自BD Transduction Laboratories)。另一實施方案中，依賴cAMP的激酶或PKA的調節，例如抑制可用于調節KCC2的磷酸化并最終用于治療或預防疼痛。例如，PKA抑制劑H-89(可購自EMD Biosciences)可用于這方面。在另一實施方案中，鈣調蛋白依賴性激酶(CAM激酶，例如II和IV)的調節，例如抑制可通過調節KCC2的活性(例如磷酸化)減輕或預防受試者的疼痛。能抑制所述激酶的化合物包括，但不局限于，KN-93(可購自EMD Biosciences)。在另一實施方案中，TrkB途徑的其它成員，例如磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C或磷脂酰膽堿特異的磷脂酶C，例如，磷脂酶Cγ(PLCγ)的調節劑，例如抑制劑，可用于降低CNS神經細胞中的細胞內氯化物水平。這樣的化合物包括，但不局限于，三環癸-9-基-黃原酸、1-O-十八烷基-2-O-甲基-消旋-甘油基-3-磷酸膽堿、硫酸新霉素、四氫氯酸精胺、1-[6-((17β-3-甲氧基雌-1，3，5(10)-三烯-17-基)氨基)己基]-1H-吡咯-2，5-二酮或1-[6-((17β-3-甲氧基雌-1，3，5(10)-三烯-17-基)氨基)己基]-2，5-吡咯烷二酮。
此外，KCC2表達的調節還可起因于調節KCC2表達的轉錄因子的調節(例如，通過磷酸化介導的)。在另一方面，本發明提供了在受試者或動物中治療疼痛或預防/減輕傷害感受的方法，其包括調節，在實施方案中減少或降低CNS神經元或組織中的細胞內氯化物水平。在一個實施方案中，細胞內氯化物水平的所述降低是通過調節，例如降低受試者CNS神經元或組織中氯化物轉運蛋白(如，KCC2)的活性或表達來完成的。在另一實施方案中，受試者是脊椎動物。在又一實施方案中，受試者是哺乳動物，在更進一步的實施方案中，受試者是人。在一個實施方案中，CNS組織是脊髓組織，神經細胞是脊髓神經細胞。
因此，本發明提供了治療疼痛的方法，其包括對受試者施用能調節，在某些實施方案中，降低或減少CNS組織(如，CNS神經細胞)中細胞內氯化物水平。在一個實施方案中，所述調節作用，例如氯化物轉運蛋白(例如KCC2)活性和/或表達的增加導致了受試者中細胞內氯化物水平的降低。在一個實施方案中，所述CNS組織是脊髓，而所述神經細胞是脊髓神經細胞。
在一個實施方案中，KCC2包含與SEQ ID NO2、4、6所提出序列或其片段基本上相同的氨基酸序列。在另一實施方案中，KCC2可由與能夠編碼SEQ ID NO2、4、6或其片段的核苷酸序列基本上相同的核酸，諸如與SEQ ID NO1、3、5中提出的序列或其片段基本上相同的序列編碼。
如上所提及的，保持活性的KCC2的同源物、變體和/或片段也可用于本發明的方法中。同源物包括與KCC2的氨基酸序列基本上相同、與KCC2共有顯著的結構和功能同源性的蛋白質序列。變體包括，但不局限于，通過任何修飾以及/或者氨基酸替換、缺失或添加而與KCC2不同的蛋白質或肽。修飾可以在包括多肽主鏈(即氨基酸序列)、氨基酸側鏈和氨基或羧基末端在內的任何部位發生。這樣的替換、缺失或添加可能涉及一個或多個氨基酸。片段包括KCC2的片段或部分或者KCC2同源物或變體的片段或部分。
至于增加或上調細胞中KCC2的表達，可使用將編碼KCC2的核酸引入細胞中的多種方法，其實例描述如下。諸如下文討論的基因治療等方法可用于這一方面。編碼KCC2的核酸的例子包括能編碼SEQ ID NO2、4或6的多肽的核酸(例如SEQ ID NO1、3和5的核酸)或與它們基本上相同的核酸。所述方法還可包括通過例如移植或引入包含所述KCC2編碼核酸的神經細胞或其前體(例如，干細胞)對某一區域或神經組織(例如CNS組織)施用包含所述KCC2編碼核酸的細胞。此外，所述方法可能需要對受試者施用能調節，例如上調或增加KCC2表達的化合物。這樣的化合物可用例如下文所述篩選方法鑒別和表征。這種化合物可進一步作為含所述化合物和藥學可接受載體的組合物提供。在一個實施方案中，所述組合物被配制或改裝以便施用于CNS。這樣的化合物或組合物可以配備使用說明書的商業包裝提供。
“同源性”和“同源的”指兩個肽或兩個核酸分子之間的序列相似性。同源性可通過比較比對序列中各位置而確定。核酸之間或氨基酸序列之間的同源程度是在序列所共有位置處相同的或匹配的核苷酸或氨基酸數目的函數。當此術語用于此處時，如果兩個序列基本上相同且序列的功能活性是保守的，則認為該核酸序列是與另一序列“同源的”(用于此處時，術語“同源的”并不意味著進化相關的)。當兩個核酸序列進行最佳序列比對(允許缺口)時，如果它們共有至少大約50％的序列相似性或同一性，或者如果所述序列共有限定的功能基元，則認為這兩個核酸序列是基本上相同的。在備選的實施方案中，最佳比對的基本上相同序列的序列相似性可以是至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。用于此處時，序列之間給定的同源性百分數指示了任選比對序列中的序列同一性程度。“非相關”或“非同源的”序列與SEQ ID NO1至6中任一個共有少于40％的同一性，盡管優選少于大約25％的同一性。
基本上互補的核酸是其中一分子的“互補物”基本上與另一分子相同的核酸。用于同一性序列比較的最適序列比對可用多種算法進行，所述算法為諸如局部同源性算法(Smith和Waterman，1981，Adv.Appl Math2482)、同源性比對算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48443)、相似性搜索方法(Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444)和這些算法的計算機實現(諸如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在Wisconsin遺傳學軟件包中，GeneticsComputer Group，Madison，WI，U.S.A.)。序列同一性也可用BLAST算法確定，參閱Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-10(用已公布的默認設置)。進行BLAST分析的軟件可通過國家生物技術信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)獲得(通過互聯網址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。BLAST算法包括首先通過識別查詢序列中與數據庫序列中同樣長度序列進行比對時匹配或滿足某些正值閾值得分T的長度W的短字確定高得分序列對(HSPs)。T指臨近字得分閾值。最初的鄰近字采樣數作為起始搜尋的種子以發現更長的HSPs。只要累積比對得分增加，字采樣數就沿著各序列的兩個方向延伸。當遇到以下參數時，字采集點在各方向的延伸暫停累積比對得分從其獲得的最大值下降量X；由于一個或多個負得分殘基比對的積累，累積比對得分達到0或之下；或者到達了任一序列的末端。BLAST算法參數W、T和X確定了比對的靈敏度和速度。BLAST程序可使用默認值序列長度(W)11、BLOSUM62得分矩陣(Henikoff和Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915-10919)比對(B)50、期望值(E)10(或1或0.1或0.01或0.001或0.0001)、M＝5、N＝4以及兩條鏈的比較。利用BLAST算法進行的兩個序列之間統計學相似性的一個量度是最小總和概率(P(N))，它提供了兩個核苷酸或氨基酸序列之間會偶然存在匹配的可能性的指征。在本發明的備選實施方案中，如果在被檢測序列比較中最小總和概率小于大約1，優選小于大約0.1，更優選小于大約0.01，最優選小于大約0.001，則認為核苷酸或氨基酸序列基本上相同。
兩個核酸序列基本上互補的另一指征是兩序列在適度嚴格或優選嚴格的條件下相互雜交。在適度嚴格的條件下與濾膜結合序列的雜交可進行如下例如，在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中65℃進行雜交，并在0.2×SSC/0.1％SDS中于42℃漂洗(參閱Ausubel等(編輯)，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，Green PublishingAssociates，Inc.以及John Wiley & Sons，Inc.，New York，2.10.3)。或者，在嚴格條件下與濾膜結合序列的雜交可進行如下例如，在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA于65℃進行雜交，并在0.1×SSC/0.1％SDS于68℃漂洗(參閱Ausubel等(編輯)，1989，同上文)。雜交條件可依照已知方法根據目的序列而改變(參閱Tijssen，1993，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic AcidProbes，第一部分，第二章，″Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic acid probe assays″，Elsevier，紐約)。通常，嚴格條件選定為，在限定的離子強度和pH條件下較熱解鏈溫度低約5℃。
在另一方面，本發明還提供了減輕受試者中傷害感受的方法。在一個實施方案中，該方法包括調節，例如降低受試者細胞(例如，CNS細胞)中的細胞內氯化物水平。在另一實施方案中，所述方法還包括調節，例如增加氯化物轉運蛋白活性或表達，如，KCC2活性或表達。在另一實施方案中，所述方法還包括使CNS神經細胞與能調節氯化物轉運蛋白活性的化合物接觸。所述化合物包括，但不局限于，TrkB抑制劑(諸如K-252a或抗-TrkB抗體)、PKA抑制劑(諸如H-89)或CAM激酶抑制劑(諸如KN-93)。
本發明另外還提供了預防和/或治療疼痛的組合物，其包含與藥學可接受載體混合的能調節(例如，降低)細胞內氯化物水平的化合物。在一個實施方案中，這樣的組合物可調節，例如增加或上調氯化物轉運蛋白活性，例如，KCC2活性和/或表達。在一個實施方案中，這樣的組合物適合或適應施用于CNS神經細胞或組織，諸如脊髓組織或細胞。在另一實施方案中，這樣的組合物可以是KCC2表達或活性的誘導劑。用于此處時，“誘導劑”是直接或間接上調或增強KCC2基因的表達、KCC2mRNA的穩定性、KCC2mRNA的翻譯、KCC2多肽的成熟、轉運(例如，KCC2多肽對細胞膜的再循環)或KCC2多肽的轉運蛋白活性的化合物。在一個實施方案中，“誘導劑”也可以下調或抑制KCC2抑制劑。
本發明另外提供了能調節(例如，降低)細胞內氯化物水平以治療或預防疼痛的上述組合物或上述化合物的用途。本發明還提供了能調節(例如，降低)細胞內氯化物水平的上述組合物或上述化合物的用途，用于制備治療或預防疼痛的藥物。在一個實施方案中，所述化合物或組合物調節，例如增加或上調氯化物轉運蛋白(如，KCC2)活性和/或表達。在另一實施方案中，所述化合物或組合物可包括TrkB抑制劑(諸如K-252a或抗-TrkB抗體)、PKA抑制劑(諸如H-89)或CAM激酶抑制劑(諸如KN-93)。在另一實施方案中，所述藥物可配制成施用于受試者的CNS組織，例如CNS細胞。此外，所述化合物可以是，例如，KCC2表達或活性的誘導劑。
本發明還提供了商業包裝，其含有能調節(例如，降低)細胞內氯化物水平的化合物或上述組合物以及用于治療或預防疼痛的說明書。在一個實施方案中，所述化合物可調節(例如，增加或上調)氯化物轉運蛋白或KCC2活性和/或表達。
在多個實施方案中，能調節(例如降低)CNS細胞中細胞內氯化物水平的化合物可在治療上用于治療疼痛的制劑或藥物中。所述化合物可，例如，調節(例如增加或上調)氯化物轉運蛋白(例如，KCC2)的活性和/或表達。本發明還提供了相應的醫學治療方法，其中將能調節(在某些實施方案中降低)細胞內氯化物水平的化合物的治療劑量以藥學可接受的劑型施用。因此，本發明還提供了治療組合物，其含有能調節(在某些實施方案中降低)細胞內氯化物水平的化合物以及藥學可接受的賦形劑或載體。所述治療組合物在生理上可接受的pH條件下可溶于水性溶液。
在一個實施方案中，施用本發明的化合物使其與CNS組織或CNS神經元接觸。用于此處時，“中樞神經系統”或CNS是包括腦和脊髓(例如，在腰部區域)在內的神經系統的一部分。相反，“外周神經系統”或PNS是除了腦和脊髓之外的神經系統部分。在一個實施方案中，CNS組織是表面背角，在更進一步的實施方案中，CNS組織是片層I神經元。同樣的，在實施方案中，可通過直接顱內或鞘內注射或注射入腦脊髓液中施用本發明的化合物以體內處理CNS細胞。或者，所述化合物可以以能穿越血腦屏障和進入CNS的形式全身(例如，靜脈內或經口)施用。“神經的”和“神經元的”可互換用于此處，均涉及神經元和神經系統。
本發明還提供了藥物組合物(藥物)，其含有能調節(在一個實施方案中降低)CNS細胞中細胞內氯化物水平的化合物。在一個實施方案中，這樣的組合物包含足以治療或減輕疼痛的治療或預防有效量化合物以及藥學可接受載體。“治療有效量”指實現預期治療效果，諸如減輕疼痛必須的以劑量和時限有效的量。能調節(在某些實施方案中降低)CNS細胞中細胞內氯化物水平的化合物的治療有效量可根據以下因素而變化諸如個體的疾病狀態、年齡、性別、體重、和化合物在該個體中引起預期反應的能力。可調節劑量方案以提供最佳的治療反應。治療有效量也是治療有益效果超過該化合物的任何毒性或有害效果的量。“預防有效量”指實現諸如預防或抑制疼痛發作或疼痛嚴重程度增加等預期預防效果必須的以劑量和時限有效的量。預防有效量可按上述確定治療有效量的方法確定。對于任何具體的受試者而言，可根據個體需要以及施用組合物或者監督組合物施用的人員的專業推斷隨時間調節特定劑量方案。
用于此處時，“藥學可接受載體”或“賦形劑”包括生理上相容的任一和全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等等。在一個實施方案中，載體適于腸胃外施用。或者，載體可適于靜脈內、腹膜內、肌內、顱內、鞘內、舌下或經口施用。藥學可接受載體包括無菌水性溶液或分散劑和用于臨時制備無菌注射液或分散體的無菌粉劑。將所述介質和活性劑用于藥學活性物質是本領域眾所周知的。除非任一常規介質或活性劑與活性化合物不相容，否則它們均可預期用于本發明藥物組合物中。輔助的活性化合物也可摻入所述組合物中。
治療組合物通常必須在制備和貯存條件下是無菌和穩定的。所述組合物可配制成溶液劑、微乳液、脂質體或適于高藥物濃度的其它有序結構。所述載體可以是溶劑或分散介質，它們包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態聚乙二醇，等等)及其合適的混合物。例如，通過使用諸如卵磷脂的包衣，對于分散劑和使用表面活性劑的情況下通過保持所需的顆粒大小可以保持適當的流動性。在許多情況下，組合物中優選包括等滲劑，例如，糖、多元醇，諸如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。通過在組合物中包含例如單硬脂酸鹽和明膠等延遲吸收的活性劑可導致可注射組合物的吸收延長。此外，能調節(在一個實施方案中增加或上調)KCC2活性和/或表達的化合物可以以定時釋放制劑的形式施用，例如，以包含緩釋聚合物的組合物施用。活性化合物可與保護化合物免于快速釋放的載體制備，諸如控釋制劑，包括植入物和微膠囊化遞送系統。可使用生物可降解的、生物相容的聚合體，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。制備所述制劑的許多方法是已受專利權保護或通常對于本領域技術人員而言是已知的。
通過將必需量活性化合物(例如，能調節，在一個實施方案中降低CNS細胞中細胞內氯化物水平的化合物)與上文列舉的一種成分或多種成分的組合摻入適當溶劑中，然后無菌過濾制備無菌的可注射溶液。通常，通過將活性化合物摻入含有基本分散介質和上面列舉的所需的其它組分的無菌賦形劑中制備分散物。在用于無菌可注射溶液制備的無菌粉劑的情況中，優選的制備方法是真空干燥和凍干，它產生了活性成分粉末及其來自先前無菌過濾溶液的任何附加預期成分。依照本發明的另一方面，能調節(在一個實施方案中降低)CNS細胞中細胞內氯化物水平的化合物可與一種或多種增強其溶解度的附加化合物配制在一起。
依照本發明的另一方面，包含能調節(在一個實施方案中降低)CNS細胞中細胞內氯化物水平的化合物的本發明的治療組合物可以以容器或商業包裝的形式提供，所述容器或商業包裝還包括所述治療組合物用于治療疼痛的說明書。
由于細胞中降低的細胞內氯化物水平與氯化物轉運蛋白(KCC2)水平/活性的調節(例如增加)相關，且進一步與本文所述傷害感受減輕相關，所以本發明的另一方面是通過對受試者(例如，CNS組織)施用編碼KCC2的核酸分子或其保持KCC2活性的變體或片段來治療疼痛。合適的施用方法包括基因治療方法。
可用諸如直接注射DNA、受體介導的DNA吸收、病毒介導的轉染或非病毒轉染和基于脂質的轉染等方法在體內將本發明的核酸轉運至細胞，所有這些方法都涉及基因治療載體的使用。已利用直接注射將裸DNA在體內引入細胞中(參閱，例如Acsadi等(1991)Nature 332815-818；Wolff等(1990)Science 2471465-1468)。可使用在體內將DNA注射入細胞中的遞送裝置(例如“基因槍”)。這樣的裝置可通過商業途徑獲得(例如，來自BioRad)。裸DNA也可通過DNA與陽離子，諸如聚賴氨酸配合而被引入細胞中，所述陽離子可以偶聯細胞表面受體的配體(參閱，例如Wu，G.和Wu，C.H.(1988)J.Biol.Chem.26314621；Wilson等人(1992)J.Biol.Chem.267963-967；和美國專利申請5,166,320)。DNA-配體絡合物與受體的結合可通過受體介導的胞吞作用促進DNA的攝取。與破壞核內體的腺病毒衣殼連接，從而將物質釋放入胞質中的DNA-配體絡合物可用于避免絡合物被細胞內溶酶體所降解(參閱，例如Curiel等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888850；.Cristiano等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902122-2126)。
為了用作基因治療載體，對缺陷型逆轉錄病毒進行了很好的表征(綜述參閱Miller，A.D.(1990)Blood 76271)。用于產生重組逆轉錄病毒以及利用所述病毒在體外或體內感染細胞的方法可參閱文獻CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.等(編輯)Greene PublishingAssociates，(1989)，第9、10-9、14節，以及其它標準的實驗室手冊。適當的逆轉錄病毒的例子包括本領域技術人員眾所周知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。適當的包裝病毒系的例子包括.psi.Crip、.psi.Cre、.psi.2和.psi.Am。逆轉錄病毒已被用于在體外和/或體內將多種基因引入許多不同類型的細胞中，包括上皮細胞、內皮細胞、淋巴細胞、成肌細胞、肝細胞、骨髓細胞(參閱，例如Eglitis等(1985)Science 2301395-1398；Danos和Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 856460-6464；Wilson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 853014-3018；Armentano等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876141-6145；Huber等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888039-8043；Ferry等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888377-8381；Chowdhury等(1991)Science2541802-1805；van Beusechem等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA897640-7644；Kay等(1992)Human Gene Therapy 3641-647；Dai等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910892-10895；Hwu等(1993)J.Immunol.1504104-4115；美國專利4,868,116；美國專利4,980,286；國際專利申請WO89/07136；國際專利申請WO89/02468；國際專利申請WO89/05345和國際專利申請WO 92/07573)。
為了用作基因治療載體，可對腺病毒基因組進行處理使其編碼和表達本發明的多肽化合物，但在正常溶胞病毒生活周期中的復制能力失活。例子參閱Berkner等(1988)BioTechniques 6616；Rosenfeld等(1991)Science252431-434；和Rosenfeld等(1992)Cell 68143-155。來自腺病毒株Ad type5d1324或其它腺病毒株(例如Ad2，Ad3，Ad7等)的適當腺病毒載體是本領域技術人員眾所周知的。重組腺病毒的有利之處在于它們作為有效的基因轉運載體不需要分裂細胞，且可用于感染多種的細胞類型，包括呼吸道上皮細胞(Rosenfeld等(1992)見上文)、內皮細胞(Lemarchand等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896482-6486)、肝細胞(Herz和Gerard(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902812-2816)和肌細胞(Quantin等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892581-2584)。
腺伴隨病毒(AAV)可用作基因治療載體轉運DNA達到基因治療的目的。AAV是天然存在缺陷病毒，其需要另一病毒，諸如腺病毒或皰疹病毒作為輔助病毒用于有效復制和再生性生命周期(Muzyczka等Curr.Topicsin Micro.and Immunol.(1992)15897-129)。AAV可用于將DNA整合入非分裂細胞中(參閱例如Flotte等(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7349-356；Samulski等(1989)J.Virol.633822-3828；和McLaughlin等(1989)J.Virol.621963-1973)。諸如Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.5.3251-3260)所述AAV載體可用于將DNA引入細胞中(參閱，例如Hermonat等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA816466-6470；Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.42072-2081；Wondisford等(1988)Mol.Endocrinol.232-39；Tratschin等(1984)J.Virol.51611-619；和Flotte等(1993)J.Biol.Chem.2683781-3790)。慢病毒(Lentiviral)基因治療載體也適于用于本發明中。
基因治療的通用方法是本領域所已知的。參閱，例如，Anderson等人的美國專利5,399,346。用于遞送遺傳物質的生物相容的膠囊可參閱Baetge等人的國際專利申請WO 95/05452。將基因轉移入造血細胞的方法先前也有報道(參閱Clapp，D.W.等，Blood 781132-1139(1991)；Anderson，Science288627-9(2000)；和Cavazzana-Calvo等，Science 288669-72(2000))。本發明還涉及移植方法，其用于在受試者中引入含有能編碼KCC2的核酸的細胞，或在受試者中引入已在體外或先體外后體內用能降低細胞內氯化物水平的化合物處理過的細胞(例如，通過在含有所述化合物的適宜培養基在培養該細胞)。在一個實施方案中，這樣的細胞是神經細胞或其前體，例如能發育/分化成神經細胞的干細胞(神經祖細胞)。涉及神經干細胞分離、增殖、表征和/或移植的方法參閱文獻，例如，美國專利5,851,832；5,968,829；5,411,883；5,750,376；6,040,180；5,753,506和6,001,654。核酸可存在于如上所述載體中，該載體通過如上所述方法在體外被引入細胞中。在一個實施方案中，所述細胞是自體的且獲自所述受試者。在某些實施方案中，所述細胞是異源或異種的。
由于CNS細胞中細胞內氯化物水平和疼痛之間具有相關性，所以能調節(例如降低)CNS細胞中細胞內氯化物水平的化合物可用于預防和治療疼痛。在一個實施方案中，可用調節(例如增加或上調)氯化物轉運蛋白(例如KCC2)活性/表達的化合物降低細胞內氯化物水平并最終預防或治療疼痛。因此，本發明還涉及用于鑒定和表征能調節細胞內氯化物水平和/或氯化物轉運蛋白活性和/或表達的篩選方法。因此，本發明還提供了確定候選化合物是否能調節細胞內氯化物水平并因此用于預防和治療疼痛的方法。在一個實施方案中，所述方法包括將CNS來源的細胞接觸所述候選化合物并測定在受試化合物存在的條件下細胞內氯化物水平是否下降。細胞內氯化物水平的下降表明受試化合物可用于治療或預防疼痛。用于此處時，“CNS來源的細胞”是分離或來自CNS組織的細胞，在實施方案中既包括初級神經元培養物，又包括永生的神經元細胞系，以及被接受的體外神經元模型系統(例如，在體外分化成神經元的細胞)。在一個實施方案中，上述細胞具有氯化物轉運蛋白或KCC2活性。在另一實施方案中，所述細胞內源性表達氯化物轉運蛋白(例如，KCC2)。在又一實施方案中，上述細胞已被基因工程化以表達氯化物轉運蛋白基因或KCC2基因。在一個實施方案中，所述細胞可以是含有外來引入氯化物轉運蛋白(諸如KCC2)來源的適當宿主細胞。可通過將編碼氯化物轉運蛋白或KCC2的核酸序列引入宿主細胞并提供所述核酸表達所需的條件來制備這種宿主細胞。在一個實施方案中，這樣的核酸是DNA。所述宿主細胞可以是真核的，諸如兩棲動物或哺乳動物細胞。在一個實施方案中，這樣的宿主細胞是人的細胞。
本發明還提供了用于鑒定或表征對治療和預防疼痛有效的藥物的另一種方法。在一個實施方案中，所述方法包括將CNS來源的細胞接觸候選化合物并測定在受試化合物存在的條件下氯化物轉運蛋白的活性是否被調節。氯化物轉運蛋白活性的調節，例如增加表明受試化合物可用于治療或預防疼痛。在一個實施方案中，該氯化物轉運蛋白是KCC2。KCC2的活性可通過例如測量鉀運輸、氯化物運輸、細胞內氯化物水平和陰離子逆轉電位來確定。
對于一種受試化合物或數種受試化合物或受試化合物文庫(例如，組合文庫)而言都可應用上述方法。在后一種情況下，也可鑒定和表征化合物組合所產生的協同作用。上述化合物可用于預防和/或治療疼痛，或可用作先導化合物用于開發和檢測具有改良的特異性、功效和/或藥理學(例如藥物動力學)特性的其它化合物。在一個實施方案中，所述化合物可以是前體藥物，其在例如CNS組織(例如，脊髓)等適當的作用位點轉換成活性形式。在某些實施方案中，本發明的篩選/檢測方法中的一個或多個步驟可以自動化。
如上所述，本發明還涉及用于鑒定和表征能調節(在某些實施方案中增加)氯化物轉運蛋白(例如KCC2)基因表達的化合物的方法。這樣的方法可包括在受試化合物存在或缺失的條件下檢測氯化物轉運蛋白(例如KCC2)的基因表達。這樣的基因表達可通過檢測相應的RNA或蛋白質，或者通過使用適報道構建體來檢測，其中所述構建體含有通常與所述氯化物轉運蛋白或KCC2基因結合的轉錄調節元件，所述基因有效連接報道基因。當第一種核酸序列與第二種核酸序列在功能上相關時，第一種核酸序列可以“有效連接”第二種核酸序列。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表達，則啟動子有效連接編碼序列。通常，有效連接的DNA序列在讀框中是相鄰的，且在必要的情況下連接兩個蛋白質編碼區。不過，由于例如增強子通常在與啟動子間隔數千個堿基的情況下仍能發揮作用且內含子序列可能是不同長度的，所以某些多核苷酸元件可以有效連接但不是相鄰的。“轉錄調節元件”是一個指誘導或調節與其有效連接的蛋白質編碼序列轉錄的DNA序列的一般術語，諸如起始和終止信號、增強子和啟動子、剪接信號、聚腺苷酸化信號。這種報道基因的表達可在轉錄或翻譯水平上進行測量，例如，通過檢測所產生的RNA或蛋白質的量。RNA可通過例如RNA印跡或逆轉錄酶-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法分析(參閱，例如Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork，USA)。蛋白質水平可用親和試劑(例如，抗體或其片段[方法參閱例如Harlow，E.和Lane，D(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY]；結合蛋白質的配體)或通過其它特性(例如在綠色熒光蛋白的情況下是熒光)直接檢測，或者通過測量可能使其具有酶活性從而產生可檢測產物(例如，具有改變的分光光度特性)或可檢測表型(例如細胞生長的變化)的蛋白質活性進行測定。合適的報道基因包括，但不局限于，氯霉素乙酰轉移酶、β-D-半乳糖苷酶、螢光素酶或綠色熒光蛋白。在一個實施方案中，候選化合物可進一步被檢測以確定其是否能調節氯化物轉運蛋白介導的過程(例如KCC2介導的過程)或氯化物轉運蛋白活性(例如KCC2活性)。在一個實施方案中，這樣的氯化物轉運蛋白介導的過程是離子轉運，例如鉀或氯化物轉運，通過例如評估鉀和/或氯化物水平(例如細胞內的)或通過測量陰離子逆轉電位(電生理學)、膜電位來測定，例如下文實施例中所描述的。
本發明還涉及疼痛的診斷和預測。在一個實施方案中，疼痛是由受試者神經系統(例如中樞神經系統)中離子(例如陰離子或氯化物)內穩態的變化所引起的。不被任何具體理論所束縛，從中樞神經系統(CNS)神經元輸出鉀和氯化物能力的降低可能導致持久的神經元超興奮性和最終導致疼痛。
本發明由此提供了用于診斷或預測與CNS功能異常相關的疼痛的方法。用于此處時，“CNS功能異常”是CNS中神經元離子內穩態的變化。在一個實施方案中，與所述CNS功能異常相關的疼痛是神經性疼痛。在一個實施方案中，所述方法包括測定CNS神經細胞中的細胞內氯化物水平并將該氯化物水平與相應的對照水平進行比較。在此具體方法中，檢測水平相對于對照水平的增加表明受試者正經受CNS功能異常相關性疼痛。在一個實施方案中，所述方法可以包括確定CNS氯化物轉運蛋白活性或表達(例如，KCC2活性或表達)相對于對照活性或表達而言是否被調節，例如上調或增加。在另一實施方案中，對照氯化物水平可選自已建立的標準、較早時間測定的受試者中相應的氯化物水平、當受試者經受疼痛較輕(相對于上文提及的當前傷害感受而言)或基本上無疼痛時在所述受試者中測定的相應氯化物水平；或者當對照受試者經受疼痛較輕(相對于上文提及的測試組受試者中當前傷害感受而言)或基本上無疼痛時在對照受試者中測定的相應氯化物水平。在一個實施方案中，經受疼痛較輕或基本上無疼痛的受試者或對照受試者未呈現出明顯的中樞或外周神經系統損傷(例如，神經性疼痛)或持續的疼痛。在另一實施方案中，對照活性或表達可選自已KCC2活性或表達的建立的標準、在較早時間測定的受試者中KCC2活性或表達的相應水平、當受試者傷害感受較輕(如上所述)或基本上無疼痛時測定的受試者中KCC2活性或表達的相應水平、或者在所經受傷害感受較輕(如上所述)或基本上無疼痛的對照受試者中測定的KCC2活性或表達的相應水平。在一個實施方案中，KCC2的活性可如上所述測定。
例如，通過對受試者施用能接觸該受試者CNS神經細胞的指示劑化合物(諸如指示氯化物水平的化合物)可測定細胞內的氯化物水平。在施用指示劑化合物后，可進行與該指示劑化合物相關的體內信號評估。在一個實施方案中，可以使用指示劑化合物，諸如放射性核素(例如，鉈-201(201Tl)、99Tcm-tetrofosmin、99Tcm-MIBI或99mTc-HMPAO或它們的氯化物綴合物)或指示KCC2表達的化合物(諸如基于免疫檢測的試劑(例如，針對KCC2多肽的抗體、單鏈抗體或Fab片段))。在另一實施方案中，指示劑化合物通過靜脈內注射時可穿過血腦屏障并積累于類似于鉀的CNS神經元中，即反應鉀水平。在另一實施方案中，所述放射性核素(例如201Tl)的劑量可以是大約100MBq(3mCi)。在另一實施方案中，放射性核素(例如201Tl)可在進行SPECT成像之前15-20分鐘注射。注射指示劑化合物后，可采用成像技術評估體內與指示劑化合物相關的信號。這樣的成像技術包括，但不局限于，單光子發射計算機層析X射線照相術(SPECT)、正電子發射層析X射線照相術和/或磁共振成像。成像技術可評估指示劑化合物的體內信號，諸如神經鉀梯度。圖象可通過，例如，用裝備有高分辨率(5-7mm)瞄準儀并連接了專用計算機系統的γ照相機獲得。在一個實施方案中，可在180°弧獲得連續投影圖像。在另一實施方案中，神經元的放射性核素(例如201Tl)滯留可表示為滯留指數(RI)。“滯留指數”按本文所述定義為(延時滯留-早期滯留)×100/早期滯留。
在一個實施方案中，“滯留指數”的“滯留”在此定義為在某一時間內被特定組織保留的指示劑化合物(例如，示蹤物或放射性核素)的量。在另一實施方案中，在延時滯留之前評估早期滯留。在又一實施方案中，測量CNS組織中滯留指數。
在一個實施方案中，上文提及的診斷/預測方法可與上文提及的治療/預防方法聯合進行，用于預防或治療受試者中與CNS功能異常相關的疼痛。所述方法因此包括CNS功能異常相關疼痛的診斷或預測，且根據診斷/預測，降低受試者中CNS細胞的細胞內氯化物水平從而預防或治療疼痛。
盡管本文描述了多種實施方案，但可依照本領域技術人員共有的常規知識在本發明范圍內進行許多改變和修飾。這樣的修飾包括為了以基本上相同的方式達到相同的效果針對本發明任一方面的已知等價方案的替代。數字范圍包括定義該范圍的數字。在權利要求中，單詞“包含”被用作一個開放的術語，基本上等同于短語“包括，但不局限于”。以下實施例是對本發明各個方面的舉例說明，而非限制本文所公開的本發明的廣泛方面。在整篇申請中，引用了許多文獻以便更完整的描述本發明所屬的領域。這些參考文獻的公開因此作為參考并入本公開。
實施例實施例1方法神經損傷簡而言之，如文獻所述(16)通過外科手術在成年雄性Spague-Dawley大鼠的坐骨神經周圍植入聚乙烯套(長～2mm，內徑0.7mm)。還有一組大鼠也接受假手術。只有顯示出機械閾值(在14-17天中)逐漸降低至2.0g或更少的動物才用于進一步的實驗。
行為檢測如文獻所述(17)檢測傷害感受消退反射的熱和機械閾值。
切片制備如文獻所述(9)從成年(大于50天)雄性大鼠制備脊髓旁矢狀面切片(300-350μm)。用含以下成分(mM)的人造腦脊髓液(ACSF)不斷澆注切片(2-3ml/分鐘)126NaCl，2.6NaHCO3，10葡萄糖，2.5KCl，2CaCl2，2MgCl2，1.25NaH2PO4，0.001TTX(通入95％O2-5％CO2，pH～7.4)；當測量GABAA/GlyR-介導的電流時，加入10μM 6-氰基-7-硝基喹喔啉-2，3-二酮(CNQX)和40μM D2-氨基-5-膦酰基戊酸(APV)以阻斷快速的谷氨酸能傳遞。
記錄為了進行穿孔膜片鉗(perforated patch)記錄，在移液器頭上吸滿含以下成分的溶液(mM)130葡糖酸銫(CsGluc)，5CsCl，2MgCl2，11BAPTA鈣螯合劑(緩沖液)，1CaCl2，4ATP，0.4GTP，10HEPES(pH～7.4)。移液器回吸補充了25μg/ml短桿菌肽D(短桿菌肽貯存液是溶于DMSO中10mg/ml)的相同溶液。當接入電阻(access resistance)穩定在25-45MQ之間時選擇此方式的記錄。為了進行全細胞電壓鉗記錄，使移液器吸滿無短桿菌肽D的上述溶液。類似的，用吸了電壓鉗所用溶液的相同的細胞內溶液進行全細胞電流鉗記錄，不同之處在于用甲基硫酸鉀(KMeSOe)代替CsGluc。為了在0mV夾住E陰離子，在細胞內溶液中用110mM CsCl代替CsGluc。所有E陰離子＝0mV時的全細胞記錄都是在Vm＝-60mV且存在GluR阻斷劑的條件下進行的。用板式微量移液器(patch micropipette)通過壓力噴射局部應用GABA 30-250ms。如文獻所述(9)進行數據采集和PSC分析。若非特別指明，所有的測量以平均值±SEM給出。用斯氏t-檢驗比較平均值的統計學顯著性、卡方檢驗檢測相依表以及混合設計ANOVAs(post-hoc-Tukey′s HSD)檢測重復測量的統計學顯著性。
鈣成像如上文關于電生理分析從PNI和首次用于實驗的大鼠制備切片。在ACSF中孵育15分鐘后，在切片裝入溶于HEPES緩沖鹽水(+10％DMSO)的10μM Fura-2-AM(熒光測定鈣指示劑，AM＝乙酸基甲基)1小時。先用ACSF漂洗切片～15分鐘再固定于記錄室中，在記錄室中繼續對切片澆注ACSF(2-3ml/分鐘)。用裝備了表面熒光光學系統的Zeiss Axioscope熒光檢測[Ca2+]i。用與CCD照相機連接的TILL Photonics單色儀獲取圖像并在清楚的明顯神經元細胞體中標出目的區域(用于定量)。
免疫印跡從PNI和首次用于實驗的成年大鼠二者的腰膨大制備SDH水平切片(150μm)。通過用特氟隆研杵在含以下成分的緩沖液中勻漿制備組織提取物0.32M蔗糖，0.5mM Tris-HCl，pH 7.5，2mM二乙胺四乙酸(EDTA)，2.5mM β-巰基乙醇和蛋白酶抑制劑的混合物(CompleteTM，RocheDiagnostics)。收集3,000g(20分鐘)和10,000g(30分鐘)離心的上清液。將稀釋于樣品緩沖液中的等量蛋白質(20μg/泳道)在37℃預熱30分鐘，用SDS-PAGE解析，并電印跡至硝酸纖維素膜上。將膜在溶于TBST緩沖液(150mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH 7.4，0.05％Tween-20)的5％脫脂干奶中封閉30分鐘并在4℃與兔抗KCC2抗體(1∶1000，Upstate Biotechnology)孵育過夜。用TBST漂洗數次后，將膜與過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體(1∶2000)一起在室溫孵育30分鐘。用Super Signal FemtoTM(PierceBiotechnology)檢測化學發光條帶。用VersaDocTM成像系統(BioRad)捕捉數碼圖像并用QuantityOneTM軟件(BioRad)分析數據。
寡脫氧核糖核苷酸如文獻所述(18)設計在所有位置硫代磷酸酯化的KCC2反義和合成的寡脫氧核糖核苷酸反義5′-TCTCCTTGGGATTGCCGTCA-3′(SEQ IDNO7；相對于ATG起始信號+59處)；合成的寡脫氧核糖核苷酸5′-TCTTCTTGAGACTGCAGTCA-3′(SEQ ID NO8)。
鞘內注射至少在藥物施用前三天，如文獻所述(11)用戊巴比妥鈉(65mg/kg)麻醉大鼠并將腰脊椎導管插入鞘內空間。簡而言之，在大池處產生一個小開口，將導管插入蛛網膜下空間并從尾部徑直前進～8cm至脊髓的腰膨大。從外科手術恢復后，通過鞘內(i.t.)注射利多卡因(2％，30μl)誘導下身麻痹從而證實正確的導管定位。只有對利多卡因呈現出適當的短暫麻痹現象以及無運動缺陷的動物被用于行為試驗。在施用藥物/載體后，處死動物并解剖它們的脊柱以在視覺上證實導管的正確放置。藥物包括DIOA(10-30μg，在0.9％NaCl，10％DMSO中)和寡脫氧核糖核苷酸(每劑2μg，0小時、12小時和24小時各一劑；0.9％NaCl)。如上所述進行行為試驗，在接受藥物或載體之前，在首次用于實驗的大鼠中證實了消退反應的正常(～15g)機械閾值。在所使用的劑量時，根據抓握、直立和放置反射以及行為觀察(17)評估發現沒有化合物產生運動干擾或鎮靜。
計算機模擬(參閱圖5)所有的模擬都通過NEURON 4.3.1基于(19)利用具有形態學和被動膜(passive membrane)性質的普通脊髓片層I紡錘狀神經元的區室模型進行。將最多分叉至第四級且軸突與文獻(19)所述相似的樹突附著于軀體。基于(30)的快速Na+和延遲的整流器K+電流分別以0.1和0.01S/cm2插入軀體和軸突起始段及節點處，形成尖峰的電壓閾值是-49mV。兩套抑制性突觸隨機分布于周圍體細胞區(perisomatic region)，而四套興奮性突觸則在更末梢，每一套都通過獨立的Poisson方法以文獻(31)和(32)外推的速率驅動。
電子顯微術(參閱圖6)
如文獻(35)所述處理組織用于超結構分析。簡而言之，先用0.9％NaCl，后用含4％多聚甲醛(Sigma-Aldrich，德國)的固定液從主動脈弓灌注大鼠。灌注后，除去脊髓，解剖冠狀阻滯，然后低溫保護切下60μm薄的切片并液氮凍融，用磷酸緩沖液漂洗數次后在初次抗血清中孵育。在含2％牛血清白蛋白(BSA)的封閉液中孵育后，將切片在兔抗KCC2(1∶500，UpstateBiotechnology，USA)中4℃孵育48小時。充分洗滌后，將切片在1nm金綴合的抗兔二級抗體(1∶250，Aurion)中4℃孵育12小時，隨后銀強化(SE-EM，Aurion)。將切片用0.5％OsO4處理(20min)，梯度乙醇中脫水，然后在氧化丙烯中脫水，并包埋于Durcupan ACM(Fluka)中。超切片后(Ultracut UCT，Leica，德國)，用電子顯微鏡(Philips Tecnai 12，配備了MegaViewTMCCD照相機)檢查樣本。用電鏡分析非連續(間隔＞3μm)超薄切片。隨機選擇具有突觸特征的小結并用片層I和II及白質分析KCC2蛋白質的表達(36)。
鞘內施用K-252a(參閱圖8)用25μl含10％DMSO的0.9％NaCl溶液配制K-252a。通過在大池產生一個小的開口并將P10聚乙烯管插入蛛網膜下空間-從尾部徑直～8cm至脊髓的腰膨大處，從而完成鞘內導管插入術。
實施例2結果通過長期壓縮坐骨神經誘導外周神經病(圖1a)。為了檢測外周神經損傷(PNI)后的SDH神經元的超興奮性(致敏)是否與陰離子梯度(陰離子)的變化相關，用穿孔短桿菌肽膜片鉗記錄檢測陰離子逆轉電位(E陰離子)。此技術避免了細胞內陰離子濃度的破壞(8)。對外源GABA應用的反應顯示來自PNI大鼠片層I(LI)神經元的陰離子逆轉電位(E陰離子)是-49.0±2.3mV(范圍-40至-62.2mV，n＝9)，相比，來自首次用于實驗的大鼠LI神經元的陰離子逆轉電位為-72.6±3.5mV(范圍-63.0到-79.9mV，n＝5；p＜0.005)(圖1b-d)。PNI(-62±4mV，n＝7)和首次用于實驗的大鼠LI神經元(-61±2mV，n＝16；p＞0.1)之間的靜息膜電位無顯著的差異。在快速谷氨酸受體(GluR)阻斷劑存在條件下從PNI大鼠LI神經元記錄的自發和激發的突觸后電流(PSCs)也是內向的(從靜止去極化)，它們的平均逆轉電位相對于首次用于實驗的大鼠片層I神經元中的逆轉電位而言提高了16.1mV(n＝6，PNI；n＝4，首次用于實驗的)。
然后研究PNI后SDH中突觸傳遞的其它特性是否改變。即使從局部抑制性中間神經元共釋放出GABA和甘氨酸，僅甘氨酸受體(GlyR)也能介導首次用于實驗的大鼠的LI神經元中的抑制性小型PSCs(mPSCs)(9；圖2a)。而在所有來自PNI大鼠的被檢測細胞中，GluR-介導的mPSC均未受PNI的影響(圖2b)，在GlyR拮抗劑馬錢子堿存在的條件下持續出現0mV外向的一群mPSC(最大1μm；n＝4)。這些殘留的mPSC是由GABAARs介導的，因為它們被荷包牡丹堿(10μM)所阻斷并且與GlyR介導的組分相比呈現出延長的衰減動力學(τD(GABAAR)＝34.0±2.9ms，n＝5相對于τD(GlyR)＝11.3±1.3ms，n＝6；p＜0.01；圖2C)。
動力學分析進一步顯示出mPSC的36.9±2.3％衰減期遵循雙指數函數(dual exponential function)(τD1＝7.5±2.0ms且τD2＝51.3±7.9ms；n＝6；圖2c)。這些事件具有GABAAR和GlyR介導的成分，因為馬錢子堿或荷包牡丹堿都可導致它們相應成分的消除(n＝4)。因此，與陰離子衰減相并行，PNI引起了LI突觸處的再組織，從而暴露出除了GlyR單獨介導的mPSC之外由GABAAR單獨介導以及混合GABAAR/GlyR-介導的mPSC。此突觸組織與不成熟LI-II神經元中觀察到的類似(9)。此突觸開關的凈效果是它產生了一組具有顯著較長的衰減動力學的量子突觸事件。
為了檢查PNI-誘導的GABAAR-介導的對mPSC的貢獻，我們分析了峰電導和mPSC的頻率。此操作的完成是利用填充了CsCl的移液器夾住來自PNI和首次用于實驗的大鼠的LI神經元在0mV的E陰離子以防止由于驅動力改變而導致的mPSC的有偏檢測。在來自PNI大鼠的LI神經元中記錄到的僅GlyR的mPSC的峰電導明顯小于(～1/2)從首次用于實驗的大鼠LI神經元記錄得到的數據(圖2d)。不過，在PNI條件下增加GABAAR-介導的事件部分補償了僅GlyR時電導的降低。GluR介導的量子事件的峰電導在來自首次用于實驗的大鼠和PNI大鼠的LI神經元之間無顯著差異(圖2d)。
通過對峰電導、動力學和驅動力改變的綜合因素分析，在來自PNI大鼠的LI神經元中靜息膜電位上GlyR單獨介導的mPSC攜帶的凈電荷大約為首次用于實驗的大鼠中的1/3(圖2e)。不過，在有GABAAR貢獻的情況下，PNI大鼠中mPSC所攜帶的凈電荷回升至首次用于實驗的大鼠中GlyR介導的水平。此結果顯示，盡管大小相當，但是首次用于實驗的大鼠LI神經元中超極化電荷只是由GlyR-介導的mPSC攜帶，而在PNI大鼠LI神經元中，由于GABAAR-介導的mPSC衰減動力學的延長，去極化電荷主要是通過GABAAR轉移。
據觀察在來自PNI大鼠的LI神經元記錄到的僅GlyR mPSC的頻率(0.13±0.04Hz，n＝5)顯著低于首次用于實驗的大鼠LI神經元在僅GlyR的mPSC頻率(0.18±0.04Hz，n＝6；p＜0.05；圖2f)。不過，如同峰電導一樣，GABAAR-介導的mPSC的加入補償了PNI-導致的頻率減小(0.22±0.10Hz，n＝4，對于所有GABAAR和/或GlyR-介導的事件組合而言，p＞0.5)。相反，分離自PNI大鼠的LI神經元中的GluR介導的事件頻率(1.51±0.90Hz，n＝9)與分離自首次用于實驗的大鼠的LI神經元中的(0.82±40Hz，n＝S；p＞0.3；圖2f)相比較無顯著變化。
如果去極化GABAAR/GlyR-介導的突觸后電流在PNI LI神經元中產生凈興奮作用，它們應直接引起動作電位，并因此導致Ca2+內向通量。為了檢驗這一假設，我們利用切片中負荷fura-2-am的LI神經元進行Ca2+成像以獲得大數據集。對神經元體施用外源GABA在PNI部位身體同側的19％LI神經元中導致了細胞內Ca2+([Ca2+]i)濃度的顯著增加(n＝53；圖3a，c)。這代表與首次用于實驗的大鼠和/或對側背角中發現的LI神經元相比增加了7倍，其中在被檢測的37個神經元中只觀察到1個具有針對GABA施用而產生的[Ca2+]i增加(圖3b、c)。這些反應可以被荷包牡丹堿(10μM；n＝5)以及電壓敏感鈉通道阻斷劑河豚毒素(TTX；1μM；n＝31)所阻斷。然后我們進一步從電生理學上證實了應用的GABA和突觸引起的陰離子突觸后電位可直接引起動作電位(圖3d、e)。這些結果表明突觸后陰離子內向通量可在PNI大鼠的片層I神經元中引起凈興奮。我們然后通過對SDH的水平切片進行免疫印跡比較了KCC2蛋白質水平。相對于受傷部位的對側而言，在PNI同側的腰SDH中KCC2表達水平顯著降低(＞2倍)(圖3f)。在首次用于實驗的大鼠中，兩側之間無顯著的差異(n＝3)。
如果KCC2轉運蛋白表達的減少導致神經元[Cl-]i的增加并，又導致了GABAAR-介導的去極化作用，那么在來自首次用于實驗的大鼠LI神經元中KCC2轉運蛋白的藥理學阻斷應具有相同的效果。為了檢測此可能性，我們對首次用于實驗的脊髓切片水浴應用選擇性的KCC2阻斷劑DIOA(30μM)。如在PNI情況中，DIOA存在時應用GABA引起30％被檢測的首次用于實驗的LI神經元中[Ca2+]i增加(圖3b、c)。為了檢查憑經驗確定的GABAAR/GlyR-介導的突觸后控制的變化是否足以導致PNI之后中樞敏化，我們利用就生物物理學而言逼真的神經元模型模擬體內情況(圖5)。模擬證實PNI之后，LI神經元敏化的程度隨它們的E陰離子而變，從輕微的去抑制至凈超興奮變化。
為了檢測此超興奮性(敏化)是否將導致引起傷害感受消退反射的刺激閾值的降低，我們通過鞘內導管將DIOA(15-30μg)直接施用于完整大鼠中脊椎的腰膨大處。DIOA導致了針對對機械和熱刺激物的傷害感受閾值快速且可逆的降低(圖4a-b)。通過脊髓施用針對KCC2mRNA的反義寡脫氧核苷酸選擇性擊倒(knock-down)所述轉運蛋白，也得到了傷害感受閾值的相似降低(圖4e)，更進一步證實了KCC2下調的功能性影響。
如圖7中所示，我們證實了在取自患外周神經病大鼠的片層I神經細胞中，跨膜陰離子逆轉電位(E陰離子)的去極化程度顯著高于取自首次用于實驗的大鼠的片層I神經元中的E陰離子。記錄自首次用于實驗的大鼠片層I神經元的陰離子(碳酸氫鹽和氯化物)逆轉電位(E陰離子)顯著小于從已接受外周神經損傷(PNI)的大鼠的片層I神經元中記錄的E陰離子。水浴應用(bath application)BDNF(50ng/ml；N/BDNF)和NGF(50ng/ml；N/NGF)二者都導致記錄自首次用于實驗的大鼠片層I神經元的E陰離子變得顯著去極化，標志著跨膜陰離子梯度的衰減。或者，對取自PNI大鼠的片層I神經元水浴應用TrkB拮抗劑K-252a(200nM；P/K252a)導致E陰離子超極化至與取自首次用于實驗的大鼠片層I神經元中觀察到的相似的水平。所有的E陰離子值都利用短桿菌肽-D穿孔膜片電壓鉗記錄得以證實。如上文所提及的，此去極化E陰離子是由于在取自神經病大鼠的片層I神經元中KCC2協同轉運蛋白表達下降所導致的。在取自首次用于實驗的大鼠的片層I神經元中，本文進一步表明可通過灌注生長因子NGF和BDNF顯著去極化E陰離子，表明這些生長因子可降低表面背角中KCC2蛋白質的功能和/或表達。或者，本文表明在取自神經病大鼠的片層I神經元中用蛋白激酶抑制劑K-252a阻斷BDNF受體TrkB逆轉了E陰離子的去極化，使該值回復到與首次用于實驗的大鼠片層I神經元中觀察到的相似的水平。此外，如在圖8中所示的，鞘內施用受體酪氨酸激酶抑制劑K-252a(6nM)(而非只注射載體)在已接受外周神經損傷的大鼠中導致觸覺傷害感受消退的閾值提高。因此K-252a可在外周神經損傷后外周神經再發育之后逆轉痛覺過敏/異常性疼痛。根據抓握、直立和放置反射以及行為觀察進行評估，K-252a不產生任何運動干擾或鎮靜作用。預計，此抑制劑通過阻斷磷酸化再次激活了取自神經病大鼠的片層I神經元中KCC2協同轉運蛋白，所述磷酸化可能是在轉運蛋白或其轉錄因子(或其它調節底物)上蛋白質酪氨酸激酶位點處。
此處的結果表明，PNI后導致疼痛的神經病變可通過KCC2exporter下調和脊髓LI神經元中陰離子的所得變化來解釋。它們還證實了在成年動物中所述陰離子的改變可發生于損傷部位跨突觸的神經元中。早先為了鑒定外圍神經病超興奮特性潛在底物所作的努力都集中于測量GABA能中間神經元的數目、GABA含量或GABAAR表達的改變。結果是矛盾的(3-6)。本文所介紹的發現提供了了解所述去抑制機制的新途徑。通過陰離子的變化，GABAAR/GlyR-介導的突觸后作用的轉變提供了中樞敏化(centralsensitization)的機械基礎，包括神經元反應性和興奮輸入的增加。
脊髓的重要特征是它利用了兩條非常不同的GABA能抑制機制感覺纖維中樞末端的GABA能控制涉及去極化機制(39)，與GABA能抑制作用涉及超極化的背角細胞相反。因此，此處所報道的KCC2表達的變化只影響了控制感覺輸入的兩種抑制機制中一種的GABA活動的極性。這一點通過初級傳入缺乏KCC2表達這一事實得以證實(圖4f、g；也參閱圖6)。
GABA/甘氨酸介導的去極化作用也可用作門控機制使得可通過電壓敏感的Ca2+通道(VSCC)和NMDA受體/通道激活(10)。經由這些通道的Ca2+內向通量被認為對于脊髓神經元的敏化是重要的(11)。確實，已證實在神經性疼痛的治療中通過諸如加巴噴丁和氯胺酮等藥物阻斷人體內的這些Ca2+通道非常有效(12-14)。不過，使用Ca2+通道阻斷劑，尤其是氯胺酮和其它NMDA拮抗劑，是與許多不希望的副作用相關的(14，15)。
實施例3-KCC2的體外TrkB-依賴性調節制備來自首次用于實驗的大鼠或PNI大鼠背角的旁矢狀面切片(250-300μm)。用加氧的林格溶液持續灌注切片并在進行進一步處理前將切片平衡至少1.5小時。除非另外說明，用10μM CNQX-一種非NMDA離子型谷氨酸受體的阻斷劑進一步灌注切片。用短桿菌肽-D穿孔膜片或全細胞電壓膜片鉗記錄儀對肉眼可識別的片層I神經元進行記錄。在兩種情況下，用移液器吸取含甲基硫酸鉀或葡糖酸銫的細胞內溶液作為主要的離子類型。通過對目的神經元體連續短暫(5-10ms)應用外源GABA來檢測E陰離子；通過操縱神經元的膜電位，將GABA既不引起內向也不引起外向陰離子電流的點作為E陰離子。對液體接點電位、移液器偏移量和電阻校正膜電位的所有測量。
如圖12中所示，腦源神經營養因子(BDNF；50ng/ml浴中)介導的TrkB活化和神經生長因子(NGF；50ng/ml浴中)介導的TrkA活化均在首次用于實驗的大鼠片層I神經元中導致陰離子逆轉電位(E陰離子)顯著的去極化作用。
利用取自外周神經損傷(PNI)大鼠的切片，其中E陰離子是慢性去極化的，應用與TrkB受體偶聯的細胞內途徑組分的多種抑制劑，發現這引起了E陰離子(碳酸氫鹽和氯化物)顯著的超極化，其程度達到了與在首次用于實驗的大鼠切片中觀察到的相似的水平(圖13)。導致此效果的活性劑包括，但不局限于，針對TrkB的抗體(抗-TrkB-IgG 1μg/ml浴中)；K-252a(TrkA/B自磷酸化的抑制劑(200nM溶液))；H-89，依賴cAMP的激酶(PKA)的膜滲透性抑制劑(15μM浴中))；以及KN-93(鈣調蛋白依賴性激酶II和IV的膜可滲透性抑制劑(5μM浴中))。
實施例4-體內傷害感受閾值的TrkB-依賴型調節用于通過鞘內導管局部脊髓遞送的所有藥物都溶于加有或未加10％v/v DMSO的0.9％NaCl中。通過在大池產生一個小的開口并將一短的P10聚乙烯管插入蛛網膜下空間-從尾部徑直～8cm至脊髓的腰膨大(L4-5)，完成鞘內導管插入術。根據通過抓握、直立和放置反射以及其它行為觀察所進行的評估，施用的藥物都不產生運動干擾或鎮靜作用。利如前所述(41)用Von Frey試驗評估機械刺激的50％消退閾值。所有的實驗都在完整成年Sprague-Dawley大鼠中進行。
利用鞘內導管局部脊髓遞送多種活性劑可鑒定導致首次用于實驗的大鼠中觸覺刺激的傷害感受閾值下降或提高PNI大鼠中傷害感受閾值的幾種化合物。
局部脊髓遞送轉導BDNF(圖14)或人重組BDNF(10μg/天，共6天)的腺病毒而不是轉導綠色熒光蛋白的腺病毒導致首次用于實驗的大鼠中機械刺激的傷害感受閾值顯著降低。同樣的，鞘內遞送人重組NGF(圖15；10μg/天，共6天)至首次用于實驗的大鼠導致所述傷害感受閾值非常相似的降低。
另一方面，通過鞘內導管對PNI大鼠連續施用針對TrkB的抗體(抗-TrkB-IgG 12μg/2小時，共3次)實現對機械刺激的傷害感受閾值顯著提高(圖16)。局部脊髓遞送PKA抑制劑H-89(380nmol)也導致傷害感受閾值的提高(圖17)。
在整篇申請書中，引用了多種文獻，它們更完整地描述了本發明所屬領域的狀況。這些文獻的公開在此引用作為本公開的參考。
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<221>CDS<222>(86)..(3433)<400>3gagcaagcga gcgagcggag aaggcgggca gaggggcgcg ggcgaagcgg cgcagccatc 60ccgagcccgg cgccgcgcag ccacc atg ctc aac aac ctg acg gac tgc gag 112Met Leu Asn Asn Leu Thr Asp Cys Glu1 5gac ggc gat ggg gga gcc aac ccc ggt gat ggc aac ccc aaa gag agc 160Asp Gly Asp Gly Gly Ala Asn Pro Gly Asp Gly Asn Pro Lys Glu Ser10 15 20 25agt ccc ttc atc aac agc acg gac acg gag aag ggc aga gag tac gat 208Ser Pro Phe Ile Asn Ser Thr Asp Thr Glu Lys Gly Arg Glu Tyr Asp30 35 40ggc agg aac atg gcc ctg ttt gag gag gag atg gac acc agc ccc atg 256Gly Arg Asn Met Ala Leu Phe Glu Glu Glu Met Asp Thr Ser Pro Met45 50 55gta tcc tcc ctg ctc agt ggg ctg gcc aac tac acc aac cta ccc cag 304Val Ser Ser Leu Leu Ser Gly Leu Ala Asn Tyr Thr Asn Leu Pro Gln60 65 70gga agt aga gag cat gaa gaa gca gaa aat aat gag ggt gga aaa aag 352Gly Ser Arg Glu His Glu Glu Ala Glu Asn Asn Glu Gly Gly Lys Lys75 80 85aag ccg gtg cag gct cct cga atg ggc acc ttc atg ggt gtg tac ctg 400Lys Pro Val Gln Ala Pro Arg Met Gly Thr Phe Met Gly Val Tyr Leu90 95 100 105ccg tgc ctg cag aac atc ttt ggt gtc atc ctc ttc ctg cgg ctc acg 448Pro Cys Leu Gln Asn Ile Phe Gly Val Ile Leu Phe Leu Arg Leu Thr110 115 120tgg gtg gtg ggc atc gcg ggc atc atg gag tcc ttc tgt atg gtc ttc 496Trp Val Val Gly Ile Ala Gly Ile Met Glu Ser Phe Cys Met Val Phe125 130 135
att tgc tgc tcc tgt acg atg ctc aca gcc att tcc atg agt gca atc 544Ile Cys Cys Ser Cys Thr Met Leu Thr Ala Ile Ser Met Ser Ala Ile140 145 150gca acc aat ggt gtt gtg cct gct ggt ggc tcg tac tac atg att tcc 592Ala Thr Asn Gly Val Val Pro Ala Gly Gly Ser Tyr Tyr Met Ile Ser155 160 165agg tct ctg ggc ccg gag ttt ggg ggc gcc gtg ggc ctc tgc ttc tac 640Arg Ser Leu Gly Pro Glu Phe Gly Gly Ala Val Gly Leu Cys Phe Tyr170 175 180 185ctg ggc acc acc ttt gct ggg gct atg tac atc ctt ggc acg atc gag 688Leu Gly Thr Thr Phe Ala Gly Ala Met Tyr Ile Leu Gly Thr Ile Glu190 195 200atc ctg ctg gct tat ctc ttc cca gct atg gcc atc ttc aag gca gaa 736Ile Leu Leu Ala Tyr Leu Phe Pro Ala Met Ala Ile Phe Lys Ala Glu205 210 215gat gcc agt ggg gag gcg gcc gcc atg ctg aac aac atg cgg gtg tat 784Asp Ala Ser Gly Glu Ala Ala Ala Met Leu Asn Asn Met Arg Val Tyr220 225 230ggc acc tgt gtg ctc acc tgc atg gcc acc gtt gtc ttt gtg ggt gtc 832Gly Thr Cys Val Leu Thr Cys Met Ala Thr Val Val Phe Val Gly Val235 240 245aag tac gtc aac aag ttt gcc ttg gtc ttc ctg ggt tgc gtc atc ctg 880Lys Tyr Val Asn Lys Phe Ala Leu ValPhe Leu Gly Cys Val Ile Leu250 255 260 265tcc atc ctg gcc atc tat gca ggg gtc atc aag tct gcc ttc gac cca 928Ser Ile Leu Ala Ile Tyr Ala Gly Val Ile Lys Ser Ala Phe Asp Pro270 275 280ccc aat ttc ccg atc tgc ctc ctg ggg aac cgc acg ctg tct cgc cat 976Pro Asn Phe Pro Ile Cys Leu Leu Gly Asn Arg Thr Leu Ser Arg His285 290 295ggc ttt gat gtc tgt gcc aag ctg gct tgg gaa gga aat gag aca gtg 1024Gly Phe Asp Val Cys Ala Lys Leu Ala Trp Glu Gly Asn Glu Thr Val300 305 310acc aca cgg ctc tgg ggc ctt ttc tgc tcc tcc cgc ctc ctc aat gcc 1072Thr Thr Arg Leu Trp Gly Leu Phe Cys Ser Ser Arg Leu Leu Asn Ala315 320 325
acc tgt gat gag tac ttc acc cga aac aat gtc aca gag atc cag ggc 1120Thr Cys Asp Glu Tyr Phe Thr Arg Asn Asn Val Thr Glu Ile Gln Gly330 335 340 345att cct ggt gct gcc agt ggt ctc atc aaa gag aac ctg tgg agt tct 1168lle Pro Gly Ala Ala Ser Gly Leu Ile Lys Glu Asn Leu Trp Ser Ser350 355 360tac ctg acc aaa ggg gtg att gtc gag agg cgt ggg atg ccc tct gtg 1216Tyr Leu Thr Lys Gly Val Ile Val Glu Arg Arg Gly Met Pro Ser Val365 370 375ggc ctg gca gac ggt acc ccc gta gac atg gac cac ccc tat gtc ttc 1264Gly Leu Ala Asp Gly Thr Pro Val Asp Met Asp His Pro Tyr Val Phe380 385 390agt gat atg acc tcc tac ttc acc ctg ctc gtt ggt atc tac ttc ccc 1312Ser Asp Met Thr Ser Tyr Phe Thr Leu Leu Val Gly Ile Tyr Phe Pro395 400 405tca gtc aca ggg atc atg gct ggc tca aac cga tct gga gac ctg cgg 1360Ser Val Thr Gly Ile Met Ala Gly Ser Asn Arg Ser Gly Asp Leu Arg410 415 420 425gat gcc cag aag tct atc cct act gga act atc ctg gcc att gct acc 1408Asp Ala Gln Lys Ser Ile Pro Thr Gly Thr Ile Leu Ala Ile Ala Thr430 435 440acc tct gct gtc tac atc agc tct gtt gtt ctg ttt gga gcc tgc atc 1456Thr Ser Ala Val Tyr Ile Ser Ser Val Val Leu Phe Gly Ala Cys Ile445 450 455gag ggg gtc gtc tta cgg gac aag ttt ggg gaa gct gtg aat ggc aac 1504Glu Gly Val Val Leu Arg Asp Lys Phe Gly Glu Ala Val Asn Gly Asn460 465 470ttg gtg gtg ggc acc ctg gcc tgg cct tct ccc tgg gtc atc gtc ata 1552Leu Val Val Gly Thr Leu Ala Trp Pro Ser Pro Trp Val Ile Val Ile475 480 485ggc tct ttc ttc tct acc tgt ggg gct gga tta cag agc ctc aca ggg 1600Gly Ser Phe Phe Ser Thr Cys Gly Ala Gly Leu Gln Ser Leu Thr Gly490 495 500 505gcc cca cgt ctg ctg cag gcc atc tcc cgg gat ggc ata gtg ccc ttc 1648Ala Pro Arg Leu Leu Gln Ala Ile Ser Arg Asp Gly Ile Val Pro Phe510 515 520ctg cag gtc ttt ggc cat ggc aaa gct aat gga gag cca acc tgg gcg 1696
Leu Gln Val Phe Gly His Gly Lys Ala Asn Gly Glu Pro Thr Trp Ala525 530 535ctg ctg ctg act gcc tgc atc tgt gag atc ggc atc ctc ata gcc tcc 1744Leu Leu Leu Thr Ala Cys Ile Cys Glu Ile Gly Ile Leu Ile Ala Ser540 545 550ctg gat gag gtc gcc cct ata ctt tcc atg ttc ttc cta atg tgt tac 1792Leu Asp Glu Val Ala Pro Ile Leu Ser Met Phe Phe Leu Met Cys Tyr555 560 565atg ttt gtg aac ttg gct tgt gcg gtg cag acg ctg ctg agg aca ccc 1840Met Phe Val Asn Leu Ala Cys Ala Val Gln Thr Leu Leu Arg Thr Pro570 575 580 585aac tgg agg cca cga ttt cgc tat tac cac tgg act ctc tcc ttc ctg 1888Asn Trp Arg Pro Arg Phe Arg Tyr Tyr His Trp Thr Leu Ser Phe Leu590 595 600ggc atg agc ctc tgc ctg gcc ctc atg ttc att tgc tcc tgg tac tac 1936Gly Met Ser Leu Cys Leu Ala Leu Met Phe Ile Cys Ser Trp Tyr Tyr605 610 615gca ctg gtg gcc atg ctc att gcc gga ctc att tat aag tac atc gag 1984Ala Leu Val Ala Met Leu Ile Ala Gly Leu Ile Tyr Lys Tyr Ile Glu620 625 630tac cgg ggg gcg gag aag gag tgg ggg gat gga atc cga ggc ctg tct 2032Tyr Arg Gly Ala Glu Lys Glu Trp Gly Asp Gly Ile Arg Gly Leu Ser635 640 645ctc agt gca gca cgc tat gct ctc ttg cgc ctg gag gaa gga cct ccg 2080Leu Ser Ala Ala Arg Tyr Ala Leu Leu Arg Leu Glu Glu Gly Pro Pro650 655 660 665cat acg aag aac tgg agg ccc cag ctg ctg gtg ctg gtg cgt gtg gac 2128His Thr Lys Asn Trp Arg Pro Gln Leu Leu Val Leu Val Arg Val Asp670 675 680cag gat cag aac gtg gtg cat ccg cag ctg ctc tcc ctg acc tcc cag 2176Gln Asp Gln Asn Val Val His Pro Gln Leu Leu Ser Leu Thr Ser Gln685 690 695ctc aag gca ggg aag ggc ctg acc att gtg ggc tcc gtc ctt gag ggc 2224Leu Lys Ala Gly Lys Gly Leu Thr Ile Val Gly Ser Val Leu Glu Gly700 705 710acc ttt ctg gac aac cat cca cag gct cag cgg gca gag gag tct atc 2272Thr Phe Leu Asp Asn His Pro Gln Ala Gln Arg Ala Glu Glu Ser Ile
715 720 725agg cgc ctg atg gag gct gag aag gtg aag ggc ttc tgc cag gta gtg 2320Arg Arg Leu Met Glu Ala Glu Lys Val Lys Gly Phe Cys Gln Val Val730 735 740 745atc tcc tcc aac ctg cgt gat ggt gtg tcc cac ctg atc cag tct ggg 2368Ile Ser Ser Asn Leu Arg Asp Gly Val Ser His Leu Ile Gln Ser Gly750 755 760ggc ctc ggg gga ttg caa cac aat acc gtg ctg gtg ggc tgg cct cgc 2416Gly Leu Gly Gly Leu Gln His Asn Thr Val Leu Val Gly Trp Pro Arg765 770 775aac tgg agg cag aag gag gat cat cag aca tgg agg aac ttc atc gaa 2464Asn Trp Arg Gln Lys Glu Asp His Gln Thr Trp Arg Asn Phe Ile Glu780 785 790ctg gtc cgg gaa act aca gcc ggc cac ctc gcc ctg ctg gtc acc aag 2512Leu Val Arg Glu Thr Thr Ala Gly His Leu Ala Leu Leu Val Thr Lys795 800 805aat gtt tcc atg ttt ccc ggg aac cct gag cgc ttc tcg gag ggc agc 2560Asn Val Ser Met Phe Pro Gly Asn Pro Glu Arg Phe Ser Glu Gly Ser810 815 820 825att gac gtg tgg tgg att gtg cac gac ggg ggc atg ctc atg ctg ctg 2608Ile Asp Val Trp Trp Ile Val His Asp Gly Gly Met Leu Met Leu Leu830 835 840ccc ttc ctg ctg cga cac cac aag gtc tgg agg aaa tgc aaa atg cgg 2656Pro Phe Leu Leu Arg His His Lys Val Trp Arg Lys Cys Lys Met Arg845 850 855atc ttc acc gtg gcc cag atg gac gat aac agt atc cag atg aag aag 2704Ile Phe Thr Val Ala Gln Met Asp Asp Asn Ser Ile Gln Met Lys Lys860 865 870gac ctg acc acg ttt ctg tac cac tta cgc att act gca gag gtg gag 2752Asp Leu Thr Thr Phe Leu Tyr His Leu Arg Ile Thr Ala Glu Val Glu875 880 885gtg gtg gag atg cat gag agc gac atc tcg gca tac acc tac gag aag 2800Val Val Glu Met His Glu Ser Asp Ile Ser Ala Tyr Thr Tyr Glu Lys890 895 900 905aca tta gta atg gag caa cga tct cag atc ctc aaa cag atg cac ctc 2848Thr Leu Val Met Glu Gln Arg Ser Gln Ile Leu Lys Gln Met His Leu910 915 920
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ggc cga gag gtc atc acc atc tac tcc tga aggccaggac ctgccactcc 3453Gly Arg Glu Val Ile Thr Ile Tyr Ser1110 1115ggcccgagcg cgcccggccc gcggccccca gagccctcgc cgcgcctccc cgccgctgtc3513accgtttaca taagacccag ttgcccatgc cctggcccct ttccttcccg ctgcctgcag3573ccctgaggcc ttgcccgtcg gggctgaccc gcagggcggc ccgtgaggcc ccttttctga3633gcctggcctc gccccgccgg agc3656<210>4<211>1115<212>PRT<213>小鼠<400>4Met Leu Asn Asn Leu Thr Asp Cys Glu Asp Gly Asp Gly Gly Ala Asn1 5 10 15Pro Gly Asp Gly Asn Pro Lys Glu Ser Ser Pro Phe Ile Asn Ser Thr20 25 30Asp Thr Glu Lys Gly Arg Glu Tyr Asp Gly Arg Asn Met Ala Leu Phe35 40 45Glu Glu Glu Met Asp Thr Ser Pro Met Val Ser Ser Leu Leu Ser Gly50 55 60Leu Ala Asn Tyr Thr Asn Leu Pro Gln Gly Ser Arg Glu His Glu Glu65 70 75 80Ala Glu Asn Asn Glu Gly Gly Lys Lys Lys Pro Val Gln Ala Pro Arg85 90 95Met Gly Thr Phe Met Gly Val Tyr Leu Pro Cys Leu Gln Asn Ile Phe100 105 110Gly Val Ile Leu Phe Leu Arg Leu Thr Trp Val Val Gly Ile Ala Gly
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Phe Cys Ser Ser Arg Leu Leu Asn Ala Thr Cys Asp Glu Tyr Phe Thr325 330 335Arg Asn Asn Val Thr Glu Ile Gln Gly Ile Pro Gly Ala Ala Ser Gly340 345 350Leu Ile Lys Glu Asn Leu Trp Ser Ser Tyr Leu Thr Lys Gly Val Ile355 360 365Val Glu Arg Arg Gly Met Pro Ser Val Gly Leu Ala Asp Gly Thr Pro370 375 380Val Asp Met Asp His Pro Tyr Val Phe Ser Asp Met Thr Ser Tyr Phe385 390 395 400Thr Leu Leu Val Gly Ile Tyr Phe Pro Ser Val Thr Gly Ile Met Ala405 410 415Gly Ser Asn Arg Ser Gly Asp Leu Arg Asp Ala Gln Lys Ser Ile Pro420 425 430Thr Gly Thr Ile Leu Ala Ile Ala Thr Thr Ser Ala Val Tyr Ile Ser435 440 445Ser Val Val Leu Phe Gly Ala Cys Ile Glu Gly Val Val Leu Arg Asp450 455 460Lys Phe Gly Glu Ala Val Asn Gly Asn Leu Val Val Gly Thr Leu Ala465 470 475 480Trp Pro Ser Pro Trp Val Ile Val Ile Gly Ser Phe Phe Ser Thr Cys485 490 495Gly Ala Gly Leu Gln Ser Leu Thr Gly Ala Pro Arg Leu Leu Gln Ala500 505 510
Ile Ser Arg Asp Gly Ile Val Pro Phe Leu Gln Val Phe Gly His Gly515 520 525Lys Ala Asn Gly Glu Pro Thr Trp Ala Leu Leu Leu Thr Ala Cys Ile530 535 540Cys Glu Ile Gly Ile Leu Ile Ala Ser Leu Asp Glu Val Ala Pro Ile545 550 555 560Leu Ser Met Phe Phe Leu Met Cys Tyr Met Phe Val Asn Leu Ala Cys565 570 575Ala Val Gln Thr Leu Leu Arg Thr Pro Asn Trp Arg Pro Arg Phe Arg580 585 590Tyr Tyr His Trp Thr Leu Ser Phe Leu Gly Met Ser Leu Cys Leu Ala595 600 605Leu Met Phe Ile Cys Ser Trp Tyr Tyr Ala Leu Val Ala Met Leu Ile610 615 620Ala Gly Leu Ile Tyr Lys Tyr Ile Glu Tyr Arg Gly Ala Glu Lys Glu625 630 635 640Trp Gly Asp Gly Ile Arg Gly Leu Ser Leu Ser Ala Ala Arg Tyr Ala645 650 655Leu Leu Arg Leu Glu Glu Gly Pro Pro His Thr Lys Asn Trp Arg Pro660 665 670Gln Leu Leu Val Leu Val Arg Val Asp Gln Asp Gln Asn Val Val His675 680 685Pro Gln Leu Leu Ser Leu Thr Ser Gln Leu Lys Ala Gly Lys Gly Leu690 695 700
Thr Ile Val Gly Ser Val Leu Glu Gly Thr Phe Leu Asp Asn His Pro705 710 715 720Gln Ala Gln Arg Ala Glu Glu Ser Ile Arg Arg Leu Met Glu Ala Glu725 730 735Lys Val Lys Gly Phe Cys Gln Val Val Ile Ser Ser Asn Leu Arg Asp740 745 750Gly Val Ser His Leu Ile Gln Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gln His755 760 765Asn Thr Val Leu Val Gly Trp Pro Arg Asn Trp Arg Gln Lys Glu Asp770 775 780His Gln Thr Trp Arg Asn Phe Ile Glu Leu Val Arg Glu Thr Thr Ala785 790 795 800Gly His Leu Ala Leu Leu Val Thr Lys Asn Val Ser Met Phe Pro Gly805 810 815Asn Pro Glu Arg Phe Ser Glu Gly Ser Ile Asp Val Trp Trp Ile Val820 825 830His Asp Gly Gly Met Leu Met Leu Leu Pro Phe Leu Leu Arg His His835 840 845Lys Val Trp Arg Lys Cys Lys Met Arg Ile Phe Thr Val Ala Gln Met850 855 860Asp Asp Asn Ser Ile Gln Met Lys Lys Asp Leu Thr Thr Phe Leu Tyr865 870 875 880His Leu Arg Ile Thr Ala Glu Val Glu Val Val Glu Met His Glu Ser885 890 895Asp Ile Ser Ala Tyr Thr Tyr Glu Lys Thr Leu Val Met Glu Gln Arg
900 905 910Ser Gln Ile Leu Lys Gln Met His Leu Thr Lys Asn Glu Arg Glu Arg915 920 925Glu Ile Gln Ser Ile Thr Asp Glu Ser Arg Gly Ser Ile Arg Arg Lys930 935 940Asn Pro Ala Asn Pro Arg Leu Arg Leu Asn Val Pro Glu Glu Thr Ala945 950 955 960Cys Asp Asn Glu Glu Lys Pro Glu Glu Glu Val Gln Leu Ile His Asp965 970 975Gln Ser Ala Pro Ser Cys Pro Ser Ser Ser Pro Ser Pro Gly Glu Glu980 985 990Pro Glu Gly Glu Arg Glu Thr Asp Pro Glu Val His Leu Thr Trp Thr995 1000 1005Lys Asp Lys Ser Val Ala Glu Lys Asn Lys Gly Pro Ser Pro Val1010 1015 1020Ser Ser Glu Gly Ile Lys Asp Phe Phe Ser Met Lys Pro Glu Trp1025 1030 1035Glu Asn Leu Asn Gln Ser Asn Val Arg Arg Met His Thr Ala Val1040 1045 1050Arg Leu Asn Glu Val Ile Val Asn Lys Ser Arg Asp Ala Lys Leu1055 1060 1065Val Leu Leu Asn Met Pro Gly Pro Pro Arg Asn Arg Asn Gly Asp1070 1075 1080Glu Asn Tyr Met Glu Phe Leu Glu Val Leu Thr Glu Gln Leu Asp1085 1090 1095
Arg Val Met Leu Val Arg Gly Gly Gly Arg Glu Val Ile Thr Ile1100 1105 1110Tyr Ser1115<210>5<211>5566<212>DNA<213>大鼠(Rattus norvegicus)<220>
<221>CDS<222>(116)..(3466)<400>5ccgctccacg gagagcaagc gacagagctc gagcaagcga gcgagcggcg aaggcgggca60gaggggcgcg ggcgaagagg cgcagccatc ccgagcccgg cgccgcgcag ccacc atg 118Met1ctc aac aac ctg acg gac tgc gag gac ggc gat ggg gga gcc aac ccg 166Leu Asn Asn Leu Thr Asp Cys Glu Asp Gly Asp Gly Gly Ala Asn Pro5 10 15ggt gac ggc aat ccc aag gag agc agc ccc ttc atc aac agc acg gac 214Gly Asp Gly Asn Pro Lys Glu Ser Ser Pro Phe Ile Asn Ser Thr Asp20 25 30acg gag aag ggg aga gag tat gat ggc agg aac atg gcc ctg ttt gag 262Thr Glu Lys Gly Arg Glu Tyr Asp Gly Arg Asn Met Ala Leu Phe Glu35 40 45gag gag atg gac acc agc ccc atg gta tcc tcc ctg ctc agt ggg ctg 310Glu Glu Met Asp Thr Ser Pro Met Val Ser Ser Leu Leu Ser Gly Leu50 55 60 65gcc aac tac acc aac ctg cct cag gga agc aaa gag cac gaa gaa gca 358Ala Asn Tyr Thr Asn Leu Pro Gln Gly Ser Lys Glu His Glu Glu Ala70 75 80gaa aac aat gag ggc gga aag aag aag ccg gtg cag gcc cca cgc atg 406Glu Asn Asn Glu Gly Gly Lys Lys Lys Pro Val Gln Ala Pro Arg Met
85 90 95ggc acc ttc atg ggc gtg tac ctc ccg tgc ctg cag aac atc ttt ggt 454Gly Thr Phe Met Gly Val Tyr Leu Pro Cys Leu Gln Asn Ile Phe Gly100 105 110gtt atc ctc ttt ctg cgg ctc act tgg gtg gtg gga atc gca ggc atc 502Val Ile Leu Phe Leu Arg Leu Thr Trp Val Val Gly Ile Ala Gly Ile115 120 125atg gag tcc ttc tgc atg gtc ttc atc tgc tgc tcc tgc acg atg ctc 550Met Glu Ser Phe Cys Met Val Phe Ile Cys Cys Ser Cys Thr Met Leu130 135 140 145aca gcc att tcc atg agc gca att gca acc aat ggt gtt gtg cct gct 598Thr Ala Ile Ser Met Ser Ala Ile Ala Thr Asn Gly Val Val Pro Ala150 155 160ggt ggc tcc tac tac atg att tcc agg tct ctg ggc ccg gag ttt ggg 646Gly Gly Ser Tyr Tyr Met Ile Ser Arg Ser Leu Gly Pro Glu Phe Gly165 170 175ggc gcc gtg ggc ctc tgc ttc tac ctg ggc act acc ttt gct ggg gct 694Gly Ala Val Gly Leu Cys Phe Tyr Leu Gly Thr Thr Phe Ala Gly Ala180 185 190atg tac atc ctg ggc acc atc gag atc ctg ctg gct tac ctc ttc cca 742Met Tyr Ile Leu Gly Thr Ile Glu Ile Leu Leu Ala Tyr Leu Phe Pro195 200 205gcg atg gcc atc ttc aag gca gaa gat gcc agt ggg gag gca gcc gcc 790Ala Met Ala Ile Phe Lys Ala Glu Asp Ala Ser Gly Glu Ala Ala Ala210 215 220 225atg ttg aat aac atg cgg gtg tat ggc acc tgt gtg ctc acc tgc atg 838Met Leu Asn Asn Met Arg Val Tyr Gly Thr Cys Val Leu Thr Cys Met230 235 240gcc acc gta gtc ttt gtg ggc gtc aag tac gtg aac aag ttt gcc ctg 886Ala Thr Val Val Phe Val Gly Val Lys Tyr Val Asn Lys Phe Ala Leu245 250 255gtc ttc ctg ggt tgc gtg atc ctc tcc atc ctg gcc atc tac gca ggg 934Val Phe Leu Gly Cys Val Ile Leu Ser Ile Leu Ala Ile Tyr Ala Gly260 265 270gtc atc aag tct gcc ttc gat cca ccc aat ttc ccg att tgc ctc ctg 982Val Ile Lys Ser Ala Phe Asp Pro Pro Asn Phe Pro Ile Cys Leu Leu275 280 285
ggg aac cgc acg ctg tct cgc cat ggc ttt gat gtc tgt gcc aag ctg 1030Gly Asn Arg Thr Leu Ser Arg His Gly Phe Asp Val Cys Ala Lys Leu290 295 300 305gct tgg gaa gga aat gag aca gtg acc aca cgg ctc tgg ggc cta ttc 1078Ala Trp Glu Gly Asn Glu Thr Val Thr Thr Arg Leu Trp Gly Leu Phe310 315 320tgt tcc tcc cgc ctc ctc aat gcc acc tgt gat gag tac ttc acc cga 1126Cys Ser Ser Arg Leu Leu Asn Ala Thr Cys Asp Glu Tyr Phe Thr Arg325 330 335aac aat gtc aca gag atc cag ggc att cct ggt gct gca agt ggc ctc 1174Ash Asn Val Thr Glu Ile Gln Gly Ile Pro Gly Ala Ala Ser Gly Leu340 345 350atc aaa gag aac ctg tgg agt tcc tac ctg acc aag ggg gtg atc gtg 1222Ile Lys Glu Asn Leu Trp Ser Ser Tyr Leu Thr Lys Gly Val Ile Val355 360 365gag agg cgt ggg atg ccc tct gtg ggc ctg gca gat ggt acc ccc gtt 1270Glu Arg Arg Gly Met Pro Ser Val Gly Leu Ala Asp Gly Thr Pro Val370 375 380 385gac atg gac cac ccc tat gtc ttc agt gat atg acc tcc tac ttc acc 1318Asp Met Asp His Pro Tyr Val Phe Ser Asp Met Thr Ser Tyr Phe Thr390 395 400ctg ctt gtt ggc atc tat ttc ccc tca gtc aca ggg atc atg gct ggc 1366Leu Leu Val Gly Ile Tyr Phe Pro Ser Val Thr Gly Ile Met Ala Gly405 410 415tcg aac cgg tcc gga gac ctg cgg gat gcc cag aag tct atc cct act 1414Ser Asn Arg Ser Gly Asp Leu Arg Asp Ala Gln Lys Ser Ile Pro Thr420 425 430gga act atc ttg gcc att gct acg acc tct gct gtc tac atc agc tct 1462Gly Thr Ile Leu Ala Ile Ala Thr Thr Ser Ala Val Tyr Ile Ser Ser435 440 445gtt gtt ctg ttc gga gcc tgc atc gaa ggg gtc gtc cta cgg gac aag 1510Val Val Leu Phe Gly Ala Cys Ile Glu Gly Val Val Leu Arg Asp Lys450 455 460 465ttt ggg gaa gct gtg aat ggc aat ctg gtg gtg ggc acc ctg gcc tgg 1558Phe Gly Glu Ala Val Asn Gly Asn Leu Val Val Gly Thr Leu Ala Trp470 475 480
cct tct cct tgg gtc att gtc ata ggc tct ttc ttc tct acc tgc gga 1606Pro Ser Pro Trp Val Ile Val Ile Gly Ser Phe Phe Ser Thr Cys Gly485 490 495gct gga cta cag agc ctc aca ggg gcc cca cgc ctg ctg cag gcc atc 1654Ala Gly Leu Gln Ser Leu Thr Gly Ala Pro Arg Leu Leu Gln Ala Ile500 505 510tcc cgg gat ggc ata gtg ccc ttc ctg cag gtc ttt ggc cat ggc aaa 1702Ser Arg Asp Gly Ile Val Pro Phe Leu Gln Val Phe Gly His Gly Lys515 520 525gcc aac gga gag cca acc tgg gcg ctg ctg ctg act gcc tgc atc tgt 1750Ala Asn Gly Glu Pro Thr Trp Ala Leu Leu Leu Thr Ala Cys Ile Cys530 535 540 545gag atc ggc atc ctc atc gcc tcc ctg gat gag gtc gcc cct atc ctt 1798Glu Ile Gly Ile Leu Ile Ala Ser Leu Asp Glu Val Ala Pro Ile Leu550 555 560tcc atg ttc ttc ctg atg tgt tac atg ttt gtg aac ttg gct tgc gcg 1846Ser Met Phe Phe Leu Met Cys Tyr Met Phe Val Asn Leu Ala Cys Ala565 570 575gtg cag aca ctg ctg agg acg ccc aac tgg agg cca cgc ttc cga tat 1894Val Gln Thr Leu Leu Arg Thr Pro Asn Trp Arg Pro Arg Phe Arg Tyr580 585 590tac cac tgg acc ctc tcc ttc ctg ggc atg agc ctc tgc ctg gcc ctg 1942Tyr His Trp Thr Leu Ser Phe Leu Gly Met Ser Leu Cys Leu Ala Leu595 600 605atg ttc att tgc tcc tgg tat tat gcg ctg gta gct atg ctc atc gct 1990Met Phe Ile Cys Ser Trp Tyr Tyr Ala Leu Val Ala Met Leu Ile Ala610 615 620 625ggc ctc atc tat aag tac atc gag tac cgg ggg gca gag aag gag tgg 2038Gly Leu Ile Tyr Lys Tyr Ile Glu Tyr Arg Gly Ala Glu Lys Glu Trp630 635 640ggg gat ggg atc cga ggc ctg tct ctc agt gca gct cgc tat gct ctc 2086Gly Asp Gly Ile Arg Gly Leu Ser Leu Ser Ala Ala Arg Tyr Ala Leu645 650 655ttg cgt ctg gag gaa gga ccc ccg cat aca aag aac tgg agg ccc cag 2134Leu Arg Leu Glu Glu Gly Pro Pro His Thr Lys Asn Trp Arg Pro Gln660 665 670cta ctg gtg ctg gtg cgt gtg gac cag gac cag aac gtg gtg cac ccg 2182
Leu Leu Val Leu Val Arg Val Asp Gln Asp Gln Asn Val Val His Pro675 680 685cag ctg ctg tcc ttg acc tcc cag ctc aag gca ggg aag ggc ctg acc 2230Gln Leu Leu Ser Leu Thr Ser Gln Leu Lys Ala Gly Lys Gly Leu Thr690 695 700 705att gtg ggc tct gtc ctt gag ggc acc ttt ctg gac aac cac cct cag 2278Ile Val Gly Ser Val Leu Glu Gly Thr Phe Leu Asp Asn His Pro Gln710 715 720gct cag cgg gca gag gag tct atc cgg cgc ctg atg gag gct gag aag 2326Ala Gln Arg Ala Glu Glu Ser Ile Arg Arg Leu Met Glu Ala Glu Lys725 730 735gtg aag ggc ttc tgc cag gta gtg atc tcc tcc aac ctg cgt gac ggt 2374Val Lys Gly Phe Cys Gln Val Val Ile Ser Ser Asn Leu Arg Asp Gly740 745 750gtg tcc cac ctg atc caa tcc ggg ggc ctc ggg ggc ctg caa cac aac 2422Val Ser His Leu Ile Gln Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gln His Asn755 760 765act gtg cta gtg ggc tgg cct cgc aac tgg cga cag aag gag gat cat 2470Thr Val Leu Val Gly Trp Pro Arg Asn Trp Arg Gln Lys Glu Asp His770 775 780 785cag aca tgg agg aac ttc atc gaa ctc gtc cgg gaa act aca gct ggc 2518Gln Thr Trp Arg Asn Phe Ile Glu Leu Val Arg Glu Thr Thr Ala Gly790 795 800cac ctc gcc ctg ctg gtc acc aag aat gtt tcc atg ttc ccc ggg aac 2566His Leu Ala Leu Leu Val Thr Lys Asn Val Ser Met Phe Pro Gly Asn805 810 815cct gag cgt ttc tct gag ggc agc att gac gtg tgg tgg atc gtg cac 2614Pro Glu Arg Phe Ser Glu Gly Ser Ile Asp Val Trp Trp Ile Val His820 825 830gac ggg ggc atg ctc atg ctg ttg ccc ttc ctc ctg cgt cac cac aag 2662Asp Gly Gly Met Leu Met Leu Leu Pro Phe Leu Leu Arg His His Lys835 840 845gtc tgg agg aaa tgc aaa atg cgg atc ttc acc gtg gcg cag atg gat 2710Val Trp Arg Lys Cys Lys Met Arg Ile Phe Thr Val Ala Gln Met Asp850 855 860 865gac aac agc att cag atg aag aaa gac ctg acc acg ttt ctg tac cac 2758Asp Asn Ser Ile Gln Met Lys Lys Asp Leu Thr Thr Phe Leu Tyr His
870 875 880tta cga att act gca gag gtg gaa gtc gtg gag atg cac gag agc gac 2806Leu Arg Ile Thr Ala Glu Val Glu Val Val Glu Met His Glu Ser Asp885 890 895atc tca gca tac acc tac gag aag aca ttg gta atg gaa caa cgt tct 2854Ile Ser Ala Tyr Thr Tyr Glu Lys Thr Leu Val Met Glu Gln Arg Ser900 905 910cag atc ctc aaa cag atg cac ctc acc aag aac gag cgg gaa cgg gag 2902Gln Ile Leu Lys Gln Met His Leu Thr Lys Asn Glu Arg Glu Arg Glu915 920 925atc cag agc atc aca gat gaa tct cgg ggc tcc att cgg agg aag aat 2950Ile Gln Ser Ile Thr Asp Glu Ser Arg Gly Ser Ile Arg Arg Lys Asn930 935 940 945cca gcc aac act cgg ctc cgc ctc aat gtt ccc gaa gag aca gct tgt 2998Pro Ala Asn Thr Arg Leu Arg Leu Asn Val Pro Glu Glu Thr Ala Cys950 955 960gac aac gag gag aag cca gaa gag gag gtg cag ctg atc cat gac cag 3046Asp Asn Glu Glu Lys Pro Glu Glu Glu Val Gln Leu Ile His Asp Gln965 970 975agt gct ccc agc tgc cct agc agc tcg ccg tct cca ggg gag gag cct 3094Ser Ala Pro Ser Cys Pro Ser Ser Ser Pro Ser Pro Gly Glu Glu Pro980 985 990gag ggg gag ggg gag aca gac cca gag aag gtg cat ctc acc tgg acc 3142Glu Gly Glu Gly Glu Thr Asp Pro Glu Lys Val His Leu Thr Trp Thr995 1000 1005aag gat aag tca gcg gct cag aag aac aaa ggc ccc agt ccc gtc 3187Lys Asp Lys Ser Ala Ala Gln Lys Asn Lys Gly Pro Ser Pro Val1010 1015 1020tcc tcg gag ggg atc aag gac ttc ttc agc atg aag ccg gag tgg 3232Ser Ser Glu Gly Ile Lys Asp Phe Phe Ser Met Lys Pro Glu Trp1025 1030 1035gaa aac ttg aac cag tcc aac gtg cgg cgc atg cac aca gct gtg 3277Glu Asn Leu Asn Gln Ser Asn Val Arg Arg Met His Thr Ala Val1040 1045 1050cgg ctg aac gag gtc atc gtg aat aaa tcc cgg gat gcc aag ttg 3322Arg Leu Asn Glu Val Ile Val Asn Lys Ser Arg Asp Ala Lys Leu1055 1060 1065
gtg ttg ctc aac atg ccc ggg cct ccc cgc aac cgc aat gga gat 3367Val Leu Leu Asn Met Pro Gly Pro Pro Arg Asn Arg Asn Gly Asp1070 1075 1080gaa aac tac atg gaa ttc ctg gag gtc ctc act gag caa ctg gac 3412Glu Asn Tyr Met Glu Phe Leu Glu Val Leu Thr Glu Gln Leu Asp1085 1090 1095cgg gtg atg ctg gtc cgc ggt ggt ggc cga gag gtc atc acc atc 3457Arg Val Met Leu Val Arg Gly Gly Gly Arg Glu Val Ile Thr Ile1100 1105 1110tac tcc tga aggccaggac ctgccactcc ggcccgagcg agcccggccc3506Tyr Ser1115gcggccccgg agccctcgcc gcgcctcccc gccgctgtca ccgtttacat aagaccccgt 3566tgcccgtgcc ctggccctct tccctcccgc tgcctgcggc ccggaggcct tgcccgtcgg 3626ggctgacccg gagggcggcc cgtgggcccc ttttctgagc ccggcctcgc cctgccggag 3686tagacgttgc aataaaggtg gcgaggcggc gtggagagga gcggaaccgt ggtcccgggc 3746cggggagccc cgagcccgtc cctccccacg ccccgccgcg ctccccccgg accctggtcg 3806ctgagcccgg gcgccgctcg gctgcgctat acatagtgta caggagacat cgagtgtatt 3866tttaatgtcc ccatatttct gtaaactaga aacgcaacgg actcctcgcc acggccgcgc 3926tctccccgct gcgggcgccc aggaaggcgg agacccggga agccagggtt ccctgcgctc 3986ccgagctgag agccaagtgc tttaaggccg gcgctctcct ttccctttcc tgtccacggc 4046ccgggcttcc ctctcttccc tccagttctt ggcgaacaca ggtgaagccc tgcccggtgc 4106cttcgtggag gagcaggcgt ctctcctctg ttggcttgcc gcctgctccc cctgtcccgt 4166ggctcctcgc caaagactga atttgtggag ctggagggca caccctcccc actttccttc 4226ctgggacagg tgaggggcca atgccagtct aggggccgac tcacaggagg cctcgcgcag 4286cctcttggtc cccactctgc aagtcctgcc tggggaccca gcccccctgg tggttctggg 4346gcggagcttt gctgcctagc agcaagtcct tagttactgt ctccagatac caggacctgg 4406agtagggaat ggagtcatat gggttcagtt gttcctggcg cttctctgcc ccctgctccc 4466
cctctccccc tctcgtagga cacaaggact ttggctttct taactcatcc ttggcgcttc 4526cgctccacca cgcccacctg tggggaggag ccctcagccc tagagaggcg tttggctggt 4586tcccttcccc cagggcacgt tactaagagg acaggcactg catgctcctt taagcgccct 4646ctgggactgg gtacagtgcc tccagcccca gggccctggt ctgcgcacct agttagacat 4706cattgcccac tccagggcca gggccactag ctgacctcac cacctttttc cttgagccca 4766aggcagagag agctgcagct ggtgccatct agacaggctc aagtgtggcc agtggcaggg 4826ctcgagggcc actgccctgt tgcttggctc aggacctctc tgagatttga tggggactgg 4886atattcttcc aggtagtagc catcaagtcg gaagtgttgg acccaggacc tgacattcct 4946tcaagactgc cctcccttgc tgtggttttg ccttttgggg caagagaggg gctgggcaaa 5006cggggaggag gcagtatcaa caccgattag ggaaccaaag ttgcactacc tgggcccagc 5066ctctggttgg caagagcaaa gtttctgttg atgaaaacaa acagcccaca acaacacccc 5126cccccccgtt ttctgtgctc catgtgcaat atttgttatg aaccttgtgt cgttcaagtc 5186acctttataa tcactgtagc tagatgttcc atgtccatcc aggtgacttt actctgagtg 5246caatatttca atagcctggt agtgagaaga gtgttgcttt tgtttcagcc gacctatgtg 5306cagggcaatg caatgcagtc caaaaccctt gtaaatagga gaggttgcaa gccaaatcaa 5366gagtatttat cgttattact attattatta ggcctgcctt taattttagt gtttcggtat 5426ttcgcatcct gcctcggtat tgatcgtgtg ttctctgtgc caatatgcaa aggagaggat 5486cagttctttc ctttactgtt gaatgctccc atttactgct ttaaggcttt tactgtgttc 5546attttttaga tacctgtctg 5566<210>6<211>1116<212>PRT<213>大鼠<400>6Met Leu Asn Asn Leu Thr Asp Cys Glu Asp Gly Asp Gly Gly Ala Asn1 5 10 15
Pro Gly Asp Gly Asn Pro Lys Glu Ser Ser Pro Phe Ile Asn Ser Thr20 25 30Asp Thr Glu Lys Gly Arg Glu Tyr Asp Gly Arg Asn Met Ala Leu Phe35 40 45Glu Glu Glu Met Asp Thr Ser Pro Met Val Ser Ser Leu Leu Ser Gly50 55 60Leu Ala Asn Tyr Thr Asn Leu Pro Gln Gly Ser Lys Glu His Glu Glu65 70 75 80Ala Glu Asn Asn Glu Gly Gly Lys Lys Lys Pro Val Gln Ala Pro Arg85 90 95Met Gly Thr Phe Met Gly Val Tyr Leu Pro Cys Leu Gln Asn Ile Phe100 105 110Gly Val Ile Leu Phe Leu Arg Leu Thr Trp Val Val Gly Ile Ala Gly115 120 125Ile Met Glu Ser Phe Cys Met Val Phe Ile Cys Cys Ser Cys Thr Met130 135 140Leu Thr Ala Ile Ser Met Ser Ala Ile Ala Thr Asn Gly Val Val Pro145 150 155 160Ala Gly Gly Ser Tyr Tyr Met Ile Ser Arg Ser Leu Gly Pro Glu Phe165 170 175Gly Gly Ala Val Gly Leu Cys Phe Tyr Leu Gly Thr Thr Phe Ala Gly180 185 190Ala Met Tyr Ile Leu Gly Thr Ile Glu Ile Leu Leu Ala Tyr Leu Phe195 200 205
Pro Ala Met Ala Ile Phe Lys Ala Glu Asp Ala Ser Gly Glu Ala Ala210 215 220Ala Met Leu Asn Asn Met Arg Val Tyr Gly Thr Cys Val Leu Thr Cys225 230 235 240Met Ala Thr Val Val Phe Val Gly Val Lys Tyr Val Asn Lys Phe Ala245 250 255Leu Val Phe Leu Gly Cys Val Ile Leu Ser Ile Leu Ala Ile Tyr Ala260 265 270Gly Val Ile Lys Ser Ala Phe Asp Pro Pro Asn Phe Pro Ile Cys Leu275 280 285Leu Gly Asn Arg Thr Leu Ser Arg His Gly Phe Asp Val Cys Ala Lys290 295 300Leu Ala Trp Glu Gly Asn Glu Thr Val Thr Thr Arg Leu Trp Gly Leu305 310 315 320Phe Cys Ser Ser Arg Leu Leu Asn Ala Thr Cys Asp Glu Tyr Phe Thr325 330 335Arg Asn Asn Val Thr Glu Ile Gln Gly Ile Pro Gly Ala Ala Ser Gly340 345 350Leu Ile Lys Glu Asn Leu Trp Ser Ser Tyr Leu Thr Lys Gly Val Ile355 360 365Val Glu Arg Arg Gly Met Pro Ser Val Gly Leu Ala Asp Gly Thr Pro370 375 380Val Asp Met Asp His Pro Tyr Val Phe Ser Asp Met Thr Ser Tyr Phe385 390 395 400Thr Leu Leu Val Gly Ile Tyr Phe Pro Ser Val Thr Gly Ile Met Ala
405 410 415Gly Ser Asn Arg Ser Gly Asp Leu Arg Asp Ala Gln Lys Ser Ile Pro420 425 430Thr Gly Thr Ile Leu Ala Ile Ala Thr Thr Ser Ala Val Tyr Ile Ser435 440 445Ser Val Val Leu Phe Gly Ala Cys Ile Glu Gly Val Val Leu Arg Asp450 455 460Lys Phe Gly Glu Ala Val Asn Gly Asn Leu Val Val Gly Thr Leu Ala465 470 475 480Trp Pro Ser Pro Trp Val Ile Val Ile Gly Ser Phe Phe Ser Thr Cys485 490 495Gly Ala Gly Leu Gln Ser Leu Thr Gly Ala Pro Arg Leu Leu Gln Ala500 505 510Ile Ser Arg Asp Gly Ile Val Pro Phe Leu Gln Val Phe Gly His Gly515 520 525Lys Ala Asn Gly Glu Pro Thr Trp Ala Leu Leu Leu Thr Ala Cys Ile530 535 540Cys Glu Ile Gly Ile Leu Ile Ala Ser Leu Asp Glu Val Ala Pro Ile545 550 555 560Leu Ser Met Phe Phe Leu Met Cys Tyr Met Phe Val Asn Leu Ala Cys565 570 575Ala Val Gln Thr Leu Leu Arg Thr Pro Asn Trp Arg Pro Arg Phe Arg580 585 590Tyr Tyr His Trp Thr Leu Ser Phe Leu Gly Met Ser Leu Cys Leu Ala595 600 605
Leu Met Phe Ile Cys Ser Trp Tyr Tyr Ala Leu Val Ala Met Leu Ile610 615 620Ala Gly Leu Ile Tyr Lys Tyr Ile Glu Tyr Arg Gly Ala Glu Lys Glu625 630 635 640Trp Gly Asp Gly Ile Arg Gly Leu Ser Leu Ser Ala Ala Arg Tyr Ala645 650 655Leu Leu Arg Leu Glu Glu Gly Pro Pro His Thr Lys Asn Trp Arg Pro660 665 670Gln Leu Leu Val Leu Val Arg Val Asp Gln Asp Gln Asn Val Val His675 680 685Pro Gln Leu Leu Ser Leu Thr Ser Gln Leu Lys Ala Gly Lys Gly Leu690 695 700Thr Ile Val Gly Ser Val Leu Glu Gly Thr Phe Leu Asp Asn His Pro705 710 715 720Gln Ala Gln Arg Ala Glu Glu Ser Ile Arg Arg Leu Met Glu Ala Glu725 730 735Lys Val Lys Gly Phe Cys Gln Val Val Ile Ser Ser Asn Leu Arg Asp740 745 750Gly Val Ser His Leu Ile Gln Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gln His755 760 765Asn Thr Val Leu Val Gly Trp Pro Arg Asn Trp Arg Gln Lys Glu Asp770 775 780His Gln Thr Trp Arg Asn Phe Ile Glu Leu Val Arg Glu Thr Thr Ala785 790 795 800
Gly His Leu Ala Leu Leu Val Thr Lys Asn Val Ser Met Phe Pro Gly805 810 815Asn Pro Glu Arg Phe Ser Glu Gly Ser Ile Asp Val Trp Trp Ile Val820 825 830His Asp Gly Gly Met Leu Met Leu Leu Pro Phe Leu Leu Arg His His835 840 845Lys Val Trp Arg Lys Cys Lys Met Arg Ile Phe Thr Val Ala Gln Met850 855 860Asp Asp Asn Ser Ile Gln Met Lys Lys Asp Leu Thr Thr Phe Leu Tyr865 870 875 880His Leu Arg Ile Thr Ala Glu Val Glu Val Val Glu Met His Glu Ser885 890 895Asp Ile Ser Ala Tyr Thr Tyr Glu Lys Thr Leu Val Met Glu Gln Arg900 905 910Ser Gln Ile Leu Lys Gln Met His Leu Thr Lys Asn Glu Arg Glu Arg915 920 925Glu Ile Gln Ser Ile Thr Asp Glu Ser Arg Gly Ser Ile Arg Arg Lys930 935 940Asn Pro Ala Asn Thr Arg Leu Arg Leu Asn Val Pro Glu Glu Thr Ala945 950 955 960Cys Asp Asn Glu Glu Lys Pro Glu Glu Glu Val Gln Leu Ile His Asp965 970 975Gln Ser Ala Pro Ser Cys Pro Ser Ser Ser Pro Ser Pro Gly Glu Glu980 985 990
Pro Glu Gly Glu Gly Glu Thr Asp Pro Glu Lys Val His Leu Thr Trp995 1000 1005Thr Lys Asp Lys Ser Ala Ala Gln Lys Asn Lys Gly Pro Ser Pro1010 1015 1020Val Ser Ser Glu Gly Ile Lys Asp Phe Phe Ser Met Lys Pro Glu1025 1030 1035Trp Glu Asn Leu Asn Gln Ser Asn Val Arg Arg Met His Thr Ala1040 1045 1050Val Arg Leu Asn Glu Val Ile Val Asn Lys Ser Arg Asp Ala Lys1055 1060 1065Leu Val Leu Leu Asn Met Pro Gly Pro Pro Arg Asn Arg Asn Gly1070 1075 1080Asp Glu Asn Tyr Met Glu Phe Leu Glu Val Leu Thr Glu Gln Leu1085 1090 1095Asp Arg Val Met Leu Val Arg Gly Gly Gly Arg Glu Val Ile Thr1100 1105 1110Ile Tyr Ser1115<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>7tctccttggg attgccgtca 20<210>8
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>8tcttcttgag actgcagtca 20
權利要求
1.治療或預防受試者中疼痛的方法，所述方法包括降低所述受試者中樞神經系統(CNS)神經細胞中的細胞內氯化物水平。
2.權利要求1的方法，其中所述方法包括調節所述CNS細胞中氯化物轉運蛋白的活性或表達，從而降低所述氯化物水平。
3.權利要求2的方法，其中所述氯化物轉運蛋白是KCC2。
4.權利要求3的方法，所述方法還包括增加所述KCC2的活性或表達。
5.權利要求1的方法，其中所述CNS神經細胞是脊髓神經細胞。
6.權利要求1的方法，其中所述疼痛信號發源于外周神經系統(PNS)細胞或所述CNS神經細胞跨突觸的感覺纖維。
7.權利要求1的方法，其中所述疼痛是神經性疼痛。
8.權利要求7的方法，其中所述神經性疼痛與神經或神經束損傷有關。
9.權利要求7的方法，其中所述神經性疼痛選自軀體疼痛和內臟疼痛。
10.權利要求1的方法，其中所述疼痛選自慢性炎癥疼痛、與關節炎相關的疼痛、纖維肌痛、背痛、癌癥相關疼痛、消化系統疾病相關疼痛、克羅恩氏病相關疼痛、自身免疫病相關疼痛、內分泌病相關疼痛、糖尿病性神經病相關疼痛、幻肢疼痛、自發性疼痛、慢性術后疼痛、慢性顳下頜疼痛、灼痛、皰疹后神經痛、艾滋病相關疼痛、I型和II型復合性區域疼痛綜合癥、三叉神經痛、慢性背痛、與脊髓損傷相關的疼痛以及周期性急性痛。
11.權利要求1的方法，其中所述方法包括對所述受試者施用能降低所述CNS細胞中所述細胞內氯化物水平的化合物。
12.權利要求11的方法，其中所述化合物能調節所述CNS細胞中氯化物轉運蛋白的活性或表達。
13.權利要求12的方法，其中所述氯化物轉運蛋白是KCC2。
14.權利要求13的方法，其中所述化合物能增加所述KCC2的活性或表達。
15.權利要求14的方法，其中所述化合物是TrkB的抑制劑。
16.權利要求15的方法，其中所述抑制劑選自K-252a和抗-TrkB抗體。
17.權利要求13的方法，其中所述化合物是依賴cAMP的激酶(PKA)的抑制劑。
18.權利要求17的方法，其中所述抑制劑是H-89。
19.權利要求13的方法，其中所述化合物是鈣調蛋白依賴性激酶(CAM激酶)的抑制劑。
20.權利要求19的方法，其中所述抑制劑是KN-93。
21.權利要求3的方法，其中所述KCC2包含與選自SEQ ID NO2、4、6及其片段的序列基本上相同的氨基酸序列。
22.用于治療或預防受試者中疼痛的組合物，所述組合物包含(a)能降低CNS神經細胞中細胞內氯化物水平的化合物；和(b)藥學可接受的載體。
23.權利要求22的組合物，其中所述化合物能調節所述CNS神經細胞中氯化物轉運蛋白的活性或表達。
24.權利要求23的組合物，其中所述氯化物轉運蛋白是KCC2。
25.權利要求24的組合物，其中所述化合物能增加所述KCC2的活性或表達。
26.商業包裝，其包含權利要求22的組合物以及其用于治療或預防疼痛的說明書。
27.商業包裝，其包含能降低CNS神經細胞中細胞內氯化物水平的化合物以及其用于治療或預防疼痛的說明書。
28.權利要求27的商業包裝，其中所述化合物能調節所述CNS神經細胞中氯化物轉運蛋白的活性或表達。
29.權利要求28的商業包裝，其中所述氯化物轉運蛋白是KCC2。
30.權利要求29的商業包裝，其中所述化合物能增加所述KCC2活性或表達。
31.權利要求22的組合物的用途，用于治療或預防疼痛。
32.權利要求22的組合物的用途，用于制備治療或預防疼痛的藥物。
33.能降低CNS神經細胞中細胞內氯化物水平的化合物的用途，用于治療或預防疼痛。
34.能降低CNS神經細胞中細胞內氯化物水平的化合物的用途，用于制備治療或預防疼痛的藥物。
35.權利要求33的用途，其中所述化合物能調節所述CNS細胞中氯化物轉運蛋白的活性或表達。
36.權利要求35的用途，其中所述氯化物轉運蛋白是KCC2。
37.權利要求36的用途，其中所述化合物能增加所述KCC2活性或表達。
38.權利要求37的用途，其中所述化合物是TrkB的抑制劑。
39.權利要求38的用途，其中所述抑制劑選自K-252a和抗-TrkB抗體。
40.權利要求37的用途，其中所述化合物是依賴cAMP的激酶(PKA)的抑制劑。
41.權利要求40的用途，其中所述抑制劑是H-89。
42.權利要求37的用途，其中所述化合物是鈣調蛋白依賴性激酶的抑制劑。
43.權利要求42的用途，其中所述抑制劑是KN-93。
44.鑒定或表征用于治療或預防疼痛的化合物的方法，所述方法包括(a)將受試化合物接觸CNS來源的細胞；和(b)測定在所述受試化合物存在下所述細胞內氯化物水平是否降低；其中所述降低表明所述受試化合物可用于治療或預防疼痛。
45.鑒定或表征用于治療或預防疼痛的化合物的方法，所述方法包括(c)將受試化合物接觸表達氯化物轉運蛋白的CNS來源的細胞；和(d)測定在所述受試化合物存在下所述氯化物轉運蛋白的活性或表達是否以使得細胞內氯化物水平降低的方式受到調節；其中所述調節表明所述受試化合物可用于治療或預防疼痛。
46.權利要求45的方法，其中所述氯化物轉運蛋白是KCC2。
47.權利要求46的方法，其中所述方法包含確定在受試化合物存在下所述KCC2表達或活性是否增加和所述調節是否為增加。
48.權利要求47的方法，其中通過測量選自鉀轉運、氯化物轉運、細胞內氯化物水平和陰離子逆轉電位的參數確定所述KCC2活性。
49.權利要求44的方法，其中所述疼痛選自慢性炎癥疼痛、與關節炎相關的疼痛、纖維肌痛、背痛、癌癥相關疼痛、消化系統疾病相關疼痛、克羅恩氏病相關疼痛、自身免疫病相關疼痛、內分泌病相關疼痛、糖尿病性神經病相關疼痛、幻肢疼痛、自發性疼痛、慢性術后疼痛、慢性顳下頜疼痛、灼痛、皰疹后神經痛、艾滋病相關疼痛、I型和II型復合性區域疼痛綜合癥、三叉神經痛、慢性背痛、與脊髓損傷相關的疼痛以及周期性急性痛。
50.鑒定或表征用于治療或預防疼痛的化合物的方法，所述方法包括(a)將受試化合物接觸包含第一種核酸的CNS來源的細胞，所述第一種核酸包含通常與氯化物轉運蛋白基因結合的轉錄調節元件，所述氯化物轉運蛋白基因有效連接包含能編碼報道蛋白的報道基因的第二種核酸；和(b)在所述受試化合物存在下測定報道基因表達或報道蛋白活性是否被調節；其中報道基因表達或報道蛋白活性的所述調節表明所述受試化合物可用于治療或預防疼痛。
51.權利要求50的方法，其中所述氯化物轉運蛋白是KCC2。
52.權利要求51的方法，其中在所述受試化合物存在下所述報道基因表達或報道蛋白活性增加。
53.減輕受試者中傷害感受的方法，所述方法包括減少所述受試者中細胞內氯化物。
54.權利要求53的方法，其中所述方法包含調節所述CNS神經細胞中氯化物轉運蛋白活性或表達。
55.權利要求54的方法，其中所述氯化物轉運蛋白是KCC2。
56.權利要求55的方法，所述方法還包括增加所述KCC2活性或表達。
57.權利要求55的方法，其中所述方法還包括將所述CNS神經細胞接觸能增加KCC2活性或表達的化合物。
58.權利要求57的方法，其中所述化合物是TrkB的抑制劑。
59.權利要求58的方法，其中所述抑制劑選自K-252a和抗-TrkB抗體。
60.權利要求57的方法，其中所述化合物是依賴cAMP的激酶(PKA)的抑制劑。
61.權利要求60的方法，其中所述抑制劑是H-89。
62.權利要求57的方法，其中所述化合物是鈣調蛋白依賴性激酶的抑制劑。
63.權利要求62的方法，其中所述抑制劑是KN-93。
64.權利要求55的方法，其中所述KCC2包含與選自SEQ ID NO2、4、6及其片段的序列基本上相同的氨基酸序列。
65.診斷或預測經受疼痛的受試者中與CNS功能異常相關的疼痛的方法，所述方法包括確定相對于相應的對照氯化物水平，受試CNS細胞內氯化物水平是否提高；其中所述提高表明該受試者正經受與CNS功能異常相關的疼痛。
66.權利要求65的方法，所述方法還包括確定相對于對照轉運蛋白活性或表達，CNS氯化物轉運蛋白活性或表達是否受到調節。
67.權利要求66的方法，其中所述氯化物轉運蛋白是KCC2。
68.權利要求67的方法，所述方法還包括確定相對于所述對照活性或表達，所述KCC2活性或表達是否降低。
69.權利要求65的方法，其中所述對照細胞內氯化物水平選自(a)已建立的標準；(b)較早時候在所述受試者中測定的相應細胞內氯化物水平；(c)當所述受試者所經受的疼痛較輕或基本上無疼痛時測定的所述受試者中相應細胞內氯化物水平；和(d)在經受疼痛較輕或基本上無疼痛的對照受試者中測定的相應細胞內氯化物水平。
70.權利要求68的方法，其中所述對照活性或表達選自(a)KCC2活性或表達的已建立的標準；(b)較早時候在所述受試者中測定的KCC2活性或表達的相應水平；(c)當所述受試者所經受的疼痛較輕或基本上無疼痛時測定的所述受試者中KCC2活性或表達的相應水平；和(d)在經受疼痛較輕或基本上無疼痛的對照受試者中測定的KCC2活性或表達的相應水平。
71.權利要求67的方法，其中通過測量選自鉀轉運、氯化物轉運、細胞內氯化物水平和陰離子逆轉電位的參數確定所述KCC2活性。
72.權利要求65的方法，其中通過(a)對所述受試者施用指示細胞內氯化物水平的指示劑化合物從而該化合物接觸所述受試者的CNS神經細胞；(b)評估與所述指示劑化合物相關的體內信號；來測定所述細胞內氯化物水平。
73.權利要求65的方法，其中所述與CNS功能異常相關的疼痛是神經性疼痛。
74.權利要求73的方法，其中所述指示劑化合物是放射性核素。
75.權利要求75的方法，其中放射性核素選自201Tl、99Tcm-tetrofosmin、99Tcm-MIBI、99Tcm-HMPAO和36Cl。
76.權利要求73的方法，其中通過成像技術評估所述體內信號。
77.權利要求72的方法，其中所述體內信號是所述指示劑化合物的滯留指數。
78.權利要求76的方法，其中所述成像技術選自單光子發射計算機層析X射線照相術、正電子發射層析X射線照相術和磁共振成像。
79.權利要求73的方法，其中所述指示劑化合物指示KCC2表達。
80.權利要求79的方法，其中所述指示劑化合物是針對KCC2的抗體。
81.治療受試者中與CNS功能異常相關的疼痛的方法，所述方法包括(a)根據權利要求65的方法，診斷或預測所述受試者中與CNS功能異常相關的疼痛；(b)降低所述受試者的CNS細胞中細胞內氯化物水平。
全文摘要
描述了用于減弱或治療疼痛和減輕傷害感受的方法和產品。所述方法和產品是以CNS細胞內氯化物水平的調節為基礎的。所述方法和產品還涉及諸如KCC2氯化鉀協同轉運蛋白等氯化物轉運蛋白的活性和/或表達的調節。本文還描述了以所述調節為基礎的商業包裝及其用途。本文還描述了用于鑒定或表征治療疼痛的化合物、減輕傷害感受以及診斷和預測疼痛的有關方法。
文檔編號A61K31/00GK1805769SQ200480016630
公開日2006年7月19日 申請日期2004年5月14日 優先權日2003年5月16日
發明者Y·德科寧克, P·德科寧克, J·A·M·庫爾 申請人:拉瓦勒大學