下調ccr5表達的組合物及其應用方法

專利名稱：下調ccr5表達的組合物及其應用方法
背景技術：
發明領域本發明涉及CCR5表達的下調，尤其是涉及包括至少一種顯示出下調表面受體CCR5表達的G1期停滯劑的組合物由此治療CCR5受體起有害作用的人的疾病。
相關技術的背景人類免疫缺陷性病毒(HIV)已經被認為是稱作獲得性免疫缺損綜合癥(AIDS)的慢性退行性免疫系統疾病的主要病因。至少有截然不同的兩類HIVHIV-1以及HIV-2。人類HIV復制只要發生在CD4 T淋巴細胞群，并且HIV感染引起這種細胞型的衰竭并最終導致免疫功能不全，機會感染，神經功能障礙，腫瘤生長并且最終死亡。
HIV是逆轉錄病毒的慢病毒家族的成員。逆轉錄病毒是包含單鏈RNA基因組，并且通過由病毒編碼的逆轉錄酶即依賴RNA的DNA聚合酶產生的DNA中間體復制的小-包膜病毒。
HIV病毒粒子包括部分由衣殼蛋白連同病毒RNA基因組以及早期復制事件所需的酶組成的病毒核心。十四烷基化的gag蛋白形成了圍繞病毒核心的外殼，其反過來由來源于受感染細胞膜的脂膜包膜包圍。HIV包膜表面糖蛋白被合成為單個的160千道爾頓前體蛋白，其由細胞蛋白酶在病毒出芽期間裂解成兩個糖蛋白gp41以及gp120。gp41是跨膜糖蛋白并且gp120是細胞外糖蛋白，其與gp41保持可能是三聚體或者多聚體形式的非共價連接。
HIV靶向CD4細胞，因為CD4細胞表面蛋白(CD4)作為HIV-1病毒的細胞受體。病毒進入細胞依賴于結合細胞CD4受體分子的gp120，解釋了HIV對CD4細胞的趨向性，而gp41錨定病毒膜中的包膜糖蛋白復合物。CCR5作為由HIV-1的非合胞體-誘導(NSI)株感染CD4細胞的共受體。
CCR5受體在T細胞上的表達依賴于細胞的激活狀態。靜息淋巴細胞不表達CCR5，然而在活化后表達CCR5。CCR5對于HIV-1最初傳播的重要性由缺乏CCR5(CCR5-Δ32純合遺傳型)表達的個體通常抗感染的事實得以強調(Liu等人，1996)。此外，近代研究指出CCR5細胞表面密度與感染個體的疾病進程有關(Lin，等，2002)。
其它失調以及影響的進展已經被認為是與CCR5受體的表達相關。例如，同種異體移植排斥的發生是由于受體單核細胞進入異體移植物之內外滲的結果，該過程由CCR5在浸潤單核細胞上的表達介導。利用過敏性氣道疾病的鼠模型進行的哮喘研究已經顯示CCR5可能在氣道炎癥中起重要作用。此外，類風濕性關節炎的特征為滑膜被單核細胞的浸潤并且CCR5似乎由于浸潤的淋巴細胞中發現CCR5高水平表達起到一定的作用。有趣的是，存在于患多發性硬化的受試者的特征性的活性脫髓鞘血小板中的單核細胞也顯示CCR5的高水平表達。
由此，降低或者抑制CCR5表面受體在單核細胞上表達的化合物的鑒定并且施用這種化合物從而有效治療與CCR5表面受體的表達相關的失調將是非常有益的。
發明概述本發明涉及通過施用停滯細胞周期G1期的組合物操縱活化的淋巴細胞的細胞周期從而下調表面受體CCR5的表達，由此破壞淋巴細胞對IL-2(通過IL-2R)的應答，支配從G1到S期的過渡，而且通過S期的進度。CCR5表達的下降減少了HIV進入T細胞的受體部位并且由此影響HIV的進展。
一個方面，本發明涉及抑制CCR5的轉錄從而減少CCR5表面受體的表達由此引起趨化因子在細胞水平的聚集。這種趨化因子的聚集應歸于用于趨化因子/配體吸收的表面CCR5受體數目的減少。
在另一方面，本發明涉及抑制CCR5的轉錄，減少CCR5表面受體的表達由此引起用于HIV gp120結合的表面受體數目的降低，其進而預防或者減少HIV的復制。
在另一方面，本發明涉及通過減少單核細胞上表達的CCR5表面受體的數目抑制CCR5-介導的HIV病毒進入的組合物，所述單核細胞包括但不限于T細胞，活化的T細胞以及巨噬細胞。
在另一方面，本發明涉及包含延緩單核細胞周期進入S-期的G1期停滯劑的組合物，其中G1期停滯劑破壞IL-2結合到細胞表面上IL-2受體(IL-2R)后發生的信號傳導以及由此抑制取決于通過IL-2受體進行信號傳導的CCR5的表達。
本發明的另一方面涉及抑制CCR5-介導的病毒進入，也就是通過免疫調節藥物雷帕霉素(RAPA)下調CCR5蛋白表達的方法。RAPA是一種細菌的大環內酯，目前已被批準用于腎移植排斥的治療，通過破壞源于IL-2與IL-2受體結合的分子事件在T細胞中發揮細胞抑制的活性(Sehgal，S.N.，1998)。
G1細胞周期調節劑可以包括停滯或者延長單核細胞的細胞周期中G1期的任何化合物，例如包括而不限于丁酸鈉，阿非迪霉素(aphidicolin)，羥基脲(HU)，olomoucine，roscovitine，生育酚，包括α-生育酚，β-生育酚，D-α-生育酚，Δ-生育酚，γ-生育酚，生育三烯酚，雷帕霉素(RAPA)及其功能類似物或者衍生物。
本發明的組合物可以更進一步包括至少一種抗病毒劑。該抗病毒劑可以包括抑制感染性病毒，具體地逆轉錄病毒諸如HIV病毒進入細胞或者在其中復制的任何藥劑。抗病毒劑包括但不限于核苷RT抑制劑，CCR5抑制劑/拮抗劑，病毒進入抑制劑及其功能類似物。
由此，在一個方面，本發明的組合物以及方法更進一步包括治療有效量的至少一種抗病毒劑，包括但不限于核苷RT抑制劑，諸如疊氮胸苷(ZDV，AZT)，拉夫米定(lamivudine)(3TC)，雙脫氧胸苷(d4T)，2′，3′-雙脫氧肌苷(ddl)，2′，3′-雙脫氧胞苷(ddC)，阿巴卡韋(Abacavir)(ABC)，Emirivine(FTC)，替諾福韋(Tenofovir)(TDF)，德拉維拉丁(Delaviradine)(DLV)，依法韋倫(Efavirenz)(EFV)，奈韋拉平(Nevirapine)(NVP)，沙奎那維(Saquinavir)(SQV)，利托那韋(Ritonavir)(RTV)，茚地那韋(Indinavir)(IDV)，奈非那韋(Nelfinavir)(NFV)，安普那韋(Amprenavir)(APV)，洛匹那韋(Lopinavir)(LPV)，阿扎那韋(Atazanavir)，雙汰芝(Combivir)(ZDV/3TC)，Kaletra(RTV/LPV)，三協唯(Trizivir)(ZDV/3TC/ABC)；CCR5抑制劑/拮抗劑，諸如SCH-C，SCH-D，PRO 140，TAK 779，TAK-220，RANTES類似物，AK602，UK-427，857，單克隆抗體；病毒進入抑制劑，諸如Fuzeon(T-20)，NB-2，NB-64，T-649，T-1249，SCH-C，SCH-D，PRO 140，TAK 779，TAK-220，RANTES類似物，AK602，UK-427，857；及其功能類似物或等效物。
本發明的另一方面涉及加強TAK-779的效力以及減少活化T細胞上CCR5表面受體數目的方法，該方法包括施用包括如下成分的組合物a)被認為是拮抗CCR5受體無效量的TAK-779以及b)有效減少CCR5的表達量的G1期停滯劑，借此組合物中包含的G1期停滯劑增強了TAK-779的效力。優選地G1期停滯劑是RAPA或者HU并且效力被協同提高。
在另一方面，本發明涉及抗病毒感染的方法，其中CCR5表面受體起到有害的作用，包括給患者施用包括有效量G1期停滯化合物以減少CCR5表面受體表達的組合物。
在另一方面，本發明涉及對HIV保持持久病毒控制的方法，該方法包括施用至少一種抗病毒劑以及治療有效量的G1停滯化合物減少CCR5受體的表達由此降低HIV gp120的結合。
抗病毒劑可以是任何HIV進入抑制劑，諸如TAK 799或者SCH-C，二者都可阻斷病毒與CCR5受體的結合。已經顯示出對這些CCR5拮抗劑分子的病毒抗性源于病毒更有效利用CCR5(Trkola等人，2002)。HIV-1病毒抗CCR5阻斷劑但仍然依賴于CCR5受體感染的事實表明CCR5的減少將干擾病毒抗性突變體的生長以及出現由此提高進入抑制劑治療的抗病毒持久性。
本發明的另一方面涉及減少HIV感染受試者體內HIV的影響以及復制的方法，所述方法包括與CCR5拮抗劑TAK 779組合施用G1期停滯劑以加強TAK-779的效力以及減少CCR5的表達。
在更進一步的方面，本發明涉及可能暴露于HIV的受試者預防HIV的方法，所述方法包括給受試者施用至少一種有效量的G1期停滯化合物減少CCR5表面受體的轉錄由此抑制HIV病毒進入受試者體內。
本發明的其它特征以及優點將根據下列詳細說明，附圖以及權利要求而更加顯而易見。


圖1顯示了RAPA對PBMCs增殖以及減少增殖的影響在高于1nM RAPA的水平是顯著的。
圖2A-D顯示了RAPA對下調T細胞以及單核細胞上CCR5表達的有效性；2A顯示了特異性檢測到CCR5在正常供體的CD4+T細胞上的表面表達，而非CCR5基因Δ32突變的同型接合個體CD4+T細胞上的CCR5表面表達；2B顯示了由PBMCs中RAPA下調CD4+T細胞上CCR5的表面表達，所述PBMCs在IL-2以及RAPA存在下培養7天然后分析CCR5的水平，其中CCR5在CD4+T淋巴細胞上的表達顯示為實線，并且IgG同種型對照的熒光強度顯示為虛線；2C顯示了由RAPA抑制CCR5 mRNA在PBMCs中的轉錄。總RNA分離自在IL-2以及RAPA存在下已經培養7天的PBMCs(來自與圖2B所示相同實驗的細胞)。利用特異于CCR5mRNA(上游)以及18S核糖體RNA(下游)擴增的引物對將同等量的RNA進行RT-PCR；2D顯示了RAPA下調在RPMI 20/10％ABHS以及RAPA存在下培養5天的成熟單核細胞上CCR5的細胞表面表達，所述成熟單核細胞雙重免疫染色CD14以及CCR5。在CD14-門控的細胞中檢測CCR5表面表達的改變。將用抗-CCR5mAb 182獲得的免疫熒光分布圖(實線)與IgG2b同種型對照的免疫熒光相比較(虛線)。2B以及2C的結果為來自5個不同供體獲得的PBMCs中的代表性數據。2D的結果為3個不同供體獲得的代表性類似分布圖。
圖3A以及3B顯示了RAPA提高PBMC培養物中細胞外β-趨化因子的水平。3A顯示了在IL-2以及RAPA存在下培養10天的供體PBMCs的結果，在培養10天時由ELISA評價上清液β-趨化因子的含量并且對細胞進行染色檢測CCR5的表達。顯示了在每一濃度的RAPA表達CCR5的CD4淋巴細胞的百分比。2個供體中顯示的結果代表利用4個不同供體的4個實驗。由斯氏t檢驗法與未經治療的對照相比*，P＜0.01；#，P＜0.05，；3B顯示了RAPA對CCR5-無效PBMCs培養物中MIP-1β細胞外水平的影響。測定正常供體以及CCR5基因Δ32突變同型接合的供體的IL-2-刺激的PBMCs的上清液中在RAPA存在以及不存在條件下MIP-1β蛋白的水平。獲得培養10天的值以及一式兩份微孔的平均值±SD。
圖4顯示了RAPA抑制PBMCs中HIV-1的復制而且R5 HIV-1中的抗病毒活性大于在X4 HIV-1中的抗病毒活性。4A顯示了7天試驗期間的復制結果，其中RAPA-處理的PBMCs感染了HIV-1 IIIb或者HIV-1 ADA。感染細胞在藥物RAPA存在下培養7天，并且在該時間由p24測定病毒復制并且由MTT分析測定細胞存活力。結果(一式三份微孔的平均值±SD)表示7個獨立實驗，每一為來自不同供體的細胞上；4B顯示了當用100nM RAPA處理時對HIV-1 IIIb以及HIV-1 ADA感染的DNase-處理的PBMCs母株的作用。HIV-1 DNA序列由PCR在感染后24小時制備的細胞裂解物中進行擴增。擴增的PCR產物用放射性探針進行檢測。“+”表示感染前后PBMC培養物中RAPA的存在；“-”表示無RAPA處理。β-肌動蛋白序列的擴增顯示了在不同細胞裂解物中細胞DNA的相同量(數據未顯示)。NC表示PCR陰性對照；4C顯示了當在HIV-1的R5株試驗組中研究時低濃度RAPA的抗病毒活性。在相同條件下培養的相同供體的未感染細胞上分析細胞增殖。結果(一式三份微孔的平均值±SD)表示3個獨立實驗，每一在不同的供體細胞上進行。
圖5表示RAPA抑制MDMs中HIV-1的復制。在RAPA的存在下培養純化的單核細胞5天。在第5天，細胞感染HIV-1 ADA并且在RAPA存在下另外培養14天。在感染后7，10以及14天，通過RT分析測定病毒生長。在第14天，由MTT測定細胞存活力。結果(平均值±SD)表示3個獨立實驗中獲得的數據，每一利用來自不同供體的細胞。
圖6表示RAPA增強CCR5拮抗劑TAK-779的抗病毒活性。已經在不存在或者存在RAPA(1，10以及100nM)下培養7天的PBMCs在0.1nM TAK-779存在下感染HIV-1 ADA。受感染細胞在RAPA以及0.1nM TAK-779存在下培養。在感染后7天，通過p24分析測定培養上清液中病毒的產量。記錄Y軸中的對數刻度。數據表示一式三份微孔的平均值±SD。顯示了3個獨立實驗之一獲得的代表性結果。
圖7顯示HU增強了CCR5拮抗劑TAK-779的抗病毒活性。已經在不存在或者存在HU下培養7天的PBMCs在TAK-779存在或者不存在下感染HIV-1 ADA。在感染后7天，通過p24分析測定培養上清液中病毒的產量。
圖8A-B顯示了HU下調T細胞以及單核細胞上CCR5表達的有效性；8A顯示了由HU下調在IL-2以及HU存在下培養7天的PBMCs中CD4+T細胞上的CCR5表面表達然后分析CCR5的水平，其中CCR5在CD4+T淋巴細胞上的表達顯示為實線，來自于IgG同種型對照的熒光強度顯示為虛線；8B顯示了由HU抑制PBMCs中CCR5 mRNA的轉錄。總RNA分離自在IL-2以及HU存在下已經培養7天的PBMCs(來自與圖8A所示相同實驗的細胞)。利用CCR5 mRNA(上游)以及18S核糖體RNA(下游)擴增的特異性引物對將等量的RNA進行RT-PCR；圖9顯示了CCR5表達測定的CCR5m RNA從基線的變化。將值標準化到細胞管家基因β肌動蛋白的值。與基線(第0天)的差異倍數顯示為對數標度。檢驗的時間點包括在RAPA施用的7，14和28天以及中止RAPA施用后2周的42天。
優選實施方案的詳細說明本發明的治療病毒感染的方法包括“預防性”治療或者“治療性”治療。“預防性”治療是針對不顯示出疾病病征或者顯示出早期的疾病病征的受試者進行治療，目的在于減少形成與疾病相關的病理特征的危險。
本發明使用的術語“治療性”是指針對顯示出病理病征的受試者的治療，目的在于減輕或者消除那些病征。
本發明使用的術語“治療有效量”是指給受試者足以提供所施用的化合物有益效果的量的化合物。有益效果是指例如使得病毒不能復制，抑制病毒復制，抑制其它寄主細胞的感染或者提高CD4T細胞的量。
本發明使用的術語“病毒靶向細胞”是指其中存在病毒以及感染病毒或者可能感染病毒的細胞并且包括上皮細胞，神經系統細胞，T-淋巴細胞(活化或者靜息)，巨噬細胞，單核細胞，組織樹突狀細胞等等。
本發明使用的術語“功能等效”是指藥劑保持相應的化合物一些或者所有的生物活性。
本發明使用的術語“功能類似物”是指由基本上不引起母體化合物生物活性損失(即超過100×)的直接取代衍生自特定母體化合物的化合物，其中這種取代是本領域技術人員公知的修飾，例如酯化作用，由鹵素取代氫，由烷基取代烷氧基，由烷氧基取代烷基等等。
發明G1期停滯化合物本發明的組合物可以包括停滯，延緩或者延長單核細胞的G1期和/或G1-S過渡期的細胞-周期活性以及減少CCR5表達的任何G1期停滯劑。優選地，G1期停滯劑破壞淋巴細胞對IL-2(通過IL-2R)的應答，所述應答支配從G1到S期的過渡以及通過S期的進度。
G1期停滯劑可以包括但是不局限于丁酸鈉，阿非迪霉素(aphidicolin)，羥基脲(HU)，olomoucme，roscovitine，生育酚，生育三烯酚，雷帕霉素(RAPA)和/或其功能類似物。優選地，組合物包括抑制T細胞針對IL-2應答的雷帕霉素，所述物質引發已經由TCR活化的T細胞進展通過G1。因此雷帕霉素將細胞停止在G1-S過渡期。更優選地，組合物包括破壞淋巴細胞針對IL-2應答(通過IL-2R)的有效量的RAPA，其支配從G1到S期的過渡由此引起CCR5表達的減少并且附隨減少HIV進入的受體位點。
本發明采用上述鑒定的G1期停滯化合物的一種施用于患病毒感染的受試者，其中該化合物延長活化的淋巴細胞的細胞周期的G1期由此抑制CCR5受體的表達并且減少HIV gp120配體的結合位點。
藥物組合物本發明提供了包括至少一種G1期停滯化合物以及任選地至少一種抗病毒劑的組合物，以及預防，治療和/或減少HIV的作用的方法。該方法包括施用所述包括G1期停滯化合物以及任選抗病毒藥的組合物，其中這兩種化合物可以單獨，同時，并行或者順序施用。
藥用衍生物以及鹽本發明使用的術語“藥用衍生物”表示本發明的化合物的藥物或者藥理學可以接受的鹽，酯或者這種酯的酯或者鹽，或者在施用到受體后能夠提供(直接或者間接)一種或者多種本發明化合物的任何化合物，或者其抗病毒活性代謝物或者殘余物。
本發明的G1期停滯化合物的優選酯包括羧酸酯，其中酯基的非羰基部分選自直或者支鏈烷基，例如正-丙基，叔丁基，正丁基，烷氧基烷基(例如甲氧基甲基)，芳烷基(例如苯甲基)，芳氧烷基(例如苯氧甲基)，芳基(例如，由鹵素，C1-4烷基或者C1-4烷氧基或者氨基任選取代的苯基)；磺酸酯諸如烷基-或者芳烷基磺酰基(例如甲基磺酰基)；氨基加成酯(例如L-纈氨酰基或者L-異亮氨酰基)；以及單，二或者三磷酸酯。磷酸酯可以進一步由例如，C1-20醇或者其活性衍生物或者由2，3-二C2-4酰基甘油酯化。
藥用鹽包括但不限于有機羧酸諸如乙酸，乳酸，酒石酸，蘋果酸，羥乙磺酸，乳糖酸，p-氨基苯甲酸以及琥珀酸的鹽；有機磺酸諸如甲基磺酸，乙基磺酸，苯甲基磺酸以及p-甲苯磺酸以及無機酸諸如鹽酸，硫酸，磷酸以及氨基磺酸的鹽。
抗病毒化合物在一個方面，本發明的組合物以及方法更進一步包括治療地有效量的至少一種抗病毒劑，包括但不限于核苷RT抑制劑，CCR5抑制劑/拮抗劑，病毒進入抑制劑及其功能類似物。
優選地，抗病毒劑包括核苷RT抑制劑，諸如疊氮胸苷(ZDV，AZT)，拉夫米定(lamivudine)(3TC)，雙脫氧胸苷(d4T)，2′，3′-雙脫氧肌苷(ddl)，2′，3′-雙脫氧胞苷(ddC)，阿巴卡韋(Abacavir)(ABC)，Emirivine(FTC)，替諾福韋(Tenofovir)(TDF)，德拉維拉丁(Delaviradine)(DLV)，依法韋倫(Efavirenz)(EFV)，奈韋拉平(Nevirapine)(NVP)，沙奎那維(Saquinavir)(SQV)，利托那韋(Ritonavir)(RTV)，茚地那韋(Indinavir)(IDV)，奈非那韋(Nelfinavir)(NFV)，安普那韋(Amprenavir)(APV)，洛匹那韋(Lopinavir)(LPV)，阿扎那韋(Atazanavir)，雙汰芝(Combivir)(ZDV/3TC)，Kaletra(RTV/LPV)，三協唯(Trizivir)(ZDV/3TC/ABC)；CCR5抑制劑/拮抗劑，諸如SCH-C，SCH-D，PRO 140，TAK 779，TAK-220，RANTES類似物，AK602，UK-427，857，單克隆抗體；病毒進入抑制劑，諸如Fuzeon(T-20)，NB-2，NB-64，T-649，T-1249，SCH-C，SCH-D，PRO 140，TAK 779，TAK-220，RANTES類似物，AK602，UK-427，857；及其功能類似物。
抗病毒治療雖然當前用抗逆轉錄病毒(ARV)治療引起HIV復制的抑制并且引起免疫功能的改進，但是當前的治療受限于高成本，毒性以及堅持的困難。而且，單獨用抗逆轉錄病毒治療實現長期HIV感染的控制似乎不太可能。迄今為止，目前的抗逆轉錄病毒治療已經顯示出不足以從感染個體完全根除HIV并且在典型抗逆轉錄病毒治療時沒有實際資料顯示殘留的病毒量隨時間減少。此外，停止抗逆轉錄病毒治療后，病毒載量可以回彈到比處理前病毒載量還高的水平(Davey，1999；Dybul等，2002和2001)。
抗逆轉錄病毒治療需要嚴格的堅持復合給藥方案。6-月期間的病毒衰退速率已經顯示出高達60％的患者不能實現高于95％的堅持。與抗逆轉錄病毒治療有關的多種不良副作用以及這種治療對估計世界范圍33百萬感染者的每20人中只有1例有效的效果的組合已經促進我們重新考慮當前實現HIV治療目標的策略。
而且，目前認為HIV治療為延長生命的過程。因此，開發可成功施用用于長期抑制逆轉錄病毒，尤其是預防和/或抑制HIV的有效治療是非常重要的。此外，希望清除，或者至少最小化與施用抗病毒藥有關的細胞毒性換句話說確定有效。普遍認為抗病毒劑的毒性可以通過施用減少劑量的抗病毒劑避免或者至少最小化；然而同時承認抗病毒劑的效果通常隨著劑量的減少而降低。
由此，本發明的一個實施方案提供了通過利用周期治療以及將本發明的G1細胞周期劑引入HIV感染受試者的給藥方案減少抗病毒藥的劑量同時保持或者減少病毒載量。具體地，通過利用G1期停滯化合物連同抗病毒藥已經有希望保持周期給藥程序中的病毒抑制。通過利用少于50％的藥物，已經證明與抗逆轉錄病毒應用相關的副作用減少并且堅持程度也已經提高。另一個明顯的影響是藥物的總成本，其將促進這些藥物在所有發達國家的應用。
由此，在本發明的一個實施方案中，采用周期治療作為設計用于提高抗病毒藥活性，減少藥物成本以及毒性的替代方法。此外，因為本發明組合物的一個組分靶向宿主的細胞機制而非病毒，因此本發明的發明人料想將基本上不會發生對這種藥物組合物的抗性。
周期抗病毒治療方案可以持續12周然后添加G1期停滯化合物或者被其所代替4周。如果病毒載量保持低水平或者基本上恒定，可以改變周期減少每一周期的時間。如果添加G1期停滯化合物，消耗抗病毒藥物的時間可以減少。此外，可以引入不包括抗病毒藥物以及只有G1期停滯化合物的時間。這種受試者不消耗抗病毒藥的時間給受試者的生物系統提供了重組的時間修復或者補償抗病毒化合物的有毒影響。
此外，本發明的組合物以及方法可用于通過減少病毒載量以及通過減少gp120配體的結合位點減少病毒復制治療HIV病毒感染。
根據G1期停滯劑，抗病毒劑，治療時間，施用頻率，宿主以及感染的特性以及嚴重程度改變施用的劑量。劑量可以由本領域技術人員不經多余的實驗就可以確定。
本發明的組合物以基本上無毒、足以保證足量劑量單位的本發明的組合物進入患者體內提供所需要的HIV病毒抑制的劑量濃度施用。實際的施用劑量可以根據身體以及生理因素諸如年齡，體重，疾病的嚴重程度和/或患者的病歷進行確定。理論上所施用的活性抗病毒組分可以實現體內約0.01μM到約100μM的抗病毒劑的體內血漿濃度，更優選地約001到10μM，并且最優選地約1-5μM，以及約1μM-25μM，更優選地約2-20μM，最優選地約5-10μM的G1期停滯劑。
例如，在HIV-陽性以及AIDS患者的治療中，本發明的方法可以使用組合物提供從約0.005-500mg/kg體重/天的抗病毒劑，更優選地從約0.1-200mg/kg/天，以及最優選地1-50mg/kg/天；以及從約0.01-1000mg/kg體重/天的G1期停滯劑，更優選地從約0.001-1000mg/kg/天或者最優選地從約0.5-50mg/kg/天。本發明的G1期停滯劑以及抗病毒劑的特定單位劑量包括例如單獨配制，或者下文所述成分一起配制的50mg，100mg，200mg，500mg以及1000mg的量。
然而應該理解，偏離所提供范圍的劑量水平也可以適于治療所列舉的病毒感染。
G1期停滯化合物的治療效果可以由細胞培養或者實驗動物中進行的標準藥物程序進行確定，例如用于確定LD50(50％群體的致死劑量)以及ED50(50％種群有效的治療劑量)。毒性以及治療作用之間的劑量比率是治療指數并且可以表示為LD50/ED50的比率。優選顯示出高治療指數的化合物。細胞培養分析以及動物研究獲得的數據可用于配制用于人的劑量范圍。這種化合物的劑量優選處于包括沒有毒性的ED 50的循環濃度范圍內。劑量可以根據所采用的劑型以及所使用的給藥途徑在這個范圍內改變。對于本發明方法中使用的化合物治療有效劑量可以從最初的細胞培養分析進行估計。可以根據動物模型配制劑量以便獲得包括在細胞培養中確定的IC50(即實現癥狀的半最大抑制的檢驗化合物的濃度)的循環血漿濃度范圍。這種信息可用于更精確地確定用于人的劑量。例如通過高效液相色譜法測定血漿中的水平。
期望的劑量優選為整天中合適間隔施用2，3，4，5，6或更多的亞劑量。這種亞劑量根據每單位劑型G1期停滯化合物的亞劑量數目以例如包含0.01到1000mg，優選地1mg到50mg的單位劑型施用。
雖然有可能連續或者同時分別施用特異性G1期停滯化合物以及抗病毒劑，優選組合在藥物組合物中一起施用。
本發明的組合物可以包括兩種上述的成分，連同一或者多種其可以接受的載體以及任選的其它治療劑。每一載體必須是“藥用的”是指與制劑的其它成分相容合并且對受試者無害。
本發明提供了治療或者預防可以根據本發明治療或者預防的病毒感染諸如逆轉錄病毒感染包括人類逆轉錄病毒感染諸如人類免疫缺陷性病毒的方法。本發明的特異性G1期停滯化合物，組合物以及方法尤其可用于治療AIDS以及相關的HIV-陽性病征。本發明的化合物也可用于治療由人逆轉錄病毒引起的或者與其有關的無征狀感染或者疾病。
本發明的治療組合物可以與其它治療病毒感染或者病征的其它治療劑組合施用。這種其它治療劑的實例包括有效治療病毒感染或者相關病征諸如免疫調節劑諸如胸腺素，核糖核苷酸還原酶抑制劑諸如2-乙酰吡啶5-[(2-氯苯氨基)硫代羰基)硫羰腙，干擾素諸如α-干擾素，1-β-D-阿糖呋喃-5-(1-丙炔基)尿嘧啶，3’-疊氮基-3’-脫氧胸苷，病毒唑以及膦酰甲酸。
施用途徑本發明的組合物可以通過任何適合的途徑施用進行治療，包括口服，直腸，鼻，局部(包括透皮，口腔以及舌下)，陰道以及腸胃外(包括皮下，肌內，靜脈內以及皮內)。應該認識到優選的途徑將根據受體的病征以及年齡，感染的性質以及所選擇的活性成分的變化而改變。
本發明的藥物制劑包括那些適合于口服，直腸，鼻，局部(包括透皮，口腔或者舌下)，陰道或者腸胃外(包括皮下，肌內，靜脈內以及皮內)施用的制劑。
制劑可以方便地以單位劑型存在并且可以由藥學領域已知的方法進行制備。這種方法包括結合G1期停滯化合物以及任選地抗病毒劑連同載體的步驟。載體任選地包括一或者多種助劑。通常，制劑通過均勻以及緊密地將單獨的成分與液體載體或者細分散的固體載體或者二者組合然后如有必要將產物成形進行制備。
適合于透皮施用的組合物可以適于與受體的表皮保持延長時間密切接觸的離散貼片的形式存在。這種貼片合適地包含G1期停滯化合物以及任選地包括抗病毒劑諸如CCR5拮抗劑1)在任選的緩沖液，水溶液中；或者2)溶解和/或分散在粘合劑中；或者3)分散在聚合物中。
本發明適合于口服的制劑可以離散單位諸如膠囊，caches或者片劑，每一包含預定量的成分；粉末或者顆粒；水或者非水液體的溶液或者懸浮液；或者水包油液體乳劑或者油包水液體乳劑的形式存在。
片劑可以壓縮或者模制，任選地與一或者多種助劑的方式制備。壓縮片劑可以在適合的機器中通過壓縮自由流動形式諸如粉末或者顆粒的G1期停滯化合物以及抗病毒劑，任選地與粘合劑(例如聚乙烯吡咯烷酮，凝膠，羥丙基甲基纖維素)，潤滑劑，惰性稀釋劑，防腐劑，崩解劑(例如淀粉乙醇酸鈉，交聯的聚乙烯基吡咯烷酮，交聯的羧甲基纖維素鈉)表面活性或者分散劑混合進行制備。模制的片劑可以通過在合適的機器中模制用惰性液體稀釋劑潤濕的粉末化合物的混合物進行制備。可以任選地對片劑包衣或者刻痕并且利用例如不同比例的羥丙基甲基纖維素進行配制以便提供其中一種或者多種成分的緩釋或者控釋從而提供期望的釋放分布圖。片劑可以任選地提供有腸溶衣提供除了胃以外在部分消化道中的釋放。
適合于局部施用于口腔的制劑包括在加香母基中通常為蔗糖或者阿拉伯膠中含有一種或者多種G1期停滯化合物以及任選抗病毒劑的錠劑；在諸如凝膠以及甘油或者蔗糖并且阿拉伯膠的惰性母基中包括一種或者多種成分的軟錠劑；以及在適合的液體載體中包含一種或者多種成分的嗽口水。
用于直腸施用的制劑可以連同適合的母基包括例如可可脂或者水楊酸酯的栓劑形式存在。
適合于陰道施用的制劑可以除了包含本發明的一種或者多種化合物外包含本領域已知的合適的載體的陰道栓，棉塞，乳油，凝膠劑，糊劑，泡沫或者噴霧劑形式存在。
適合于腸胃外施用的制劑包括水以及無水等滲無菌注射溶液，其可以包含可賦予所述制劑與目的受體的血液等滲的抗氧化劑，緩沖液，抑菌劑以及溶質；以及可以包括懸浮劑以及增稠劑的水以及無水無菌懸浮液。制劑可以存在于單位劑量或者多劑量的密封容器中，例如安瓿以及小瓶中，并且可以只需在使用之前添加無菌液體載體，例如注射用水的冷凍干燥(凍干)形式保藏。現配的注射溶液以及懸浮液可以從先前描述的無菌粉末，顆粒以及片劑制備而來。
對于懷孕的受試者，本發明的藥物組合物例如可以在懷孕36周后口服施用并且持續到分娩。妊娠晚期以及分娩(發生大多數傳播的時間)前后的時間進行干預是最有效的。
除了先前描述的組合物，所述化合物也可配制成長效制劑。這種長效制劑可以通過植入(例如皮下或者肌內)或者通過肌肉注射施用。由此，例如化合物可以與適合的聚合或者疏水材料(例如作為可以接受油形式的乳劑)或者離子交換樹脂，或者作為微溶衍生物，例如作為微溶鹽一起配制。其它適合的遞送系統包括提供局部延長時間非擴散遞送藥物可能性的微球體。所施用的治療劑緩慢地從這些微球體釋放并且由周圍的組織細胞(例如內皮細胞)吸收。
如果期望組合物可以存在于包裝或者分配裝置中，所述裝置可以包括含有活性成分的一或者多種單位劑型。包裝可以例如包括金屬或者塑料薄膜，諸如薄膜包裝。包裝或者分配裝置可以附有施用的說明書。
適合的G1細胞周期劑可被用于允許持續病毒抑制從而保持較少組合抗逆轉錄病毒(ARV)治療依賴的HIV治療策略。ARV的當前目標是獲得盡可能低盡可能長的病毒抑制。需要低頻率給藥或者減少量ARV控制病毒抑制直接引起下述的與實現抗逆轉錄病毒治療的當前目標相關的問題，包括1.當前的HAART方案麻煩又復雜并且需要持續的耐受以及嚴格堅持3或更多的藥物。
2.長期嚴格堅持對于大多數患者而言是不可能的。
3.對于累積藥物毒性的長期耐受對于大多數患者而言是不可能的。
4.HIV感染的當前治療原則推薦相對晚開始HAART因為單獨的HARRT不能根除感染以及包括嚴重代謝綜合癥的藥物相關副作用的危險。
5.一些沒有治療直到疾病晚期階段的患者將具有高水平的病毒載量，其可以提高傳播的危險性以及引起公共衛生問題。
6.最后，全世界的大多數HIV感染人群大多數由于費用并不采用抗逆轉錄病毒藥物。
通過將G1細胞期停滯劑引入焦點治療方法，將轉向用較低復雜性，較少毒性以及更可承受的可應用于世界范圍的方案保持長期的病毒控制。靶向G1細胞周期減少活化T細胞的CCR5受體表達的本發明可以成功用于無需多種抗逆轉錄病毒藥物的持續治療就可保持慢性HIV-1感染的病毒抑制。這些結果對于費用，副作用以及HIV治療的有效性具有正面的影響。
本發明通過下列實施例進一步進行描述，并且所述實施例不應被認為是以任何方式對本發明進行限制。
本發明的應用除非另有陳述將使用本領域技術人員所掌握范疇內的細胞生物學，細胞培養，分子生物學，轉基因生物學，微生物學，重組DNA以及免疫學的傳統方法。這種技術全部解釋在文獻中。例如參見，Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd，Sambrook，Fritsch以及Maniatis編輯(Cold Spring Harbor Laboratory Press；1989)；DNA Cloning，I以及II卷(D.N.Glover ed.，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis et al.U.S.Patent No4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer andWalker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of ExperimentalImmunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
實施例方法和材料細胞培養以及流式細胞術如(Poli，1993；Perno，1993)所述在正常供體上進行外周血單核細胞(PBMCs)以及單核細胞-衍生的巨噬細胞(MDMs)的培養。在存在100單位/ml rhIL-2(Roche MolecularBiochemicals)條件下培養PBMCs。通過臺盼藍染色或者通過MTT分析(Roche Molecular Biochemicals)確定細胞的存活力。
RAPA購自Calbiochem。CCR5拮抗劑，TAK-779獲自NationalInstitutes of Health AIDS Research以及Reference Reagent Program(Rockville，MD)。
在IL-2存在下培養7-10天的PBMCs上測定CCR5的表面表達。如前所述(Lane，1999)進行染色但是利用CCR5mAb 182(R&D系統)。通過添加同種型-匹配的對照(IgG2b，R&DSystems)代替抗CCR5 mAb確定背景染色。通過利用FACSCalibur流式細胞儀(BD Biosciences)以及通過利用FLOWJO(Tree Star，San Carlos，CA)的分析獲得數據。
通過利用ELISA試劑盒(R&D系統)在培養上清液中測定β-趨化因子MIP-1α，MIP-1β以及RANTES的水平。
傳染性分析下列病毒用于感染試驗HIV-1 IIIb，HIV-1 ADA，HIV-1 BaL，HIV-1 JRFL，HIV-1 JRCSF以及HIV-1 SF162。HIV-1 IIIb是T細胞系適應的實驗室株，其利用CXCR4進入細胞而其余的使用CCR5進行分離。病毒獲自National Institutes of Health AIDS Research以及Reference Reagent Program。
對于PBMCs感染，將新鮮的供體PBMCs培養在含IL-2的培養基中7天。在第7天將細胞暴露于病毒3小時。通過用PBS洗滌細胞3次除去未吸附的病毒。將受感染細胞培養在IL-2培養基中。如前所述(Perno，1993)進行MDMs的感染。除非另有陳述，通過利用0.001的moi(感染多重度)感染PBMCs，并通過利用0.002的moi感染MDM。通過ELISA(NEN)或者通過測定RT分析中(Willey，1988)病毒RT的活性測定p24抗原水平監控培養上清液中的病毒生長。
PCR法通過所述的RT-PCR(Baba，1996；Levine，1996)進行CCR5以及β-趨化因子RNA序列的擴增。在一些實驗中，RAPA治療對病毒進入PBMCs的效果通過DNA PCR進行研究。簡而言之，已經用IL-2以及RAPA處理7天的PBMCs在0.05的moi用HIV-1 IIIb或者HIV-1 ADA感染3小時。病毒接種體經由0.22-μm過濾器粗濾器然后用DNase(10μg/ml)在37℃處理30分鐘凈化HIV-1 DNA的接種物。徹底洗滌受感染細胞除去殘留的病毒。感染后24小時，制備細胞裂解物，并且利用引物對M661/M667(Zack，1990)通過DNA PCR擴增等分試樣。通過液相雜交利用32P標記的探針檢測擴增產物(Spina，1995)。在磷光影像分析儀中測定雜交信號的強度。β-肌動蛋白引物用來控制樣品中DNA的輸入量。
實施例1RAPA對PBMC增殖以及存活力的影響來自正常供體的純化PBMCs在IL-2以及RAPA存在下培養(10倍系列稀釋，從104到0.01nM)。在第7天，通過MTT分析測定細胞增殖的程度。顯示了每一利用來自4個供體的細胞的2個獨立實驗之一獲得的代表性結果。對于每一供體而言，數據值為3個獨立微孔的平均值±SD。如圖1所示在≥1nM藥物濃度檢測在第7天通過MTT分析測定的增殖的降低。在高于103nM的藥物濃度觀察到藥物毒性(數據未顯示)。
實施例2RAPA下調CCR5在T淋巴細胞以及單核細胞上的表達利用通過測定正常供體以及先前表征為CCR5基因Δ32突變同型接合的供體的淋巴細胞上CCR5的表達的表面染色方案測定CCR5的特異性。染色之前，來自兩種供體的PBMCs在IL-2存在下培養7天因為這些培養條件上調了CCR5的表面表達(Bleul，1997)。描述門控CD4T細胞上CCR5表達的結果顯示在圖2A中。結果顯示了特異性檢測了CCR5在來自正常供體的CD4+T細胞上的表面表達而非在來自CCR5基因Δ32突變同型接合的個體的CD4+T細胞上的表面表達。結果顯示，用于本實施例的方法可以特異性檢測CCR5的表面表達。
為了確定RAPA對正常供體淋巴細胞上CCR5表面表達的影響，將新鮮的供體PBMCs培養在逐漸提高濃度的RAPA(0.1，1，10以及100nM)的IL-2培養基中10天。在第7以及10天，通過抗CD4以及抗CD8抗體連同抗CCR5 mAb 182的雙重染色法以及FACS上的分析測定CD4以及CD8T淋巴細胞上的CCR5表面表達。第7天以及第10天的結果顯示≥1nM濃度的RAPA下調所試驗的5個供體中CD4淋巴細胞上CCR5的表面表達。0.1nM的RAPA下調來自一些而不是所有供體的CD4淋巴細胞上CCR5蛋白的表達。顯示有效下調所有供體中CCR5的RAPA的濃度的第7天的代表性結果描述在圖2B中。CD8淋巴細胞亞型上CCR5表達的類似減少是明顯的，并且在第10天也觀察到CCR5對CD4以及CD8淋巴細胞亞型的下調(數據未顯示)。
在轉錄水平，分離自RAPA-處理的PBMC培養物的RNA的半定量RT-PCR分析顯示藥物存在下減少量的CCR5轉錄本(圖2C的上圖)。核糖體18S RNA的RT-PCR分析顯示了在產生減少水平的CCR5轉錄本樣本間類似的RNA含量(圖2C的下圖)。此外，無RT步驟時RNA樣品的擴增不會顯示擴增信號，由此排除了RNA制劑中細胞DNA污染的可能性(數據未顯示)。
類似地，RAPA下調成熟單核細胞上CCR5的細胞表面表達。對在RPMI 20/10％ABHS以及RAPA存在下培養5天的單核細胞雙重免疫染色CD14以及CCR5。在CD14-門控細胞中檢驗CCR5表面表達的改變。如圖2D所示將由抗-CCR5mAb 182獲得的免疫熒光分布圖(實線)與IgG2b同種型對照的免疫熒光相比較(虛線)。在RAPA的存在下培養5天的單核細胞與未經藥物處理的培養物相比顯示減少水平的CCR5表面表達。利用來自3個不同供體的單核細胞的實驗顯示低達0.01nM的RAPA濃度時一致的CCR5表面表達的下調。這些結果顯示RAPA減少CCR5在培養的T淋巴細胞(CD4以及CD8)以及單核細胞上的表面表達。連同PBMCs中的RT-PCR結果，這些結果顯示RAPA通過降低基因轉錄干擾CCR5的表達。
實施例3RAPA提高PBMC培養物中MIP-1α以及MIP-1β的細胞外水平因為RAPA存在下培養的淋巴細胞以及單核細胞呈遞減少水平的CCR5RNA以及蛋白，因此在RAPA-處理的PBMC培養物中測定CCR5配體MIP-1α，MIP-1β以及RANTES的水平。來自4個供體的PBMCs培養在IL-2以及RAPA存在下10天。在第10天，對每一供體測定表達CCR5的細胞的百分比以及上清液趨化因子的含量。如前述的實驗，RAPA治療引起CCR5蛋白表達水平的降低。當測定培養物上清液中的趨化因子含量時，人們發現所有4個供體中RAPA存在下MIP-1α以及MIP-1β的水平比不存在RAPA時高。在不同的供體之中，RAPA-處理的培養物包含比未處理的培養物高6-39倍的MIP-1α。類似地，在RAPA存在下與未處理的對照相比MIP-1β的水平提高17-47倍。相比之下，RAPA存在下RANTES的水平在2個供體中增加而在其他供體中保持不變乃至減少。圖3A中圖示了RAPA存在下顯示不一致RANTES水平的供體中2個獲得的趨化因子的結果。
為了確定RAPA-處理的細胞的上清液中檢測的MIP-1α以及MIP-1β蛋白水平的提高是否是轉錄活性提高的結果，通過半定量RT-PCR對來自RAPA處理的以及未處理的培養物的總RNA進行擴增。用MIP-1α以及MIP-1β特異性引物對擴增在第3，7以及10天的培養物分離的RNA顯示RAPA-處理的以及未處理的培養物之間趨化因子的轉錄本量沒有差異(數據未顯示)。這些數據暗示RAPA不通過增強趨化因子轉錄本的產量增加細胞外MIP-1α/β的水平。
上述顯示RAPA處理細胞引起CCR5轉錄本(以及蛋白水平)量的減少不增強趨化因子轉錄本產量的結果暗示所觀察到的MIP-1α/β蛋白的提高應歸于RAPA處理的細胞上趨化因子吸收的缺乏。上述結果由RAPA對MIP-1β在來源于CCR5基因Δ32突變同型接合的供體的PBMCs培養物中分泌的影響的評價得以證實，所述MIP-1β是一種運用CCR5作為其唯一受體的趨化因子。在該MIP-1β不能被CCR5胞吞的實驗組中，RAPA對MIP-1β蛋白水平的影響提供了關于RAPA提高β-趨化因子水平的機制的信息。為此，如前所述實驗在RAPA存在下培養來自2個正常供體以及來自CCR5-無效供體的刺激的PBMCs。在第10天評價上清液中MIP-1β的水平。正常供體之一獲得的代表性結果顯示在圖3B中緊接于CCR5-無效供體上獲得的結果。在正常供體中，如前述實驗所料RAPA處理引起MIP-1β蛋白水平的提高(與RAPA-未處理的對照相比提高9.3倍)。然而，在RAPA存在下CCR5-無效供體中MIP-1β水平只增加1.2倍。合起來，這些結果顯示了RAPA存在下MIP-1β蛋白以及另外的MIP-1α水平的提高反映了由于呈遞減少了CCR5共受體細胞的吸收水平的減低引起的趨化因子的累積。
實施例4PBMCs中RAPA的抗病毒活性分析感染之前在RAPA存在下培養7天的PBMCs中RAPA的抗病毒活性。細胞感染X4 HIV-1 IIIb以及R5 HIV-1 ADA株。受感染細胞在RAPA(與預處理期間相同的濃度)存在下另外培養7天，在該期間內測定病毒復制以及細胞存活力。在利用不同供體細胞的總共7個不同實驗中，RAPA的抗病毒效果抗HIV-1 ADA比抗HIV-1 IIIb更有效。圖4A所示的一個供體的結果顯示10nM RAPA時7個實驗中HIV-1 ADA抑制的平均值是91％(88-97％的)，而在100nM RAPA，HIV-1 ADA被抑制94％(92-99％的范圍)。相比之下，10nM RAPA抑制13.5％(5-25％的范圍)的HIV-1 IIIb，并且100nM RAPA抑制32％(29-60％的范圍)的HIV-1 IIIb。
為了更進一步顯示RAPA對R5比較X4 HIV-1株的不成比例的抗病毒效果，藥物的抗病毒效果通過測定感染之后不久細胞中病毒DNA進行評價。已經在藥物不存在或者存在(100nM RAPA)下培養1周的供體PBMCs感染DNase處理的R5 HIV-1ADA或者X4 HIV-1 IIIb母株。感染后24小時，制備細胞裂解物并且通過PCR擴增HIV-1的DNA序列。通過利用放射性標記探針檢測擴增的PCR產物。如圖4B所示，放射性信號的磷光影像分析儀分析顯示HIV-1 IIIb DNA的含量在RAPA-處理的以及未處理的細胞中是相同的。相比之下，RAPA-處理的細胞中HIV-1 ADA DNA的含量比未處理的細胞中低3倍。β-肌動蛋白基因的特異性引物對顯示樣本間相同的DNA輸入量(數據未顯示)。
因為HIV-1 IIIb以及HIV-1 ADA獲得的結果暗示RAPA在R5中比在X4 HIV-1中發揮更有效的抗病毒效果，然后評價低濃度RAPA(0.01，0.1以及1nM)抗5個HIV-1的R5株的試驗組的抗病毒活性，結果顯示在圖4C中。RAPA在這些濃度下顯示抗R5株的抗病毒活性但是不抗HIV-1 IIIb。0.01nM的RAPA根據毒株抑制10-64％的R5HIV-1，而0.1nM的RAPA抑制15-85％的病毒復制。1nM的RAPA抑制≥90％的所有R5病毒。合起來，這些結果顯示RAPA降低了PBMCs對于由利用CCR5的HIV-1的毒株感染的敏感度而對利用CXCR4的毒株沒有效果。
實施例5巨噬細胞中RAPA的抗病毒活性RAPA在MDMs中的抗病毒活性首先在顯示下調CCR5表達的培養條件下進行分析(參見上述結果)。為此，在RAPA存在下培養供體單核細胞5天。在第5天，細胞感染了HIV-1 ADA。RAPA存在下培養受感染細胞另外的14天。感染后第7，10以及14天在培養上清液上測定病毒產量。在實驗的最后通過MTT分析測定細胞存活力。實驗期間，RAPA以劑量依賴的方式抑制病毒復制。在第14天，0.1-100nM濃度范圍的RAPA抑制70-95％的病毒產生，如圖5所示。實驗最后的細胞存活力在RAPA濃度≥10nM時減少。在另外使用0.01nM RAPA的試驗中，R5病毒HIV-1 ADA以及HIV-1 SF 162被分別抑制64％以及45％(數據未顯示)。
上述實驗中，在5-天分化期間已經用RAPA預先處理了單核細胞。為了控制RAPA對單核細胞分化過程的可能干擾，設計了新的感染試驗其中在5-天單核細胞分化期間不存在RAPA。為此，在無RAPA時培養新鮮的單核細胞5天。在第5天，細胞感染HIV-1 ADA然后暴露于RAPA。在這些試驗條件下，利用來自2個不同供體的單核細胞的2個獨立試驗顯示在一個供體中1nM RAPA抑制～60％的病毒復制而在其它供體中抑制～80％的病毒復制(在感染后14天測定病毒產量；數據未顯示)。
合起來，這些結果顯示RAPA處理分化單核細胞干擾其成為HIV感染的易感目標的能力而且RAPA也干擾HIV在已經分化的巨噬細胞中復制的能力。
實施例6RAPA增強CCR5拮抗劑TAK-779的抗病毒活性進行檢驗確定RAPA存在下觀察到的CCR5表面表達的下調是否提高CCR5拮抗劑藥物的效力。為了檢驗這種假設，在RAPA不存在或者存在(1，10以及100nM)下將供體PBMCs培養在IL-2培養基中。7天后，在0.1nMTAK-779存在下將細胞感染HIV-1 ADA，0.1nM的TAK-779的藥物濃度顯示很低的抗病毒活性。RAPA存在下(與預處理期間相同的濃度)加0.1nM TAK-779培養受感染的細胞。感染后7天確定病毒產量。圖6中顯示的結果表明不存在RAPA時，0.1nM的TAK-779引起21％的病毒復制的抑制。然而，1nM RAPA存在下，TAK-779的抗病毒效果引起的病毒抑制從21％提高到74.5％。類似地，TAK-779的抗病毒活性在10以及100nM RAPA存在下病毒抑制分別增至89％以及96％。使用的TAK-779濃度不影響細胞存活力(數據未顯示)。這些結果暗示CCR5拮抗劑藥物的抗病毒特性通過RAPA得以增強。
圖6中顯示的結果圖解了RAPA和TAK 779組合的協同效果。如上所述，0.1nM TAK-779顯示較低的抗病毒活性并且圖4所示的結果顯示單獨施用RAPA將P24的水平降低到毫微克/ml量。然而，兩種化合物的組合將p24的水平降低到微微克/ml。由此，該組合物提供了HIV-1復制的協同降低。
實施例7RAPA以及TAK-779降低HIV-1復制的協同活性用HU以及TAK-779的組合得以進一步顯示。圖7圖解了HU協同增強CCR5拮抗劑TAK-779的抗病毒活性。在HU不存在或者存在(0以及10μM)下將供體PBMCs培養在IL-2培養基中。7天后，細胞感染HIV-1ADA。HU存在下(與預處理相同的濃度)加0，2以及20nM范圍的不同濃度的TAK-779培養受感染細胞。感染后7天確定病毒產量。TAK-779以及HU的組合顯示無HU以及TAK-799時p24的值為大約5000微微克/ml。導入10μM的HU將p24的水平降低大約60％。引入2nM的TAK-779將p24的水平降低約20％。然而，10μM的HU以及2nM的TAK-779的組合引起大約90％p24的總下降，由此顯示該組合物引起p24水平的協同減少并且提高了CCR5拮抗劑TAK-779的活性。因此，這些結果顯示了CCR5拮抗劑活性的協同增加。
實施例8為了確定HU對正常供體淋巴細胞上CCR5表面表達的效果，將新鮮的供體PBMCs培養在逐漸提高濃度的HU(0，50，100以及200μM)的IL-2培養基中10天。在第7以及10天，通過抗-CD4以及抗-CD8抗體連同抗-CCR5 mAb 182的雙重染色法以及FACS上的分析測定CD4以及CD8T淋巴細胞上的CCR5表面表達。第7天以及第10天的結果顯示≥50μM的HU濃度下調5個實驗供體中CD4淋巴細胞上的CCR5表面表達。在轉錄水平，分離自HU-處理的PBMC培養物的RNA的半定量RT-PCR分析顯示藥物存在下減少量的CCR5轉錄本(圖8B的上圖)。核糖體18S RNA的RT-PCR分析顯示了在產生減少水平的CCR5轉錄本樣本間類似的RNA含量(圖8B的下圖)。
實施例9對由于減低呈遞減少表達水平的CCR5共受體吸收的慢性HIV感染HIV-1志愿者，雷帕霉素對趨化因子受體5(CCR5)的表達以及趨化因子MIP 1α，MIP-1β以及RANTES的積累的體內效果已經顯示在大多數情況下利用趨化因子受體CCR5作為進入巨噬細胞以及CD4淋巴細胞的共受體。CCR5共受體的天然配體為稱作β-趨化因子的蛋白。在如上所述的體外模型中，據證實雷帕霉素以及其他包括羥基脲的G1細胞周期劑如圖2B-C以及8A-B所示顯著降低CCR5表面受體的表達。
為了評價CCR5的表達活性及其對CCR5受體的體內作用水平，進行開放標記非隨機化的概念驗證(Proof of concept)試驗，其中已經感染HIV的8名志愿者施用2mg/天的雷帕霉素，接著6mg的負荷劑量28天。在雷帕霉素施用的第7，14以及28天以及42天(在最后劑量的雷帕霉素后2個星期)的設盲訪問時獲得外周血確定CCR5的表達水平。8名受試者參加本研究并且迄今為止已經完成3名志愿者的實驗并且雷帕霉素得以良好耐受。
圖9圖示了在這個試驗期間感染HIV的志愿者體內觀察到的CCR5表達的改變。所有3名志愿者顯示與施用RAPA相關的最后28天CCR5表達的減少。顯而易見，志愿者001以及006經歷了CCR5表達幾乎立即的減少而志愿者007經歷了在處理后期的減少。因此，用G1-特異性試劑，雷帕霉素改變外周血單核細胞的細胞周期引起已經建立了HIV感染的HIV感染志愿者體內CCR5的RNA表達的減少；并且這種藥劑可被良好耐受。
RAPA靶向諸如CCR5的細胞組分與靶向病毒本身相比提供了不可能引起病毒抗性的抗病毒策略，因為細胞組分不期望在藥物迫使下突變。體外試驗暗示了RAPA可能比控制HIV-1的X4株更有效控制HIV-1的R5株的復制。在這方面，治療使用RAPA作為早期HIV-1疾病的治療方案(出現X4株之前)非常有價值，尤其是考慮到當前提倡延緩抗逆轉錄病毒治療開始的原則(Dybul，2002)。此外，RAPA的抗病毒特性尤其適于存在HIV-1 C亞型的地理區，因為這些病毒使用CCR5作為主要的共受體(Bjornal，1999)。過去的十年間HIV-1 C亞型感染已經開始流行，并且他們目前構成了世界范圍內的主要亞型(Essex，M.(1999)。
而且，RAPA的抗病毒特性給經歷實質器官移植的HIV感染受試者提供了抑制同種異體移植排斥的新的治療機會。RAPA的抗病毒特性聯合其抗血管生成特性(Guba，2002)暗示RAPA給經歷器官移植的HIV患者提供了較好的選擇。
總之，RAPA下調CCR5共受體表達以及增加β-趨化因子的細胞外水平的能力給HIV-1感染的治療以及預防提供了具有重要意義的新策略。RAPA以及CCR5拮抗劑的組合可尤其有效控制患者體內的病毒復制。
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權利要求
1.用于降低CCR5表面受體在單核細胞上的表達的藥物組合物，所述組合物包括治療有效量的至少一種G1期停滯化合物。
2.權利要求1的藥物組合物，更進一步包括至少一種抗病毒劑。
3.權利要求1的藥物組合物，其中的G1期停滯化合物為選自如下組分的成員丁酸鈉，阿非迪霉素，羥基脲(HU)，olomoucine，roscovitine，生育酚，生育三烯酚以及雷帕霉素(RAPA)。
4.權利要求2的藥物組合物，其中的抗病毒劑為HIV抗病毒劑。
5.權利要求4的藥物組合物，其中的HIV抗病毒劑為核苷RT抑制劑，CCR5抑制劑/拮抗劑，病毒進入抑制劑或者其功能等效物。
6.權利要求2的藥物組合物，其中的抗病毒劑為至少一種選自如下的成分疊氮胸苷(ZDV，AZT)，拉夫米定(3TC)，雙脫氧胸苷(d4T)，2′，3′-雙脫氧肌苷(ddl)，2′，3′-雙脫氧胞苷(ddC)，阿巴卡韋(ABC)，Emirivine(FTC)，替諾福韋(TDF)，德拉維拉丁(DLV)，依法韋倫(EFV)，奈韋拉平(NVP)，Fuzeon(T-20)，沙奎那維(SQV)，利托那韋(RTV)，茚地那韋(IDV)，奈非那韋(NFV)，安普那韋(APV)，洛匹那韋(LPV)，阿扎那韋，雙汰芝(ZDV/3TC)，Kaletra(RTV/LPV)，三協唯(ZDV/3TC/ABC)，SCH-C，SCH-D，PRO 140，TAK 779，TAK-220，RANTES類似物，AK602，UK-427，857，單克隆抗體，NB-2，NB-64，T-649，T-1249及其功能類似物。
7.權利要求4的藥物組合物，其中的化合物經口服，直腸，經鼻，局部，經陰道或者腸胃外施用。
8.權利要求1的藥物組合物，其中的G1期停滯劑為RAPA或者HU。
9.用于通過減少CCR5表面受體在單核細胞上的表達降低人類免疫缺陷性病毒(HIV)感染的作用的藥物組合物，所述組合物包括治療有效量的雷帕霉素。
10.權利要求9的藥物組合物，其中雷帕霉素的治療有效量為從約5mg/kg到約50mg/kg每天。
11.誘導活化淋巴細胞中抗-HIVβ-趨化因子的水平提高的方法，該方法包括施用包括至少一種有效量的G1期停滯劑以減少CCR5表面受體的表達的組合物，其中CCR5表面受體水平的減少降低HIV的病毒進入。
12.權利要求11的方法，其中的G1期停滯劑為選自如下組分的成員丁酸鈉，阿非迪霉素，羥基脲(HU)，olomoucine，roscovitine，生育酚，生育三烯酚以及雷帕霉素(RAPA)。
13.權利要求11的方法，其中的G1期停滯劑為RAPA。
14.權利要求11的方法，更進一步包括至少一種HIV抗病毒劑。
15.權利要求14的方法，其中的HIV抗病毒劑為核苷RT抑制劑，CCR5抑制劑/拮抗劑，病毒進入抑制劑或者其功能等效物。
16.權利要求13的方法，其中的抗病毒劑為選自如下組分的成員疊氮胸苷(ZDV，AZT)，拉夫米定(3TC)，雙脫氧胸苷(d4T)，2′，3′-雙脫氧肌苷(ddl)，2′，3′-雙脫氧胞苷(ddC)，阿巴卡韋(ABC)，Emirivine(FTC)，替諾福韋(TDF)，德拉維拉丁(DLV)，依法韋倫(EFV)，奈韋拉平(NVP)，Fuzeon(T-20)，沙奎那維(SQV)，利托那韋(RTV)，茚地那韋(IDV)，奈非那韋(NFV)，安普那韋(APV)，洛匹那韋(LPV)，阿扎那韋，雙汰芝(ZDV/3TC)，Kaletra(RTV/LPV)，三協唯(ZDV/3TC/ABC)，SCH-C，SCH-D，PRO 140，TAK 779，TAK-220，RANTES類似物，AK602，UK-427，857，單克隆抗體，NB-2，NB-64，T-649，T-1249及其功能類似物。
17.權利要求13的方法，其中的化合物經口服，直腸，經鼻，局部，經陰道或者腸胃外施用。
18.抗依賴于CCR5表面受體水平的病毒感染的有效治療的方法，該方法包括給受試者施用包括G1期停滯化合物的治療有效量組合物以抑制CCR5表達由此降低CCR5的表面受體以及病毒感染的復制。
19.權利要求18的方法，其中的G1期停滯化合物為選自如下組分的成員丁酸鈉，阿非迪霉素，羥基脲(HU)，olomoucine，roscovitine，生育酚，生育三烯酚以及雷帕霉素(RAPA)。
20.權利要求18的方法，更進一步包括施用有效量的至少一種HIV抗病毒劑。
21.權利要求20的方法，其中的抗病毒劑為核苷RT抑制劑，CCR5抑制劑/拮抗劑，病毒進入抑制劑或者其功能等效物。
22.權利要求21的方法，其中的抗病毒劑為至少一種選自如下的成分疊氮胸苷(ZDV，AZT)，拉夫米定(3TC)，雙脫氧胸苷(d4T)，2′，3′-雙脫氧肌苷(ddl)，2′，3′-雙脫氧胞苷(ddC)，阿巴卡韋(ABC)，Emirivine(FTC)，替諾福韋(TDF)，德拉維拉丁(DLV)，依法韋倫(EFV)，奈韋拉平(NVP)，Fuzeon(T-20)，沙奎那維(SQV)，利托那韋(RTV)，茚地那韋(IDV)，奈非那韋(NFV)，安普那韋(APV)，洛匹那韋(LPV)，阿扎那韋，雙汰芝(ZDV/3TC)，Kaletra(RTV/LPV)，三協唯(ZDV/3TC/ABC)，SCH-C，SCH-D，PRO 140，TAK 779，TAK-220，RANTES類似物，AK602，UK-427，857，單克隆抗體，NB-2，NB-64，T-649，T-1249及其功能類似物。
23.權利要求18的方法，更進一步包括施用有效量的HIV疫苗。
24.權利要求23的方法，其中的HIV疫苗以及G1期停滯劑同時施用。
25.保持HIV感染的病毒控制的方法，該方法包括施用至少一種有效量的G1期停滯化合物以使CCR5表面受體的表達以降低HIV gp120的結合位點的量降低。
26.權利要求25的方法，其中的G1期停滯化合物為選自如下組分的成員丁酸鈉，阿非迪霉素，羥基脲(HU)，olomoucine，roscovitine，生育酚，生育三烯酚以及雷帕霉素(RAPA)。
27.權利要求25的方法，其中的G1期停滯劑為雷帕霉素。
28.包括G1期停滯劑以及CCR5拮抗劑化合物的藥物組合物，其中的G1期停滯劑為雷帕霉素或者羥基脲。
29.權利要求28的藥物組合物，其中的CCR5拮抗劑化合物為TAK-779。
30.權利要求29的藥物組合物，其中雷帕霉素或者羥基脲的量足以協同增強TAK-779的活性。
31.協同增強CCR5拮抗劑化合物的活性的方法，該方法包括與G1期停滯劑組合施用CCR5拮抗劑化合物。
32.權利要求31的方法，其中的CCR5拮抗劑化合物為TAK-779并且G1期停滯劑為雷帕霉素或者羥基脲。
全文摘要
本發明涉及通過施用將細胞周期停滯在G1期的組合物操縱活化淋巴細胞中的細胞周期下調表面受體CCR5的表達，由此降低HIV進入T細胞的受體部位，并且因此降低HIV的作用。更進一步，本發明公開了組合物，所述組合物包括G1期停滯劑以及抗病毒劑，其中所述組合物協同增強抗病毒劑的活性。
文檔編號A61K31/17GK1805740SQ200480016720
公開日2006年7月19日 申請日期2004年5月17日 優先權日2003年5月16日
發明者羅伯特·R·雷德菲爾德, 安東尼·阿莫羅索, 查爾斯·E·戴維斯, 阿隆薩·埃雷迪亞 申請人:馬里蘭大學生物技術研究所