通過施用rna改變細胞性質的方法

專利名稱：通過施用rna改變細胞性質的方法
技術領域：
本發明涉及改變細胞性質。具體地，它涉及改變細胞的動員(mobilise)、遷移、整合、增殖和分化的一種或多種能力，其中這種能力是潛在的或顯著的，以及其中可以按任何的次序表現出每種能力。例如，它涉及改變干細胞的性質，包括獲得顯著的或潛在的動員、遷移、整合、增殖和分化的能力。它也涉及在體內改變干細胞性質，包括獲得顯著的或潛在的動員、遷移、整合、增殖和分化的能力。它也涉及在體外改變干細胞性質，包括獲得動員、遷移、整合、增殖和分化的能力，其中這種性質的改變在體外可以是顯著的或潛在的，或者只是在隨后導入到宿主之后在體內、或是在隨后導入到體外培養物的其它階段之后，包括導入到回體(ex vivo)的樣品之后才會成為顯著的。因此，它涉及促進功能性修復和/或再生。本發明也涉及在體外和在體內改變細胞的基因型。本發明還涉及誘導干細胞的分化，以及涉及逆轉分化細胞的分化。
背景技術：
干細胞及其在再生醫學中的應用繼續占據著科學的和非專業的出版物。干細胞是能自我更新以及也能分化成一種或多種分化細胞類型的未分化細胞。這種能分裂生成其它的干細胞以及分化的雙重能力意味著干細胞群可以保持它們的數目，同時也能生成大量的分化細胞。
干細胞存在于植物和動物的多個部位中。盡管許多對干細胞進行的最初研究都集中于胚胎干細胞，但是成體組織也含有干細胞。干細胞在例如正常組織的修復中發揮著重要作用。干細胞也生成分化細胞以取代在機體的正常工作過程中所丟失的那些細胞。例如，造血干細胞分化生成多種祖細胞，其依次生成免疫細胞的多種細胞。因此，當成熟的免疫細胞死亡時，它們被來源于造血干細胞的新的免疫細胞所取代。通過一種類似的方式，某些類型的干細胞可以生成其它類型的干細胞。
可以常規地分離干細胞群，將其用于體外培養或者可以在體內操縱。可以從多種來源中分離到干細胞，包括正常的成體組織、植入前胚胎、胎兒組織(處于發育的不同階段)和腫瘤。已經建立了成體干細胞系和胚胎干細胞系。可以將干細胞系或多或少不確定地保持在培養物中。也可以在培養物中操縱干細胞系，使得可以利用例如干細胞靶向的技術導入特異的遺傳修飾。然后可以將在體外培養或操縱的干細胞群導入到宿主體內，或導入到組織培養物的后繼形式內。
任何干細胞技術的應用核心都是在體外和在移植到受體人、動物及植物后控制干細胞動員、遷移、整合、增殖和分化的能力。盡管干細胞在體內動員、遷移、整合、增殖和分化的能力是熟知的，但是人為控制干細胞的動員、遷移、整合、增殖和分化成靶組織中的成熟細胞的能力仍處于起步階段。現有的方法很大程度上依賴于將培養的干細胞暴露于特異的生長因子和/或生長條件中。利用這些方法只能生成相當有限數目的特異的分化細胞類型。
WO 95/12665揭示了一種用于將胚胎干細胞分化成所需細胞系的方法。用編碼促進干細胞分化成特異細胞系的蛋白質或多肽的DNA工程化胚胎干細胞。所述DNA可以編碼在特殊細胞系中所發現的轉錄因子。
Dai等(2000)表明通過逆轉錄病毒介導的基因轉移將人促紅細胞生成素受體基因轉移到鼠胚胎干細胞內可以增強分化中的胚狀體的紅細胞生成。
WO 01/00650揭示了用于通過導入來自較少分化的細胞類型(例如卵母細胞)的細胞質而將受體細胞(例如人體細胞)去分化的方法。
Tada等(2001)證實成體胸腺細胞和胚胎干細胞的融合可以將體細胞的后生型的某些方面重設為胚胎干細胞的某些方面。例如，雜合體在體內顯示出多能性。

發明內容
本發明與細胞性質的改變有關。具體地，它涉及改變細胞的分化以及細胞動員、遷移、整合、增殖和分化的能力。本發明也與細胞基因型的改變以及與分化的控制有關。
不希望受理論上的限制，本發明依據于兩個假設(a)通過經來自需要再生的組織的RNA向效應細胞轉移信息而支配用于組織再生的細胞的行為；和(b)通過經RNA將信息從一個細胞轉移到另一個細胞可以實現細胞基因型的改變。
因此，本發明與促進由干細胞介導的功能修復、通過影響細胞的動員、遷移、整合、增殖和分化、成體細胞和一般意義上的干細胞的分化以及它們獲得動員、遷移、整合、增殖和分化的能力來治療多種疾病狀態有關。本發明也與細胞基因型的改變、和通過改變細胞基因型治療多種疾病狀態有關。本發明者已經發現誘導干細胞分化成所需的分化細胞類型是可能的，以及相反地逆轉分化細胞的分化以提供干細胞也是可能的。本發明者也已經發現誘導干細胞動員、遷移、整合、增殖和分化成整合到靶組織內的所需分化細胞類型是可能的，逆轉分化細胞的分化以提供干細胞是可能的，以及改變細胞的基因型也是可能的。通過向靶細胞提供特異的RNA序列可以實現這一點。
影響細胞命運或基因型的能力容許誘導多種臨床有用的現象，包括容許修復患病細胞、組織和器官，容許改變細胞的遺傳組成，容許誘導特異的細胞類型和細胞命運，容許隨意地改變免疫學特征譜(profile)，容許誘導特殊的免疫功能等等。誘導干細胞在體內的動員、遷移、整合、增殖和分化的能力意味著可以在完整生物體中，特別是在動物體內有利地促進干細胞介導的功能修復和基因型改變。
因此，本發明提供了一種用于將一種細胞性質改變為一種或多種所需細胞類型的性質的方法，其包括將分離的RNA在實現所需細胞的細胞性質被改變的條件下提供給一群細胞，分離的RNA包括可從包括所述所需細胞類型的細胞中提取的RNA序列。
分離的RNA可以是可從一種或多種具有感興趣的性質的細胞類型中提取的或提取的。分離的RNA可以包括可從一種或多種具有感興趣的性質的細胞類型中提取的RNA序列。因此，并不總是必需從所需細胞類型中提取RNA；例如，利用重組表達系統可以合成產生賦予所述細胞類型有利的性質的RNA序列。通過體外擴增分離的RNA可以生成更大量的所需RNA。
可以在體外或在體內將細胞群暴露于RNA。在體外，細胞群例如可以是細胞培養物，例如在細胞培養皿或滾瓶中的細胞培養物、或生長在支持物、膜、植入物、支架或基質上的細胞；或組織，例如生長在體外的分離的組織。在體內，細胞群可以是生物體，例如人患者、或從生物體中分離到的組織，例如器官、器官的特異部分、或特異的細胞類型或多種細胞類型的集合(collection)。
可以用本發明的方法在體內或在體外提高干細胞介導的修復。在一個實施方案中，本發明的這個方面提供了誘導細胞系的全能或多能干細胞或來源于動物或植物的組織的全能或多能干細胞分化成一種或多種所需細胞類型的方法，其包括將分離的RNA在實現所述干細胞的所需分化的條件下提供給所述干細胞的細胞培養物，所述分離的RNA包括可從包括所述所需細胞類型的組織或細胞中提取的RNA。然后可以將以這種方式在體外生成的細胞輸送給受體。對于體內處理而言，干細胞可以駐留在患者體內并在原位暴露于RNA。或者，可以將經過或未經過上述預處理的干細胞本身或聯合本發明的RNA一起施用給組織或生物體，以誘導干細胞在治療對象體內的動員、遷移、整合、增殖和分化。細胞和RNA也可以與治療特殊疾病有效的其它治療應用同時、分開或順序施用。在一個實施方案中，可從一種或多種干細胞類型或干細胞活性組織中提取的RNA可以任選地與細胞例如干細胞同時、分開或順序施用。例如，在一個特別優選的實施方案中，來自胚胎的或胎兒的、全身的、器官的、器官的特異部分的、或特異的細胞類型的或細胞類型的收集物的RNA與干細胞、或來源于體外處理的干細胞特別是骨髓干細胞的細胞同時、分開或順序施用。
在一些情況中，可以用分離的RNA本身誘導原位分化。同樣，可以用分離的RNA本身誘導原位動員、遷移、整合、增殖和分化。同樣，可以用分離的RNA本身誘導原位基因型修飾。因此，在另一方面，本發明也提供了能誘導細胞特別是干細胞的分化的RNA在治療或在生產用于提高或矯正組織或細胞損害或遺傳疾病的藥物中的用途。本發明也提供了能誘導細胞特別是干細胞的遷移、動員、整合、增殖和分化的RNA在治療或在生產用于提高或矯正組織或細胞損害或遺傳疾病的藥物中的用途，包括修復患病細胞、誘導特異的細胞類型和細胞命運、改變細胞的免疫學特征譜、和誘導特殊的所需免疫功能或性質。本發明也提供了能誘導細胞特別是干細胞的基因型修飾的RNA在治療或在生產用于提高或矯正組織或細胞損害或遺傳疾病的藥物中的用途，包括修復患病細胞、改變細胞的遺傳組成、誘導特異的細胞類型和細胞命運、改變細胞的免疫學特征譜、和誘導特殊的所需免疫功能或性質。可以將分離的RNA作為一種藥物提供給細胞群，其中RNA構成了藥物的主要活性成分。
可以用分離的RNA誘導干細胞在體內的動員、遷移、整合、增殖和分化。因此，在另一方面，本發明提供了一種治療方法，其包括給需要治療的患者施用治療有效量的能誘導干細胞分化的RNA。本發明也提供了一種治療方法，其包括給需要治療的患者施用治療有效量的能誘導干細胞動員、遷移、整合、增殖和分化的RNA。例如，可以用這些方法促進干細胞介導的功能修復，包括修復患病細胞、改變細胞的遺傳組成、誘導特異的細胞類型和細胞命運、改變細胞的免疫學特征譜、和誘導特殊的所需免疫功能或性質。
因此，可以用包括可從特殊的所需類型的干細胞或干細胞系中提取的RNA的分離的RNA促進在體內由干細胞介導的功能修復，和提高或矯正組織或細胞損害或遺傳疾病。這些損害例如可以歸結于疾病、衰老或遺傳組成(makeup)或遺傳突變、外傷、手術、任何其它形式的治療、疾病、或意外的或有意的病態。
或者，可以將RNA聯合其它的活性劑一起施加給細胞群，活性劑包括例如干細胞、或根據上述方法在體外來源于干細胞的細胞。可以同時地、順序地或分開地施用RNA和其它活性劑。
可以用本發明的方法誘導干細胞動員、遷移、整合、增殖和/或分化成一種或多種所需細胞類型。本發明的這個方面提供了一種誘導干細胞系的全能或多能干細胞或來源于動物或植物的組織的全能或多能干細胞動員、遷移、整合、增殖和/或分化成一種或多種所需細胞類型的方法，其包括將分離的RNA在實現所述干細胞的所需動員、遷移、整合、增殖和/或分化的條件下提供給所述干細胞的細胞培養物，所述分離的RNA包括可從包括所述所需細胞類型的組織或細胞中提取的RNA。在一些實施方案中，在體外處理全能或多能干細胞。在其它實施方案中，在患者體內，在體內處理全能或多能干細胞。所采用的干細胞可以是成體干細胞。
也可以用本發明的方法誘導成體細胞動員、遷移、整合、增殖和/或分化成一種或多種所需的干細胞類型。在這個方面，本發明還提供了一種用于獲得干細胞的方法。因此，本發明提供了一種在體外逆轉細胞系的分化細胞或來自動物或植物的組織的分化細胞的分化以生成所需類型的全能或多能干細胞或干細胞系的方法，其包括將分離的RNA在實現所需的將分化細胞的分化逆轉成所述類型的干細胞或干細胞系類型的條件下提供給所述分化細胞的細胞培養物，所述分離的RNA包括可從所需類型的干細胞或干細胞系中提取的RNA。本發明提供了用這種方法獲得的干細胞。本發明也提供了這些細胞在生產用于提高或校正組織或細胞損害或遺傳疾病的藥物上的用途。在其它方面，本發明提供了一種治療方法，其包括給需要治療的患者施用治療有效量的這些細胞。
在一些實施方案中，所采用的干細胞是成體干細胞，以及所需細胞類型包括胚胎干細胞或胚胎干細胞系。因此，本發明也提供了從成體干細胞生成胚胎干細胞或胚胎干細胞樣細胞的方法。
更普遍的，所采用的干細胞可以是來自胚胎后發育階段，例如胎兒、新生兒、幼體、或成體、或這些階段內的任何亞階段，以及所需細胞類型包括胚胎干細胞或胚胎干細胞系。本發明因此提供了一種從這些胚胎后階段細胞生成胚胎干細胞或胚胎干細胞樣細胞的方法。例如，本發明容許通過來自同一個體的自體(成體)干細胞的衍生作用生成用于治療成體的、具有胚胎干細胞性質的干細胞。
某些類型的干細胞只存在于特殊的發育階段(例如，某一類型的產紅細胞的干細胞存在于胎兒發育的某一階段的肝內，而具有這種類型的行為的肝干細胞在成體中并不存在)。因此，本發明提供了一種從在發育的其它階段可獲得的干細胞生成只存在于發育的某些特異階段的干細胞或干細胞樣細胞的方法。
在本發明的一些實施方案中，所采用的干細胞是特殊類型的干細胞(例如骨髓間質干細胞)以及所需細胞類型包括不同類型的干細胞(例如神經干細胞)。本發明提供了從一種類型的干細胞生成具有另一種干細胞性質的細胞的方法。
根據天然宿主的發育階段，任何特殊類型的干細胞可以具有不同的能力。因此，在一些實施方案中，所采用的干細胞是特殊類型的和特殊發育階段的干細胞(例如，成體的骨髓間質干細胞)以及所需細胞類型包括具有屬于不同發育階段的干細胞的性質的相同或不同類型的干細胞(例如，新生兒的骨髓間質干細胞)。因此，本發明也提供了一種從不同發育階段的相同或不同的類型的干細胞生成具有屬于某一發育階段的特殊類型的干細胞的性質的細胞的方法。
從干細胞生成分化細胞的能力意味著可以獲得大量的所需分化細胞。另外，從分化細胞生成干細胞的能力提供了一種比直接分離干細胞更為簡單、更少勞動強度和更少侵襲性的提供干細胞的方法。這也意味著可以從成體組織中獲得高度多能干細胞，這使得不必使用胚胎組織。通過聯合用于生產干細胞和用于分化干細胞的技術，可以生成大量的所需分化細胞。本發明的方法和藥物意味著可以在組織培養物中和在完整生物體特別是在動物中控制分化。
也可以用本發明的方法誘導成體細胞分化成其它的、不同的成體細胞類型。這些分化的實例包括修復患病(包括癌變)細胞、改變細胞的遺傳組成、誘導特異的細胞類型和細胞命運、改變細胞的免疫學特征譜、和誘導特殊所需的免疫功能或性質。
本發明也提供了用上述方法獲得的細胞。這些分化細胞可被用于生產用于治療多種疾病的藥物。因此，在其它方面，本發明提供了細胞在生產用于提高或矯正組織或細胞損害或退化或遺傳疾病的藥物中的用途。本發明包括治療方法，其包括向需要治療的患者施用治療有效量的這些細胞。而且，分化細胞可被用于診斷和/或研究的目的和/或用于生產用于診斷和/或治療的試劑。因此，在其它方面，本發明提供了細胞在診斷或研究和在生產用于診斷或研究的試劑中的用途。
利用本發明的方法可以誘導用本發明的方法獲得的干細胞動員、遷移、整合、增殖和/或分化。因此，在其它方面，本發明提供了一種生產分化細胞的方法，其包括(a)實施本發明的方法以從分化細胞生成干細胞或干細胞系；(b)對干細胞或干細胞系實施本發明的方法以生成分化細胞。所述方法可以在體內和/或在體外實施。
本發明也提供了用這些方法獲得的細胞。可以用獲得的細胞治療多種疾病。因此，本發明也提供了這些細胞在生產用于提高或矯正組織或細胞損害或遺傳疾病的藥物中的用途以及這些細胞用于診斷或研究的用途。在其它方面，本發明提供了一種治療方法，其包括給需要治療的患者施用治療有效量的這些細胞。
在一些情況中，通過本方法可以將所需的遺傳修飾導入干細胞、或來源于干細胞的細胞。


圖1通過受體動物的空間學習和記憶能力評價腦RNA分化的干細胞對大鼠腦的年齡相關性損害的作用。年齡468到506天大的外飼養(ex-breeder)雄性大鼠靜脈內給予未處理的骨髓干細胞或經腦RNA提取物處理的骨髓干細胞。顯示了接受未處理的干細胞的對照大鼠的結果(實心塊)和接受了腦處理干細胞的實驗大鼠的結果(空心圓)。結果表明了實驗大鼠的學習能力的顯著增加。
圖2脊髓RNA分化的干細胞對運動神經元疾病的動物模型的作用。SOD1小鼠靜脈內給予經脊髓RNA提取物處理的骨髓干細胞、未處理的骨髓干細胞或生理鹽水。顯示了接受了脊髓RNA處理的干細胞的實驗小鼠的結果(實心塊)、接受了未處理的干細胞的對照小鼠的結果(空心三角)和接受了生理鹽水的對照小鼠的結果(實心圓)。結果表明用脊髓來源的RNA對干細胞的預處理顯著地提高了干細胞治療在已建立的進行性神經退行性疾病模型中的療效。
圖3通過受體動物的空間學習和記憶能力評價供體組織發育階段對腦RNA分化的干細胞對小鼠腦的年齡相關性損害的作用的影響。254-299天大的C57/B1小鼠靜脈內給予經胎兒(E15)腦RNA提取物處理的骨髓干細胞、成體(90天)腦RNA提取物處理的骨髓干細胞或未處理的骨髓干細胞。顯示了接受了未處理的干細胞的對照小鼠的結果(實心塊)、接受了胎腦處理的干細胞的實驗小鼠的結果(實心圓)和接受了成體腦處理的干細胞的實驗小鼠的結果(空心三角)。結果表明實驗小鼠增加了學習能力，接受了胎腦處理的干細胞的小鼠表現出顯著地更快的學習能力。
圖4通過受體動物的空間學習和記憶能力評價直接注射骨髓干細胞來源的RNA對大鼠腦的年齡相關性損害的作用。將骨髓干細胞RNA或經RNaze處理的骨髓干細胞RNA注射到年齡433到579天之間大的外飼養的雄性大鼠的右側腦室內。顯示了接受了RNaze處理的干細胞RNA的對照大鼠的結果(實心塊)和接受了干細胞RNA的實驗大鼠的結果(空心圓)。結果表明對照大鼠不能學習任務，而經干細胞RNA處理的動物能學會任務，其具有與年輕大鼠相當的能力。
詳細描述本發明者已經發現給細胞提供來自特殊來源的RNA序列可以影響細胞性質。因此，在一個方面，本發明與促進由干細胞介導的功能修復有關。“修復”意思是組織的恢復、再生、加固、更新、復壯、或部分或完全再生或更新。由干細胞介導的修復可以出現在體外或出現在體內。本發明也與干細胞向成體的、特化的細胞的分化、成體特化的細胞向干細胞的分化、和特化的成體細胞向不同特化的其它成體細胞的分化有關。通過給靶細胞提供特異的RNA序列可以實現這一點。本發明也與在體外或體內對細胞的基因型的修飾有關。
本發明通常與細胞性質的改變有關。“性質”意思是細胞的任何所需的性質，包括為存在于細胞表面之內或之上的、或細胞所分泌的生物分子類型反映的生物性質。所需性質包括細胞內的特殊生物分子的活性狀態、或細胞所具有的一種特殊行為的能力。
性質可以是潛在的性質或者是細胞內明顯的性質。性質可以是一種特殊的表型，其意思是任何可觀察到的生理的或生化的特征。這樣的表型變化可以是例如細胞表面標記物的表達、改變的免疫功能、改變的MHC限制、改變的一種或多種蛋白的活性等等。所需的表型變化可以是更為極端的，例如細胞功能從一種組織更改(redirection)為另一種組織，例如肝細胞更改為腎細胞。這樣的表型變化可以是腫瘤細胞活性向健康細胞活性的逆轉。
因此性質可以是細胞所擁有的任何所需功能。術語“功能”意思是包括所需細胞類型所實現的任何生物活性。功能實例包括那些特異于特殊組織的功能，特殊組織例如是腦(例如，皮層、小腦、海馬、視網膜、黑質、腦室下區)、脊髓、肝臟、腎臟、肌肉、神經組織(周圍神經、中樞神經、神經元、神經膠質)、心臟組織(例如，心房、心室、瓣膜、心臟神經支配)、免疫細胞、血液、胰腺組織、胸腺組織、脾臟、皮膚和胃腸道、肺、骨、軟骨、肌腱、毛囊、感覺器官(例如，耳、眼)、任何腺體包括內分泌、外分泌、旁分泌腺體，例如甲狀腺、胸腺、垂體、腎上腺、胰腺、生殖系統(例如，睪丸、前列腺、精囊、卵巢、子宮、輸卵管、乳腺)、牙、血管、消化道組織(例如，胃、膽囊、小腸、結腸)。在更詳細的水平上，組織類型內的特殊細胞類型的功能可能是感興趣的功能，例如在腦組織內，神經元細胞或皮質神經元或神經膠質細胞在腦內具有更為特化的功能。仍在更詳細的水平上，所需功能可以是在分子水平上的功能，其中需要在細胞表面上表達特異分子，例如對于免疫系統的T細胞就需要特異的T細胞受體。徹底地羅列所有的所需功能是不可能的，在每種情況中可能需要的等價功能對于本領域技術人員是顯而易見的。
性質的改變可能造成細胞進行向著更為特化的形式或功能的分化，例如從干細胞向具有特化功能的成體細胞(例如肝細胞)的分化。改變也可以造成細胞進行向著較少特化的形式或功能的逆向分化，例如從成體特化細胞向干細胞的逆向分化。改變也可以造成細胞及其子代獲得了動員、向一種或多種組織、器官或其它部位遷移、和/或與之整合、和增殖的行為。“動員”意思是休眠靜息狀態的干細胞的變化，以及當在體內時，指的是其離開休眠靜息的位置。“遷移”意思是干細胞從它們的動員或人為輸送的位點移向和移到靶組織。“整合”意思是干細胞的相互作用以及它們與靶細胞群及環境的整合。
改變也可以造成細胞及其子代獲得了在遷移和整合之前、之中或之后增殖的行為。“增殖”意思是細胞及其子代的分裂以提供新組織。
改變也可以造成細胞進行遺傳轉化以獲得改變的、可遺傳的基因型。這樣一種改變的基因型可以逆轉細胞通過體細胞突變獲得的或細胞已經繼承的遺傳突變。通過這種方式，可以治療或預防遺傳疾病。這樣一種改變的基因型可以提供一種遺傳改變，它提供了一種附加的、修飾的、可去除的或有缺陷的功能。這種轉化方法是一種基因治療的形式，其中細胞被遺傳學改變，優選地是可遺傳的，使得改變可以被傳遞給任何子代。因此，用于提供被遺傳學修飾的，優選的是可遺傳的細胞的本發明的方法可用于體細胞或生殖細胞的基因治療。其它的實例對于本領域技術人員是顯而易見的。
因此，在一個方面，本發明提供了一種指導干細胞分化為一種或多種所需細胞類型的方法，其包括將分離的RNA在實現所述群中的干細胞的所需分化的條件下提供給一群干細胞，所述分離的RNA包括可從包括所述所需細胞類型的細胞中提取的RNA序列。本發明也提供了一種在體外指導干細胞動員、遷移、整合、增殖和分化為一種或多種所需細胞類型、或在體內與靶組織整合的方法，其包括將分離的RNA在實現所述群中的干細胞的所需分化的條件下提供給一群干細胞，所述分離的RNA包括可從包括所述所需細胞類型的細胞中提取的RNA序列。RNA可以是可從包括所述所需細胞類型的細胞中提取的或提取到的。
本發明容許將分化的方向指定為一種特殊的特化(speciality)。例如，可以將干細胞指定為肝功能，或更特異地指定為肝細胞的功能。本發明容許特殊類型的干細胞，例如骨髓間質干細胞的動員。本方法容許遷移并整合到特殊的組織內，例如左側股骨。
本發明提供了用于可控地操縱任何細胞特別是干細胞以誘導細胞分化成所需分化細胞類型的方法和藥物。這些方法包括通過指定干細胞的動員、遷移、整合、增殖和分化提高由干細胞介導的修復。
這些方法包括誘導干細胞分化成一種或多種所需的成體細胞類型。另外，本發明也提供了用于誘導逆轉分化細胞的分化以提供干細胞的方法。可以組合兩種方法，使得例如可以從分化細胞獲得干細胞，然后分化以提供不同的或相同的細胞類型的分化細胞。在后一種分化之前，可以擴增干細胞的數目和/或按所需的模式操縱例如以導入所需的遺傳修飾。
例如，可以誘導干細胞分化以實現特異的終末分化狀態。利用本發明的方法，保證分化細胞與預期受體是免疫相容的也是可能的。選擇誘導干細胞分化成哪種類型的細胞的能力意味著可能從單一的干細胞系或干細胞系生成多種不同的細胞類型。可以將本發明的RNA分子、或所獲得的分化細胞類型應用于治療，或應用于生產用于治療多種疾病的藥物。具體的，它們可以被用于提高或矯正組織或細胞損害或遺傳疾病。本發明也提供了用于在體內誘導干細胞動員、遷移、整合、增殖和/或分化以及促進由干細胞介導的功能再生和/或修復的方法和藥物。
這些方法包括誘導一種細胞類型的干細胞分化成一種或多種其它的所需干細胞類型；誘導成體細胞分化成一種或多種所需的干細胞類型以及誘導成體細胞分化成其它的、不同的成體細胞類型。
利用RNA影響細胞命運的能力容許修復患病細胞，容許改變細胞的遺傳組成，容許誘導特異的細胞類型和細胞命運，容許隨意改變免疫學特征譜，容許誘導特殊的免疫功能等等。
干細胞可以用本發明生成或分化任何合適的干細胞。也可以用本發明在體內誘導干細胞動員、遷移、整合、增殖和分化。干細胞一般被理解為一種能自我更新的細胞，它也能分化成一種或多種特異的分化細胞類型。干細胞可以是多能的，即它們可以能生成多種不同的分化細胞類型。在一些情況中，干細胞可以是全能的，即它們可以能生成其所來源的生物體中的所有不同的細胞類型。本發明適用于多能干細胞或全能干細胞。
在特別優選的實施方案中，用本發明分化或獲得成體干細胞。已知干細胞出現在動物體內的多個部位。通過本發明分化或獲得的干細胞可以是那些來自其中存在干細胞的任何器官和組織的干細胞。實例包括來自骨髓、造血系統、神經元系統、腦的干細胞、肌肉干細胞或臍帶干細胞。具體地，干細胞可以是骨髓基質干細胞、神經元干細胞或造血干細胞，在一個優選的情況中，它們可以是骨髓基質干細胞或神經元干細胞。具體地，當用本發明的方法誘導干細胞分化時，干細胞是骨髓基質細胞。
干細胞可以是植物或動物干細胞。
在一個優選的情況中，干細胞是動物干細胞和優選地是哺乳動物干細胞。在一個優選的實施方案中，干細胞可以是人干細胞。或者，干細胞可以是來自非人動物以及特別是來自非人哺乳動物。干細胞可以是那些家養動物或農業上重要的動物的干細胞。動物可以是例如綿羊、豬、牛、馬、公牛、或家禽或其它商業飼養的動物。動物可以是狗、貓或鳥，以及特別是家養動物。動物可以是非人靈長類動物，例如猴。例如，靈長類動物可以是黑猩猩、大猩猩、或猩猩。干細胞可以是嚙齒類動物干細胞。例如干細胞可以來自小鼠、大鼠、或倉鼠。
在另一個優選的情況中，干細胞可以是植物干細胞。已知干細胞存在于種子和發育中的或成體的植物中的多個部位。在本發明中分化的或獲得的干細胞可以是那些來自其中存在干細胞的任何組織的干細胞。實例包括來自頂端和根部分生組織的干細胞。在一個優選的實施方案中，干細胞來自農業上重要的植物。植物例如可以是玉米、小麥、水稻、馬鈴薯、生產可食用水果的植物或其它商業上種植的植物。
在多種情況中，可以用分化細胞治療對象或用于藥物的生產。在這些情況中，干細胞可以來自預期受體。特別地可以是這樣一種情況，其中為了逆轉分化細胞的分化以提供干細胞，利用本發明的方法獲得干細胞。在其它的情況中，干細胞可以來源于不同的對象，但是選擇與預期受體免疫相容。在一些情況中，干細胞可以來自預期受體的親屬，例如同胞、半同胞、表親、父母或孩子、以及特別地是來自同胞。干細胞可以來自無關對象，其已經被組織分型并且發現其具有一種免疫學特征譜，它使得預期受體不會形成免疫應答或只會形成很少的免疫應答，對對象無害。但是，在多種情況中，干細胞、或用于生成干細胞的分化細胞可以來自無關對象，只要可以用本發明使得干細胞與預期受體免疫相容。例如，干細胞和受體可以具有或可以不具有組織相容單元型(例如，HLA單元型)。
在一些情況中，干細胞可以是胚胎干細胞、胎兒干細胞、新生兒干細胞、或幼體干細胞。胚胎、胎兒、新生兒、或幼體干細胞可以是多能干細胞以及特別地是全能干細胞。細胞可以是來自發育的任何階段或亞階段，具體地它們可以是來源于胚泡的內細胞團(例如胚胎干細胞)。胚胎、胎兒、新生兒或幼體干細胞可以來自或來源于在此提及的任何生物體。胚胎、胎兒、新生兒或幼體干細胞可以是人干細胞或非人干細胞及特別地是非人動物干細胞(例如非人靈長類動物)。胚胎、胎兒、新生兒或幼體干細胞可以是嚙齒類動物干細胞，以及特別地是小鼠胚胎干細胞。在一些情況中，可以回收胚胎、胎兒、新生兒或幼體干細胞，然后將其用于生產治療同一對象的藥物，通常是在他們生命的一些階段。在一個實施方案中，其中采用了胚胎、胎兒、新生兒或幼體干細胞，它們是來自于已經建立了的胚胎、胎兒、新生兒或幼體干細胞系。特別地這是針對人細胞的情況。在一些情況中，干細胞可以從胚胎外組織中獲得或來源于此。干細胞可以來自臍帶，以及特別地可以來自臍帶血。
因為公共政策的原因，在某些司法管轄區內，干細胞不可以是具有形成人的能力的全能干細胞。特別的情況是干細胞是人胎兒或胚胎干細胞。
本發明也適用于干細胞系。干細胞系通常是已經從生物體中分離到的并維持在培養物中的干細胞群。因此，本發明可以適用于干細胞系，包括成體、胎兒、胚胎、新生兒或幼體干細胞系。干細胞系可以是克隆干細胞系，即它們可能來源于單一的干細胞。在一個優選的實施方案中，本發明可以適用于現有的干細胞系，特別地適用于現有的胚胎和胎兒干細胞系。在其它情況中，本發明可以適用于新建立的干細胞系。
干細胞可以是現有的干細胞系。可以用于本發明的現有的干細胞系的實例包括Geron提供的人胚胎干細胞系和Reneuron提供的神經干細胞系。在優選的情況中，干細胞系可以是一種可免費獲得的干細胞系，其使用權限是對外開放的，以及特別地它是一種現有的干細胞系。
對于人胚胎干細胞系，在一個優選的情況中，將使用預先存在的干細胞系。在本發明的一個特別優選的實施方案中，其中使用了人胚胎干細胞系，細胞系可以是這樣一種細胞系，其中在2001年8月9日下午9時EDT之前開始的衍生過程(與胚胎的破壞一起開始)。人胚胎干細胞系優選地可以是一種從因生殖目的所捐贈的胚胎中所生成的細胞系，其中該胚胎已經不再需要被用于最初的目的，因為例如它們對于需求已經是過剩的。優選地應該獲得了使用胚胎生成細胞系的知情同意書。在一個優選的情況中，所采用的人胚胎干細胞系將滿足布什總統在2001年8月9日所宣布的要求，這對于獲得用于胚胎干細胞研究的美國聯邦基金是必需的。這些被認為滿足要求的干細胞系是來自澳大利亞BresaGen Inc.、CyThera Inc.、瑞典斯德哥爾摩的Karolinska研究所、澳大利亞墨爾本的Monash大學、印度Bangalore的國立生物科學中心(National Centre for Biological Sciences)、印度Mumbai的Reliance Life Sciences、以色列海法的Technion-IsraelInstitute of Technology、加州大學舊金山分校、瑞典Goteborg的Goteborg大學、和Wisconsin Alumni Research Foundation的干細胞系。
在此對干細胞的參考文獻通常包括也適用于干細胞系的所提及的實施方案，除非例如有證據顯示靶細胞是新分離的干細胞或干細胞是體內固有的干細胞。本發明適用于新分離的干細胞以及也適用于包括干細胞的細胞群。也可以用本發明控制干細胞在體內的分化。
在本發明的方法中的最初步驟可以是分離適當的干細胞。用于分離特殊類型干細胞的方法在本領域是熟知的，并且可以用于獲得在本發明中所使用的干細胞。可以用本方法例如從本發明藥物的預期受體中回收干細胞。可以用干細胞的細胞表面標記物特征分離干細胞，例如通過細胞分選。可以從在此所提及的任何類型的對象中獲得干細胞，特別地是從那些患有在此所提及的任何疾病的對象中獲得。
在一些優選的實施方案中，可以利用本發明的方法逆轉分化細胞的分化生成干細胞而獲得干細胞。具體地，從對象中回收分化細胞，在體外處理以生成干細胞，然后在回輸到對象之前(和/或之后)可以按需操縱并分化所獲得的干細胞。因為干細胞通常只占個體內存在細胞的極少數，因此這個方法可能是優選的。這也意味著從特異個體中獲得干細胞是更為容易的，并且可以消除了對胚胎干細胞的需要。另外，這樣的一個方法通常比分離干細胞本身的方法有著更少勞動強度和花費。在一些情況中，可以從對象中分離出干細胞，在體外將其分化，然后回輸到相同的對象中。這樣的回體方法是特別優選的。
在一些情況中，靶干細胞可能是原位的，即它們可能是存在于對象體內。因此，在其它方面，本發明提供了本發明的能誘導干細胞分化的RNA在生產用于提高或矯正組織或細胞損害或遺傳疾病的藥物中的用途。本發明也包括使用本發明的分離的RNA提高或矯正組織或細胞損害或治療遺傳疾病的方法，其中分離的RNA能誘導干細胞的分化。這樣的一種方法可以被用于例如治療退行性腦病或腦或脊髓損害。它也可以被用于治療例如肝病、心臟病、骨骼肌或心肌疾病和I型糖尿病的疾病。此外，它可以被用于對抗年齡相關性退行性疾病。
在這些實施方案中，干細胞可以是在此所提及的任何類型的干細胞，以及可以是在此所提及的任何生物體中的干細胞。靶干細胞可以存在于此處所提及的、干細胞所存在的機體內的任何器官、組織或細胞群中。靶干細胞通常是天然存在于對象中的固有干細胞，但是在一些情況中，可以將利用本發明的方法所生成的干細胞轉移到對象內，然后用RNA轉移誘導分化。
多種用于在培養物中分離、維持、擴增、定性和操縱干細胞的技術是已知的，并且都可以被采用。在一些情況中，可以將遺傳修飾導入到干細胞的基因組內。干細胞本身接受這樣的操縱，用例如PCR或Southern印跡技術可以建立并容易地篩選出克隆系。可以用例如基因打靶或隨機整合的技術將變化導入到細胞的基因組內。
在一些時候，干細胞可以來源于具有遺傳缺陷的個體。然后可以進行修飾以糾正或改善缺陷。例如，可以將缺失或缺陷基因的功能拷貝導入到細胞的基因組內。可以用基因打靶導入所需的特異變化以及特別地是修飾缺陷基因使其變為正常。可以用位點特異性重組酶去除在基因打靶過程中所涉及的選擇標記物。在一個特別優選的實施方案中，可以從具有遺傳缺陷的個體中獲得分化細胞，利用本發明的方法從分化細胞中獲得干細胞，糾正或改善遺傳缺陷，然后將從其中獲得的干細胞或分化細胞用于治療原始對象或用于生產用于治療原始對象的藥物。
在一些情況中，可以選擇干細胞，因為它們具有特異的基因型。例如，可以用干細胞生產分化細胞以治療具有遺傳缺陷的對象。干細胞可能缺少遺傳缺陷。例如，可以從從缺少該缺陷的對象親屬中獲得的分化細胞中獲得或生產干細胞。例如，細胞可以來源于未患有該疾病的同胞。在一個優選的情況中，可以用本發明的方法使得細胞與預期宿主免疫相容或更好的免疫相容。
RNA分子為了生成所需的細胞性質的變化，本發明采用特異的RNA。所采用的RNA是包括可從包括下述細胞類型的組織或細胞中提取的RNA的RNA，所述細胞類型是誘導靶細胞具有一種細胞性質或用于治療受體所需的，所采用的RNA是包括可從包括組織或細胞類型的組織或細胞類型中提取的RNA的RNA，所述組織或細胞類型是再生或修復所需的。因此，在其中目標是例如誘導干細胞分化成所需的分化細胞類型的情況中，給靶細胞所提供的RNA通常是一種分離的RNA，它包括可從包括所需分化細胞類型的組織或細胞中提取的RNA序列。分離的RNA可以包括一種可從包括所需分化細胞類型的組織或細胞中提取的或提取到的RNA。
RNA來源的均一程度部分是由所需組織類型的特異性決定的。RNA可以是從特殊的組織類型中提取的，或RNA序列可以來源于特殊的組織類型，例如腦(例如，皮層、小腦、海馬、視網膜、黑質、腦室下區)、脊髓、肝臟、腎臟、肌肉、神經組織(周圍、中樞、神經元、神經膠質)、心臟組織(例如，心房、心室、瓣膜、心臟神經支配)、免疫細胞、血液、胰腺組織、胸腺組織、脾臟、皮膚、和胃腸道、肺、骨、軟骨、肌腱、毛囊、感覺器官(例如，耳、眼)、任何內分泌、外分泌、或旁分泌腺體、例如甲狀腺、胸腺、垂體、腎上腺、胰腺、生殖系統(例如，睪丸、前列腺、精囊、卵巢、子宮、法羅皮奧管、乳腺)、牙、血管、消化道組織(例如，胃、膽囊、小腸、結腸)。這些組織是由多種不同的細胞類型所構成的，例如腦組織的組成細胞包括多種亞型的神經元和神經膠質細胞、血管組織、結締組織和腦固有干細胞。RNA可以來自特殊部位的特殊類型的組織，例如左側脛骨或左側額葉。因此，更為均一的細胞群可以包括神經元，因此其中所需的細胞命運本身是特異的(例如，用于治療年齡相關性腦病)，RNA可以是從神經元提取的，或RNA序列可以是來源于神經元。更為特異的，RNA可以來自特異的神經元類型例如皮層神經元。更為特異地，RNA可以是來自特異類型的皮層神經元，例如多巴胺能皮層神經元。在這樣的一些實施方案中，RNA來自純化的細胞來源。
在一些實施方案中，本發明所采用的RNA來源于特殊的組織類型或細胞或細胞系或細胞類型的組、或一個細胞系或單一細胞類型，或RNA序列來源于這樣的來源，還可以使用來自特異發育階段的供體中的這些材料的來源。因此，RNA可以來源于來自特殊發育階段的神經元，其中發育階段與預期受體的發育階段相同、或更早或更晚。例如，用于治療心臟退行性的RNA是可以從幼體供體的心臟組織中提取的。發育階段包括胚胎、胎兒、新生兒、幼體或成體、或任一這些階段的任一亞階段。
在一些實施方案中，本發明所采用的、用于治療處于某一發育階段的受體中的組織或器官的RNA可以來源于與靶組織相關的組織或細胞類型，但是其中確切類型的來源組織只出現在不同的發育階段。例如，可以用來源于新生兒或年輕幼體的牙組織的RNA治療成體中的牙組織。
在本發明中所用的其它優選的均一的、純化的RNA來源包括胎兒、新生兒或幼體細胞的純制品以及胚胎干細胞的純制品。
在需要將分化細胞的分化逆轉為所需的干細胞類型的情況中，所提供的RNA通常是一種分離的RNA，其包括可從希望獲得的所需干細胞類型中提取的RNA序列。RNA可以從包括所述所需細胞類型的細胞中提取或提取到。
在本發明的一些實施方案中，為了實現在體內的再生或修復，所采用的RNA來源于干細胞，并將其施用到整個生物體、或器官、或組織內。這可以造成受體干細胞群本身的再生和活化，并對通常由這些干細胞所支持的組織隨之產生繼發的再生作用。在這種情況中，所提供的RNA通常是分離的RNA，其包括可從干細胞類型或干細胞活性組織中提取的RNA序列。RNA可以是可從干細胞類型或干細胞活性組織中提取或提取到的RNA。富含干細胞的組織的實例包括胎兒組織和胚胎組織、或來自正在進行生長修復或再生期的更遲發育階段的組織。
細胞RNA提取物通常包括一個異質群的不同的RNA分子種類。在異質群中的RNA分子類型可以包括信使RNA(mRNA)、核糖體RNA(rRNA)、轉移RNA(tRNA)、不均一核RNA(hnRNA)、核內小RNA(snRNA)、胞質內小RNA(scRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、轉錄相關RNAs、剪接相關RNAs、信號識別顆粒RNAs、線性RNA、環狀RNA、抑制RNA(例如siRNA)、單鏈RNA、雙鏈RNA等等。在一個優選的實施方案中，RNA包括包括所需細胞類型的組織或細胞的RNA提取物，具體地RNA可以包括或基本上由來自所需細胞類型的提取物所組成。
因此優選地從供體材料制備富含RNA的提取物。供體材料可以是例如死后所獲得的器官類型的來源。也可以從與受處理的細胞相同的來源、或從與所處理的細胞的預期受體獲得供體材料。例如，RNA提取物可以來自器官或組織或從器官或組織中分離到的細胞。例如，RNA提取物可以來自器官、組織或從下組中所分離到的細胞，所述組包括但不限于腦、脊柱、心臟、腎臟、脾臟、皮膚、胃腸道或肝臟。在一些實施方案中，可以用本發明的方法或藥物處理來源器官、組織或細胞一或多次。提取物可以來自具有特異選擇的表型的細胞系、原代細胞培養物、或具有特異的免疫學特征譜的供體組織。
RNA通常包括可從與所處理的靶細胞相同的物種中提取的RNA序列。因此，在對于為其提供RNA的靶細胞是動物細胞的情況中，RNA常常包括可從動物細胞，以及特別地從與所處理的靶細胞相同物種動物中提取的RNA序列或提取到的RNA。同樣，對于靶細胞是植物細胞的情況，RNA常常包括可從植物細胞中，以及與靶細胞相同物種的植物細胞中提取的RNA序列或提取到的RNA。
RNA可以包括從在此所提及的任何生物體或生物體組中可提取的RNA序列或提取到的RNA。RNA可以包括從在此所提及的任何干細胞類型或分化細胞類型中可提取的RNA序列或提取到的RNA。
在一些實施方案中，RNA可以包括可從與所處理的細胞的受體不同的發育階段中提取的RNA序列或提取到的RNA。例如，發育階段可以比所處理的細胞的受體更為不成熟。或者，發育階段可以是更活躍的細胞產生階段。例如，通過用從供體胚胎組織獲得的來自神經系統的RNA治療可以實現對脊髓損害的治療。發育階段也可以是一個表現出干細胞活性增強的階段。例如，在本發明的一些優選的實施方案中，RNA可以包括可從胎兒、新生兒、幼體或胚胎發育階段中提取的RNA序列或提取到的RNA。例如，對于RNA是可從腦細胞或組織中提取的情況，供體可以是處于正在發生廣泛的神經發生的發育階段，例如胎兒發育階段。本發明者已經證實提供可從早期發育階段的細胞中提取的RNA具有有利的作用，特別是對于啟動由干細胞介導的組織修復。
在其它實施方案中的發育階段可以比所處理的細胞的受體更成熟，或是更不活躍的細胞產生階段。在一些實施方案中，RNA可以包括可從已經被以任何方式預處理(例如，化學或物理處理)的或預條件化的(例如，鍛煉肌肉組織或誘導生殖組織的特殊生殖階段)組織中提取的RNA序列或提取到的RNA，這些預處理或預條件化可以修飾可提取的RNA的活性。例如，可以從已經被應激或損害的組織中提取RNA。
用如上討論的本發明的RNA進行的對細胞性質的改變可以造成靶細胞采取與從中可提取RNA的生物體相似或相同的免疫學特征譜。術語“免疫學特征譜”在此用于包括預期受體中的靶細胞的免疫學性質。因此，可以用本發明按所需方式改變靶細胞的免疫學特征譜。可以用此確保所生成的細胞、或從細胞中所生成的產物具有特異的免疫學特征譜。具體地，因此可以選擇提供給靶細胞的RNA，使得所形成的細胞、或細胞的產物具有一種免疫學特征譜，這樣它們在預期的受體體內不具有免疫原性或只生成很小的不顯著的免疫應答，優選地這不會形成有害的表型。因此，在優選的情況中所提供的RNA是可從預期受體或免疫相容的對象的細胞或組織中提取的RNA序列或提取到的RNA，特別是從中可提取的RNA。這些方法學在給患者提供同種異體移植物或異種移植物時是特別有用的，可將排異的危險減少到最小或預防排異的危險。
改變細胞的免疫學特征譜的能力可以意味著提供RNA的干細胞或分化細胞本身與預期受體不必是免疫相容的。這意味著細胞例如干細胞可能不必必需是從預期受體中分離到的，例如可以使用現有的干細胞或來自更為便利來源的干細胞。這也可以意味著可以采用具有特異的所需基因型的細胞以及具體的是干細胞，并將其轉化成相容的免疫學特征譜。例如，預期受體可以具有遺傳缺陷，而向其提供了RNA的干細胞或分化細胞可以來自不具有相同缺陷的不同對象。利用本發明可以使得供體細胞與預期受體免疫相容，同時也代償了遺傳缺陷。
因此可以用利用本發明的RNA對細胞性質的改變改變細胞的免疫性質，這樣就可以施用相對于所治療的個體是同種異體的或甚至是異種的細胞，這具有最小化的細胞排異危險。例如，可以將在注射之前用人RNA處理過的豬細胞導入到人患者體內，通過細胞表面分子表達的改變以及將它們用自身分子取代而將排異的危險最小化，否則，所述細胞表面分子將被所治療的個體識別為非自身的。因此，分離的RNA可以包括可從與所處理的靶細胞不同的物種中提取的RNA序列或提取到的RNA。
可以用利用如上討論的本發明的RNA對細胞性質的改變增強患病患者的免疫功能。例如，可以從或經自然抗性或經疫苗接種對疾病免疫或相對免疫的患者或物種中分離到用于治療的RNA序列。RNA可以具有給所治療的對象賦予抗性的作用，例如通過誘導從中提取到RNA的個體的細胞所已經具有的所需免疫功能或性質。一個實例是病原性或病毒性疾病的發病率。在這樣的情況中，可能是從相同或不同物種的抗病個體的免疫細胞例如T細胞中提取的RNA賦予了所治療的個體所需的免疫功能。一個實例可以是HIV的情況，其對黑猩猩或某些組的人都具有很小的致病作用。為了賦予人患者對AIDS的抗性，可以將從黑猩猩或這些組的人的免疫細胞中提取的RNA施用給人或給從人中分離到的免疫細胞，然后將其重新導入到人體內。
可以用利用如上討論的本發明的RNA對細胞性質的改變逆轉腫瘤生長。在此假定通過將腫瘤細胞暴露到可從健康細胞、或處于早期發育階段中的細胞中提取的RNA序列或提取到的RNA，腫瘤細胞可以被誘導逆轉成為正常的、健康的表型，或變得易感于免疫系統或遺傳完整性維護系統例如p53介導的凋亡的清除。
RNA的制備目前存在著多種用于提取供體RNA的技術。可以用這些技術獲得提供給靶細胞的RNA。或者，可以用這些技術提供RNA以鑒定RNA提取物中的必需RNA分子的序列(例如通過分級分離和篩選)。因此，本發明包括一種用于篩選RNA序列的方法，所述RNA序列能將所需的性質從一種細胞類型賦予給另一種細胞類型，其包括步驟i.從包括所需細胞類型的細胞中提取RNA；ii.將所提取到的RNA分成不同的部分；iii.將一個部分提供給一種或多種測試細胞和/或測試受體；iv.分析測試細胞或受體的從中提取出RNA的所需細胞類型所具有的改變的性質。
其中將向測試細胞或受體賦予改變的性質的部分鑒定為包括能賦予所需性質的RNA序列。
通過將RNA提取物分級分離并利用合適分析的分析RNA功能，這個篩選方法鑒定出能將所需性質從一種細胞類型賦予給另一種細胞類型的RNA序列。合適分析的一個實例是在下面的實施例1中所述類型的實驗。分析包括將分離的RNA提供給一群細胞，分離的RNA包括可從包括特殊細胞類型的細胞中提取的RNA；并確定細胞性質是否被改變為所述所需細胞類型的性質。這樣，提取物中的RNA可以被鑒定為對于本發明的目的不是必需的，并可以將其忽略(即將RNA組合物簡單化或標準化)，最終只留下起到所需活性作用的RNA分子或RNA分子的組。
因此，本發明也預期了(envisage)在RNA提取物中的已經被鑒定為能將所需性質從一種細胞類型賦予到另一種細胞類型的特異RNA序列、特異RNA亞型、或特殊RNA結構的用途。可以人工合成這些RNA分子。在一些情況中，RNA可以是基于可提取序列的序列的人工或合成的RNA或RNA類似物。類似物可以根據穩定性或能進入靶細胞的能力或其它所需性質選擇。
因此，在本發明中所采用的RNA也可以是一種包括可從包括如下一或多種細胞類型的組織或細胞中提取的RNA序列的RNA，所述一或多種細胞類型所具有的一種細胞性質是意欲誘導靶細胞以便使之具有的細胞性質。因此，對于目標是例如誘導干細胞分化成所需的分化細胞類型的情況，提供給靶細胞的RNA通常可以是一種分離的RNA，其包括可從包括所需分化細胞類型的組織或細胞中提取的RNA序列。
或者，可以例如從供體來源中制備RNA。合適的技術包括用冷或熱苯酚提取法制備。或者，通過采用商業化可獲得的試劑盒可以從特異組織或細胞中制備RNA，特別地，這些試劑盒基于蛋白的變性以及經離心分離RNA。例如，在一個優選的提取方案(冷苯酚)中，將原代供體組織或細胞勻漿于一體積的生理鹽水中。加入等體積的95％飽和苯酚，最初在超速離心機中在18,000rpm下離心30分鐘。保留水相，并通過加入1M MgCl2將其變成0.1M MgCl2溶液。然后加入兩體積乙醇，沉淀約30分鐘。在6,000rpm下最終離心15分鐘，生成了富含RNA的沉淀，可以將其保留并儲存在乙醇中。或者，可以用任何商業化可獲得的RNA提取試劑盒(例如，RNAzolTM)制備活性的富含RNA的提取物。但是，提取RNA的精密方法學對于本發明通常不是關鍵的。
在一些情況中，可以采用RNA提取物的特異部分。例如，可以根據提供給靶細胞的RNA種類的大小和特殊的重量范圍將RNA群分級分離。分級分離也可以基于重量、電荷、或可識別的普通化學特征(例如，結構、核苷酸特殊的共有序列或形式的存在)、或大小、重量或電荷或普通化學特征的任何組合。
在一些實施方案中，所采用的RNA可以包括或由提取物中存在的mRNA序列組成。在一些實施方案中，RNA部分或RNA分子可以特異地影響分化過程的一些部分，但不影響其它部分。例如，一種RNA類型或分子可以只誘導遺傳改變，但對例如遷移、終末分化、整合或增殖都沒有任何作用。在另一個實施方案中，RNA類型或分子可以影響除遺傳修飾以外的所有因素。在另一個實施方案中，RNA類型或分子只能影響遷移的定位、或只能影響增殖的程度、或只能影響終末分化的表型細胞類型，但不能影響任何其它方面。在一些情況中，RNA可以包括可從不同的細胞類型或組織中提取的序列的混和物。例如，RNA種類可以包括可從兩種、三種、四種、五種或更多的不同的細胞類型中提取的序列的混和物。對于需要分化干細胞的情況，RNA可以是例如可從不同的細胞類型中提取的，以生成具有兩種細胞類型特征的分化細胞。對于將RNA提供給具有遺傳缺陷的靶細胞的情況，RNA可以是可從包括和缺乏該缺陷的細胞中提取的序列的混和物。例如，RNA可以包括從來自具有缺陷的對象的細胞和來自缺乏缺陷的另一個對象的相同類型的細胞中提取的RNA提取物的混和物。在一些情況中，可以不存在可從所需細胞類型中提取的特異序列。例如，可以去除缺陷基因的轉錄物。例如，通過選擇性降解或通過雜交可以實現對特異序列的去除。可以用核酶分解特異序列。也可以用具有一定程度特異性的RNase分子。
可以往可提取序列中加入或從中去除特異序列。例如，在一些情況中，RNA可以來源于預期為所產細胞的最終受體的對象，以及該對象可以缺乏特異的基因序列或具有有缺陷的基因序列。在這些情況中，可以往提取物中加入對應于編碼缺失或缺陷基因的表達產物的RNA的額外RNA。在這些情況中，可以修復、修飾、去除或選擇性降解靶向的遺傳序列。
對于RNA是可從干細胞中提取的情況中，優選干細胞包括在此所提及的任何干細胞，以及特別是成體干細胞。干細胞例如可以是造血干細胞、骨髓基質干細胞或神經元干細胞。對于RNA是可從分化細胞中提取的情況中，分化細胞可以是任何的分化細胞，以及特別是成體分化細胞。在一個優選的實施方案中，分化細胞可以選自骨髓細胞、神經元細胞、或造血細胞。分化細胞可以來自任何的哺乳動物器官，例如腎臟、肝臟、心臟、胰腺、中樞神經系統、生殖器官和其它器官。
在一些實施方案中，可從細胞中提取的并在本發明的方法中所用的分離的RNA在衍生作用上是天然的。這意味著RNA不含有非天然的序列，并完全是由來自細胞所屬物種的RNA組成的。在一些實施方案中，RNA不含有病毒的、外源逆轉錄病毒或病原體序列。在一些實施方案中，RNA是均一的混和物，不含有siRNA、miRNA或其它類型的干擾RNA。在一些實施方案中，RNA可以不編碼蛋白(例如，RNA在沒有位于蛋白編碼區兩側的框內起始和終止密碼子)。在一些實施方案中，RNA不是可從腫瘤細胞中提取的。在一些實施方案中，RNA不含有一類直接激活抗病毒的免疫應答的雙鏈RNA(例如，通過與Toll受體結合)。在一些實施方案中，RNA不含有反義RNA(例如，沒有與也存在的RNA轉錄物的有義鏈互補的RNA)。本發明所用的RNA可以是整合的或非整合的。它能或不能復制。它可以有或可以沒有5’帽。它可以有或可以沒有聚腺苷酸尾。它可以作用為或可以不作用為內源性逆轉錄酶的底物。
修飾的RNA和類似物本發明一般涉及RNA的用途。該RNA包括能從包括所需特征的細胞中提取的序列。RNA向靶細胞的轉移引起了靶細胞的所需變化，該變化是由RNA決定的。
如在此所示的，決定變化的RNA是活性的，甚至當在靶細胞RNA的苯酚提取物內被輸送時仍是活性的。該苯酚提取物含有多種不同的RNA分子。如果活性與提取物內特異的RNA分子和/或序列有關，為了簡化制備和質量控制，優選地是輸送特異的RNA而不是復合物混和物。通過純化RNA提取物可以制備特異的RNA，或者可以合成或人工制備特異的RNA(例如，通過化學合成，至少部分化學合成，或通過在從模板核酸中轉錄出特異的RNA之后的純化)。
因此本發明提供了一種用于制備本發明所用的RNA的方法，其包括用化學手段、至少部分合成RNA的步驟。本發明也提供了一種用于制備本發明所用的RNA的方法，其包括步驟將所述RNA的模板與RNA聚合酶接觸，從而聚合酶可以與模板相互作用以生成所述RNA。RNA聚合酶可以是RNA依賴性RNA聚合酶，但通常是DNA依賴性RNA聚合酶(即模板優選是DNA，例如質粒形式的DNA)。
可以修飾RNA分子以增加細胞內穩定性和半衰期。可能的修飾包括，但不限于在分子的5’和/或3’末端添加側翼序列或在分子的骨架內應用硫代磷酸或2’O-甲基而不是磷酸二酯酶鍵。這個概念在生產PNA中是固有的，并可以將其擴展到這些分子的任何一種分子中，通過包含非傳統的堿基例如次黃嘌呤核苷、queosine和butosine、以及腺嘌呤、胞嘧啶核苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的乙酰化、甲基化、硫化及相似的修飾形式，這些修飾形式是不容易被內源性內切核酸酶所識別的。堿基例如假尿嘧啶、甲基胞嘧啶和次黃嘌呤核苷可以存在于這些RNA分子中。也可能包括DNA核苷酸以形成DNA/RNA嵌合體。修飾骨架的應用是本發明的修飾RNA分子的優選特征。
也可以使用RNA類似物和模擬物。可以用例如Kirshenbaum等(1999)所述的方法制備并使用模擬天然RNA結構的聚合物。這些修飾的分子和類似物在此可以被認為是“RNA”，盡管從嚴格的化學觀點上看，它們并不是簡單的核糖核酸。
給靶細胞提供RNA可以在體外或在體內給靶細胞提供RNA。RNA也可以被用于生產用于在原位給靶細胞提供RNA的藥物的生產。這特別是對于將RNA提供給動物體內的靶細胞的情況。對于植物，本發明也提供了在體外和在體內將RNA提供給靶細胞的方法。通過任何合適的技術都可以將RNA提供給靶細胞。
用于給細胞提供核酸分子的多種方法都是已知的，并且都可以采用。例如，合適的技術可以包括磷酸鈣轉染、DEAE-Dextran、電穿孔、脂質體包囊化(encapsulation)、脂質體介導的轉染、微球包囊化、利用病毒包膜顆粒的轉導和微注射。可以采用Graham&van der Eb(1978)的磷酸鈣沉淀法。在美國專利No.4,399,216中已經描述了哺乳動物細胞宿主系統轉化的一般方面，可以將其采用。對于多種用于轉化哺乳動物細胞的技術，見Keown等(1990)和Mansour等(1988)。在一些情況中，RNA或被包裹的RNA可以與化學試劑結合，這增強了靶細胞對其的攝取。例如，可以將含RNA顆粒的RNA與特異于合適受體的抗體連接。這樣的靶向化學物可以增加所有細胞類型的攝取，或可以具有特異于特殊細胞類型或干細胞類型的作用。或者，可以施用沒有與這些試劑結合的RNA，例如裸RNA。在一些情況中，可將RNA簡單地加入到細胞的培養基中一段合適的時間。例如，可以將細胞和RNA一起培養從1分鐘到10天，優選的是從1個小時到5天，更優選的是從6個小時到2天。在一個優選的實施方案中，可以將RNA與細胞一起培養12到24個小時，特別是12個小時。對于提供的RNA是包括RNA序列的脂質體形式，可以采用相似的時間段。
在其它實施方案中，RNA可以被用于治療方法或用于容許將RNA在體內提供給干細胞或其它細胞的藥物的生產。在這些情況中，RNA通常被配制，使得藥物是適合于施用給預期對象的形式。
藥物可以是RNA處于脂質體內以促進輸送或被包裝在病毒包膜顆粒內的形式。RNA可以是裸RNA分子或與蛋白質、特別是與已知能增加細胞對核酸攝取的蛋白質復合的RNA分子。
可以在給予其它治療之前、與之同時或之后聯合施用藥物，這增加了藥物在體外或在體內保持其活性狀態的時間。例如，可以將已知的RNase抑制物用于這種治療。或者，可以給予飽和劑量的無效(inactive)或犧牲(sacrificial)RNA以阻斷現有RNase活性。
可以在全身或局部給予其它治療之前、與之同時或之后聯合施用藥物，這增加了藥物在體外或在體內的攝取或作用。例如，在組織損害后以局灶或全身方式分泌的分子可以增強藥物的攝取。這些分子可以來源于受損組織本身，或來源于干細胞來源。在另一個實例中，可以聯合本發明的RNA在體外使用已知的特異組織的組織分化非RNA誘導物，例如用視黃酸有助于神經元組織的分化。在另一個實例中，可以與藥物聯合使用已知的組織培養物的非RNA支持物，例如在脊髓神經元培養物中的堿性成纖維細胞生長因子。
可以用任何合適的途徑輸送包括RNA的藥物。例如，可以腸胃外施用藥物，并可以經靜脈內、直腸、口服、耳、骨內、動脈內、肌內、皮下、皮膚、皮內、顱內、鞘內、腹腔內、局部、胸內、眶內、腦脊液內、經皮、鼻內(或其它粘膜)、肺、吸入、或其它適當的給藥途徑輸送藥物。可以將藥物直接施用到所需器官或組織上，或可全身施用。在特別優選的給藥途徑中，包括通過直接器官注射、血管通路、或通過肌內、靜脈內、或皮下途徑。可以以這種方式配制RNA以有助于向靶細胞輸送。
可以提供金屬顆粒上的RNA。在一些情況中，可以施用藥物，使得將裸RNA提供給靶細胞。對于所提供的RNA存在于脂質體或其它顆粒內的情況，在顆粒表面上可以具有靶向分子，以容許靶向預期的干細胞。例如，顆粒可以包括靶干細胞或靶分化細胞上的受體的配體。在一個優選的實施方案中，將RNA經用Felgner等(1987)的方法所制備的脂質體輸送到細胞內。其它合適的脂質里包括免疫脂質體(例如，US4,957,735)。
也可以將RNA制品與細胞例如干細胞一起施用給生物體。施用可以是同時的、分開的或順序的。也可以與治療特殊疾病的其它有效的治療同時地、分開地或順序地施用本發明的細胞和RNA。在一個實施方案中，可以與細胞例如干細胞同時地、分開地或順序地施用可從一種或多種干細胞類型或干細胞活性組織中提取的RNA。例如，在優選的實施方案中，可以與干細胞特別是骨髓干細胞同時地、分開地或順序地施用全胚胎RNA、胎兒RNA、新生兒RNA、或幼體RNA。表明通過共注射胚胎衍生的RNA部分與干細胞提高了由干細胞介導的組織修復和再生。
細胞和藥物組合物本發明提供了用本發明的方法獲得的細胞。提供的細胞可以是在合適容器中的冷凍細胞。可以提供培養物中的細胞。也提供了細胞的提取物，例如全細胞提取物。
本發明也提供了包括本發明的多種RNA分子、干細胞和/或分化細胞的藥物組合物。可以將RNA分子、干細胞和分化細胞與在藥物領域常規的標準的藥學可接受的載體和/或賦形劑一起配制。可以采用合適的用于配制細胞和核酸的技術。可以提供生理鹽水或注射用水中的細胞或核酸。配方的確切性質將依賴于一些因素，包括所施用的特殊物質和所需的給藥途徑。在Remington’s Pharmaceutical Sciences，19thEdition，Mack Publishing Company，Eastern Pennsylvania，USA中充分地描述了合適的劑型類型，通過引用的方式將其全文并入本申請。基于RNA的藥物在本領域是已知的。例如，“Ampligen”(Hemispherx Pharma)是一種包括雙鏈RNA分子的藥物。
除了上面提及的成分之外，本發明的組合物通常還包括一種或多種藥學可接受的載體，其包括本身不會誘導生成對接受組合物的個體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、緩慢代謝的大分子例如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、糖、和脂聚集物(例如油滴或脂質體)。這些載體對于本領域技術人員都是熟知的。組合物也可以含有稀釋劑，例如水、鹽水、甘油等。另外，可以存在輔助物質例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等等。無菌無致熱原的、磷酸緩沖的生理鹽水是一種常用的載體。在Gennaro(2000)中可得到對藥學可接受的賦形劑的全部討論。
本發明的組合物通常是水樣的形式(例如，溶液或懸浮液)，但是它們還可以是干燥的形式(例如凍干)。液體制劑容許直接施用來自其包裝形式的組合物，不需要在水性介質中進行復水(reconstitution)，因此其是注射用的理想劑型。組合物可以存在于藥瓶內，或它們可以存在于預先填滿的注射器中。注射器可以有或沒有針頭。一個注射器將包括單一劑量的組合物，其中一個藥瓶可以包括單個劑量或多個劑量。
可以以單位劑量的形式或以多個劑量的形式包裝本發明的組合物。對于多個劑量的形式，藥瓶優選地是預先填滿的注射器。可以常規建立有效的劑量體積，但是用于注射的典型的人劑量體積是0.5ml。
用于患者給藥的組合物的pH值優選地是在6和8之間，優選地約為7。通過在組合物中包含緩沖液可以維持穩定的pH值(例如，組氨酸或磷酸緩沖液)。組合物通常將是無菌的和/或無致熱原的。組合物相對于人體應當是等滲的。本發明的組合物可以包括提供張力的鈉鹽(例如氯化鈉)。
本發明的組合物可以包括一種抗微生物素，特別是當組合物被包裝成多劑量形式時。用于給靶細胞提供在此所討論的RNA的多種RNA制品和組合物也可以包括增加RNA穩定性的試劑。例如，它們可以包括RNase抑制劑或其它穩定RNA和/或不含RNA避免降解的試劑。也可以處理RNA制品以去除其它類型的分子，例如可以用蛋白酶或DNase處理去除蛋白和/或DNA。因此，組合物可以基本上沒有DNA和/或蛋白。
本發明的一些藥物組合物包括根據上述任一實施方案的從細胞或組織中提取到的RNA的組合，單獨或與干細胞聯合。可以與其它的活性試劑一起給患者施用本發明的細胞，例如一種或多種抗炎劑、抗凝劑和/或人血清白蛋白(優選地是重組的)，它們通常是在同一個注射液中。通常給患者施用細胞，細胞基本上是其離開培養物時的形式。但是，在一些情況中，可以在生產和施用之間處理細胞。可以在生產和施用之間保存細胞(例如深低溫保存)。細胞可以存在于維持培養基中。
特別感興趣的特異組合包括從腦組織、神經元細胞、皮層神經元等中提取到的RNA與干細胞例如骨髓間質干細胞的組合物；脊髓RNA與干細胞例如骨髓間質干細胞的組合；胎兒RNA與干細胞例如骨髓間質干細胞的組合；胚胎來源的RNA例如胚胎干細胞RNA與干細胞例如骨髓間質干細胞的組合。治療的實例包括用骨髓干細胞和胎兒腦RNA治療Alzheimer病；用骨髓干細胞和來自從幼體供體中獲得的多巴胺能神經元細胞的培養物的RNA治療帕金森病；用來自幼體或成體尸體的RNA處理過的骨髓干細胞治療心臟病；用來自正常成體尸體的胰腺的胰島細胞的RNA處理的CD34+的循環干細胞治療糖尿病；用經來源于少突膠質的原代培養物的RNA處理過的骨髓干細胞治療多發性硬化。將這些組合物同時地、分開地或順序地施用給患有疾病的患者體內，疾病是適合于本發明治療的疾病(盡管在每種情況中，通過只給受體直接施用RNA也可以實現治療)。上面顯示了這些疾病的實例。其中，一起施用干細胞和RNA，它們可以被分開或混和包裝，然后它們可以被分開或混和施用。
給對象施用治療有效量的藥物、組合物、細胞或RNA分子。根據多種參數可以確定出劑量，特別是根據所用的物質、所治療的患者的種族、年齡、體重和病變包括免疫狀態、給藥途徑、和所需的用藥方案。醫生能為任何特殊的患者確定出所需的給藥途徑和劑量。可以結合所治療的對象的年齡、體重和病變、退行性的類型和嚴重度以及給藥的頻率和途徑確定出劑量。
提供給靶細胞的RNA的量將足以給細胞性質帶來所需的改變。例如，RNA的濃度(例如在本發明的組合物中)可以從10ng到5mg/ml，優選地從100ng/ml到2.5mg/ml，更優選地從1μg/ml到500μg/ml，甚至更優選地從5μg/ml到100μg/ml，以及仍更優選地從10到50μg/ml。在一個特別優選的情況中，RNA濃度可以從15到40μg/ml，優選地從20到35μg/ml以及特別是25μg/ml。這些濃度可以應用于體外或體內的應用。在一些情況中，可以施用總共100ng到0.1g的RNA，優選地從1μg到50mg，更優選地從100μg到10mg，仍更優選地從250μg到1mg的RNA。可以提供任何合適的濃度和/或量的RNA。可以采用大范圍的濃度和/或量的RNA，以及根據向靶細胞或組織輸送RNA的方法、RNA的來源和是否在體外或在體內提供，精確的濃度和/或量都可以有所不同。為了帶來所需的改變，常規將提供給靶細胞的RNA的量最優化。
本發明提供了一種包括本發明的RNA(包括RNA模擬物、類似物和修飾RNA)的藥物組合物，其中組合物(i)具有6和8之間的pH值；(ii)包含一種緩沖液；(iii)是無菌的；以及(iv)基本上沒有致熱原。組合物中的RNA優選地是均一的。RNA優選地是組合物中的活性藥物制劑。組合物優選地位于一個容器內，將容器標簽以說明組合物的藥用目的。
用于治療對象的藥物和方法可以用本發明所提供的干細胞、RNA和分化細胞治療大量疾病以及生產合適的藥物。具體地，可以用本發明的RNA和細胞提高或矯正組織或細胞損害或遺傳疾病，以及生產合適的藥物。
本發明可以采用多種方法治療這些疾病并提供合適的藥物。具體地，給所治療的對象施用本發明的藥物可以造成(a)為了在原位誘導細胞(例如干細胞)的分化，給對象施用本發明的RNA；或為了在原位誘導細胞(例如干細胞)的動員、遷移、整合、增殖和分化，給對象施用本發明的RNA；(b)給對象施用本發明獲得的干細胞；(c)給對象施用利用本發明的方法獲得的分化細胞；(d)在施用細胞(例如干細胞或分化細胞)之前、與之聯合或之后給對象施用本發明的RNA，其中通過本發明的方法可能已經改變或沒有改變細胞；和/或(e)在給對象施用細胞之前、或之后，用本發明的RNA處理干細胞。
(f)給對象施用利用本發明的方法所獲得的具有改變的性質的細胞或干細胞；一般而言，在本發明的(b)到(f)的部分，在一些情況中，可能需要利用本發明的方法提供在數目上有所缺少、耗竭或有功能缺陷的細胞類型。可以給特異的部位或更大的區域提供本發明的細胞。例如，可以給損害或損傷的組織或器官的部位例如傷骨或斷骨提供細胞。可以給神經損傷的部位提供細胞，特別是給脊柱損傷的部位。可以給受損的或患病的肝臟、腎臟、心臟或其它器官提供細胞。對于受損的或有缺陷的心肌疾病的情況，例如心臟病的情況，死亡的或受損的細胞可以被放大或取代。同樣地，可以給患有肝病例如肝纖維化或其它類型的肝臟損害的對象提供細胞。通常提供了利用本發明的方法獲得的分化細胞或具有改變的性質(潛在的或明顯的)的細胞，但是在一些情況中，可以提供利用本發明的方法獲得的干細胞，并容許其原位分化。
a)RNA治療在此顯示了給對象施用從腦細胞中提取到的RNA具有刺激患者體內的固有干細胞以增厚腦皮層的作用。此外，已經證實從已知顯示出增加干細胞活性的發育階段中制備的RNA能刺激內源性修復機制。在上述方法學的一個實施方案中，給對象施用本發明的RNA在原位誘導了細胞(例如干細胞)的分化，通過這種方式促進了由干細胞介導的功能修復。給藥可以在原位誘導細胞的動員、遷移、整合、增殖和分化，以促進由干細胞介導的功能修復。
因此，本發明的這個方面提供了一種在體內指導細胞命運分化為一種或多種所需細胞類型或組織的功能或性質的方法，其包括將分離的RNA在實現所述細胞的所需分化的條件下提供給一群細胞，分離的RNA包括可從包括所需細胞類型的細胞中提取的RNA序列。RNA可以是可從包括所述所需細胞類型的細胞中提取的或提取到的。細胞群優選是組織，例如生長在體外的分離的組織或生物體例如人類患者。
本發明也提供了一種提高或矯正對象中的組織或細胞損害或遺傳疾病的方法，方法包括誘導對象中的全能或多能的固有干細胞分化(例如具有動員、遷移、整合和增殖)成一種或多種所需的細胞類型(例如在靶位置)，該方法包括將分離的RNA序列在實現所述干細胞的所需分化(例如動員、遷移、整合和增殖)的條件下提供給原位固有干細胞，分離的RNA序列包括可從包括所述所需細胞類型的組織或細胞中提取的RNA。RNA可以是可從包括所述所需細胞類型的細胞中提取的或提取到的。可以用本發明的方法在體內或在體外提高由干細胞介導的修復。
在一個實施方案中，本發明的這個部分提供了一種誘導動物或植物的組織中的全能或多能干細胞分化成一種或多種所需細胞類型的方法，其包括將分離的RNA在實現所述干細胞的所述分化的條件下提供給所述干細胞，分離的RNA包括可從包括所述所需細胞類型的組織或細胞中提取的RNA序列。RNA可以是可從包括所述所需細胞類型的細胞中提取的或提取到的。干細胞停留在生物體內并在原位暴露于RNA。
可以用本發明治療、緩解和逆轉腫瘤生長。上面假設通過將腫瘤細胞暴露于可從健康細胞或處于早期發育階段的細胞中提取的RNA序列(例如胎兒RNA、胚胎細胞RNA、新生兒RNA或幼體RNA)，可以誘導腫瘤細胞逆轉為更正常、健康的表型。在本發明的這個部分，用于治療腫瘤細胞的RNA序列可以來源于從患者或相關個體、無關個體、或甚至不同物種的個體中分離到的健康細胞。優選地，RNA是來自緊密相關的個體。用于治療的RNA所起源的細胞類型優選是與致腫瘤組織相似的細胞類型或相同的細胞類型。如熟練人員所知道的那樣，目前存在多種用于分型腫瘤細胞的技術。
在本發明的其它實施方案中，可以用本方法在患者體內(任選地在原位)將一種細胞類型的所需性質任意地賦予給另一種細胞類型。例如，通過相同的方式，可以將所需的免疫學特征譜賦予給靶細胞，通過從具有所需性質的細胞類型中提取RNA并將靶細胞暴露于該RNA可以將特殊細胞類型所具有的所需性質賦予靶細胞。實例包括從訓練有素的運動員的肌肉細胞中提取RNA，以賦予被治療患者所需的功能；轉移疫苗接種或天然抗病個體中對疾病的抗性；和強化患病患者的免疫功能。
在一些情況中，本發明的藥物和方法可以包括將本發明的RNA提供給原位靶干細胞。這可以造成固有干細胞分化生成所需的分化細胞類型。可以將這樣的一種方法用于任一種上面所提及的病變和疾病。在這樣的一種方法中，通常輸送RNA，使得它僅僅影響相當局限的一群干細胞。優選地，靶向的干細胞可以是那些生成疾病所涉及的特殊細胞類型的細胞，但并不一直都是這樣。例如，對象可能患有免疫系統疾病，就可以靶向于造血干細胞。
通過給適合的組織或器官局部提供RNA可以實現向所選定的干細胞群的輸送。例如，RNA的施用可以是靜脈內、直腸、口服、耳內、骨內、動脈內、肌肉內、皮下、皮膚、皮內、顱內、鞘內、腹腔內、局部、胸內、眶內、腦脊液內、結節內、病灶內、經皮、鼻內(或其它粘膜)、肺、或吸入到感興趣的位置。例如，可以通過局部注射提供RNA。可以通過將RNA注射到血管或其它脈管內并到達所需的靶位置以提供RNA。可以通過局部注射到所需組織以施用RNA。可以通過在此所提及的任一途徑施用RNA，如肌內注射或經ballistic輸送。在一些情況中，可以實現局部輸送，因為所提供的RNA是一種能特異地將RNA靶向于所選定細胞的形式。例如，可以提供脂質體或其它顆粒內的RNA，它們具有針對于特異的所需干細胞類型的靶向分子。在優選的實施方案中，可以經直接器官注射、血管通路、或經肌內、腹腔內或皮下途徑施用RNA。
在一個優選的實施方案中，如下實現RNA的施用●從包括任一在此所提及的組織類型的所需組織類型中制備RNA提取物；●直接給受影響的器官注射RNA或經如上定義的全身輸送的方式注射RNA；和●RNA誘導固有干細胞的分化，造成了例如所需細胞類型的增殖、遷移和修復。
在一些實施方案中，RNA序列是可從一種或多種分化細胞類型中提取的或提取到的。例如，在一個特異的實施方案中，RNA來源于原代組織，例如腦組織。在其它的實施方案中，RNA是可從一種或多種干細胞類型或干細胞活性組織中提取的。例如，在一個特異的實施方案中，RNA來源于成體干細胞，例如骨髓干細胞。在另一個特異的實施方案中，RNA來源于胎兒、新生兒、幼體或胚胎組織。
b)利用干細胞的治療在一些情況中，可以給對象施用利用本發明的方法獲得的干細胞，而不是施用具有用本方法經來自非干細胞的細胞的RNA所改變的性質的分化細胞或干細胞。可以施用干細胞以放大那些已經存在于對象體內的干細胞。在一些情況中，可以給組織損害的部位施用干細胞，然后容許其自然分化。在一些情況中，可以加入干細胞以放大那些已經作為缺少固有干細胞群中存在的一些缺陷和特別是遺傳缺陷的附加干細胞存在的干細胞。例如，對象可以具有一種遺傳疾病，它造成了特殊細胞類型或細胞系的缺失、特殊細胞類型或細胞系數目的減少或造成了特殊細胞類型或細胞系的缺陷。然后可以轉移缺少缺陷的干細胞以補償遺傳缺陷，因為它們可以生成所需的細胞類型或細胞系或者它們生成了缺少功能缺陷的細胞或細胞系。施用的干細胞可以增殖以保持它們的數目，并且也生成了分化細胞，因此具有長期持續的作用，減少了頻繁治療的需要。事實上，干細胞的轉移可以造成病變的永久治愈或緩解。
對象例如可以具有遺傳缺陷所引起的一種免疫缺陷。轉移利用本發明獲得的沒有缺陷的干細胞群可能足以治療疾病，因為所生成的免疫細胞群將缺少缺陷并且是有功能的。在一些情況中，疾病可能是由感染特別是由病毒感染所引起的，并且干細胞可能具有避免干細胞被感染的一些修飾。在其它情況中，可以將利用本發明的方法獲得的干細胞轉移到其自身干細胞群已經被清除的對象中。例如，對象已經被暴露于放射線或化學劑，造成了干細胞數目的減少。
在本發明的一個特別優選的實施方案中，對于干細胞被轉移到對象的情況，干細胞來源于同一個對象，利用本發明從它們的分化細胞中生成干細胞。在其它情況中，干細胞可以分化自一個免疫相容的無關個體。在一些情況中，用于獲得干細胞的分化細胞可以來自不同的個體，但是提供給細胞的RNA可以來自預期受體或遺傳相容的受體。RNA的提供可以造成干細胞與預期受體是免疫相容的。
c)利用分化細胞的治療在一個其它的實施方案中，可以給對象施用利用本發明獲得的分化細胞。在一個優選的實施方案中，可以從預期受體中獲得或生成用于獲得分化細胞的干細胞。可以施用在此所提及的任何一種分化細胞類型，以及對象可以患有在此所提及的任何一種疾病和病變。
可以給疾病所影響的局限部位施用分化細胞。例如，在糖尿病中，它們可以被輸送到胰腺；在脊髓損害中，它們可以被輸送到脊髓神經；對于腦部疾病，可以輸送到腦部等等。在一些情況中，可以給對象提供出現在一種結構中的或作為結構的一部分的分化細胞。例如，可以將分化細胞包被的支架插入到血管中或者可以給受損的或患病的肝臟提供置于基質上的肝細胞。
本發明也提供了一種提高或矯正對象中的組織或細胞損害或遺傳疾病的方法，方法包括給對象施用在體外通過誘導干細胞系的全能或多能干細胞或從動物的組織中獲得的全能或多能干細胞分化成一種或多種所需細胞類型而獲得的有效量的分化細胞，其包括將分離的RNA在實現所述干細胞的所需分化的條件下提供給所述干細胞的細胞培養物，分離的RNA包括可從包括所述所需細胞類型的組織或細胞中提取的RNA。在一個特別優選的方法中，從所治療的對象中獲得所用的干細胞。在一個甚至更優選的實施方案中，通過利用本發明的方法在體外誘導逆轉分化細胞的分化以提供干細胞而獲得所用的干細胞，以及特別地從對象中獲得用于獲得干細胞的分化細胞。
d)RNA和細胞的聯合治療本發明的RNA可以聯合其它的活性劑施用給細胞群，活性劑包括例如于細胞(具有或不具有改變的、潛在的或明顯的性質)或分化細胞。可以同時地、順序地或分開地施用RNA和其它的活性劑。
也可以采用這些成分的組合。例如，可以給對象施用包括干細胞的藥物，然后可以施用包括本發明的能誘導分化的RNA的藥物，以在原位誘導它們的分化或改變。在其它的方法學中，可以在導入RNA后導入干細胞。可以同時地、分開地或順序地施用本發明的細胞和RNA。也可以與治療特殊疾病有效的其它治療同時地、分開地或順序地施用本發明的細胞和RNA。在一個實施方案中，可以與細胞例如干細胞同時地、分開地或順序地施用可從一種或多種干細胞類型或干細胞活性組織中提取的RNA。例如，在優選的實施方案中，可以與干細胞特別是骨髓干細胞同時地、分開地或順序地施用全胚胎RNA、胎兒RNA、新生兒或幼體RNA。顯示了通過共同注射胚胎來源的RNA部分和干細胞提高了由干細胞介導的組織修復和再生。
e)在施用之前用RNA處理細胞施用本發明這個方面的本發明的藥物可能包括在給對象施用干細胞之前用本發明的RNA處理干細胞。這個方法具有增強對象中干細胞的動員、遷移、整合、增殖和/或分化的作用。在一個優選的實施方案中，用根據本發明上述的任一實施方案從一種或多種分化細胞類型中可提取的或提取到的RNA序列處理干細胞。例如，在一個特異的實施方案中，可以在將骨髓干細胞施用給對象之前用腦RNA預處理骨髓干細胞，對象是例如患有年齡相關性腦部損害的對象。在此已經成功地證實逆轉并因此治療了年齡相關性腦部疾病。在另一個特異的實施方案中，在將骨髓干細胞施用給對象之前，用脊髓RNA預處理骨髓干細胞，例如對象患有運動神經元病。在此已經證實這對于公認的運動神經元病的模型是有效的。
f)利用具有改變的性質的干細胞的治療在一個其它的實施方案中，可以給對象施用利用本發明獲得的具有改變的性質的干細胞。在一個優選的實施方案中，在體外用RNA處理之后即刻，在當一些改變的性質仍是潛在的而不是明顯的時候，施用細胞，其中可以在受體體內出現更晚階段的遷移、整合、增殖和分化。在另一個實施方案中，在增殖和分化都已經是明顯的時候施用細胞。在一個優選的實施方案中，可以從預期受體中獲得或衍生的用于獲得具有明顯的或潛在的改變的性質的干細胞。相對于在此所提及的任一分化細胞類型，可以施用具有潛在的或明顯的改變的性質的細胞，以及對象可以是患有在此所提及的任一疾病和病變的對象。
可以將具有潛在的或明顯的改變的性質的細胞施用給受疾病所影響的局部部位。例如，在糖尿病中，它們可以被輸送到胰腺；在脊髓損傷中，它們可以被輸送到脊髓神經；對于腦部疾病可以輸送到腦部等等。在一些情況中，可以給對象提供存在于一種結構上或作為結構的一部分的所述細胞。例如，可以將經所述細胞包被的支架插入到血管內或可以給受損的或患病的肝臟提供基質中的肝細胞。在另一個實施方案中，可以根據更常用的途徑施用具有改變的性質的細胞，例如通過施用到循環內、腹腔內、施用到腦脊液內、胸腔內。
通過給例如合適的組織或器官局部提供細胞可以實現具有潛在的或明顯的改變的性質的細胞的輸送。例如，細胞的施用可以是經靜脈內、骨內、動脈內、肌肉內、皮下、皮膚、皮內、顱內、鞘內、腹腔內、局部、胸腔內、眶內、腦脊液內、結節內、病灶內、經皮、鼻內(或其它粘膜)、肺、吸入到相關位置。例如，可以通過局部注射提供細胞。通過將細胞注射到血管或其它管路內使其到達所需的靶位置。可以通過給所需組織局部注射而施用細胞。可以通過在此所提及的任一途徑例如經肌肉內注射施用細胞。在優選的實施方案中，可以經直接器官注射、血管通路、或經肌肉內、腹腔內、或皮下途徑施用細胞。
本發明也提供了一種提高或矯正對象中的組織或細胞損害或遺傳疾病的方法，方法包括給對象施用有效量的具有明顯的或潛在的改變的性質的細胞，這些細胞是在體外通過改變干細胞系的全能或多能干細胞或從動物的組織中獲得的全能或多能干細胞的性質而獲得的，方法包括將分離的RNA在實現所述干細胞的性質的改變的條件下提供給所述干細胞的細胞培養物，分離的RNA包括可從包括所述所需細胞類型或組織的組織或細胞中提取的RNA。在特別優選的方法中，從所治療的對象中獲得所用的干細胞。在另一個優選的實施方案中，通過利用本發明的方法在體外誘導分化細胞的分化的逆轉以提供干細胞而獲得所用的干細胞，以及特別的，從對象中獲得用于獲得干細胞的分化細胞。
可以用本發明治療或改善退行性腦病、腦或脊髓損傷或其它神經元疾病。在優選的實施方案中，可以給患有退行性疾病的對象提供細胞，特別是患有年齡相關性退行性疾病的對象。利用本發明的藥物所治療的疾病或損害可以影響腦部。對象例如可以是患有退行性腦病的對象。腦部疾病的實例具體地包括帕金森病、帕金森型疾病、Alzhermer’s病、癡呆、其它年齡相關性腦部病變和運動神經元病。也可以治療多發性硬化。可以治療的另一種疾病是糖尿病，特別是1型和2型糖尿病，通過提供產胰島素的朗格漢斯細胞島取代或放大(augment)有缺陷的細胞。本發明也可以用于患有由關節的損害，例如關節炎所引起的疾病對象。
本發明也提供了一種用于提高或矯正組織或細胞損害或遺傳疾病的制劑(agent)，該制劑包括在此定義的RNA或分化細胞(或具有潛在的或明顯的改變性質的細胞)、或兩者的組合。例如，本發明提供了對退行性疾病和年齡相關的任何器官的退行性，例如心臟病、充血性心臟衰竭、心臟瓣膜功能不全、靜脈瓣膜功能不全、退行性腎臟疾病、和退行性肝臟疾病的治療。本發明也提供了在血管意外所引起的損害之后的組織再生，血管意外例如是缺血、血栓形成、動脈瘤和褥瘡。
本發明也提供了一種用于再生、修復或取代經任何形式的病理學、年齡或外傷所引起的受損的或缺失的組織的方法。例如，本發明提供了一種用于在脊柱的外傷性損害之后的再生和修復的方法。
在上述的治療對象的方法中，可以如在此的任何地方所定義的那樣定義干細胞、分化細胞、改變細胞、RNA、提供RNA和其它方面。對于上述的試劑，RNA或分化細胞或改變細胞可以是任何的在此所定義的RNA或分化細胞或改變細胞。
在體外用于逆轉分化細胞的分化以提供干細胞的方法本發明提供了逆轉分化細胞的分化以生產干細胞的方法。因此本發明提供了一種在體外逆轉細胞系的分化細胞或從動物或植物的組織中獲得的分化細胞的分化以生產所需類型的全能或多能干細胞或干細胞系的方法，其包括將分離的RNA在實現將分化細胞的分化逆轉成所述類型的干細胞或干細胞系類型的條件下提供給所述分化細胞的細胞培養物，分離的RNA包括可從所需類型的干細胞或干細胞系中提取的RNA序列。RNA可以是可從包括所述所需類型的細胞中提取的或提取到的。
現有的用于分離干細胞的方法常常是辛苦的并需要來自對象的大量材料，逆轉分化細胞的分化以提供干細胞的能力提供了更為便利的可選擇方法，它更不費時，更經濟和更少侵襲性。具體地，對于需要從患有疾病的對象中獲得干細胞的情況，由于從患者中回收干細胞或有限量的可回收材料所需方法的侵襲性，從這樣一個對象中直接分離到干細胞簡直是不現實的。本發明的方法也具有的優點是它可以獲得很廣范圍的干細胞以及所獲得的干細胞具有分化成很廣范圍的分化細胞類型的能力。
在本發明中所采用的分化細胞可以是任何適合的分化細胞，包括在此所提及的任何分化細胞。具體地，分化細胞可以是容易接近的細胞。可以從皮膚樣品或從口腔中獲得分化細胞。在一個特別優選的情況中，分化細胞可以是成纖維細胞以及特別是皮膚成纖維細胞。在一些情況中，可以從體液以及特別是從血液中獲得細胞。在一些情況中，可以使用白細胞例如淋巴細胞。
利用在此所述的任何方法都可以提供RNA。在給細胞提供RNA之后，可以培養并傳代所形成的干細胞。通過檢查細胞形態并檢查干細胞特異標記物的存在可以確認分化的逆轉。通過檢查被傳代的細胞經幾代后沒有發生分化也可以確認干細胞自我更新的能力。也可以檢測細胞分化成特異細胞的能力。可以確定出所獲得的干細胞的核型，特別是可以檢查其核型以保證細胞的核型在經過數代后仍是穩定的。可以擴增干細胞。可以將干細胞的樣品冷凍用于以后的施用或參照。具體地，可以冷凍已經進行少數代傳代的細胞的樣品，例如已經進行少于10代、少于5代、兩代或1代傳代的細胞。從常用的干細胞群中可以建立克隆干細胞系，并選擇出其特異的所需特征例如它們的發育能力。
也可以操縱所形成的干細胞以導入所需的遺傳修飾。例如，如果原有的分化細胞包括一種遺傳缺陷，就可以糾正該缺陷。可以導入能功能性彌補缺失的或有缺陷的序列的序列。可以導入缺失的或有缺陷的基因的功能拷貝或其它序列。可以用例如PCR和Southern印跡技術篩選和鑒定具有所需修飾的克隆。可以分化并評價所獲得的干細胞，以檢查缺陷是否已經被糾正。可以用例如基因打靶技術將位點特異性改變導入到基因的內源性拷貝中。可以聯合位點特異性重組酶采用這些技術以去除在打靶中所用的選擇性標記。具體地，利用這些技術可以糾正單基因疾病。可以糾正顯性和隱性疾病。
在本發明利用干細胞的任一方面都可以使用所獲得的干細胞。它們也可以被用于干細胞的任何其它應用。例如，它們可以被用于非人嵌合動物和轉基因的非人動物的產生。
在此顯示了利用從胚胎干細胞中提取到的RNA可以從成體干細胞生成胚胎干細胞樣細胞。也顯示了當用多種干細胞來源的RNA部分處理時，其它的分化成體組織可以被分化成干細胞樣組織。
本發明提供了利用上述方法獲得的細胞。在一些情況中，可以提供作為在合適容器中等份冷凍的細胞。本發明也提供了細胞的細胞提取物。
用于在體外誘導干細胞分化的方法本發明也提供了用于在體外誘導干細胞分化的方法。通過給細胞提供一種RNA序列實現分化，所述RNA序列包括可從需要將干細胞分化為其的細胞類型中提取的RNA。RNA可以是可從包括所述所需細胞類型的細胞中提取的或提取到的。具體地，本發明提供了一種在體外誘導干細胞系的全能或多能干細胞或從動物或植物的組織中獲得的全能或多能干細胞分化成一種或多種所需細胞類型的方法，其包括將分離的RNA在實現所述干細胞的所需分化的條件下提供給所述干細胞的細胞培養物，分離的RNA包括可從包括所需細胞類型的組織或細胞中提取的RNA序列。
在本方法中可以使用任何干細胞，包括在此所提及的任一干細胞。在一個優選的實施方案中，利用本發明的方法逆轉分化細胞的分化以提供干細胞可以獲得被分化的干細胞。在預計所獲得的分化細胞被用于對象的治療或用于生產治療對象的藥物的情況中，干細胞可以來源于預期受體。在一些情況中，干細胞可以來源于具有遺傳缺陷的受體，在這些情況中，優選地可以糾正或改善干細胞中的遺傳缺陷。
利用在此所討論的任一方法可以將RNA提供給靶干細胞。
可以將干細胞誘導成任何所需細胞類型，包括在此所提及的任一細胞類型。在一個優選的情況中，干細胞被分化成穩定的終末分化的細胞類型。終末分化細胞類型一般可以被認為是一種不會天然分化生成任何其它細胞類型的細胞類型，以及它通常處于譜系的末端。在一些情況中，干細胞可以被分化成干細胞和譜系終末細胞之間的中間細胞。這些中間物可以具有一定程度的增殖能力。
分化細胞可以是器官或組織中的細胞，例如肝臟、脾臟、心臟、腎臟、皮膚、胃腸道、眼、或生殖器官。在一個優選的實施方案中，分化細胞類型可以是一種在特殊病變下缺少的、數目減少的或有缺陷的細胞類型。病變可以是在此所提及的任一病變，包括損傷、退行性疾病或遺傳疾病所造成的病變。在一個特別優選的實施方案中，分化細胞可以是朗格漢斯細胞島，所形成的細胞可以被用于治療糖尿病。在另一種情況中，分化細胞可以是中樞神經系統中的一種細胞，它可以被用于治療中樞神經系統的疾病或損傷，特別是治療腦部疾病或脊髓損傷。在一個優選的實施方案中，骨髓基質細胞可以被分化成神經元細胞。
在一些情況中，被分化的干細胞可以是多能干細胞，而不是全能干細胞。在這些情況中，干細胞例如可以被分化成一種細胞類型，該細胞類型是已知干細胞在其從中分離的生物體中可以分化的一種細胞類型。
在一個優選的實施方案中，骨髓基質干細胞可以被分化成神經元細胞。具體地，它們可以被分化成表達神經元標記蛋白(NeuN)的神經元細胞。典型地，通過提供分離的RNA可以將骨髓干細胞分化成神經元細胞，所述分離的RNA包括可從一種或多種類型的腦細胞或腦細胞系中提取的RNA。在一些情況中，RNA可以包括可從腦組織中提取的RNA，特別地它可以包括一種可從腦組織中提取到的RNA。在一個特別優選的情況中，RNA可以包括可從皮層神經元或皮層神經元細胞系中提取的RNA。在一些情況中，可以采用可從在非腦的其它部位所發現的神經元中提取的或可從來源于這些神經元的細胞系中提取的RNA。
在另一種優選的實施方案中，可以誘導骨髓干細胞分化成肌肉細胞，特別是骨骼肌細胞。所提供的RNA序列典型地包括可從肌肉細胞或肌肉細胞系中、特別是從肌肉干細胞中提取的或提取到的RNA。
在另一個優選的實施方案中，用脊髓來源的RNA預處理骨髓干細胞，顯著地提高了干細胞治療已建立的進行性神經退行性疾病模型的療效。在這個實施方案中，所提供的RNA序列典型地包括可從脊髓細胞或周圍神經系統的其它細胞中提取的或提取到的RNA。這個方法學也可以包括在體內施用這些RNA以原位影響干細胞的增殖、遷移和功能整合。
在另一個優選的實施方案中，已經顯示用腦來源的RNA對干細胞的預處理增加了它們的增殖、遷移和功能整合到受體的神經系統中。此外，來源于更不成熟的發育階段、處于活躍細胞增殖階段的RNA表現出更為顯著的對干細胞刺激的作用以及它們對年齡和疾病相關性損害的必然的改善作用。本方法學也可以包括在體內施用這些RNA以原位影響干細胞的增殖、遷移和功能整合。
本發明提供了利用上述方法獲得的細胞。在一些情況中，可以提供作為合適容器中的等份冷凍的細胞。本發明也提供了細胞的細胞提取物。
在一些情況中，當干細胞被分化時，干細胞可以存在于一種結構之內或之上，例如支持物、膜、植入物、支架或基質，或者分化細胞可以被加入到這樣一種結構中。然后可以將結構用于生產用于治療在此所提及的任一病變的藥物。例如也可以制備不同的分化細胞類型的混和物以模擬在體內出現在一起的群。
在一個優選的實施方案中，體外方法可以包括●根據已建立的方案提供并在體外培養干細胞群；●給干細胞提供從所需靶組織類型(例如神經元、神經膠質細胞、肌肉或上面所提及的任一分化細胞類型)中提取的RNA；和●將細胞維持在培養物中；在一個其它的優選實施方案中，體外方法還可以包括步驟●從所需靶組織類型(例如神經元、神經膠質細胞、肌肉或上面所提及的任一分化細胞類型)中提取RNA。
在本發明的這些實施方案中，或1)作為裸RNA提取物，或2)經脂質體介導的轉移，或3)經對受體細胞的電穿孔或其它已建立的方法，可以將RNA優選地提供給干細胞。
然后優選地可以將所形成的分化細胞配制成藥物，其能通過合適的途徑例如經皮下、真皮下、靜脈內或腹腔內途徑給施用給對象。
一般概念術語“包括”涵蓋了“包含”和“組成”，例如包括“X”的組合物可以由X唯一地構成，或可以包含一些附加的物質例如X+Y。
術語“基本上”并不排除“完全地”，例如“基本上沒有”Y的組合物可以完全不含Y。如果需要，可以從本發明的定義中刪除術語“基本上”。
與數值x有關的術語“大約“意思是例如x±10％。
具體實施例方式
下面的實施例舉例說明了本發明。
實施例1從骨髓基質干細胞產生神經元和肌肉細胞骨髓采集和培養從成體Sprague Dawley大鼠中獲得骨髓基質(間質)干細胞。該技術基于Owen和Fridenstein(1988)的方案，并代表著一種典型的已建立的適用于體外擴增的成體干細胞來源。簡單地，在按計劃殺死鼠(斷頸)之后，在死亡的5分鐘內切下脛骨和股骨。去除骨骼上的所有結締組織和肌肉組織，在無菌條件下進行所有的其它操作。
通過用含有10％胎牛血清和1％青霉素/鏈霉素的培養基(α-MEMS-Gibco Invitrogen Co.UK)沖洗骨骼，排出骨骼中的骨髓。通過將連接在5ml塑料管上的25號針頭插入到骨骼的頸部(遠端和近端的切口)并經骨骼排出2ml培養基而實現沖洗。將培養基和骨髓樣品收集在無菌的通用容器內。隨后，通過經19號針頭輕輕地碾磨約10次將骨髓細胞分離。然后將1ml抽吸物放置到6孔板(SLS Ltd.UK)內。然后往每個孔內加入2ml新鮮的α-MEMS，使得每個板內的細胞密度為約12,000-15,000個細胞/ml。然后將板在37℃、5％CO2的空氣中孵育并留置24到48個小時(Harrison&Rae，1997)。
在這個時間段之后，通過抽吸板內的培養基，從非塑料粘附的細胞中分離出骨髓來源的干細胞。留下了塑料粘附的骨髓基質干細胞，然后加入2ml新鮮的α-MEMS(10％胎牛血清和1％青霉素/鏈霉素)支持。每48個小時供應一次新的培養基，直到板被經顯微鏡分析確認的集落形成單位(CFU)鋪滿(Owen&Friedenstein，1988，如前)。在優化條件下，在37℃需要5到7天。所形成的細胞經形態學和免疫組化確認為基質干細胞。
RNA操作制備腦勻漿液，并用RNA的商業分離試劑盒或標準的基于苯酚的操作法分離RNA。在最初的實驗中，用基于Kirby(1956)的冷苯酚提取法制備RNA。從8只新近殺死的大鼠中新近切下腦。稱量除了小腦的8克腦，并加入5ml磷酸緩沖鹽水(PBS)。在玻璃Teflon勻漿器內將混和物勻漿約4分鐘。加入相同體積的95％飽和苯酚。將所形成的溶液在室溫下放置15分鐘，然后在超速離心機內在18,000rpm離心30分鐘。保留水相，并加入1M MgCl2使得MgCl2的濃度為0.1M。然后加入2倍體積的乙醇，然后沉淀約30分鐘。最后在6,000rpm下離心15分鐘生成富含RNA的沉淀，將其保留并儲存在乙醇中。將所形成的RNA風干并溶解在如上定義的6ml新鮮培養基內。
往每個鋪滿骨髓干細胞的孔內加入1ml含有RNA的培養基，24小時。24小時之后，去除RNA培養基并用新鮮培養基取代。每12小時觀察細胞的表型變化。
另外，將細胞進行免疫組織化學分析以確定RNA在骨髓干細胞中所誘導的是神經元表型。通過測試所處理的細胞的神經元標記物NeuN的表達可以實現這一點。在下面的表中顯示了所獲得的結果。

對細胞的檢查表明在應用腦來源的RNA后24個小時，RNA誘導細胞分化變為清晰的神經元表型。未處理的骨髓干細胞仍保持經典的集落形成單位形態。但是，早到處理后12個小時，腦RNA處理的干細胞就表現出經典的神經元和神經膠質細胞的形態。另外，這些細胞表達常用于神經元的免疫化學標記物。對照細胞沒有表達。表型的這種變化可傳代存活(x3)，因此表現為受體干細胞分化中的穩定變化。通過隨后的實驗確認了供體組織RNA改變干細胞分化的作用，其中經RNaze的預處理消除了RNA的誘導作用，而其對強蛋白酶胰蛋白酶對供體腦RNA的處理具有抗性。
用來源于骨骼肌的供體RNA重復實驗以確認所誘導的分化的特異性。如上制備干細胞并用肌肉來源的RNA(利用商品化可獲得的試劑盒RNAzol制備的)處理干細胞，清楚地表現出向肌肉表型的穩定的分化改變。通過用受磷蛋白和毒傘素的免疫染色確認這一點。在肌肉研究中，經不同方法的RNA輸送，將干細胞暴露于肌肉來源的RNA(用不同的RNA分離技術所獲得的)。經用Felgner等(1987)的方法制備的脂質體將RNA輸送給干細胞。從這些研究中可以得出結論對干細胞的誘導是特異于供體組織來源的，經通常適用于將核酸輸送給細胞的多種技術可以給干細胞添加RNA。
實施例2通過受體動物的空間學習和記憶能力評價腦RNA分化的干細胞對大鼠腦的年齡相關性損害的作用如上實施例1所述在體外制備骨髓間質干細胞。當細胞鋪滿時，將細胞暴露于腦RNA(如上制備)12小時。供體干細胞來源于有色大鼠品系(Lister Hooded)。提供了來自不同大鼠品系(SpragueDawley)的供體RNA和受體動物。
受體Sprague Dawley大鼠是年齡在468-506天之間的外飼養雄性大鼠。已知這些高齡動物不能學會找到水迷宮中的隱藏平臺(Stewart&Morris，1993；Bagnall&Ray，2000)。實驗動物接受0.5ml腦RNA處理的干細胞的靜脈內注射，等同于一個6孔板的腦RNA處理細胞的產量。對照動物接受相同量的未處理的干細胞。簡單地，通過用橡膠刮棒將細胞與塑料板機械分離并經抽吸收集培養基中的細胞，從板中收集細胞，包括處理的(實驗)或未處理的(對照)細胞。經在1000rpm下旋轉5分鐘濃縮細胞，并使細胞達到上面所列的濃度。不知情地進行所有的注射操作。對于兩組而言，經尾部靜脈實施注射。
在注射后14天，在常用的空間學習任務Morris水迷宮中不知情地評價老齡大鼠。每只動物在3天的時間內接受每天3次游泳，試驗中間間隔10分鐘(Stewart&Morris，1993)。記錄下每只動物在每個試驗中發現平臺的潛伏期。每個試驗由60秒的游泳構成。如果在間隔之后，動物還沒有找到平臺，試驗者輕輕地將其引導到平臺。在達到平臺之后，容許動物停留10秒鐘以便在回到飼養籠之前定位其位置。通過在重復試驗中縮短找到平臺的時間可以證明學習能力。
在圖1中顯示了研究的結果。靜脈內接受沒有暴露于RNA的干細胞的對照大鼠(n＝9)不能學會這個任務，在多次試驗中都沒有縮短其反應潛伏期。但是，接受了經腦RNA處理的干細胞的實驗動物表現出與年輕嚙齒類動物相當的顯著的學習能力(p＜0.0000000001)。從這個研究中可以得出兩個結論。首先，經RNA處理的干細胞能顯著地改善年齡相關的空間學習缺陷。對照未處理的干細胞則不能。第二，應當注意到所捐贈的干細胞是來自于不同的大鼠品系，以及不需要受體動物成為免疫缺陷的。因此，結果提示實驗組細胞不僅分化成了能功能改善的合適的神經組織，它們還獲得了一種使得它們能被受體接受的免疫狀態。應當注意到供體腦RNA來源于受體的同胞動物，供體細胞來源于不同系。
結果不僅確認了RNA分化的干細胞能通過恢復行為能力修復年齡相關性損害，而且這樣處理的細胞還獲得了供體RNA的免疫特征。這就提供了一種改變干細胞系或干細胞庫的免疫學特征譜以生成具有與受體特異相容性的分化細胞的策略。
實施例3經外源性RNA刺激的分化、遷移和整合對固有干細胞的體內刺激。
在實施例1和2中獲得了外源性RNA對干細胞的強刺激作用，和這些細胞對修復哺乳動物模型中的年齡相關性損害的作用，現在進一步給出其它的實施例，確立原代組織來源的RNA對宿主動物的固有干細胞的作用。為此，新生大鼠在出生后第1天就接受了腹腔內注射供體表達GFP的粗制骨髓。每只動物接受了含有約800,000個細胞的0.2ml注射液。這些外來細胞容易與宿主骨髓整合，并因為其生物學環境而容易被觀察到。在90天大時，隨機地將GFP骨髓移植動物分成兩組。
實驗動物接受腦RNA注射，對照動物接受生理鹽水注射。如實施例1所述制備實驗腦RNA。進行皮下注射。每只動物接受了含有與一個全腦等價的供體RNA的0.5ml注射液。對照接受了等價的生理鹽水注射液。
所獲得的結果顯示實驗動物比對照動物具有顯著增厚的受體皮層(p＜0.0001)。另外，在實驗動物中的顯著數量的分化神經元和神經膠質細胞都表現出GFP的表達，說明在應用外源性腦RNA之后固有骨髓干細胞對腦部的浸潤。
實施例4通過從皮層神經元的原代細胞培養物中分離到的外源RNA誘導干細胞的分化。
根據Saneto和de Vellis(1987)的方案，在實驗室中建立了胚胎皮層神經元的純化培養物。簡單地，在懷孕16天時，殺死定時交配的Sprague Dawley雌性大鼠。用70％乙醇消毒腹部區域，并暴露出子宮。然后切下含有胚胎的子宮，并將其放置在100mm培養皿內。為了預防污染，所有的上述操作都在無菌罩外面的凈化臺上進行。在無菌條件下進行所有的其它操作。
然后用生理鹽水沖洗整個子宮，并將其轉移到另一個無菌培養皿內。然后從子宮中切割下胚胎并將其放置在一個新的用于腦部切割的培養皿內。暴露出腦組織并用刮勺輕輕地將其取出，在解剖顯微鏡下解剖出皮層。然后在生理鹽水中清楚地切開腦膜。在處理了皮層之后，反復地通過10ml玻璃吸管將其輕輕地弄碎。然后將細胞懸浮液流經Nitex130過濾器(篩孔大小130μm)，并在40g下離心過濾。然后將沉淀重新分散在無血清的基礎培養基中(Saneto&deVellis，1987，如前)，并流經Nitex130(篩孔大小33μm)，計數細胞。
往懸浮液中補加胰島素(5μg/ml)和運鐵蛋白(100μg/ml)以形成神經元專用培養基。將細胞按1×105個細胞/孔的密度種植在經多賴氨酸(2.5μg/ml)預先包被的24孔培養板上。用表達標記物神經纖維蛋白，而不表達星形膠質細胞及少突膠質細胞的生化及免疫標記物的免疫學標準確認培養物中含有超過95％的神經元(Saneto&deVellis，1987，如前)。在鋪板后，每3天更換培養基，并在RNA提取之前維持培養物12天。
根據廠商的說明利用商業試劑盒(RNAzol)從原代皮層神經元培養物中提取RNA。收集所形成的RNA并在應用到如實施例1中所制備的大鼠骨髓細胞的鋪滿集落之前將其重新溶解在骨髓培養基中(如實施例1所定義)。每個受體骨髓培養孔都接受了從一個完整的24孔原代神經元培養物中提取的總RNA(盡管多種外源性RNA的濃度都獲得了相似的結果)。
在應用溶解在培養基中的外源性RNA后24個小時，顯微鏡下檢查骨髓干細胞。對照骨髓干細胞接受了相等量的RNAzol制備的骨髓干細胞RNA。
結果顯示所有實驗干細胞孔都清楚地產生了分化神經元，其神經元標記物染色陽性。在骨髓RNA處理的孔中沒有發現干細胞分化的可觀察到的變化。這些結果說明來自純化細胞來源的供體RNA可以誘導高度特異的干細胞分化。
外源性RNA部分的分化誘導作用對于RNaze對供體RNA的預處理是敏感的，而對胰蛋白酶是不敏感的。這說明是RNA介導了這個作用。利用包括脂質體或電穿孔的多種輸送方法和載體外源輸送廣泛范圍的RNA劑量可以重復這些作用。
實施例5經外源性應用從干細胞來源中獲得的RNA部分對終末分化細胞的逆轉化在實施例1到4中給出了RNA組織提取物對干細胞分化的強大的和特異的作用，提供最后一個技術實施例。在此，從培養的于細胞中獲得了供體的富含RNA的提取物。通過向終末分化的成體成纖維細胞外源性應用干細胞來源的RNA部分以探討受體的成熟分化細胞是否能再分化成干細胞的特征和行為，并測試其逆轉分化的能力。所獲得的結果顯示可以從分化組織中生成干細胞類型組織。
根據Kawaja等(1992)的方案，獲得成體大鼠(Lister Hooded)的成纖維細胞，并將其保持在培養條件下。將皮膚的活檢物(近1cm2)放置在含有磷酸緩沖鹽水(PBS)(pH7.4)的無菌Petri皿內。然后將活檢物浸泡(3x)在另一個裝滿70％乙醇的皿中，然后放回到新鮮的PBS中，并將其切成1-2mm的碎片。將這些分離塊放置到預先裝有1ml Delbecco基本必需培養基(加有10％胎牛血清(FBS)和0.1％谷氨酰胺，也加有10單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)的60mm組織培養皿內。在5％CO2和37℃下孵育培養物。
在這些的培養條件下兩天之后，成纖維細胞開始從分離塊中遷出，在此階段加入附加的2-3ml營養培養基。
當板達到近90％被鋪滿時，通過將培養物與1-2ml胰蛋白酶溶液孵育將細胞傳代，轉移到15ml離心管內，然后在臺式離心機(benchcentrifuge)中室溫下離心10分鐘。去除上清液，將細胞沉淀物重懸在10ml培養基中。將細胞在未處理的6孔板中保持到匯合，每個板都加有含有0.5ml細胞懸浮液的2ml培養基。此時它們還可以被進一步傳代。
供體DNA來源于如實施例1中所報道的保持在培養物中的成體大鼠骨髓間質干細胞或來源于根據Reynolds&Weiss(1992)的方案培養的神經干細胞(神經球)。按照產品說明，用RNAzole分離法制備所有的富含RNA的提取物。因此，可以獲得兩種供體RNA部分1)骨髓干細胞RNA(BMS-RNA)和2)神經干細胞RNA(NS-RNA)。按從0.75μg/ml到500μg/ml的不同濃度將這些RNA部分分別溶解在成纖維細胞生長培養基中，并將其加入到保持在最終培養孔中的成體分化成纖維細胞5天。用干細胞來源的外源性RNA對成纖維細胞的轉化表現出跨度范圍很大的劑量。
在所獲得的結果中，沒有用外源性干細胞RNA處理的分化成纖維細胞沒有表現出表型的變化。在RNA應用48個小時之后，用25μg/ml RNA劑量的外源性的NS-RNA或BMS-RNA處理的成纖維細胞都表現出清楚的形態學變化。NS-RNA處理的受體成纖維細胞所形成的浮球具有神經球的表觀和特征，從這些神經表型細胞中開始發散出那些容易在形態上被鑒定為神經元和神經膠質細胞的細胞。例如在25μg/ml的BMS-RNA處理的受體成纖維細胞表現出間質干細胞的經典的雙極形態并且能粘附塑料。
隨后的試驗顯示當如實施例1中所述用外源性RNA進一步誘導時，這些細胞能生成神經元和肌肉組織。外源性干細胞來源的RNA部分的逆分化誘導作用對于用RNaze對供體RNA的預處理是敏感的，而對胰蛋白酶是不敏感的。這說明作用是由RNA所介導的。利用經各種轉運方法和載體包括脂質體或電穿孔外源性轉運的廣泛范圍的RNA劑量可以重復這些作用。
因此，當分化的成體組織被各種干細胞來源的RNA部分處理時，它們可被逆分化成干細胞樣組織。所形成的細胞的性質反映出供體干細胞的形態學、行為和能力。因此，提供了一種新的和倫理上較少爭議的獲得用于各種在退行性醫學上的應用的全能和多能干細胞的方法。
實施例6脊髓RNA處理的骨髓干細胞和未分化的骨髓干細胞在運動神經元病的動物模型中的比較SOD1小鼠是一種已建立好的人運動神經元病的動物模型。這些轉基因動物在70-90日齡時表現出后肢癱瘓，以及運動神經元的進行性丟失并在120-135日齡時死亡。在這個研究中使用了30只動物。確認所有的動物都表達SOD1基因型。將動物隨機地分成如下的三個組(i)組1-與脊髓RNA一起孵育的骨髓干細胞；(ii)組2-僅有骨髓干細胞；和(iii)組3-PBS注射液。
如實施例1所述收集并培養供體骨髓干細胞。利用在實施例1中所述的Kirby方案從新近殺死的成體C57/B1小鼠中制備出脊髓RNA。將在組1中所用的干細胞與脊髓RNA孵育5個小時(250μg/ml)，在新鮮培養基中洗滌兩次，然后將其濃縮在0.1ml中，以用于給每只動物注射約90,000個細胞。將組2中用于注射的干細胞保持在培養物中，不暴露于RNA并給予5個小時對新鮮培養基的等價暴露。
每個組中的受體動物都接受了經尾部靜脈的注射。利用30G針頭實施注射。對72日齡到86日齡之間的受體動物實施注射，此時所有的動物都表現出后肢癱瘓。每日記錄下在每種條件中存活動物的數目。另外，在簡單的跑步測試中每周評價肢體運動以觀察后肢和前肢的功能。
在圖2中顯示了這個研究的結果。用脊髓來源的RNA對干細胞的預處理顯著地提高了干細胞治療在已建立的進行性神經退行性疾病模型中的療效。未處理的骨髓來源的干細胞的確具有一些作用，但是用RNA預分化干細胞這一新的步驟顯著地提高了作用。從這個實施例中還注意到，在RNA干細胞組中的所有存活動物(6)以及在僅有干細胞組中的存活者(1)的治療前癱瘓完全復原，并且所述治療防止了這種正常地進行性疾病的進一步進展。
實施例7RNA供體組織的年齡和發育階段對干細胞遷移、整合和修復的作用已經在各種應用中認識到了供體組織來源的RNA對干細胞的作用，這里提供了一個進一步的實施例，探討了在RNA提取之前的供體組織的發育階段對干細胞增殖、遷移和整合到宿主組織內的作用。
如在實施例1中所列的從表達Tau-GFP的小鼠中收集并培養骨髓干細胞。受體動物(N＝24)是254-299天大的C57/B1小鼠，它們被隨機地分成三個受體組(n＝8)。干細胞培養物被隨機分到三種用于注射前RNA處理的條件(i)組1胎兒(E15)腦RNA+干細胞；(ii)組2成體(90天)腦RNA+干細胞；和(iii)組3干細胞+沒有RNA。
利用在實施例1中詳細描述的Kirby法提取RNA，并將上面詳細描述的合適來源的RNA以200μg/ml的濃度溶解在培養基中。每孔的受體培養物在2ml補加1ml含RNA培養基(組1和2)的新鮮培養基中或3ml新鮮培養基(組3)中孵育12個小時。然后洗滌細胞兩次并將其在0.3μl新鮮培養基中濃縮為含有約40,000個細胞以用于注射。將動物麻醉，并利用立體定位系統將細胞注射到腦的左側腦室內。在手術后20天，利用在實施例2中報告的用于大鼠的相同的訓練方案，在小鼠Morris水迷宮中評價所有的組。這個年齡的小鼠表現出與利用該訓練方法的老齡大鼠相似的空間學習的缺陷。在訓練之后，殺死受體大鼠，并檢查腦組織的皮層厚度，并用熒光顯微鏡評價表達GFP的細胞的存活、增殖和遷移。
在圖3中顯示了行為的結果。當與組3中的動物比較時，在組1和組2中的動物在Morris水迷宮中都表現出極好的學習能力。這還顯示出外源性RNA處理對干細胞在修復年齡相關性腦損害中的刺激作用(見實施例2和6)。另外，胎兒RNA+干細胞組比成體RNA+干細胞組表現出顯著更快的任務的達成(p＜1×10-10)。這些數據說明當用于處理用于組織修復的干細胞時，來源于正出現廣泛神經發生時的發育階段的RNA可能具有更為顯著的作用。對皮層厚度的檢查進一步支持了這個結論。
對在每只動物中的20個同一解剖橫切面中的皮層厚度的測定顯示出成體RNA+干細胞受體和僅有干細胞組之間的顯著差異(p＜1×10-5)，這證實了相似的大鼠的數據(見實施例3)。但是，在胎兒RNA+干細胞組中的皮層測定值也顯著地比成體RNA組更厚。在熒光顯微鏡下的光學觀察顯示成體RNA+干細胞組在整個被注射側的以及對側的半球都有廣泛分布的表達GFP的細胞。但是，胎兒RNA+干細胞動物在整個兩個半球的皮層內比成體RNA組多約30％的細胞。在僅有干細胞組中，表達GFP的細胞主要位于注射的側腦室的下緣以及嗅球。只是偶爾有細胞位于同側皮層。
從這個研究中可以得出結論用腦來源的RNA對干細胞的預處理增加了干細胞的增殖、遷移和功能遷移到受體神經系統內。另外，來源于更不成熟的發育階段(活躍的細胞繁殖階段)的RNA可能對干細胞刺激以及干細胞所造成的年齡和疾病相關的改善作用具有更為明顯的作用。
實施例8成體干細胞來源的RNA對內源性神經干細胞及其活性的刺激作用的比較在實施例3中提供的證據顯示內源性RNA對固有骨髓干細胞恢復年齡相關性行為缺陷具有刺激作用。也描述了(實施例5)干細胞來源的RNA能影響分化組織。本實施例探討了直接注射骨髓干細胞來源的RNA是否能刺激內源性修復機制改善年齡相關性行為缺陷。現在已知各種內源性神經修復方法，包括神經干細胞介導的直接神經生成以及干細胞分泌能影響受損的分化組織的生存因子。
如實施例1中所述收集并體外培養骨髓干細胞。然后選擇用于RNA提取的匯合的培養物。利用商業產品RNAzol按產品說明書實施RNA提取。然后將所形成的骨髓RNA溶解在PBS(200μg/ml)中，準備用于注射到受體體內。
受體Sprague Dawley大鼠是年齡在433天和570天之間的外飼養(ex-breeder)的雄大鼠。因為嚴重的年齡相關性對CNS的損害，這些動物不能學習或記憶Morris水迷宮任務。匹配年齡將受體分成兩組，每組10只動物(i)組1-接受15μl干細胞RNA注射；和(ii)組2-接受15μl用RNaze處理的干細胞RNA注射(見實施例1)。
在麻醉下，經立體定位將RNA注射到右側腦室內。簡而言之，將受體大鼠麻醉，刮干凈頭部并將其置于立體定位框內。用100％乙醇消毒皮膚，經縱向切口暴露出顱骨。在囟門前1.5mm和中線外側1.5mm處鉆出1.5mm寬的孔。用30G皮下針頭的尖部切開可見的硬腦膜。經立體定位將裝滿內容物的管子插入到側腦室內，并以5μl逐漸地射入內容物。在去除之前將管子在原位留置2分鐘，用縫線閉合切口。
在注射后14天，如實施例2中所述在Morris水迷宮中盲向評價老齡大鼠。
在圖4中顯示了這個研究的結果。接受失活的干細胞RNA(RNase處理過的)對照大鼠不能學會任務。在試驗過程中沒有應答時間的縮短。但是，用干細胞RNA處理的動物都學會了任務，其在能力上與年輕大鼠相當。
干細胞來源的RNA對刺激老齡受體腦中的內源性修復機制具有顯著的作用(p＝1.28×10-45)。通過對固有神經干細胞神經生成本身的刺激或通過增加在組織修復中所涉及的分泌性分子產物的產生都可以實現這個作用。
也已經用125μg/μl劑量的胎兒(E12)來源的全腦RNA(n＝8)和注射PBS的對照(n＝8)重復了這個試驗，具有相似的刺激作用。注射胎兒RNA的動物比對照進行地明顯更好(p＜1×10-5)。這個重復試驗說明從已知顯示增加的干細胞活性的發育階段中制備的RNA也能用于刺激內源性修復機制。
實施例9胎腦提取的RNA對受損的腦組織的體外作用實施例8中的兩個研究的結果說明來源于干細胞活性組織的外源性RNA或干細胞來源的RNA不僅可能影響內源性干細胞，也可能影響固有分化細胞。實施例5也顯示了這一點。當前的描述探討了胎腦來源的RNA對放置在體外的成體腦皮層細胞的作用。
已經知道胎兒神經元能在組織培養物中存活，而成體皮層神經元不能很好地存活。主要原因是細胞在最初的細胞制備和鋪板過程中遭受的損害。已知分解外傷能產生不可修復的損害。已經假設來自活躍發育的(胎兒)組織中的RNA可以修復這樣的損害，并增強這些細胞的存活。
利用在實施例1中所述的Kirby方案從3g新鮮的胎兒(E18)皮層中提取RNA。
通過在實施例4中所述的技術(Saneto&deVallis，1987)培養成體神經組織。這個方案生成了極好的胎兒皮層神經元的培養物，但是利用這個方法，成體皮層的制備物不能存活。從48天大的SpragueDawley大鼠中切割下來源皮層，并將其以約1×105個細胞的密度鋪板到24孔板內。據此制備出96孔板。在鋪板后24個小時，觀察到所有的孔都有大量的死亡的、壞死的和即將死亡的細胞。用150μg溶解在神經元培養基中的胎腦RNA處理每個24孔板中的12個孔。每個對照孔接受新鮮的培養基。再留置細胞48個小時，然后所有的孔都接受新鮮培養基的培養基更換。每3天重復培養基更換一次。每24個小時觀察細胞一次。
在培養基更換后24個小時的最初觀察顯示所有對照孔都是死亡細胞。沒有看到活細胞，觀察到漂浮的碎片塊，并且在所有對照孔的底部發現了厚厚一層的死物質。發現所有的對照孔都具有混濁的變色的提示死培養物的培養基。試驗孔表現為較健康，但仍含有一些死物質。但是，可看到活細胞。
在72個小時(第二次培養基更換)之后，所有對照孔都是死細胞(并被清除)。試驗孔含有經培養基更換清除了的細胞碎片，但是在所有孔中，仍有一些活細胞粘附在板上。從許多細胞中都可看到向外長出小的軸突以及清楚的神經形態學。
在96個小時之后，所有試驗孔都具有茂密的神經元，許多都具有可見的軸突和樹突樣結構。17/48(35％)孔表現出廣泛的細胞接觸和連通性。
在120個小時之后，所有試驗組都含有大量的表現出神經元和神經膠質細胞形態的細胞群。在所有孔中都有明顯的廣泛的神經網絡。
再保持細胞30天，并始終都表現出神經形態學。
這個實施例顯示了出用于培養成體神經組織的新的方法學。此外，它說明從富含干細胞的胎兒組織來源中提取到的RNA對受損細胞具有明顯的解救作用。這提示了一種通過可經各種方法被轉運到老齡的、患病的組織或難治的創傷或傷口的胎兒的或培養的干細胞而進行組織修復和再生的新方法。
實施例10大鼠胚胎RNA增加干細胞參與組織再生的用途成年哺乳動物包括人類在多個組織和器官中都具有比胎兒階段更差的再生能力，在胎兒階段常常具有廣泛的再生能力。與這種再生能力喪失有關的兩個主要因素是疤痕組織的形成和將新細胞補充到受損組織中的分泌分子的喪失。雖然多個實驗室已經報告所注射的干細胞在受損組織內的整合，但這只是相當小的級別。假設如果可以在成體中重演胎兒階段的信號傳導的機制，應該可以提高干細胞實現表現出很少的修復或沒有表現出修復的結構的主要再生的能力。這包括與疤痕相關的舊損傷，已知疤痕能抑制干細胞遷移、整合和修復的能力。所用的方法是完整胚胎RNA和干細胞的共注射。所提供的實施例舉例說明了在注射完整大鼠胚胎RNA和骨髓干細胞之后，成體大鼠中的已有的耳穿孔病灶的完全再生。
從定時配對的Lister Hooded大鼠的子宮中取出15天大的胎兒。用Turex勻漿器在冷PBS中機械地分離胎兒組織。利用在實施例1中所述的Kirby方案提取RNA。
如實施例1中所述培養骨髓干細胞，并如實施例7中所述將其濃縮成注射液。
損傷模型包括在注射時年齡為137和149天之間的雄性ListerHooded大鼠。所有大鼠在注射日期之前30天時接受了一個左耳的1.5mm的穿孔損傷，以建立一個舊損傷的模型。在這個年齡的大鼠不再生耳組織。
試驗動物(n＝6)都接受了尾部靜脈注射800μg溶解在0.3ml PBS中的胚胎RNA。1個小時之后，動物接受了第二次注射，注射了懸浮在0.3ml α-MEMS培養基中的約2×105個骨髓干細胞。對照動物(n＝6)接受了初次尾部靜脈注射約2×105個骨髓干細胞，隨后在1個小時之后第二次注射了0.3ml PBS。另一組是沒有處理的對照(n＝6)，它們是耳部受損的但沒有接受處理。
每天觀察動物的任何耳部損傷再生的征象。結果顯示在未處理對照組沒有組織修復或重塑的證據。相似地，僅僅注射干細胞的對照也沒有表現出任何修復的證據，除了在一只動物的損傷部位的周圍的輕微的炎癥反應持續了17個小時。所有用胚胎RNA和干細胞聯合處理的試驗動物在注射后6到9天之間都顯示出損傷的完全閉合。在6只試驗動物的5只中，有著損傷的完全重塑直到沒有任何可見的疤痕或原始病變的證據的程度。動物3表現出病變的完全閉合，但仍有可見的皮膚覆蓋的凹陷。
結果清楚地顯示共注射胚胎來源的RNA部分與干細胞能顯著地提高由干細胞介導的組織修復和再生。從這個實施例以及本發明人的其它相似的研究中可以清楚地看到，胚胎RNA改變了組織周圍的宿主組織環境以引導所注射的干細胞進入到受損區域。此外，相似地改變了舊的損傷疤痕以提供干細胞浸潤以及隨后的病變修復的可行的環境。通過這樣的共治療，干細胞被補充到受損組織中，然后一旦進入位置則可以通過相關組織類型的再生逆轉該損害。最為重要的事實是在本實施例中所用的損害模型是單獨干細胞注射所不能修復的相當舊的損傷。本發明提供了一種提高任何潛在的干細胞治療的療效的新方法。利用從保持在組織培養物中的胎兒組織中提取的并早至干細胞注射之前48個小時將其注射的RNA也已經發現了相似的結果。還沒有研究更長的間隔。相似地，RNA和干細胞的同步注射實現了相似的受損組織的大部修復。推定胚胎RNA重新生成了胎兒期間的可行的再生環境和信號傳導環境。
實施例11從成年大鼠骨髓間質干細胞中生成大鼠胚胎干細胞樣細胞雖然在許多研究實驗室中都把更多的重點放在了成體干細胞的可塑性上，但是其它的實驗室認為胚胎干細胞會給未來的再生醫學提供最大的希望。胚胎干細胞具有一些實際的缺點例如生成胚胎干細胞的倫理問題、細胞系的污染或合適細胞的可得性。本實施例嘗試用胚胎干細胞提取的RNA將成體骨髓干細胞轉變成胚胎干細胞樣細胞。
按照Fandrich等(2002)的方案實施對大鼠胚胎干細胞(RESC)的分離、生長和維持。簡而言之，從來源于定時配對的Sprague Dawley大鼠的4到5日齡胚泡的解離的內細胞團中分離出RESC。將胚胎干細胞維持在絲裂霉素處理過的胚胎成纖維細胞的滋養層上。培養基由高葡萄糖的Dulbecco修飾的Eagle培養基、10％熱滅活的胎牛血清、1％200mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/鏈霉素溶液(50IU/50μg)、胰島素(0.09mg/ml)、1000U/ml LIF和5ml核苷溶液(如在Ruhnke等，2003中所報告的)構成。
這些細胞生長為有特征的光滑的圓形簇團，并且對于一種常用的ES標記物堿性磷酸酶染色呈陽性。
按照產品說明書，用RNAzol制劑從這些RESC中提取到RNA。如在實施例6中所述的將成體骨髓干細胞培養在6孔培養板中。將每個匯合孔分成試驗(n＝12)或對照(n＝12)。試驗孔在常規培養基更換時接受了3ml含有150μg RESC RNA的骨髓培養基(見實施例1)。對照動物接受了3ml骨髓培養基。在24個小時之后，在實驗組的一些細胞的形態上已經出現了顯著的變化。骨髓間質干細胞典型的集落形成單位出現了斷裂，以及大量的聚集的光滑圓形簇團的細胞漂浮出現在培養基中。這種形態學是RESC培養物的提示。在對照孔中沒有出現這些結構。抽吸出漂浮的聚集結構及培養基并將其放置到如上面所述的RESC培養基中的滋養層上，并長期培養維持。在60天內它們保持漂浮的圓形聚集形態學。在培養60天后，這些細胞的堿性磷酸酶(ES標記物)染色呈陽性。也抽吸出對照孔的培養基并將其放置在與進行RESC培養相同的孔內，沒有出現聚集的漂浮結構。
這個試驗說明了一種用于從成體干細胞生成胚胎干細胞樣細胞的新方法，它所遇到的倫理問題較少。
實施例12體內注射來自有運動耐力大鼠的肌肉RNA誘導了久坐(sedentary)大鼠的運動耐力已知運動對于肌肉解剖學和生理學都是有益的。在反復運動過程中，骨骼肌的微損害誘導了干細胞活性和肌肉細胞生物學的改變。這些改變促進了運動耐力的增加。
將從運動大鼠的后肢肌肉中提取到的RNA注射到久坐動物內，以探討這樣的處理對受體動物在劇烈運動期間的能力的作用。運動任務包括在旋轉圓筒內的奔跑。大鼠容易學會通過按圓筒的旋轉速度所指示的合適的速度奔跑而停留在裝置上。當動物累了并停止奔跑后，它就掉到了裝滿碎紙片的塑料柜中。一旦掌握了奔跑技巧，動物將在裝置上快樂地奔跑直到精疲力竭。在裝置上最初訓練一段時間之后，將奔跑時間記錄為對運動耐力的測定值。
每日按如下的合適的運動方案訓練試驗供體大鼠(n＝10)周1-每天給予動物5次試驗(10分鐘)，試驗間的間隔為1個小時。旋轉速度被設定為15mm/秒。一旦動物掉下，將其放置回到圓筒上直到完成試驗的整個持續時間。在這個適應周中，所有動物都輕易地掌握了這項運動技能。
周2-每天給予動物5次試驗，將速度增加到37mm/秒，以及1個小時的試驗間的間隔。如果動物掉下，馬上將其放回到裝置上。每個試驗的持續時間為15分鐘。
周3-每天給予動物試驗一次，速度與前相同，但一直奔跑直到第一次掉下。
周4-每天給予動物試驗一次，奔跑速度為97mm/秒直到第一次掉下。
對照供體大鼠(n＝10)沒有被暴露于運動裝置，在整個4周的運動期內仍留在它們的籠子中。
在第4周結束時犧牲兩組供體，并切下后肢肌肉。用在實施例1中所列的方法提取RNA。然后儲存900μg劑量的RNA用于注射。
將受體動物(n＝20)分成兩個匹配的組。所有的受體動物都接受了1周的裝置上的定位訓練，如在供體的第1周訓練中所述的那樣。它們沒有接受其它的訓練。
在最后的定位試驗后1天，受體大鼠接受了注射到尾部靜脈內的含有900μg RNA的0.3ml PBS。試驗受體動物接受了運動肌肉RNA，對照動物接受了未運動的RNA。
在注射后1周，所有大鼠都接受了如下的奔跑試驗以15mm/秒的速度輕輕地奔跑5分鐘。所有的大鼠在這個時期都是能平衡的并能安逸地奔跑。在5分鐘的平衡試驗之后，速度被增加到了97mm/秒，記錄直到掉下/跳下的持續時間作為運動耐力的測定值。
在兩組之間有著明顯的差異。接受未運動的RNA的受體有著3.54分鐘的平均運動時間。接受來自運動大鼠的肌肉RNA的受體有著6.19分鐘的平均運動時間。
與對照比較，從運動鍛煉的動物中提取的RNA增強了受體動物的運動耐力。這些初步的數據說明通過體內應用RNA可以將運動誘導的肌肉增強作用轉移給未接受過實驗的(naive)肌肉。這可以提供一種有價值的各種肌肉退行性疾病的治療方法或一種提高疾病、衰老或年齡相關性病態中的肌肉量的新方法。此外，該技術在農業上也是有價值的。
應理解上面僅僅通過實施例的方式描述了本發明，在本發明的范圍和精神之內可以進行修飾。
參考文獻Bagnall，L.&Ray，S.(1999)Rat strain Differences on performancein the Morris water maze.，Animal Technology.Vol.50(2).69-77.
Dai et al.(2000)Biol Blood Marrow Transplant.6(4).395-407.
Fandrich，F.，Lin，X.，Chai，G.X.et al.(2002)Preimplantation-stagestem cells induce long term allogeneic graft acceptance withoutsupplementary host conditioning.Nature Medicine.Vol.8.171-178.
Felgner et al.(1987)Proc.Nat.Acad.Aci.Vol 84.7413-7417.
Gennaro(2000)RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy.20th edition，ISBN0683306472Graham&van der Eb(1978)Virology 52456-457.
Harrison，MA.&Rae，IF.(1997)General Techniques of Cell Culture.Cambridge Univ.Press.Cambridge.
Kawaja，et al.(1992)In Neural TransplantationA practicalApproach.IRL Press.Oxford.
Keown et al.(1990)Methods in Enzymology 185527-537Kirby，K.S.(1956)J.Biochem.Vol.64.405.
Kirshenbaum et al.(1999)Curr Opin Struct Biol 9530-5.
Mansour et al.(1988)Nature 336348-352(1988)Owen，M.&Friedenstein，AJ.(1988)Stromal stem cellsmarrowderived osteogenic precursors CIBA Foundation Symposium 136.42-60.
Reynolds，B.A.&Weiss，S.(1992)Science.Vol.255.1707-1710.
Ruhnke，M.，Ungefroren，H.，Zehle，G.，Bader，M.，Kremer，B.，&Fandrich，F.(2003)Long-term culture and differentiation of ratembryonic stem cell-like cells into neuronal9 glial，endothelial andhepaticlineages.Stem Cells.Vol. 21.(4).428-436.
Saneto，R.PO&de Vellis，J.(1987)Neuronal and Glial cellscellculture of the central nervous system.In Turner，A.J.&Bachelard，H.S.(Eds.)NeurochemistryA practical approach.IRL Press.Oxford.
Stewart，C.A.&Morris，R.G.M.(1993)The watermaze.In Sahgal.A(Ed.)Behavioural Neuroscience.A practical approach.Vol.1.IRLPress.Oxford.
Tada，et al.(2001)Curr Biol.Vol 11(19).1553-8.
權利要求
1.一種將一種細胞的性質向一種或多種所需細胞類型的性質改變的方法，其包括將分離的RNA在實現改變細胞性質的條件下提供給一細胞群，所述分離的RNA包括可從包括所述所需細胞類型的細胞中提取的RNA序列。
2.權利要求1的方法，其中將所述分離的RNA提供給患者體內的細胞群。
3.權利要求1或權利要求2的方法，其中所述性質是表型的性質。
4.前述權利要求中任一項的方法，其中所述性質是一種細胞功能。
5.前述權利要求中任一項的方法，其中所述性質的改變涉及一種遺傳轉化，以使得所述細胞群獲得一種改變的、可遺傳的基因型。
6.前述權利要求中任一項的方法，其中細胞性質的改變是干細胞向成體的特化細胞的分化。
7.前述權利要求中任一項的方法，其中細胞性質的改變是成體的特化細胞向干細胞的逆分化。
8.前述權利要求中任一項的方法，其中細胞性質的改變是特化成體細胞向具有不同特性的成體細胞的分化。
9.前述權利要求中任一項的方法，其中細胞性質的改變是免疫學特征譜的變化。
10.前述權利要求中任一項的方法，其中所述方法提高了患者體內干細胞介導的修復。
11.前述權利要求中任一項的方法，其中所述方法在患者體內誘導干細胞的動員、遷移、整合、增殖和/或分化。
12.前述權利要求中任一項的方法，其中所述方法實現患病細胞的修復，改變細胞的遺傳組成，誘導特異細胞類型和/或細胞命運，改變細胞的免疫學特征譜，和/或誘導特殊的所需免疫功能或性質。
13.前述權利要求中任一項的方法，其還包括向患者提供干細胞的步驟。
14.前述權利要求中任一項的方法，其中所述提供干細胞的步驟與所述的提供分離的RNA的步驟是順序進行的、同時進行的、或分開進行的。
15.前述權利要求中任一項的方法，其中所述分離的RNA包括可從處于與所處理細胞的發育階段不同的發育階段的細胞中提取的RNA序列。
16.前述權利要求中任一項的方法，其中所述分離的RNA包括可從處于比所處理細胞的增殖階段更為活躍的細胞增殖階段的細胞中提取的RNA序列。
17.前述權利要求中任一項的方法，其中所述分離的RNA包括可從來自表現出對疾病或病變具有免疫性或抗性的個體的細胞中提取的RNA序列。
18.前述權利要求中任一項的方法，其中所述分離的RNA包括可從胎兒細胞、新生兒細胞、幼體細胞或胚胎干細胞中提取的RNA序列。
19.一種在體內或在體外誘導干細胞系的全能或多能干細胞或來源于動物或植物組織的全能或多能干細胞分化成一種或多種所需細胞類型的方法，其包括將分離的RNA在實現所述干細胞的所需分化的條件下提供給所述干細胞的細胞培養物，所述分離的RNA包括可從包括所述所需細胞類型的組織或細胞中提取的RNA。
20.一種在體內或在體外誘導干細胞系的全能或多能干細胞或來源于動物或植物組織的全能或多能干細胞的動員、遷移、整合、增殖和/或分化的方法，其包括將分離的RNA在實現所述干細胞的所需分化的條件下提供給所述干細胞的細胞培養物，所述分離的RNA包括可從包括所述所需細胞類型的組織或細胞中提取的RNA。
21.前述權利要求中任一項的方法，其中所述細胞是于細胞。
22.權利要求20的方法，其中所述干細胞是成年動物干細胞或成體干細胞系。
23.權利要求20或權利要求21的方法，其中所述干細胞是胚胎干細胞或來源于這些細胞的干細胞系。
24.權利要求21的方法，其中所述成體干細胞是骨髓基質細胞、造血干細胞或神經元干細胞或相應衍生的干細胞系。
25.前述權利要求中任一項的方法，其中所述細胞是人干細胞或人干細胞系。
26.前述權利要求中任一項的方法，其中所述細胞被導致分化成一種或多種穩定的終末細胞類型。
27.前述權利要求中任一項的方法，其中所述細胞在分化之前被遺傳修飾。
28.前述權利要求中任一項的方法，其中所述細胞來源于所述所需細胞的預期受體。
29.前述權利要求中任一項的方法，其中所述RNA包括從與所處理的細胞的個體來源不同的組織或細胞中提取的RNA，所述提取的RNA來源于具有與所需細胞的預期受體相容的免疫學特征譜的供體。
30.前述權利要求中任一項的方法，其中一種全組織或全細胞RNA提取物作為RNA提取物被提供用于細胞攝取。
31.前述權利要求中任一項的方法，其中可從一種或多種類型的腦細胞或腦細胞系中提取的RNA被提供用于細胞攝取。
32.前述權利要求中任一項的方法，其中所述細胞是骨髓基質干細胞且所提供的分離的RNA包括可從一種或多種類型的腦細胞或骨骼肌或兩者任一相應的衍生細胞系中提取的RNA。
33.權利要求1到31中任一項的一種能誘導干細胞分化的RNA在生產用于提高或矯正組織或細胞損害或遺傳疾病的藥物中的用途。
34.權利要求32的用途，其中所述RNA適合于在體內誘導全能或多能干細胞的分化以治療退行性腦病或腦部或脊髓損傷。
35.權利要求32或權利要求33的用途，其中所述RNA適合于在體內誘導全能或多能干細胞的分化以治療選自肝病、心臟病、骨骼肌或心肌疾病或I型糖尿病的疾病。
36.權利要求32或權利要求33的用途，其中在體內誘導干細胞的分化以對抗年齡相關性退行性疾病。
37.一種在體外逆轉細胞系的分化細胞或從動物或植物組織中獲得的分化細胞的分化以生成一或多種所需類型的全能或多能干細胞或干細胞系的方法，其包括將分離的RNA提供給所述分化細胞的細胞培養物由此實現所需的分化細胞向所述類型的干細胞或干細胞系類型的分化逆轉，所述分離的RNA包括可從所需類型的干細胞或干細胞系中提取的RNA。
38.權利要求36的方法，其中所述細胞是在權利要求20到24的任一項中所定義的細胞。
39.權利要求36或37的方法，其中所述分化細胞選自皮膚細胞、骨髓細胞和造血細胞或來源于這些細胞的細胞系。
40.權利要求36或37的方法，其中所述分化細胞是成纖維細胞或成纖維細胞系，以及RNA是可從骨髓干細胞或神經元干細胞中提取的RNA。
41.權利要求39的方法，其中所提供的分離的RNA包括從骨髓基質干細胞、神經元干細胞或衍生自兩者中任一的干細胞系中提取的RNA。
42.一種生產分化細胞的體外方法，其包括i)實施權利要求36到40中任一項的方法以從分化細胞中生成干細胞或干細胞系；ii)對所述干細胞或干細胞系實施權利要求I到31中任一項的方法以生成分化細胞。
43.權利要求41的方法，還包括將遺傳修飾引入到干細胞內。
44.通過權利要求1到31、或36到42中任一項的方法獲得的細胞。
45.權利要求43的細胞在生產用于提高或矯正組織或細胞損害或遺傳疾病的藥物中的用途。
46.一種篩選能將所需的性質從一種細胞類型賦予給另一種細胞類型的RNA序列的方法，所述方法包括步驟a)從包括所需細胞類型的細胞中提取RNA；b)將所提取的RNA分成不同的部分；c)向測試細胞提供一個部分；d)分析測試細胞的改變的性質，所述改變的性質是提取RNA所用的所需細胞類型所具有的；其中將改變的性質賦予測試細胞的部分被鑒定為包括能賦予所需性質的RNA序列的部分。
全文摘要
本發明涉及利用RNA改變細胞性質。具體地，本發明涉及改變細胞的動員、遷移、整合、增殖和/或分化的能力。例如，本發明涉及誘導干細胞的分化，包括獲得遷移、整合、和增殖的能力。本發明也涉及在體外誘導干細胞的動員、遷移、整合、增殖和/或分化。因此，本發明涉及促進由干細胞介導的功能修復。本發明也涉及逆轉分化細胞的分化。通過將分離的RNA在實現細胞性質的改變的條件下提供給一群細胞可以實現所有這些作用，所述分離的RNA包括可從包括所需細胞類型的細胞中提取的RNA序列。
文檔編號A61K48/00GK101072866SQ200480025874
公開日2007年11月14日 申請日期2004年7月9日 優先權日2003年7月9日
發明者斯蒂芬·雷 申請人:里伯斯代姆有限公司