專利名稱：干擾素－β復合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有聚乙二醇的干擾素-β復合體，所述聚乙二醇特異性結合位于干擾素-β氨基酸序列第19或134位上的賴氨酸，并且涉及其生產方法。
背景技術：
已知水溶性聚合物如聚乙二醇，當結合以蛋白質藥物為典型例子的生物分子時，以帶來如下效應的方式賦予臨床用途，如提高的物理學和熱穩定性、對蛋白酶的耐受性和溶解性，以及體內分布體積的減少和血液中滯留的增強(見Inada等，J.Bioact and CompatiblePolymers 5，343(1990)；Delgado等，Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems 9，249(1992)；和Katre，Advanced DrugDelivery Systems 10，91(1993))。
現有多種方法將天然干擾素-β或具有與天然干擾素-β相同一級結構的干擾素-β結合到水溶性聚合物聚乙二醇(PEG)上。例如，Katre等已將賴氨酸等的氨基修飾應用到干擾素-β的PEG化作用中(見美國專利號4766106和4917888和國際公開號WO87/00056)。具體地，他們報道了一種通過將具有300-100,000分子量的水溶性聚合物(PEG)結合到重組干擾素-β或IL-2上而獲得的綴合物，所述結合是通過其氨基酸序列中的1-10個賴氨酸殘基進行的。備選地，在“Chemically modifiedlymphokine and production thereof”中已經報道了將PEG結合到淋巴因子的氨基上的技術(見日本專利公開(Kokai)號60-226821A(1985))。不過，實際上，通過這些方法制得的結合PEG的干擾素-β具有減少到小于10％的干擾素-β活性并且不能進行實際應用。
以往尚無報道描述過將PEG選擇性地結合到干擾素-β中特定賴氨酸的氨基上的技術。如果可能選擇并且特異性修飾賴氨酸，使得由PEG結合引起的干擾素-β生物學活性的減弱比率最小化，則作為藥物給藥的蛋白質總量的減少會導致對患者更少的副作用并且進一步導致更容易的質量控制。
另一方面，還已知一種方法，其使用不涉及賴氨酸殘基的還原性烷基化作用以便通過在適于所述干擾素的氨基端α氨基的選擇性活化的pH下的反應，將水溶性聚合物選擇性地結合到干擾素的氨基端上(見日本專利公開(Kokai)號9-25298A(1997))。不過，實際上，通過這種方法進行的干擾素-β的PEG化作用并不給出單-PEG化作用并且在任何賴氨酸殘基上或N末端都帶來非選擇性的PEG化作用，導致生成沒有充分抗病毒活性和細胞生長抑制活性的異質混合物。
更重要的是，如Pepinsky等所報道的，還已知當PEG具有高于20,000的分子量時純化的N末端結合PEG的干擾素-β具有顯著降低的殘留活性(相對于結合前干擾素-β活性的比率)，并且當所述PEG具有40,000的分子量時完全缺失活性(見Pepinsky等，The Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics，vol.297，p1059-1066，(2001))。
對于干擾素-α，Bailon等曾生產出在賴氨酸殘基上用分枝的聚合物PEG非選擇性單-PEG化的干擾素-α，所述分枝的聚合物PEG具有40,000的分子量(Bailon等，Bioconjugate Chem.12，195(2001))。不過，他們報道如N末端結合PEG的干擾素-β的情形一樣，結合具有高達40,000分子量的PEG的干擾素-α的殘留活性顯著降低，為7％。
也就是說，直接應用技術是困難的，所述技術是為了以低分子量PEG乃至高分子量PEG進行修飾而發展出來的(結合的PEG的數目和位置)。因而，需要一種新技術來生產結合一定分子量PEG的高活性干擾素-β復合物，所述PEG具有足夠獲得諸如延長的體內循環半壽期和減小的清除值的效應所必需的分子量(20,000或更高)，所述延長的體內循環半壽期和減小的清除值帶來作為藥物的用途。
如上所述，到目前為止尚無對賴氨酸殘基的選擇的報道，所述賴氨酸殘基有待進行修飾以避免結合高分子量水溶性聚合物的干擾素-β活性的減弱，以及對于為此目的的技術的報道。而且，尚無高分子量水溶性聚合物如PEG選擇性結合到存在于干擾素-β中11個賴氨酸殘基中的任一個上產生高度活性干擾素-β復合物的報道。
發明內容
本發明的一個目的是發現一種干擾素-β復合物的結構，即使以高分子量物質如聚乙二醇進行修飾它也沒有生物學活性的損害，并且提供高效生產這種復合物的方法。特別地，本發明的一個目的是獲得即使結合具有高達40,000的分子量的PEG也會保留10％或更高的干擾素-β活性的干擾素-β復合物。
本發明人已經進行了許多種研究以達到所述目的并且因此發現天然干擾素-β在第80位上具有糖鏈連接的天冬酰胺，使其活性的減少最小化的方法是用高分子量物質選擇性地修飾位于第19或134位上的賴氨酸殘基，從三維結構的觀點來看所述賴氨酸殘基最接近此天冬酰胺。即使當使用具有超過10,000的分子量的聚合物(例如，PEG)時，所述聚合物選擇性結合到位于第19或134位上的賴氨酸也能夠最小化干擾素-β活性的減弱。
以往將位于第19位上的賴氨酸殘基列為應當在PEG結合到干擾素-β的氨基上時被去除的賴氨酸殘基之一(見國際公開號WO01/15736)。所以，這一結合位點不能由傳統技術所預期。至于位于第134位上的賴氨酸殘基，到目前為止尚無報道高分子量修飾物質選擇性結合到這一位點上使得干擾素-β活性的減弱最小化。
也就是說，本發明提供一種方法來生產干擾素-β復合物，包括在至少一種選自由具有5個或更少糖單元的寡糖、單糖、其相應的糖醇和C2-6多羥基醇構成的組的添加劑存在的情況下，將干擾素-β結合到聚乙二醇上。本發明還提供由所述方法生產的干擾素-β復合物，特別是一種干擾素-β復合物，其特征在于所述復合物是通過將聚乙二醇特異性結合位于干擾素-β氨基酸序列中第19或134位上的賴氨酸殘基來生產的。
本發明的干擾素-β復合物具有高度血溶性、干擾素-β活性和物理學和生物學穩定性，并且可用作在干擾素-β應用到的全部癥狀和疾病的治療、預防和緩解中的藥物。
附圖簡述
圖1是顯示干擾素-β復合物的Poros HS柱分離和純化的圖示，所述干擾素-β復合物具有結合位于第19位上賴氨酸的氨基的聚乙二醇。在該圖示中，上面的箭頭表示混合的溶劑B的比例，而下面的箭頭表示280nm上的吸光度；
圖2是顯示對通過干擾素-β復合物的Poros HS柱分離和純化所獲得的峰1-4(在附圖中為(i)-(iv))的組分進行分析的結果的圖示，所述干擾素-β復合物具有結合位于第19位上賴氨酸的氨基的聚乙二醇，其中所述組分通過SDS-PAGE進行分離并且隨后通過銀染進行分析；圖3是顯示干擾素-β復合物的SP-5PW柱分離和純化的圖示，所述干擾素-β復合物具有結合位于第19位上賴氨酸的氨基的聚乙二醇；圖4是顯示干擾素-β復合物的氨基酸序列以及其中預測的賴氨酰基內肽酶剪切位點的圖示；圖5是顯示在與具有40K分子量的PEG結合反應之后用SP-5PW柱分離的峰2-4(在附圖中，用圓圈中的數字表示)的洗脫組分的肽圖譜(用賴氨酰基內肽酶處理)，以及在與PEG反應之前干擾素-β的肽圖譜(在附圖中，用最下部分的Pre表示)的圖示；圖6是顯示干擾素-β在兔血液中滯留的圖示，所述干擾素-β具有結合位于第19位上賴氨酸的40K分子量的PEG；圖7是顯示干擾素-β在兔中誘導藥效標記(2-5A合成酶活性)的時間進程的圖示，所述干擾素-β具有結合位于第19位上賴氨酸的40K分子量的PEG；圖8是顯示分析由TOYOPEARL CM 650柱分離干擾素-β復合物獲得的峰級分的結果的圖示，所述干擾素-β復合物具有結合位于第134位上的賴氨酸的氨基的聚乙二醇，其中通過SDS-PAGE分析所述級分(A)，用SP-5PW柱進一步分析峰3(在附圖中為(iii))的級分(B)(以洗脫的順序從下到上列出每次層析)；圖9是顯示具有2個或多個PEG分子的非選擇性多-PEG化的干擾素-β復合物以及具有選擇性結合位于第19或134位上的賴氨酸的PEG的單-PEG化的干擾素-β復合物的活性。在該圖中，用TOYOPEARL CM 650(S)柱(Tosoh)(B)獲得的層析圖，相應于每種分離級分的SDS-PAGE分析的結果(A)，和抗病毒活性值/每種級分的蛋白的量以及相對于PEG結合前IFN-β比活性的活性保持率(C)彼此相關地進行顯示；和圖10是顯示靜脈內給藥到兔中的結合20,000(20K)-或40,000(40K)-分子量PEG的IFN-β復合物在血液中滯留的圖示。
本說明書包括在日本專利申請號2003-299850的說明書中所述的內容，其作為本申請優先權的基礎而起作用。
實施發明的最佳方式如上所述，本發明的方法能夠有效地將聚乙二醇結合位于干擾素-β氨基酸序列第19或第134位上的賴氨酸并且從中分離未結合的產物和副產物。
可以將天然干擾素-β，改自天然干擾素-β的具有糖鏈的干擾素-β，或者有或無糖鏈的重組干擾素-β用作實施本發明方法的干擾素-β。在本發明的方法中，可以將商業上現有的產品用作這種干擾素-β。天然干擾素-β在第80位上具有糖鏈連接的天冬酰胺，從三維結構的觀點來看其最接近位于第19位上的賴氨酸。當高分子量的PEG結合于其上時，優選使用無糖鏈的重組干擾素-β，因為可能的位阻減弱反應效率。任何具有伴隨著一個或幾個氨基酸的刪除、取代或添加的天然干擾素-β氨基酸序列的干擾素-β都可以用作實施本發明方法的干擾素-β。
本發明的干擾素-β還包括天然干擾素-β，重組干擾素-β，及其變化形式。所述變化形式意指通過改變或修飾如上所述的天然干擾素的氨基酸序列或糖鏈而獲得的任何形式。在本說明書中，位于第19或第134位上的賴氨酸由這種天然干擾素-β的氨基酸序列的氨基酸號碼來表示(圖4和SEQ ID NO1)。所述變化形式的這種賴氨酸的氨基酸號碼以對應于天然干擾素-β氨基酸序列中的賴氨酸的位置的方式改變。
任何這些形式的干擾素-β都可以通過任何方法，如從組織中提取，蛋白質合成，和利用天然或重組細胞的生物學生產來獲得。遺傳工程化的無糖鏈的干擾素-β是商業上現有的，并且這種商業上現有的干擾素-β也可以用在本發明的方法中。
聚乙二醇(PEG)對于人體是無害的，并且當作為結合到其上的干擾素-β復合物而進行施用時，在使所述復合物溶解于血液中所必需的水平上賦予水溶性。本領域已知PEG結合到生理活性物質上允許活體中的生理活性物質獲得提高的物理和熱穩定性，對抗酶降解的保護作用，增強的溶解性，延長的體內循環半壽期，和降低的清除值。根據這些效果，PEG可以優選用于本發明中。
在PEG末端激活中可以使用任何方法以便將PEG結合到干擾素-β中的賴氨酸殘基的氨基上。例如，可以采用在末端具有氨基反應性結構如羥基琥珀酰亞胺酯或硝基苯磺酸酯結構的PEG。在本說明書中，任何這些末端結構都稱作“氨基反應性官能團”，而具有任何這些末端結構的PEG都稱作“用氨基反應性官能團活化的聚乙二醇”。具有任何這些結構的PEG被常規地廣泛用于和氨基結合，并且可以通過公知的或商業上現有的合成方法輕易地進行生產。在本發明中，這種商業上現有的產品也可以優選地進行使用。
對所述PEG的平均分子量并不進行特別限定，不過，從允許活體中的干擾素-β獲得物理和熱穩定性，對抗酶降解的保護作用，增強的溶解性，延長的體內循環半壽期，和降低的清除值的觀點來看，優選大約10,000-60,000，更優選大約20,000-40,000。
可以通過將干擾素-β與PEG在pH 5.0-8.5，優選pH 5.5-8.0，以及在針對干擾素-β的活性的抗還原劑存在的情況下，優選在緩沖溶液如磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖溶液中反應來進行干擾素-β和PEG之間的結合反應。所述針對干擾素-β的活性的抗還原劑不僅抑制由干擾素-β被置于適于反應的pH5.0-8.5的環境中而引發的干擾素-β的積聚，還有助于PEG與位于第19位或第134位上的靶向賴氨酸或其鄰近位點的特異性結合反應。針對干擾素-β的活性以便有效地將PEG結合到預期位點并保持干擾素-β活性的抗還原劑的例子可以包括糖類等，具有5個或更少糖單元的寡糖，單糖，其對應的糖醇，C2-6多羥基醇。特別優選的是二糖或單糖如葡萄糖、甘露糖、山梨糖、蔗糖或海藻糖，其對應的糖醇，和C2-3多羥基醇如乙二醇或甘油。這些針對干擾素-β的活性的抗還原劑可以單獨使用或以其中兩個或多個的任意組合形式使用。
對用在本發明方法中的針對干擾素-β的活性的抗還原劑的濃度并不作特別限定，不過，相關于反應混合物的總重，大約為1-90％(當使用多種針對干擾素-β的活性的抗還原劑時為合計；下文中，以相同方式進行指定)，更加優選大約1-50％，還要更加優選大約10-30％。對干擾素-β∶PEG混合物的比例并不作特別限定，不過，對于用琥珀酰亞胺酯活化的PEG來說，一般是大約1∶1-1∶400摩爾比，并且優選大約1∶4-1∶100摩爾比。適于本發明的方法的反應溫度一般是4-40℃，優選4-25℃。盡管反應時間是根據反應溫度等進行適當確定的，但是一般大約1小時-24小時是足夠的。
通過所述反應方法可以將聚乙二醇特異性地結合位于干擾素-β氨基酸序列中第19位或第134位上的賴氨酸或其空間鄰近位點。所述“其空間鄰近位點”指在干擾素-β活性構象中的鄰近位點，具體地，是對于位于第19位的賴氨酸來說位于第17位的半胱氨酸或位于第80位的天冬酰胺(具體是連接于其上的糖鏈)。另外，術語“特異性的”或“特異性地”指聚乙二醇與位于第19位或第134位上的賴氨酸或其空間鄰近位點的選擇性和優先性結合。這種特異性結合給出均一的單-PEG化的干擾素-β。
將在末端具有巰基反應性結構如正吡啶基(orthopyridyl)二硫化物、乙烯基砜(vinyl sulfone)、馬來酰亞胺或碘乙酰胺(iodoacetamide)結構的水溶性聚合物，優選將具有馬來酰亞胺結構的水溶性聚合物用在與半胱氨酸巰基的結合反應中。對于將具有特別需要的10,000-60,000分子量的PEG結合到干擾素-β氨基酸序列中的半胱氨酸殘基上來說，優選使用具有小于天然糖鏈的糖鏈的干擾素-β，去除了糖鏈的干擾素-β，或最初沒有糖鏈的干擾素-β。使用這種干擾素-β允許無還原性解離的結合反應以便在單一步驟中高效進行。
在結合反應后，可以通過任何方法或方法的組合去除未反應的干擾素-β和PEG以及副產物，所述方法如使用離子交換載體、凝膠過濾載體、或疏水性或親水性載體的層析譜，以便純化或濃縮具有結合位于第19或第134位上賴氨酸的PEG的所需干擾素-β復合物。
最有效純化或濃縮具有結合位于第19或第134位上賴氨酸的PEG的干擾素-β復合物的方法之一是使用離子交換載體的層析。所用的離子交換載體優選是陽離子交換載體，更加優選將磺丙基、磺酸或羧甲基附于基底物質上的載體，任何這些離子交換載體都是商業上現有的。例如，當使用HiTrap SP HP(Amersham Pharmacia)，Poros HS(Applied Biosystems)，或SP-5PW(Tosoh)時，通過鹽濃度梯度將痕量存在于反應溶液中的二-PEG化的干擾素-β復合物最先洗脫。隨后，以全部洗脫級分的40％或更大的比例將具有結合位于干擾素-β氨基酸序列中第19位上賴氨酸的PEG的所需干擾素-β復合物洗脫，接著是具有結合N末端氨基或位于第33、46或108位上的賴氨酸作為PEG結合位點的少量異構體的復合物以及未反應的干擾素-β的洗脫和分級。在此過程中，可以同時分離具有結合位于第134位上賴氨酸的PEG的干擾素-β復合物。
通過將反應溶液調節到適于在pH3.0-8.0結合的離子強度來實施結合到陽離子交換載體上。在此情況下，所述陽離子交換載體可以加載到柱上或懸浮于反應溶液中。不過，當所述陽離子交換載體中的未反應的親水性聚合物的積聚減小所需復合物的分離效率時，優選在懸浮和結合后將所述載體加載到柱上進行洗脫。通過用不斷提高的鹽濃度或pH在由檸檬酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽等組成的緩沖溶液中實施逐步的梯度或無梯度洗脫可以進行由陽離子交換載體的洗脫。
如實施例3中所述，通過繪制肽圖譜，接著進行獲得的PEG結合片段的氨基酸分析或測序，可以分析分級和洗脫的干擾素-β復合物的PEG結合位點。
通過本領域已知的方法可以輕易測量由此產生的具有PEG的干擾素-β復合物的抗病毒活性，所述PEG結合位于第19或第134位上的賴氨酸(例如，Armstrong，J.A.，Methods In Enzymology，78，381-387，(1981)；Rubinstein等，J.Virol.37，755(1981)；和Borden等，Canc.Res.42，4948(1982))。具有結合位于第19位上賴氨酸的40,000分子量PEG的干擾素-β保持了結合前10％或更高的活性，這一活性等同于結合具有20,000分子量PEG的干擾素-β的活性。或者，具有結合位于第134位上賴氨酸的40,000分子量PEG的干擾素-β保持了結合前70-100％的活性。以往曾經報道過具有結合干擾素-βN末端的40,000分子量PEG的復合物的殘留活性為0％(Pepinsky等，The Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics，vol.297，p1059-1066，(2001))。因此，這顯示位于第19或134位上的賴氨酸用作干擾素-β的高分子量PEG結合位點是非常有用的。
還可以將本發明的方法應用到除了PEG之外的物質作為生產不會減弱干擾素-β活性的復合物的方法。優選地，所述除了PEG之外的物質具有氨基反應性結構，如羥基琥珀酰亞胺酯或硝基苯磺酸酯結構。這種第二分子不限于賦予體內穩定性的分子如PEG和血清蛋白并且可以是具有完全不同功能的生理活性物質，如酶、細胞因子、抗體分子或其片段。衍生自任何這些物質的復合物都可用于構建也具有干擾素-β活性的融合分子或標記試劑。
此外，可以應用本發明的方法來將干擾素-β固定到多種支持物上，例如，糖、玻璃或樹脂材料的平坦表面或顆粒。也就是說，位于第19或134位上的賴氨酸用作干擾素-β和多種支持物中任一種之間的結合點允許干擾素-β的固定而不會減弱其活性。這種固定方法需要引入具有類似氨基反應性官能團的交聯劑或預先將所述交聯劑結合到支持物上。
可以將本發明的干擾素-β與PEG之間的復合物用于治療多種涉及IFN生物學活性的疾病。例如，所述復合物可以用于治療慢性活性乙型肝炎、慢性丙型肝炎和其它病毒性疾病；多種惡性瘤如成膠質細胞瘤、成神經管細胞瘤、星細胞瘤和皮膚惡性黑素瘤；以及自身免疫疾病如發性硬化癥。另外，它可以用于治療伴隨血管生成的疾病，例如，炎性疾病(例如，類風濕性關節炎或牛皮癬)，眼科疾病(例如，糖尿病性視網膜病、早產兒視網膜病、新生血管性青光眼(neovascularglaucoma)、Stevens-Johnson綜合征及其相關疾病、眼類天皰瘡及其相關疾病、角膜化學灼傷，或沙眼)，以及癌癥(例如、乳腺癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤、腎癌、腦腫瘤，或卡波西肉瘤)。
可以通過口服或腸胃外途徑，將本發明的干擾素-β復合物直接給藥或者作為通過將所述復合物與本領域已知的可藥用載體或賦形劑相混合制備的藥物組合物進行給藥。不過，優選通過皮下、肌內或靜脈內注射進行給藥。
對于口服給藥的劑型的具體例子包括片劑、丸劑、膠囊、顆粒、糖漿、乳劑和懸浮液。這些劑型是通過本領域公知的方法生產的并且包含一般用于藥學領域的載體或賦形劑。
片劑的載體或賦形劑的例子包括乳糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉和硬脂酸鎂。腸胃外給藥的劑型的例子包括眼藥水、軟膏、注射劑、泥罨劑、栓劑、經鼻吸收劑、經肺吸收劑、經皮吸收劑和局部持續釋放劑。
液體制品可以通過本領域已知的方法制備，例如，通過將干擾素-β復合物溶解或懸浮于一般用于注射的無菌水性溶液中或者通過干擾素-β復合物的乳化作用或包埋入脂質體。
固體制品可以通過本領域已知的方法制備，例如，通過將賦形劑如甘露糖、海藻糖、山梨糖、乳糖或葡萄糖加到干擾素-β復合物中以制成凍干產品。這種凍干產品可以進一步粉末化，或者，可以將這種粉末與聚乳酸或羥基乙酸混合和固化以便使用。
凝膠劑可以通過本領域已知的方法制備，例如，通過將干擾素-β復合物溶于增稠劑或多糖如甘油、聚乙二醇、甲基纖維素、羧甲基纖維素、透明質酸或硫酸軟骨素中。任何這些制品都可以添加以人血清白蛋白、人免疫球蛋白、α2-巨球蛋白、氨基酸等作為穩定劑，并且可以添加以醇、糖醇、離子表面活性劑、非離子表面活性劑等作為在不損害IFN生物學活性范圍內的分散劑或吸收促進劑。或者，可以任選地向其中加入痕量金屬或有機酸鹽。
根據患者的年齡和體重，要治療的疾病或癥狀，給藥形式和途徑，PEG的分子量等適當地確定本發明的復合物的劑量。不過，通常，在一次劑量/月到一次劑量/天的范圍內給藥本發明的復合物，優選一次劑量/月到一次劑量/周，1,000單位-100百萬單位/劑量，優選10,000單位-18百萬單位/劑量。
實施例下文中，參照實施例對本發明進行更充分地描述。
添加劑對于羥基琥珀酰亞胺酯活化的聚乙二醇與重組干擾素-β的氨基的結合反應的作用將葡萄糖、甘油或乙二醇以每種終濃度1，5，10，和20％加入到保存于0.5M氯化鈉和100mM醋酸鹽緩沖溶液(pH 5.0)中的重組人干擾素-β中(終濃度200μg/ml；其是根據Goeddel等，Nucleic Acid.Res.Vol.8，4057-4074(1980)的方法用重組大腸桿菌(Escherichia coli)表達和純化的)。用1M的磷酸氫二鈉溶液將這些溶液和無添加劑的對照的pH調節到7.8。以大約10/摩爾干擾素-β的摩爾比將羥基琥珀酰亞胺酯活化的聚乙二醇(平均分子量40K；Shearwater Polymers，INC生產，購自NOF Corp)與每種得到的溶液相混合，隨后于4℃過夜進行結合反應。反應后，去除未反應的干擾素-β，測量在每種制備的反應溶液中的干擾素-β活性。
利用酶抗體技術(夾心法免疫測定)(見Eiji Ishikawa，“EnzymeImmunoassay”3rd Ed.，p.180，Igaku-shoin)進行所述活性的測量。具體地，將兔抗干擾素-β抗體固定于免疫板上，隨后與樣品一起向其中加入只識別活性干擾素-β結構的酶標記的小鼠單克隆抗體。在洗去未結合的產物后，向免疫板上加入著色底物以通過與標準的著色值相比較來計算樣品的干擾素-β活性(確證干擾素-β活性的結果等同于由基于培養細胞的抗病毒活性的生物學活性測量方法獲得的結果)。同時，以與上面相同的方式加入表面活性劑Tween 80或HCO-60抑制干擾素-β的積聚，不過，還在很大程度上抑制PEG的結合反應的進行，導致所述綴合物活性的不成功的測量。
如表1中所示，與對照(通過在缺失添加劑情況下的PEG的結合反應獲得的PEG-干擾素-β復合物的活性)相比，在含有適量葡萄糖、甘油或乙二醇的反應溶液中觀察到提高活性的明顯效果。
具有結合位于第19位上的賴氨酸的氨基的聚乙二醇的干擾素-β復合物的分離和純化以20％的終濃度將乙二醇加入到保存于0.5M氯化鈉和100mM醋酸鹽緩沖溶液(pH5.0)中的重組人干擾素-β中(終濃度200μg/ml)，隨后用1M的磷酸二氫鈉溶液調節pH到7.6。將羥基琥珀酰亞胺酯活化的聚乙二醇(平均分子量40K；購自NOF Corp)與得到的溶液相混合，隨后于4℃過夜進行結合反應。相對于含有10mM NaCl-0.05％Tween 20的20mM醋酸鹽緩沖溶液(pH4.5)于4℃過夜透析反應溶液。將透析溶液應用到陽離子交換柱Poros HS 1.7mL-gel(由AppliedBiosystems生產)或SP-5PW(Tosoh)。通過提高與溶劑A(含有10mMNaCl的20mM醋酸鹽緩沖溶液(pH4.5-4.7))混合的溶劑B(含有1MNaCl的20mM醋酸鹽緩沖溶液(pH4.5-4.7))來進行洗脫。具體地，通過逐步將溶劑B的比例提高到Poros HS柱中的30，40，50，和100％和通過在SP-5PW柱中使用0-100％的連續梯度來進行洗脫。通過用Poros HS柱進行的洗脫獲得的吸光度層析譜顯示于圖1中。將通過逐步提高溶劑B的比例到30，40，50，和100％洗脫的吸光度層析譜上的組分分別叫做峰1-4(在附圖中為(i)-(iv))。
在SDS-PAGE分離后通過銀染分析每種峰組分(1-4)的結果顯示于圖2中。在峰2中可以獲得所需的具有結合位于第19位上的賴氨酸殘基的40K分子量PEG的干擾素-β復合物。可以將不能完全被反應所控制的PEG結合位點的少量異構體(minor isomers)分離為副產物，其包括具有結合位于第33位上的賴氨酸殘基的PEG的干擾素-β復合物(在峰3中)，和具有結合N末端氨基或位于第108或134位上的賴氨酸殘基的PEG的干擾素-β復合物(在峰4中)。在峰4和1中可以分別分離出未反應的干擾素-β和二-PEG化的干擾素-β。
通過用SP-5PW柱進行的洗脫獲得的吸光度層析譜顯示于圖3中。所述SP-5PW柱能夠進行類似于Poros HS柱的分離。作為峰2，所需的具有結合位于第19位上的賴氨酸殘基的40K分子量PEG的干擾素-β復合物占蛋白質總量的大約65％(相對于除了未反應干擾素-β的全部PEG化復合物其比例為65％或更大)。
重組干擾素-β的聚乙二醇結合位點的確認將實施例2中用SP-5PW柱分離的每種峰級分脫鹽并用固相抽提柱(OASIS HLB；Waters)進行濃縮，隨后用離心蒸發器進行干燥。將得到的產物溶于含有6mol/L胍的Tris緩沖溶液(pH9)中，隨后進行二硫蘇糖醇的Cys還原和碘乙酰胺的酰胺甲基化作用。加入賴氨酰基內肽酶后，將得到的混合物于37℃溫育5小時以進行結構特異性消化。用醋酸終止酶反應以制成預處理的樣品進行分析。
將這種樣品在下列條件下進行反相HPLC分析柱Cadenza CD-C(184.6×150)；檢測波長214nm(UV)；柱溫度40℃；流速0.8mL/min；流動相A醋酸/TFA/蒸餾水(1/0.2/1000)；流動相B醋酸/TFA/乙腈/蒸餾水(0.9/0.2/800/200)；梯度在80分鐘內5％-70％的流動相B，接下來為在5分鐘內的70％-100％的流動相B；分析循環120min。
相應于PEG結合反應之前的干擾素-β的賴氨酰基內肽酶消化片段的HPLC層析譜中的峰(K1至K12)顯示于圖4和5-βre中。圖4中的箭頭表示賴氨酰基內肽酶剪切位點。由剪切產生的肽片段命名為K1到K12。圖5中的符號K1到K12分別對應于圖4中的肽片段K1到K12。相反地，如圖5-2(在附圖中為(ii)；下文中，以相同方式指定)中所示，在峰2的肽圖譜中觀察到肽片段K1和K2的明顯缺失。這可能是因為PEG導入位于第19位上賴氨酸的側鏈上的氨基使得這一位點阻遏賴氨酰基內肽酶消化，導致不生成肽片段K1和K2。由這一結果，估計導入PEG的位點是位于第19位上的賴氨酸。
峰3的肽圖譜產生顯示于圖5-3中的結果，其中觀察到肽片段K2的明顯缺失。這可能是因為PEG導入位于第33位上賴氨酸的側鏈上的氨基使得這一位點阻遏賴氨酰基內肽酶消化，導致不生成肽片段K2。由這一結果，估計導入PEG的主要位點是Lys33。
因為在如圖5-4中所示的峰4中觀察到肽片段K1的減少，估計存在N-末端綴合物。此外，肽片段K10減少一半，提示可能包含Lys 134或Lys 123異構體。
接下來，將作為在峰的反相HPLC分析中75分鐘左右的峰出現的PEG-肽綴合物片段進行氨基酸序列分析。這一結果和由肽圖譜獲得的信息顯示峰2，主要的反應產物，是所需的具有結合位于第19位上賴氨酸的PEG的復合物。分別在峰3和4中分離具有結合位于第33位上賴氨酸的PEG的位置異構體和具有結合位于第134或108位上賴氨酸或N端的PEG的位置異構體，作為少量副產物。
具有選擇性結合位于第19位上賴氨酸殘基的40K或20K分子量PEG的干擾素-β復合物殘留活性的測量通過實施例2的方法對具有選擇性結合位于第19位上賴氨酸殘基的40K或20K分子量PEG的重組人干擾素-β復合物進行合成、分離和純化，隨后與PEG結合之前的重組人干擾素-β進行活性比較。通過測量抗病毒活性來進行干擾素-β活性的比較。具體地，通過利用人羊水細胞FL細胞組合以辛德畢斯病毒或水泡性口炎病毒(VSV)的生物分析來進行評估(Armstrong，J.A.，Methods In Enzymology，78，381-387，(1981))。
作為結果，PEG結合前的重組人干擾素-β的活性為1.22×108MIU/mg，而具有40K PEG的綴合物則具有5.5×107MIU/mg的抗病毒活性和高達45％的殘留活性。以相同方式測量的具有20K PEG的綴合物的殘留活性為38.7％。
具有選擇性結合位于第19位上賴氨酸殘基的40K分子量PEG的干擾素-β復合物的藥物動力學分析及其誘導藥效標記活性的評估通過實施例2的方法對具有選擇性結合位于第19位上賴氨酸殘基的40K分子量PEG的重組人干擾素-β復合物進行合成、分離和純化。以9MIU/kg向兔(NZW，雄性)施用這種干擾素-β復合物。在給藥前和在給藥后15分鐘，1.5小時，3.5小時，8小時，1天，2天，3天，4天，5天，6天，和7天由所述兔收集血液以測量血漿中的抗病毒活性和全血中的2-5AS合成酶活性。抗病毒活性通過實施例1中所述的方法測量，而2-5AS合成酶活性是利用2-5A試劑盒“Eiken”(Eiken Chemical)根據特定的方案進行測量的。基于抗病毒活性測量的血液中干擾素-β殘留活性的時間過程在圖6中以圖表形式表示。作為藥效標記而起作用的2-5AS合成酶活性的時間過程在圖7中以圖表形式表示。具有40K分子量的PEG的結合導致血液中干擾素-β殘留活性(AUC)的20.8倍的提高。這種提高導致誘導藥效標記的活性的提高(AUC由PEG的結合提高7.6倍并且超過了由未修飾的干擾素-β進行的藥效標記誘導的最高值，即使在給藥7天之后)。
具有結合位于第134位上的賴氨酸的氨基的聚乙二醇的干擾素-β復合物的分離和純化將以與實施例2中相同方式獲得的重組人干擾素-β和PEG之間結合的反應溶液添加以5倍體積的10mM醋酸鹽緩沖液(pH4.5)，并應用到以相同緩沖溶液平衡的陽離子交換柱(TOYOPEARL CM 650(S)(Tosoh))上。
通過提高從0-65％以連續梯度混合的緩沖溶液的比例來用含有1M氯化鈉的相同緩沖溶液洗脫蛋白質，并且隨后進行分級。通過SDS-PAGE以及用SP-5PW柱(Tosoh)對洗脫的級分進行分析。相應結果示于圖8-A和8-B中。
作為結果，如實施例2中一樣獲得三個峰。不過，當用SP-5PW柱單獨分析第三個峰(圖8-A中的峰(iii))中包含的級分時，所述級分顯示為進一步分離成幾種組分(圖8-B)。在這些組分中，以與實施例3中相同的方式對含有組成第三個峰最高百分比的和最后洗脫的峰的級分進行分析。作為結果，從其中分離出具有結合位于第134位上的賴氨酸的PEG的干擾素-β復合物。
由PEG與賴氨酸的非選擇性結合反應獲得的PEG干擾素-β復合物和由其選擇性結合反應獲得的PEG干擾素-β復合物之間活性的比較以20％的終濃度將乙二醇加入到保存于0.5M氯化鈉和100mM醋酸鹽緩沖溶液(pH5.0)中的重組人干擾素-β或天然干擾素中，隨后以與實施例2中相同的方式利用1M磷酸氫二鈉溶液將pH調節到5.5(反應條件1)或大約7.6(反應條件2)。以相對于一個干擾素-β分子的45倍的量將羥基琥珀酰亞胺酯活化的聚乙二醇(平均分子量10K，20K，或40K；由Shearwater Polymers，INC生產，購自NOF Corp)與得到的溶液混合，隨后于4℃過夜進行結合反應。
同時，以0.1％的終濃度將SDS加入到重組人干擾素-β或天然干擾素-β溶液中，隨后將反應溶液的pH調節到9.0(反應條件3)。以相對于一個干擾素-β分子的45倍的量將羥基琥珀酰亞胺酯活化的聚乙二醇(平均分子量10K，20K，或40K)與得到的溶液混合，隨后于4℃過夜進行結合反應。
通過與實施例4中相同的抗病毒活性測量方法對反應后每種溶液中的干擾素-β活性進行評估。通過SDS-PAGE確認每種溶液中結合反應的進程。
如表2中所示，在不確保PEG與賴氨酸的結合選擇性的反應條件3下，不論PEG的分子量如何，干擾素-β活性都降至10％或更低。在另一方面，在提高PEG與位于第19或134位上賴氨酸的結合選擇性的反應條件1和2下，不論PEG的分子量如何，都確認至少10％或更高的干擾素-β活性得以保留。
具有2或多個PEG分子的非選擇性多PEG化的干擾素-β復合物和具有選擇性結合位于第19或134位上賴氨酸的PEG的單PEG化的干擾素-β復合物之間活性的比較在與實施例6中相同方式的PEG結合反應之后，用TOYOPEARLCM 650(S)柱(Tosoh)分離包含具有2或多個PEG分子的非選擇性多PEG化的干擾素-β復合物的級分和包含具有選擇性結合位于第19或134位上賴氨酸的PEG的單PEG化的干擾素-β復合物的級分以通過實施例4中所述的測量抗病毒活性的方法測量它們的干擾素-β活性。作為結果，如圖9所示，具有2或多個PEG分子的非選擇性多PEG化的干擾素-β復合物僅保留了大約1％的活性，而具有選擇性結合位于第19或134位上賴氨酸的40K PEG的單PEG化的干擾素-β復合物則保留了10％或更多的活性。
結合20,000分子量PEG的IFN-β復合物與結合40,000分子量PEG的IFN-β復合物之間在血液中滯留的比較用125I對結合20,000-或40,000-分子量PEG的IFN-β和非PEG化的IFN-β進行標記并向兔進行靜脈給藥。按照時間先后從兔中收集血液，一直持續6天。通過用γ計數器測量放射活性來測量血液中殘留的每種干擾素-β的量。血液中殘留的干擾素-β量的時間過程顯示于圖10中，給藥時的放射活性為100％。在長達6天中對于結合40,000分子量PEG的IFN-β來說血液中殘留的干擾素-β的量的積分是非PEG化的IFN-β的量的5.5倍。對于結合20,000分子量PEG的IFN-β來說血液中殘留的干擾素-β的量的積分是非PEG化的IFN-β的量的1.5倍。這一結果顯示對于血液中IFN-β復合物的滯留來說將20,000或更高分子量PEG結合到IFN-β上是重要的，活性得以保持。
在此將本文引用的所有出版物、專利和專利申請的全部內容并入作為參考。
工業實用性根據本發明，可以將聚乙二醇特異性結合位于干擾素-β氨基酸序列中第19或134位上的賴氨酸。通過本發明的方法生產的干擾素-β復合物保持高度活性，同時在活體內具有充分的溶解性與物理和生物學穩定性以及極佳的循環半壽期和清除值。因而，本發明的干擾素-β復合物產生更少的副作用并且可以用作高效藥物。
序列表<110>Toray Industries Inc.
<120>干擾素-β復合物<130>PH-2231-PCT<140>
<141>
<150>JP2003-299850<151>2003-08-25<160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>166<212>PRT<213>智人<220>
<223>發明人Narumi，Hideki發明人Tsushima，Yoshiaki發明人Yamashita，Koji發明人Sone，Saburou發明人Sato，Miyuki<400>1Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln1 5 10 15Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu20 25 30Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln35 40 45Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln50 55 60Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn85 90 95His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr100 105 110Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg115 120 125Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr130 135 140Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu145 150 155 160Thr Gly Tyr Leu Arg Asn16權利要求
1.一種生產干擾素-β復合物的方法，包括在至少一種添加劑存在的情況下，將干擾素-β結合到聚乙二醇上，所述添加劑選自由具有5個或更少糖單元的寡糖、單糖、其相應的糖醇和C2-6多羥基醇構成的組。
2.根據權利要求2的方法，其中所述添加劑選自由二糖、單糖、其相應的糖醇和C2-3多羥基醇構成的組。
3.根據權利要求1-3任一項的方法，其中所述添加劑選自由葡萄糖、甘露糖、山梨糖、蔗糖、海藻糖、乙二醇和甘油構成的組。
4.根據權利要求1-4任一項的方法，其中所述干擾素-β是天然的或重組的干擾素-β或其變化形式。
5.根據權利要求1-4任一項的方法，其中所述聚乙二醇具有10,000-60,000的平均分子量。
6.根據權利要求1-5任一項的方法，包括將聚乙二醇特異性結合位于干擾素-β氨基酸序列中第19或134位上的賴氨酸或其空間鄰近位點。
7.根據權利要求1-5任一項的方法，包括將聚乙二醇特異性結合位于干擾素-β氨基酸序列中第19或134位上的賴氨酸。
8.根據權利要求1-7任一項的方法，包括在pH5.0-8.5將干擾素-β與聚乙二醇反應。
9.根據權利要求1-8任一項的方法，包括在pH5.0-8.5將干擾素-β與用氨基反應性官能團活化的聚乙二醇反應，隨后利用離子交換載體將得到的反應產物進行濃縮和純化步驟，由此獲得具有聚乙二醇的干擾素-β復合物，所述聚乙二醇特異性結合位于干擾素-β氨基酸序列中第19或134位上的賴氨酸。
10.根據權利要求9的方法，包括用具有羥基琥珀酰亞胺酯或硝基苯磺酸酯結構的化合物活化聚乙二醇。
11.由根據權利要求1-10任一項的方法生產的干擾素-β復合物。
12.根據權利要求11的干擾素-β復合物，特征是所述復合物在抗病毒分析中顯示干擾素-β活性保留了結合前干擾素-β活性的10％或更高。
13.一種藥物組合物，其包含根據權利要求11或12的干擾素-β復合物。
全文摘要
本發明涉及具有高度生物學活性的干擾素－β和聚乙二醇之間的復合物，并且涉及高效生產所述復合物的方法。也就是說，本發明涉及生產干擾素－β復合物的方法，包括在至少一種添加劑存在的情況下，將干擾素－β結合到聚乙二醇上，所述添加劑選自具有5個或更少糖單元的寡糖、單糖、其相應的糖醇和C
文檔編號A61K38/21GK1871257SQ20048003130
公開日2006年11月29日 申請日期2004年8月24日 優先權日2003年8月25日
發明者成見英樹, 津島義明, 山下浩志, 曾根三郎, 佐藤美由紀 申請人:東麗株式會社, 谷口雄紹