專利名稱：梣酮作為肝病治療藥物的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于制藥技術領域。
背景技術：
梣酮(Fraxinellone)的化學結構自被報道以來，對該化合物的研究甚少，關于其藥理活性方面，尤其是保肝降酶、抗肝纖維化作用等，迄今未見報道。本發明主要發現了梣酮對多種急、慢性肝損傷具有顯著的改善作用。
發明內容
本發明的目的是研究梣酮在治療各種急、慢性病毒性肝炎、化學性肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝炎、重癥肝炎、暴發性肝衰竭、脂肪肝、肝纖維化、肝硬化及其他肝臟相關疾病中的應用。
本發明的技術方案1、梣酮的提取分離及其結構鑒定本發明所研究的梣酮(Fraxinellone)系從蕓香科植物白鮮Dictamnusdasycorpus Turcz.的根皮中分離得到。即取白鮮皮粗粉，用20倍量95％乙醇回流提取兩次，得乙醇提取液，經減壓濃縮后，用4倍量石油醚萃取，將石油醚部位用正相硅膠柱層析，用石油醚∶乙酸乙酯(3∶7)洗脫，得到梣酮。
梣酮為無味針狀晶體(乙醇)，可溶于乙醇、氯仿等有機溶劑。mp.117.5-118.5℃，[α]20D＝-44.7(1％，乙醇)，UVλmaxMeOH(nm)，221；IRνmaxKBr(cm-1)，3140，1745，1740，1674，1204，1040，1020，870，1HNMR(300MHz，CDCl3，TMS)，δ(ppm)，7.47(1H，d，1.0)，7.44(1H，d，1.0)，6.30(1H，s)，4.90(1H，s)，2.13(3H，s)，1.4-2.3(6H，m)，0.86(3H，s)。以上數據與文獻報道的一致，故鑒定為梣酮(Fraxinellone)，其結構式如下
本發明所述梣酮除上述分離方式外，還可從其它植物中分離得到，也可通過化學合成的方式獲取。
2、梣酮的藥理實驗1)CCl4誘導的急性肝損傷取ICR小鼠(20-24g)，隨機分成6組，其中4組分別按0.1ml/10g體重經口給予梣酮10、20、40mg/kg和聯苯雙酯(BDD)150mg/kg，模型組和正常組給予等量蒸餾水，連續7天。術次給藥后2小時除正常組外，其余各組腹腔注射0.15％CCl4橄欖油溶液(0.1ml/10g)，正常組腹腔注射等量的橄欖油溶液，24小時后取血，測血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)，天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)活力。
2)D-半乳糖胺(D-GalN)加LPS誘導小鼠肝損傷取昆明種小鼠(20-24g)，隨機分成7組，其中4組分別按0.1ml/10g體重經口給予梣酮(10、20、40mg/kg)和聯苯雙酯(150mg/kg)，每日一次，連續給藥7天，正常組，對照組和LPS組每天經口給予等體積水。末次給藥后2小時，除正常和LPS組外其他組均腹腔注射D-GalN(7mg/0.1ml/10g)，同時尾靜脈注射5μg LPS，LPS組僅尾靜脈注射5μg LPS，24小時后摘眼球取血，測血清ALT、AST活力。
3)CCl4誘導的慢性肝損傷取ICR小鼠(20-24g)，隨機分成6組，除正常組外其余各組均每隔2天經口給予0.3％CCl4橄欖油溶液(0.1ml/10g)，并每天喂食由20％豬油和0.25％膽固醇組成的特殊飼料，其中四組每天經口給予梣酮10、20、40mg/kg和聯苯雙酯200mg/kg，正常組和模型組給予等量蒸餾水，連續69天，于第34天起以25％乙醇代替飲水。第70天時(末次注射CCl4后3天)取血測血漿中脯氨酸肽酶(PLD)的活力，以及血清中ALT，AST，LDH，AKP的活力和肝組織羥脯氨酸含量，血清中白蛋白和總蛋白的含量。
4)梣酮對體外CCl4誘導的肝細胞損傷的影響從正常小鼠中分離出肝細胞，并通過二步灌流方法分離肝細胞，在96培養板中加入肝細胞，每孔細胞數為2×104，加藥預培養3小時，棄上清，再加入CCl4和藥物共培養2小時，吸取上清測ALT活力。
3、梣酮藥理實驗結果分析1)梣酮對CCl4誘導小鼠急性肝損傷的影響如圖1所示，與正常組相比，模型組ALT活力和AST活力顯著上升。梣酮10mg/kg能顯著降低AST活力，梣酮20、40mg/kg均能顯著抑制ALT及AST活力，作用呈劑量依賴性；BDD 150mg/kg也能降低ALT和AST活力。
2)梣酮對D-GalN和LPS誘導肝損傷的影響如圖2所示，與正常組相比，模型組ALT和AST活力顯著上升。梣酮10、20mg/kg均能顯著降低升高的AST活力，并有抑制ALT活力升高的趨勢。梣酮40mg/kg能顯著降低升高的ALT和AST的活力，梣酮三個劑量組均能改善肝損傷小鼠的死亡率，而BDD 150mg/kg未能抑制升高的ALT、AST的活力，也不能改善肝損傷小鼠的死亡率。
3)梣酮對CCl4致慢性肝損傷的影響如表1所示，與正常組相比，模型組ALT、AST、PLD、LDH、AKP活力，Hyp、TP含量顯著升高，A/G比值顯著降低。梣酮10mg/kg能顯著降低升高的PLD活力，梣酮20mg/kg能顯著降低升高的ALT、AST、PLD、LDH的活力，梣酮40mg/kg能顯著降低升高的ALT、AST、PLD、LDH、AKP活力。BDD 200mg/kg也能顯著降低升高的ALT、AST、PLD、LDH、AKP的活力。
4)梣酮對體外CCl4誘導肝損傷的影響肝細胞與不同濃度的梣酮預培養3小時后，棄上清，加入不同濃度梣酮及0.15％CCl4共孵育2小時，取上清測ALT，如圖3所示，與肝細胞的自動釋放ALT相比，加入CCl4使肝細胞釋放的ALT顯著增加，梣酮10-4-10-5g/ml能完全抑制ALT的釋放，梣酮3×10-6-10-6g/ml則部份抑制了ALT的釋放。
本發明所述，梣酮可用于制備多種急、慢性肝炎，包括病毒性肝炎、化學性肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝炎、重癥肝炎、暴發性肝衰竭、脂肪肝的治療藥物，也可應用于制備肝纖維化、肝硬化及其他肝臟相關疾病的治療藥物。
表1 梣酮對CCl4誘導的小鼠慢性肝損傷的影響
昆明種小鼠隨機分成6組，除正常組外其余各組均每隔2天經口給予0.3％CCl4橄欖油溶液(0.1ml/10g)，每天喂食由20％豬油和0.25％膽固醇組成的特殊飼料，其中4組每天經口給予梣酮10，20，40mg/kg和聯苯雙酯BDD 200mg/kg，正常組和模型組給予等量蒸餾水，連續69天，于第34天起以25％乙醇代替飲水。第70天時(末次注射CCl4后3天)取血，測血漿中脯氨酸肽酶(PLD)的活力，血清中ALT，AST，LDH，AKP的活力，血清中白蛋白和總蛋白的含量，及肝組織羥脯氨酸Hyp的含量，結果以X±S表示。
#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001與正常組相比；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與對照組相比(Student’s-t test).
四
圖1 梣酮對CCl4誘導的小鼠急性肝損傷的影響。
ICR小鼠隨機分成6組，分別為正常組、模型組、梣酮10，20、40mg/kg和聯苯雙酯(BDD)150mg/kg，連續經口給藥7天。末次給藥后2h除正常組外，其余各組腹腔注射0.15％CCl4橄欖油溶液(0.1ml/10g)，正常組腹腔注射等量的橄欖油溶液，24h后取血，測血清ALT，AST活力，結果以X±S表示。##P＜0.01 vs normal；*P＜0.05，**P＜0.01 vs control(Smdent’s-t test).
圖2 梣酮對D-GalN和LPS誘導肝損傷的影響。
昆明種小鼠隨機分成7組，其中4組分別經口給予梣酮10、20、40mg/kg和聯苯雙酯BDD 150mg/kg，每日一次，連續灌胃給藥7天，正常組，對照組和LPS組每天經口給予等體積水。末次給藥后2h除正常和LPS組外其他組均腹腔注射D-GalN(700mg/10ml/kg)，同時尾靜脈注射5μg LPS，LPS組則僅尾靜脈注射LPS，24h后取血，測血清ALT，AST活力。結果以X±S表示。###P＜0.001vs normal；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs control(Student’s-t test).
圖3 梣酮與藥物共孵育對CCl4誘導小鼠原代肝細胞損傷的影響。
以常規方法制備肝細胞，2×104個細胞/孔與不同濃度的梣酮預培養3小時后，棄上清，加入不同濃度梣酮及0.15％CCl4共孵育2小時，取上清測ALT。圖中數據為3次實驗的平均值，每次實驗為3復孔。
五具體實施例方式
1.從蕓香科植物白鮮Dictamnus dasycorpus Turcz.的根皮中分離得到梣酮。即取白鮮皮粗粉9.0kg，經乙醇提取，石油醚萃取，層析洗脫得到梣酮3.5g。梣酮也可從其它植物中分離或通過化學合成獲取。
2.對CCl4誘導的小鼠急性肝損傷，口服給予梣酮10mg/kg即能顯著降低肝損傷所致的AST活力升高，梣酮20、40mg/kg均能顯著抑制ALT及AST活力，作用呈劑量依賴性。
3.對D-GalN和LPS誘導的肝損傷，梣酮10、20mg/kg均能顯著降低升高的AST活力，并有抑制ALT活力升高的趨勢。梣酮40mg/kg能顯著降低升高的ALT和AST的活力，梣酮三個劑量組均能改善肝損傷小鼠的死亡率。
4.對CCl4致慢性肝損傷，梣酮10mg/kg能顯著降低升高的PLD活力，梣酮20mg/kg能顯著降低升高的ALT、AST、PLD、LDH的活力，梣酮40mg/kg能顯著降低升高的ALT、AST、PLD、LDH、AKP活力。
以上結果提示，梣酮不但能改善CCl4急性肝損傷及D-GalN+LPS急性肝損傷，而且能明顯改善CCl4慢性肝損傷，顯示出良好的保肝作用，故其作為肝炎治療藥物可在制備各種急、慢性肝炎(病毒性、化學性、酒精性、藥物性)、重癥肝炎、暴發性肝衰竭、炎癥性脂肪肝、中毒性脂肪肝、肝纖維化、肝硬化疾病的治療藥物中得到應用。
權利要求
1.梣酮，可從中藥白鮮皮或其他植物中分離得到，或通過化學合成得到，其結構式為
2.根據權利要求1所述，梣酮在制備多種急、慢性肝炎，包括病毒性肝炎、化學性肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝炎、重癥肝炎、暴發性肝衰竭、脂肪肝治療藥物中的應用。
3.根據權利要求1所述，梣酮在制備肝纖維化、肝硬化及其他肝臟相關疾病治療藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬于制藥技術領域。本發明所述，從蕓香科植物白鮮Dictamnusdasycorpus Turcz.的根皮中分離得到梣酮。梣酮(Fraxinellone)可顯著改善CCl
文檔編號A61P1/16GK1724527SQ200510040878
公開日2006年1月25日 申請日期2005年7月4日 優先權日2005年7月4日
發明者徐強, 吳斐華, 朱丹妮, 陳婷 申請人:徐強