專利名稱：HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術及生物醫藥領域，尤其涉及一種能有效控制肝癌等腫瘤復發轉移及抗類風濕關節炎、骨關節炎等侵襲性疾病的小片段干涉RNA藥物及其用途。
背景技術：
據世界衛生組織(WHO)估計，每年全世界死于癌癥患者約600萬，占全球死亡人數的12％。我國1995年主要疾病死亡率及死亡原因構成中，惡性腫瘤排列第2位，占死亡總人數的21.85％。長期以來，由于腫瘤高復發、高轉移的惡性特點，一直是腫瘤治療亟待解決的問題。目前國內外抗癌治療關注的熱點之一是抗腫瘤的浸潤、轉移。腫瘤的轉移規律極其復雜，涉及諸多因素，如(1)蛋白水解酶；(2)血管生成因子；(3)粘附因子，如整合素(integrin)，選擇素(selectin)，鈣粘合素(E-cadherin)等；(4)運動因子。在腫瘤的侵襲、轉移過程中，癌細胞誘導效應細胞分泌蛋白水解酶，降解細胞外基質，其中基質金屬蛋白酶(MMPs)最為重要，目前已發現了20余種，它們幾乎能降解細胞外基質的所有成分。MMPs的作用可概括為(1)降解間質，破壞膠原限制腫瘤生長的機械屏障作用；(2)破壞基底膜完整性，利于癌細胞穿過血管壁進入血流；(3)通過對細胞外基質的改建，促進腫瘤新生血管或轉移灶的形成。由于MMPs在腫瘤侵襲轉移中的重要作用，因而腫瘤組織中MMPs的來源一直是人們研究的重點問題。
近年來本申請人研究發現，HAb18G/CD147在肝癌等多種高侵襲轉移性腫瘤及炎性滑膜中高度表達，HAb18G/CD147與其效應細胞(如癌周成纖維細胞)結合常常大量誘導產生MMPs或上調激活MMPs的活性，使腫瘤組織中MMPs含量及活性顯著提高，間質成分和血管基底膜的膠原蛋白過度降解，癌細胞穿過基底膜及結締組織屏障不斷侵襲擴散和轉移。目前，抗間質降解多采用酶抑制劑，如天然酶抑制劑-組織型金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)，能夠與MMPs結合并抑制酶活性，但TIMPs在組織中含量極微且難于提取，人工重組TIMPs是大分子蛋白質，存在降解和口服吸收不良等問題。人工合成的擬肽類金屬蛋白酶抑制劑，如Batimastat(BB-94)，只能抑制早期腫瘤誘導產生的MMPs的活性，幾乎不能抑制晚期腫瘤誘導產生的大量MMPs的活性，導致III期臨床實驗的停止。
類風濕性關節炎(RA)在我國成人中的發病率約0.3％’(患病人數達300余萬)。發病年齡輕，致殘率高。此外，幼年型類風濕性關節炎也是小兒常見的結締組織病。其臨床特點為累及到周身關節的增殖性和侵蝕性滑膜炎，呈進行性病變終生反復不斷。被認為是類似“局限性惡性腫瘤”的增生性和破壞性病變。RA組織病理學特征是滑膜襯里過度增生和襯里下層大量炎性單個核細胞浸潤。成纖維細胞樣滑膜細胞和滑膜組織巨噬細胞在關節損傷中起最重要的作用。這兩種細胞均能產生大量MMPs。這些酶以協同作用方式能夠消化滑膜、關節軟骨和軟骨下骨的所有主要的細胞外基質組分。RA滑膜中EMMPRIN(CD147)的表達上調，可誘導局部產生MMPs1、2、3等蛋白水解酶，且可導致MMPs和TIMPs的不平衡最終引起RA關節的破壞。此病至今尚無特效治療。90年代以來，國內外學者采用仿效結核病和惡性腫瘤的聯合療法，是此類疾病治療學上的一大突破，使部分患者病情得到較長期緩解，生活質量得到提高，但并未治愈疾病。抑制軟骨和骨侵蝕仍是此病治療亟待解決的問題。
發明內容
本專利申請發明人在長期從事肝癌免疫導向藥物研究的基礎上，獲得肝癌高親和力單抗HAb18(第四軍醫大學細胞工程中心研制)的相應膜抗原HAb18G的cDNA全長序列，發現其與CD147的序列高度同源，通過基底膜侵襲實驗和明膠酶譜實驗分析，證實HAb18G/CD147分子可大大促進肝癌細胞的侵襲和轉移。基于以上研究基礎，以及HAb18/CD147在正常肝細胞中不表達，在肝癌上為高表達的特點，可通過在分子水平直接高位阻斷HAb18G/CD147分子的表達來抑制肝癌轉移。所以，本發明的目的之一就是設計有效的HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物從分子水平高位阻斷效應細胞分泌MMPs，這對腫瘤復發轉移的治療可能更為直接有效。
鑒于MMPs通過直接降解軟骨、骨組織和間接促進血管形成而參與RA關節破壞。因此抑制MMPs是治療RA的基本途徑之一。此外，骨關節炎與老齡化密切相關，隨著人類壽命的延長，發病率增高，軟骨細胞、滑膜細胞和成纖維細胞產生MMPs，亦在骨關節炎發病中起重要作用。但迄今有關應用酶抑制劑抗間質降解的臨床實驗結果與上述抗腫瘤轉移治療一樣令人失望。所以，本發明的另一目的之一就是利用設計有效的HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物，在分子水平高位阻斷抑制效應細胞分泌MMPs，也是類風濕性關節炎和骨關節炎治療的新途徑和發展趨勢。
本發明提供一種具有抗腫瘤復發、轉移和抗類風濕性關節炎、骨關節炎、的小片段干涉RNA藥物及其用途。
本發明是以下述方式實現的HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物，是抗間質降解和抗炎的一類干涉RNA藥物，具有抗腫瘤復發、轉移和抗類風濕性關節炎、骨關節炎的作用，針對靶抗原HAb18G/CD147分子的小片段干涉RNA藥物的序列如下，5’-GUUCUUCGUGAGUUCCUCdTdT-3’，3’-dTdTCAAGAAGCACUCAAGGAG-5’HAb18G/CD147分子小片段RNA干涉藥物的制備方法，根據HAb18G/CD147分子的基因序列，我們選擇其mRNA分子起始密碼子后第470-488位共18個核苷酸為靶向干涉序列，經DNA合成儀按上述設計的序列大量合成雙鏈互補的HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物。此合成的小片段干涉RNA藥物經脂質體混合轉染靶細胞后，用于腫瘤復發、轉移及類風濕關節炎、骨關節炎的治療。
在HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物的基礎上，進一步加免疫球蛋白Fc段或用納米質脂體包裹后的制劑，可用于腫瘤復發、轉移及類風濕關節炎、骨關節炎的治療。
體外實驗表明我們設計合成的HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物，經細胞侵襲力抑制實驗證明，該小片段干涉RNA藥物對肝癌細胞及其與人成纖維細胞共培養后細胞侵襲能力的抑制率分別為82.9％和82.3％。明膠酶譜實驗證明，肝癌細胞及其與人成纖維細胞共培養后MMP-2、9的分泌量分別降低60.1％、73.5％。此外，ELISA證實，干涉RNA轉染后的FHCC-98細胞分泌VEGF的量下降了25％。
體內功能實驗用合成的HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物對荷人肝癌的裸鼠進行治療，發現其對肝癌成瘤性有明顯抑制作用。當對照組在第12天每只裸鼠都成瘤時，其試驗組裸鼠均成瘤不明顯。此外，治療組的平均生存期比對照組延長接近一倍以上。
綜上所述，這此結果說明該小片段干涉RNA藥物在抗肝癌等腫瘤復發、轉移上有明確的應用效果，其可能在類風濕關節炎及骨關節炎等疾病的治療中也具有潛在的應用價值。
圖1是RT-PCR、Western-blot和流式細胞儀檢測RNAi干涉細胞HAb18G/CD147表達結果，其中(a)為RT-PCR結果，泳道“-”為未轉染的FHCC-98細胞中HAb18G/CD147、GAPDH的mRNA的量，泳道“+”為轉染后細胞中HAb18G/CD147、GAPDH的mRNA的量。(b)為western-blot的結果，泳道1為未轉染的細胞中HAb18G/CD147，泳道2為轉染后的HAb18G/CD147。(C)為流式細胞儀的檢測圖，右峰為轉染前的HAb18G/CD147，左峰為轉染后的HAb18G/CD147。
圖2(a)為明膠酶譜實驗結果，RNA干涉HAb8G/CD147表達后FHCC-98細胞及其與HPF-1細胞共培養后，MMP-2的分泌量分別顯著降低。(b)為細胞侵襲力抑制結果，分別為FHCC-98在干涉前后、及與HPF-1共培養后觀察到的侵襲穿膜細胞。可見，在siRNA干涉CD147表達后，細胞的侵襲能力顯著降低(2.5)。(C)為ELISA測定結果，FHCC-98細胞在RNA干涉前后VEGF的分泌量顯著下降。
具體實施例方式
1。HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物的設計與合成根據HAb18G/CD147分子的基因全長mRNA序列，經BALST在GENEBANK中搜索比對后，我們選擇了HAb18G/CD147基因mRNA分子起始密碼子后第470-488位共18個核苷酸為靶向干涉的具體序列，設計合成了一段高特異性的雙鏈互補的HAb18G/CD147小片段干涉RNA，經DNA合成儀大量合成后用PAGE技術純化鑒定純度達99％以上，其序列如下所示。
5’-GUUCUUCGUGAGUUCCUCdTdT-3’，3’-dTdTCAAGAAGCACUCAAGGAG-5’2。脂質體介導小片段干涉RNA藥物轉染肝癌細胞FHCC-98細胞經24小時培養后，將50pmol小片段干涉RNA與10ul脂質體lipfectamine2000共溶入1640培養基中，室溫孵育混合20分鐘后，加在接種的細胞中。轉染細胞24小時后，提取總RNA作RT-PCR分析HAb18G/CD147mRNA量。提取總蛋白用WESTERN-BLOT檢測HAb18G/CD147蛋白表達量。同時，用流式細胞儀進一步驗證HAb18G/CD147分子表達量。
結果發現，小片段干涉RNA藥物轉染后，HAb18G/CD147基因轉錄的mRNA量明顯降低，HAb18G/CD147蛋白的表達量也顯著降低(參見圖1)。
3。小片段干涉RNA藥物的體外功能實驗(1)細胞侵襲力抑制實驗，即在底層鋪有Matrigel膠Millicell小室中，將轉染和未轉染的FHCC-98細胞單培養，或將其與HPF-1細胞共培養后，檢測穿過Matrigel膠的肝癌細胞較對照是否有減少，并計算HAb18G/CD147小片段干涉RNA分子對肝癌細胞轉移的抑制率。計算公式[(干涉前細胞均數-干涉后細胞均數)/干涉前細胞均數]×100％。(2)明膠酶譜實驗，即將轉染和未轉染的FHCC-98細胞單培養，或將其與HPF-1細胞共培養后，收集無血清培養細胞上清，經分離膠中含0.1％明膠粉的凝膠電泳后，加入明膠酶孵育、染色進行灰度掃描比較。(3)ELISA檢測人VEGF的分泌表達實驗，即將轉染和未轉染的人肝癌細胞FHCC-98無血清培養上清，分別加至包被人VEGF單抗的酶標板上，進行常規夾心ELISA，置492nm處測吸光值，檢測HAb18G/CD147小片段RNA干涉對人VEGF分子分泌表達量的影響。
結果發現，小片段干涉RNA藥物轉染，其對肝癌細胞及其與人成纖維細胞共培養后細胞侵襲能力的抑制率分別為82.9％和82.3％，其對肝癌細胞及其與人成纖維細胞共培養后MMP-2、9的分泌量分別抑制降低60.1％、73.5％，其對FHCC-98細胞分泌VEGF的量下降了25％(參見圖2)。
4。小片段干涉RNA藥物的體內功能實驗采用皮下接種人肝癌細胞系FHCC-98形成瘤塊的BALB/C裸鼠模型，尾靜脈加壓注射脂體包裹的HAb18G/CD147小片段干涉RNA藥物(125μg/kg/day)，同時設立對照。皮下組隔日1次，共12次；皮下組觀察接種FHCC-98細胞后皮下腫瘤生長情況，從d10開始，每4d測定1次腫瘤體積；觀察150d裸鼠生存情況。結果發現，在d 30 RNA干涉治療組的抑瘤率為61.3％，與對照組比顯著縮小(P＜0.05)(見表1)，其150d生命延長率比對照組延長40.9％(P＜0.01)(見表2)。
表1荷人肝癌FHCC-98裸鼠經小片段干涉RNA治療后的抑瘤率
*與對照組相比較，P＜0.05表2荷人肝癌FHCC-98裸鼠經小片段干涉RNA治療后150天內平均生存情況
**與對照組相比較，P＜0.0權利要求
1.HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物，其特征在于該針對靶分子HAb18G/CD147的小片段RNA具有互補的雙鏈核苷酸序列5’-GUUCUUCGUGAGUUCCUCdTdT-3’，3’-dTdTCAAGAAGCACUCAAGGAG-5’。
2.如權利要求1所述的HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物作為制備抗腫瘤復發、轉移和抗類風濕關節炎、骨關節炎治療劑的應用。
全文摘要
HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物涉及生物技術及生物醫藥領域。本發明是一種能抗腫瘤間質降解、抗炎感染的雙鏈互補小片段RNA類物質。其以肝癌轉移相關因子HAb18G/CD147為靶向分子，設計并合成它的小片段干涉RNA抑制劑；阻斷效應細胞(成纖維細胞、滑膜細胞)誘導分泌基質金屬蛋白酶(MMPs)的功能；減少腫瘤組織間質的降解、關節軟骨侵蝕、新生血管(血管翳)的形成；達到治療肝癌等腫瘤的復發、轉移，以及類風濕性關節炎和骨關節炎的目的。經體內、外實驗證明，這類特異性靶向HAb18G/CD147分子的小片段RNA干涉藥物對肝癌細胞轉移有明確的抑制效果。
文檔編號A61P35/00GK1720999SQ20051004275
公開日2006年1月18日 申請日期2005年6月3日 優先權日2005年6月3日
發明者續惠云, 張思河, 徐靜, 朱平, 陳志南 申請人:陳志南