專利名稱：抗急性髓性白血病的gm－csf靶向藥物脂質體及制備方法
技術領域：
本發明涉及一種治療急性髓性白血病的藥物，具體的說是在包封有抗急性髓性白血病的藥物的脂質體表面聯接具有主動靶向性的導向物GM-CSF而形成的靶向藥物脂質體及其制備方法。
背景技術：
急性白血病是造血系統的惡性腫瘤，發病率約3/10萬居住人群，占青少年惡性腫瘤第一位。致病原因目前還不是十分清楚，可能與病毒、物理及化學致癌因素有關。急性白血病往往導致正常造血功能障礙和白血病細胞浸潤癥狀，臨床常有嚴重感染、出血、貧血等表現，不經治療中位生存期不足三個月，對生命財產構成很大威脅。急性白血病分為急性髓性白血病和急性淋巴細胞白血病兩種主要類型，其中在我國急性髓性白血病占2/3以上。
急性髓性白血病通常采用化學治療，標準的DA化療方案能夠使60％-80％的初發患者獲得緩解，但單純用化療治愈率不足15％。近年來急性髓性白血病(AML)的治療有了很大進展，骨髓干細胞移植等方法可以使近50％~60％的患者獲得治愈，但仍然有相當部分患者療效較差或復發而成為難治病例。另一方面，某些患者的身體狀況如年齡較大或有臟器功能損傷不能承受較強烈的化療或骨髓移植治療，因此，對于一般情況不佳耐受性差的患者，開發增強藥物的特異靶向性、增加療效、減少不良反應的治療方法顯得十分重要。國外多采用單克隆抗體作為靶向制導劑，單用或攜帶同位素、毒素、化療藥物制備成靶向治療劑。但單克隆抗體十分昂貴，如果用鼠抗還易導致抗體產生而不能重復使用。
脂質體是一種定向藥物載體，屬于靶向給藥系統的一種新型制劑。它具有類細胞結構，進入人體內主要被網狀內皮系統吞噬而激活機體自身的免疫功能，并改變被包封藥物的體內分布、使藥物主要在肝、脾、肺和骨髓等組織器官中蓄積，從而提高藥物的治療指數、減少藥物的治療劑量和降低藥物的毒性。因此，脂質體在許多疾病尤其是癌癥的治療中顯示了明顯的優越性。脂質體作為抗癌藥物的載體具有能增加藥物與癌細胞的親和力，克服耐藥性，增加藥物被癌細胞的攝取量、降低用藥劑量、提高療效、降低毒副作用的特點。大量的研究結果表明抗癌藥物脂質體可以提高藥物療效、降低毒性作用(參見文獻BayesM.Gateways to clinical trials[J].Methods Find Exp Clin Pharmacol，2003，25(1)53-76；和Gokhale PC.Improved safety pharmacokinetics and therapeuticefficacy profiles of a novel liposomal formalation of mitoxantrone[J].Anticancer Res，2001，21(5)3313-3321；和Adlakha-Hutchem G.Controlled destabilization of aliposomal drug delivery system enhances mitoxantrone antitumor activity[J].NatBiotechnol，1999，17(8)775-779)。但是脂質體本身的靶向性是一種非特異性作用，要使脂質體特異性地分布到特定的組織器官需要在脂質體表面聯接上導向物質制成靶向脂質體。
靶向脂質體對靶細胞具有特異親和力、療效顯著、不良反應小，同時包封多種化療藥物制成聯合化療靶向脂質體，可方便高效地實現聯合化療。靶向脂質體的優點是載藥量大，體內滯留時間長，有專一靶向性，是當前較受重視的一種釋藥系統(參見文獻Bendas G.Immunoliposomesa promising approach totargeting cancer therapy[J].BioDrugs，2001，15(4)215-224，和Hou XP.Study onthird-type immunoliposomes loaded drugs and the targeting in vitro and in vivo[J].Yao Xue Xue Bao，2001，36(7)539-542，和Maruyama.K.In vivo targeting byliposomes[J].Biol Pharm Bull，2000，23(7)791-799)。
發明內容
本發明的目的，是提供一種抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向藥物脂質體。它利用對急性髓性白血病細胞(表達GM-CSF受體)具有特異靶向性的GM-CSF作為導向物質，聯接已包封抗急性髓性白血病的藥物的脂質體，制備成靶向脂質體。抗急性髓性白血病的藥物可以采用抗腫瘤抗生素或烷化劑類抗腫瘤藥或影響核酸生物合成的抗腫瘤藥或影響蛋白質合成的抗腫瘤藥或拓撲異構酶抑制劑或生物毒素，以組成不同的與GM-CSF組成的藥物脂質體。抗急性髓性白血病的藥物優選米托蒽醌、柔紅霉素、阿霉素、阿克拉霉素、刺孢酶素、吡南阿霉素、阿糖胞苷、氟達拉賓、吉西他賓、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、長春新堿、長春花堿、拓撲替康、足葉一甙、VM26、環磷酰氨、異環磷酰氨、順鉑、卡鉑、卡氮芥、馬法蘭、馬利蘭、羥基脲、紫山醇。
本發明采用粒單細胞集落刺激因子(GM-CSF)作為導向藥物與藥物脂質體聯接形成新的具有靶向治療特征的治療制劑，用于治療急性髓性白血病，一方面使治療成本較單克隆抗體顯著降低，另一方面由于脂質體可以攜帶一種或多種較大劑量的治療因子，從而顯著提高療效并有利于克服耐藥。
本發明采用體外模型MTT實驗檢測其對急性髓性白血病細胞株HL60的細胞毒作用和對細胞凋亡的影響，為用靶向脂質體包封藥物治療惡性腫瘤，提供了研究基礎。
本發明的另一個目的，是提供制備DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體的方法。
它包括以下步驟1).制備DHAQ脂質體；2).測定DHAQ脂質體包封率；3).制備DHAQ靶向脂質體；4).DHAQ-GM-CSF靶向脂質體的純化。
本發明的實施例采用治療急性白血病有良好療效的米托蒽醌(DHAQ)作為被包封藥物，導向物質采用粒-巨嗜細胞集落刺激因子GM-CSF。在脂質體表面聯接導向物質制成靶向藥物脂質體DHAQ-GM-CSF，通過導向物質的特異性專一地與靶細胞表面的受體分子相互作用，而使脂質體在靶區釋放藥物。
本發明的再一個目的，是提供DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體對急性髓性白血病具有特異殺傷性的試驗結果。
本發明的優點是用DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體治療AML具有相對選擇作用，藥物的特異靶向性好，療效高，毒副作用小，提高患者對化療的耐受性，使DHAQ發揮更佳的抗白血病作用。由于重組人GM-CSF易得到，不會刺激體內產生抗體而影響療效，可以多次重復使用，因此成本低，安全性高。
本發明采用急性髓性白血病細胞株HL60，其細胞膜上可以大量表達GM-CSF受體，結合位點為322個/細胞。
本發明采用戊二醛交聯法，以戊二醛作偶聯劑，使其兩端的醛基分別與磷脂的NH2和蛋白質的NH2縮合，將已制好的脂質體和導向物質相聯。此方法方便高效，其反應條件溫和，免疫物質活性高。
本發明采用DHAQ脂質體表面聯接導向物質制成的DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體，其脂質體粒徑為160-220，此粒徑的脂質體細胞毒作用強。其原因是在導向物質和被包封藥物相同的條件下，靶向脂質體對細胞的殺傷作用主要受脂質體的粒徑和被包封的藥物量決定，前者主要是影響脂質體顆粒與細胞碰撞結合的機率，小顆粒脂質體具有較高的運動速度和碰撞機率游離于受體-配體結合，后者主要是決定單位導向物質的效應。在脂質體粒徑無顯著差異的條件下，較大顆粒的脂質體包封的藥物更多與小顆粒相比具有更高的單位效應，故能發揮更強的殺傷作用。因此，我們選擇超聲30min制備粒徑為約為200nm脂質體以達到更好的細胞殺傷作用。
當然選擇不同的抗急性髓性白血病的藥物與GM-CSF組成的藥物脂質體，達到相同或近似的細胞毒作用，有不同的粒徑。
脂質體作為抗癌藥物載體，具有能增加與癌細胞的親和力、克服耐藥性、增加藥物被癌細胞的攝取、降低用藥劑量、提高療效、降低毒副作用的特點。
GM-CSF是粒單核細胞系祖細胞增殖分化的正向調節因子，它能刺激髓系造血細胞生長和分化，增強成熟粒細胞和單核巨噬細胞的功能。GM-CSF通過結合細胞表面的同源受體發揮作用。
本發明在進行MTT實驗的同時，還進行了GM-CSF的導向性的驗證實驗。由于DHAQ-GM-CSF靶向脂質體上的GM-CSF能夠發揮導向作用，而該導向效應是通過配體-受體結合而起效的，如果預先加入飽和量的GM-CSF占領HL60細胞表面的受體，則后續加入的DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體的特異性殺傷作用將被阻斷，僅余留脂質體的非特異性殺傷作用。
圖1-1為電鏡下本發明的脂質體；圖1-2為電鏡下本發明的脂質體；圖1-3為電鏡下本發明的脂質體；圖2-1電鏡下調亡的HL60細胞；圖2-2電鏡下調亡的HL60細胞；圖3-1流式細胞術測GM-CSF活性保留率；圖3-2流式細胞術測GM-CSF活性保留率；圖3-3流式細胞術測GM-CSF活性保留率；圖4-1Annexin V/PI雙染法測HL60細胞的凋亡率；圖4-2Annexin V/PI雙染法測HL60細胞的凋亡率；圖4-3Annexin V/PI雙染法測HL60細胞的凋亡率；圖4-4Annexin V/PI雙染法測HL60細胞的凋亡率；圖5不同濃度的DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體、DHAQ脂質體、DHAQ對HL60細胞的殺傷作用趨勢圖(24h)；圖6不同濃度的DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體、DHAQ脂質體、DHAQ對HL60細胞的殺傷作用趨勢圖(48h)。
具體實施例方式
為了進一步說明DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體及制備方法，參照下列實施例說明，這些實施例是為了進一步進行解釋，而不以任何方式限制本發明。
1.材料HL60細胞，由上海生物研究所提供。
2.試劑DHAQ原料藥購自重慶凱林制藥有限公司；GM-CSF原料藥由北京北醫聯合醫藥有限公司提供，其結合位點平均為322個/HL60細胞[16]；膽固醇、卵磷脂、MTT、DMSO購自Sigma公司；PE-抗人GM-CSF抗體及對照購自美國Biolegend公司；FTIC-Annexin-V購自北京晶美生物技術有限公司；乙醚、無水乙醇、戊二醛購自重慶醫藥化玻分公司，均為分析純；胎牛血清購自杭州四季青工程有限公司。
細胞培養HL60細胞用含體積分數為10％胎牛血清的RPMI-1640培養液，置于37℃，體積分數為5％的CO2，飽和濕度的培養箱中培養。取對數生長期的細胞進行實驗。
實施例1 DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體的制備、純化和鑒定1.DHAQ脂質體的制備采用逆向蒸發法制備DHAQ脂質體(參見文獻Szoke F.Procedure forpreparation of liposomes with large internal aqueous space and highcapture by reverse-phase evaporation[J].Proc Natl Acad Sci USA，1978，75(9)4194)。
取10mgDHAQ原料藥，溶于20ml蒸餾水中備用，另取卵磷脂(Pc)2g、膽固醇(Cho)0.4g(Pc∶Cho＝1∶0.2，W/W)，加入60ml乙醚，攪拌至完全溶解，將DHAQ溶液緩慢加入Pc和Cho的乙醚溶液中(WPc∶WDHAQ＝200∶1，有機相∶水相＝3∶1)，邊加邊攪拌，再置于超聲振蕩儀中振蕩約30min，至水相和有機相混合均勻，呈藍色乳狀懸液。乳狀液以旋轉蒸發儀減壓蒸發40min，30℃，中間加入PBS緩沖液15ml。上述操作均在20℃室溫下進行。
2.DHAQ脂質體的純化采用離心法分離脂質體和游離DHAQ水溶液。
將上述步驟1中制得的乳狀液以10000rpm的轉速離心20min，取脂質體層用于靶向脂質體的制備，水溶液層用于包封率的測定。
3.DHAQ脂質體包封率的測定用下列公式(1)計算包封率Qw％＝[(W總-W游)/W總]×100％(1)式中Qw％為包封率；W總為DHAQ的總投樣量；W游為未包封的游離DHAQ含量W游的測定參照中國藥典第二部中DHAQ和注射用DHAQ的含量測定項下的規定，采用比色法進行測定(參見中國藥典第二部附錄IIB[S]，附錄27.)，具體操作如下取DHAQ原料藥10mg，精密稱定，置于100ml量瓶中，加水1ml溶解，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加0.1mol/l的鹽酸溶液5ml，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，照比色法，在663nm的波長處測定吸光度，DHAQ的吸收系數為570，代入公式(2)計算A＝ECL (2)式中A為吸光度、E為吸收系數、C為100ml溶液中所含的被測物質的克數，L為液層厚度(單位cm).
連續測定三個樣品的C值，計算平均數即為對照品溶液的濃度，換算成對照品的含量。
精密量取實施例2中2步驟得到的水溶液1ml，置于50ml量瓶中，用無水乙醇分次洗滌量器，洗滌并入量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，照上述方法，自“精密量取5ml”起，依法測定，照公式(3)計算含量CX＝(AX/AR)/CR(3)式中CX為待測樣品溶液的濃度、AX為待測樣品溶液的吸光度、CR為對照品溶液的濃度、AR為對照品溶液的吸光度。
連續測定三瓶，計算平均數，即得1ml水溶液中游離DHAQ的含量，換算成實施例2中2步驟水溶液中游離DHAQ的含量W游。上式中CX為已知，AX為與待測樣品同時測得的對照品的吸光度。
4.DHAQ靶向藥物脂質體的制備采用戊二醛交聯法制備靶向脂質體(參見文獻汪冰，楊翰儀.單克隆抗體偶聯脂質體的制備及其與胃癌細胞特異結合研[J].沈陽藥學院學報，1993，11(1)17)。
取10％的DHAQ脂質體溶液13ml，加入25％的戊二醛13ml，室溫20℃，放置10min，過量的戊二醛用生理鹽水透析4h除去，換液2次，加入1mgGM-CSF原料藥，4℃過夜。得到DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體。
5.DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體的純化采用蔗糖密度梯度離心法分離游離GM-CSF和靶向脂質體(參見文獻汪冰，楊翰儀.用密度梯度離心法分離脂質體-IG復合物與游離IG[J].中華物理醫學雜志，1993，1(15)39)。
取上述制得的DHAQ-GM-CSF靶向脂質體0.4ml，加入0.8ml蔗糖溶液(30％，W/W)混勻，放入離心管中，加入2.4ml蔗糖溶液(15％，W/W)作為第二層，最上層加0.4ml緩沖液作為封閉層，4℃，30000rpm，離心30min，從上到下吸出，封閉層和脂質體層各0.4ml，脂質體層再按上述方法梯度離心一次。
6.偶聯率的測定采用紫外分光光度法測定偶聯率(參見文獻牛榮麗，薛弘燮，李志良.阿苯達唑靶向脂質體的制備[J].新疆醫科大學學報，2001，24(1)60-62)。
分離后的靶向脂質體為脂質體-蛋白質復合物，用紫外分光光度法測定其中蛋白質的含量即為偶聯上的GM-CSF量，具體操作如下取純化后的DHAQ-GM-CSF靶向脂質體加入比色杯中，在280nm波長處測定其A值，連續測定三個樣本，計算平均值，再代入公式(4)計算偶聯率＝(純化后DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體的A值/純化前DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體的A值)×100％ (4)7.DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體中GM-CSF活性保留率的測定采用流式細胞術測定靶向脂質體中GM-CSF活性的保留率。
取對數生長期的HL60細胞，調成密度為5×108個/l的細胞懸液，接種于6孔板上，每孔加入細胞懸液3ml，實驗分為3組DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體組、GM-CSF組和空白對照組。
DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體組加入濃度為2.5μg/ml的靶向脂質體溶液300μl；GM-CSF組加入濃度為0.9μg/ml的GM-CSF溶液300μl(等于DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體中GM-CSF的濃度)；空白對照組加入等體積生理鹽水。
3組于CO2孵箱內培養2h后，2000rpm離心10min，棄培養液，用PBS洗滌2次，2000rpm離心20min，棄上清液，收集細胞，加入PE-抗人GM-CSF抗體，0.5h后用PBS洗滌2次，流式細胞儀分析。
結果DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體的包封率81％；多為單層脂質體，粒徑170-220nm，參見圖1-1-圖1-3；偶聯率41.7％；活性保留率75.1％，參見圖3-1-圖3-3。
采用濃度為10％戊二醛既可達到較理想的偶聯率(41.7％)，又可盡量避免戊二醛對導向物質的影響以及戊二醛對后續透析實驗帶來的不便。
實施例2.細胞毒實驗采用MTT法。取無藥培養1周的HL60細胞，配成5×104/ml的細胞懸液，接種于96孔板中，在配制細胞懸液時盡量使細胞成單個細胞，在接種時不斷輕輕振搖細胞懸液，以使每孔加入的細胞數一致，每孔加入細胞懸液200μl(1×104個細胞/孔)。
實驗分為四組①DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體組依次加入濃度(按DHAQ的含量計)為0.0025μg/ml、0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml、25μg/ml的靶向脂質體溶液，20μl/孔。
②DHAQ脂質體組依次加入濃度(按DHAQ的濃度計)為0.0025μg/ml、0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml、25μg/ml的脂質體溶液，20μl/孔。
③DHAQ組依次加入濃度為0.0025μg/ml、0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml、25μg/ml的DHAQ溶液，20μl/孔。
④空白對照組加入等體積的生理鹽水。每個濃度組設3個平行孔。
將96孔板置于振蕩器上振蕩20min后置于CO2孵箱內培養24h、48h后，吸去培養液，加入無血清的培養液200μl/孔和濃度為50mg/ml的MTT溶液20μl/孔，輕輕振蕩培養板，放回CO2孵箱中孵育4h，吸盡每孔中的液體，加入DMSO150μl/孔，于振蕩器上振蕩20min，使形成的紫色結晶充分溶解，用酶標儀測定每孔的A值(波長為490nm)。實驗重復3次，取每組每一濃度的均值按下式求細胞存活率細胞存活率＝(處理組A490nm值/對照組A490nm值)×100％細胞抑制率＝1-細胞存活率根據線性方程求得IC50。
結果經DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體、DHAQ脂質體、DHAQ處理24h、48h后，HL60細胞存活率參見表1和表2。
表1不同濃度的DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體、DHAQ脂質體、DHAQ對HL60細胞的殺傷作用(24h)(x±s)
注以SAS軟件包進行兩樣本均數間的q檢驗，a＝0.05*與相應濃度的DHAQ組比較，p＜0.05；#與相應濃度的DHAQ-GM-CSF靶向脂質體組比較，p＜0.05。
表2不同濃度的DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體、DHAQ脂質體、DHAQ對HL60細胞的殺傷作用(48h)(x±s)
注以SAS軟件包進行兩樣本均數間的q檢驗，a＝0.05*與相應濃度的DHAQ組比較，p＜0.05；#與相應濃度的DHAQ-GM-CSF靶向脂質體組比較，p＜0.05。
3種藥物作用24h后，在濃度＜0.0025μg/ml時，其細胞毒作用無顯著性差異；在濃度為0.025μg/ml時，DHAQ-GM-CSF靶向脂質體組的細胞毒作用顯著強于DHAQ脂質體組和DHAQ組(p＞0.05)。而后兩者的作用之間無顯著性差異(p＞0.05)，當濃度≥0.25μg/ml時，DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體組和DHAQ脂質體組的細胞毒作用均顯著強于DHAQ組(p＞0.05)，其中DHAQ-GM-CSF靶向脂質體組的細胞毒作用比DHAQ脂質體更強，且二者的差異也具有統計學意義(p＞0.05)。
3種藥物作用48h后，當濃度≥0.0025μg/ml時，DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體組和DHAQ脂質體組的細胞毒作用均顯著強于DHAQ組(p＜0.05)，其中DHAQ-GM-CSF靶向脂質體組的細胞毒作用比DHAQ脂質體更強，且二者的差異也具有統計學意義(p＜0.05＝。
參見圖5和圖6。DHAQ-GM-CSF靶向脂質體、DHAQ脂質體和DHAQ對HL60細胞作用24h的IC50分別是3.04μg/ml、9.33μg/ml、18.15μg/ml；作用48h的IC50分別是0.87μg/ml、3.02μg/ml、6.69μg/ml本實驗采用HL60細胞株，是一種急性髓性白血病細胞株，其細胞膜上大量表達GM-CSF受體，結合位點為322個/細胞。
實施例3 DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體中GM-CSF導向作用驗證實驗在本發明中，我們在進行MTT實驗的同時進行了GM-CSF的導向性的驗證實驗。該實驗說明DHAQ-GM-CSF靶向脂質體上的GM-CSF能夠發揮導向作用，其導向效應是通過配體-受體結合而起效的，如果預先加入飽和量的GM-CSF占領HL60細胞表面的受體，則后續加入的DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體的特異性殺傷作用將被阻斷，僅余留脂質體的非特異性殺傷作用。采用MTT法與實施例2同時進行。
方法同實施例2。
實驗分為5個劑量組每組首先加入7.5ng飽和量的GM-CSF(含3×1011個GM-CSF分子，是每孔細胞結合位點的104倍)，置于CO2孵箱中孵育1h，然后加入濃度依次為0.0025μg/ml、0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml、25μg/ml的DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體溶液20μl/孔，每個濃度設置3個平行孔，按照實施例3中的方法測定每孔的A490nm值，求細胞存活率，再與實施例3中DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體組的結果作對比。
結果，預先加入飽和量的GM-CSF可阻斷DHAQ-GM-CSF靶向脂質體對HL60細胞的毒性作用，24h和48h時各濃度組的阻斷實驗組的細胞存活率均顯著高于相應濃度的DHAQ-GM-CSF組(p＜0.05)。
實施例5 透射電鏡觀察1.DHAQ脂質體結構和粒徑分布將DHAQ脂質體原液稀釋80倍，滴在有膜銅網上，陰干，滴加1％醋酸雙氧鈾溶液，靜置5min，濾紙吸干，H600透射電鏡下放大6萬倍觀察其形態并攝影。
2.細胞形態取對數生長期的HL60細胞，調成密度為5×108個/l，接種于6孔板上，每孔加入細胞懸液3ml。
實驗分為2組DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體組和空白對照組。
DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體組加入濃度為2.5μg/ml的靶向脂質體溶液300μl；空白對照組加入等體積生理鹽水。
兩組于CO2孵箱中培養24h，2000rpm離心10min，棄培養液，用PBS洗滌2次，2000rpm離心20min，棄上清液，4℃預冷的3.5％戊二醛沿管壁緩慢加入，覆蓋沉淀的細胞，固定1h，用探針撥離細胞團塊，凝膠包埋，鋨酸染色，超薄切片，H600透射電鏡下觀察細胞超微結構的改變及凋亡細胞形態特征。
結果DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體作用24h后的HL60細胞，經瑞特染色，在光鏡下可見細胞胞漿濃縮，染色質變粗、核濃縮、核碎裂等細胞凋亡的形態。透射電鏡下可見大量壞死細胞和凋亡細胞，凋亡細胞膜和線粒體結構完整，染色質濃縮，沿核膜聚集成塊狀和新月狀，形成大量凋亡小體。參見圖2-1-圖2-2。
3.流式細胞術檢測早期凋亡情況采用AnnexinV/PI雙染法。
實驗分為4個組DHAQ脂質體組、DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體組、DHAQ組、空白對照組。
DHAQ脂質體組加入濃度為2.5μg/ml的DHAQ脂質體液300μl；DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體組加入濃度為2.5μg/ml的靶向脂質體溶液300μl；DHAQ組加入濃度為2.5μg/ml的DHAQ液300μl；空白對照組加入等體積生理鹽水。
細胞處理方法同實施例2中的步驟7，培養6小時后棄培養液，收集細胞，孵育緩沖液洗1次，用100μl的AnnexinV標記液重懸細胞，室溫下孵育10-15min，沉淀細胞，孵育緩沖液洗1次，加入熒光(SA-Flous)溶液，4℃下孵育20min，離心去上清，孵育緩沖液洗滌1次，加入400μl孵育緩沖液洗，流式細胞儀分析。
經DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體、DHAQ脂質體、DHAQ作用24h后的HL60細胞中出現凋亡細胞，DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體組的凋亡率(25.05％)較DHAQ脂質體組(15.33％)和DHAQ組(6.64％)明顯提高。參見圖4-1-圖4-4。
結論DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體對HL60細胞的細胞毒作用具有劑量依賴性。一定濃度的DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體可以誘導HL60細胞發生凋亡。DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體對HL60細胞明顯的細胞毒作用顯著強于DHAQ脂質體和DHAQ，將DHAQ制備成靶向脂質體具有提高被包封藥物的療效和降低毒性的作用，有助于提高患者的耐受性，使DHAQ更好地發揮抗白血病作用，DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體作為免疫導向化療藥物治療白血病具有可行性，對AML具有治療作用。
DHAQ-GM-CSF靶向藥物脂質體在制備、純化和鑒定方法方面具有可行性。本發明具有較高的包封率、偶聯率和活性保留率，是一種理想的免疫導向治療制劑，具有廣泛的臨床應用和推廣前景。
采用本發明方法用脂質體包封不同的抗急性髓性白血病的藥物表面聯接GM-CSF得到包封多種化療藥物的靶向藥物脂質體，可以達到上述同樣的效果，因而具有廣泛的參考應用價值。
權利要求
1.一種抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向藥物脂質體，由在脂質體表面聯接具有主動靶向性的細胞因子導向物和脂質體內一種或幾種抗急性髓性白血病的藥物組成。
2.根據權利要求1所述的抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向藥物脂質體，其特征在于抗急性髓性白血病的藥物包括抗腫瘤抗生素或烷化劑類抗腫瘤藥或影響核酸生物合成的抗腫瘤藥或影響蛋白質合成的抗腫瘤藥或拓撲異構酶抑制劑或生物毒素中的一種或/和幾種。
3.根據權利要求2所述的抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向藥物脂質體，其特征在于抗急性髓性白血病的藥物包括米托蒽醌、柔紅霉素、阿霉素、阿克拉霉素、刺孢酶素、吡南阿霉素、阿糖胞苷、氟達拉賓、吉西他賓、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、長春新堿、長春花堿、拓撲替康、足葉一甙、VM26、環磷酰氨、異環磷酰氨、順鉑、卡鉑、卡氮芥、馬法蘭、馬利蘭、羥基脲、紫山醇。
4.根據權利要求1所述的抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向藥物脂質體，其特征在于所述的細胞因子導向物為粒單細胞集落刺激因子。
5.制備權利要求1所述的抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向藥物脂質體的方法，包括以下步驟1).制備抗腫瘤藥物脂質體；2).測定脂質體包封率；3).制備相應的GM-CSF靶向脂質體；4).GM-CSF靶向脂質體的純化；5).GM-CSF靶向脂質體中GM-CSF活性的測定。
6.權利要求1所述的抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向藥物脂質體，用于治療急性髓性白血病的制劑。
全文摘要
本發明涉及一種抗急性髓性白血病的GM－CSF靶向藥物脂質體及制備方法，它由在脂質體表面聯接具有主動靶向性的細胞因子導向物和脂質體內抗急性髓性白血病的藥物組成。本發明的體外模型MTT實驗檢測其對急性髓性白血病細胞株HL60的細胞毒作用和對細胞凋亡的影響，實驗證明本發明藥物的特異靶向性好，療效高，毒副作用小，提高了患者對化療的耐受性，可以多次重復使用，并且成本低，安全性高，為用靶向脂質體包封藥物治療惡性腫瘤，提供了研究基礎。
文檔編號A61K45/00GK1806794SQ20051005726
公開日2006年7月26日 申請日期2005年9月12日 優先權日2005年9月12日
發明者婁世峰, 張穎, 陳林, 陳姝, 翁春嵐, 彭薇, 周慷, 鄧建川, 羅云 申請人:重慶醫科大學附屬第二醫院