專利名稱：一種白血病干細胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPα的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種可溶性蛋白，它是由人⑶47受體SIRP α的胞外段，與其氨基末端融合的TrxHis表達標簽組成的一種白血病干細胞革巴向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，屬于醫藥生物技術領域。
背景技術：
信號調節蛋白ct (Signal-regulatory protein α , SIRP α ),又稱為 SHPS-1,SIRPA，p84及BIT，屬于免疫球蛋白超家族成員。它主要表達在巨噬細胞、神經元、樹突細胞及中性粒細胞。這種跨膜蛋白包含胞外區的三個免疫球蛋白樣結構域及胞漿區的酪氨酸磷酸化位點，其胞漿區在大鼠，小鼠和人之間高度保守，含有酪氨酸殘基并形成抑制性受體基于酪氨酸的抑制性基序ITIM，從而激活包含SH2結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-I及SHP-2。SHP-I主要表達在造血細胞及上皮細胞，可負性調節這些細胞的許多功能，SHP-2表達廣泛，可通過調節小GTP結合蛋白Ras及Rho而發揮促進細胞生長、遷移及分化等正向調節功能。因此，SIRPa就作為一個船塢蛋白對細胞膜外的刺激產生反應，并通過募集SHP-I或SHP-2而發揮它特殊的生物學功能。此外，SIRPa也可以連接Src激酶相關蛋白SCAP2 (也稱為SKAP55hom/R)以及Fyn連接蛋白FYB (也稱為SLAP-130)而引起明顯的抑制性信號。近年研究發現，SIRPa作為CD47的胞外受體，在巨噬細胞對腫瘤細胞的清除過程中發揮著重要作用。CD47,又稱整合素相關蛋白(integrin-associated protein , IAP),也屬于免疫球蛋白(Ig)超家族的成員。最初從人胎盤與整合素α V β3共純化而為人們所認識。它是一種廣泛表達的抗原，存在于所有組織的不同細胞上。這種跨膜蛋白包含V型I g樣胞外結構域，高度疏水的五次跨膜區以及胞漿區。CD47最初是作為整合素依賴的白細胞，對細胞外基質蛋白反應進行調節而發揮作用。最經典的確定CD47在調節吞噬作用的證據來源于將⑶47敲除紅細胞(RBCs)移植入正常小鼠體內后很快被巨噬細胞從血液中清除，表明RBC表面的CD47與巨噬細胞表面的SIRPa結合可能在緩沖巨噬細胞對自身細胞清除中具有重要作用。巨噬細胞的吞噬作用是腫瘤免疫監視的重要調節因素。最近的研究表明，在急性髓細胞白血病(AML)、急性淋巴細胞白血病(ALL)及非何杰金氏淋巴瘤(NHL)等惡性血液系統腫瘤病中，大量的白血病細胞及白血病干細胞(LSC) CD47表達顯著上調，并可通過與SIRPa間的相互作用，阻止白血病細胞被宿主的先天免疫系統清除。這也是白血病耐藥、復發的重要原因之一。而通過靶向性的⑶47單克隆抗體阻斷⑶47-SIRPa間的作用，可以促進巨噬細胞對白血病細胞及LSC的吞噬作用，且不會減少正常的造血干細胞，對于白血病的治療有著重要的臨床意義。本發明基于⑶47-SIRPa在調節吞噬中的重要作用，表達了可溶性的SIRP α胞 外段蛋白，與巨噬細胞上的SIRPa競爭結合白血病細胞上⑶47，從而促進巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用。
發明內容
本發明的目的，是提供一種白血病干細胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，該蛋白可以結合于白血病細胞及白血病干細胞表面，有效地增強巨噬細胞對白血病干細胞的吞曬作用。本發明的技術方案是一種白血病干細胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，其特征是它由人SIRPa蛋白胞外段和融合TrxHis的表達標簽組成；其中hSIRP α蛋白胞外段是hSIRPa第26 370位氨基酸。所述的hSIRP α第26 370位氨基酸包含與⑶47結合的IgV樣結構域；所述的融合的TrxHis表達標簽是該可溶性蛋白的氨基末端。其中，氨基酸序列是Nol，并由No2的核酸序列編碼。 Nol TrxHis-hSIRP α 的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapiIdeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlIIfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadigvageeelqviqpdksvlvaagetatIrctatslipvgpiqwfrgagpgreIiynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfkngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstakvvltredvhsqvicevahvtlqgdpIrgtanlsetirvpptlevtqqpvraenqvnvtcqvrkfypqrlqltwlengnvsrtetastvtenkdgtynwmswlIvnVsahrddvkltcqvehdgqpavskshdlkvsahpkeqgsntaaentgsner0No2 TrxHis-hSIRPa 的核酸序列 atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatc
ctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatcggagtggcgggtgaggaggagctgcaggtgattcagcctgacaagtccgtgttggttgcagctggagagacagccactctgcgctgcactgcgacctctctgatccctgtggggcccatccagtggttcagaggagctggaccaggccgggaattaatctacaatcaaaaagaaggccacttcccccgggtaacaactgtttcagacctcacaaagagaaacaacatggacttttccatccgcatcggtaacatcaccccagcagatgccggcacctactactgtgtgaagttccggaaagggagccccgatgacgtggagtttaagtctggagcaggcactgagetgtctgtgcgcgccaaaccctctgcccccgtggtatcgggccctgcggcgagggccacacctcagcacacagtgagcttcacctgcgagtcccacggcttctcacccagagacatcaccctgaaatggttcaaaaatgggaatgagctctcagacttccagaccaacgtggaccccgtaggagagagcgtgtcctacagcatccacagcacagccaaggtggtgctgacccgcgaggacgttcactctcaagtcatctgcgaggtggcccacgtcaccttgcagggggaccctcttcgtgggactgccaacttgtctgagaccatccgagttccacccaccttggaggttactcaacagcccgtgagggcagagaaccaggtgaatgtcacctgccaggtgaggaagttctacccccagagactacagctgacctggttggagaatggaaacgtgtcccggacagaaacggcctcaaccgttacagagaacaaggatggtacctacaactggatgagctggctcctggtgaatgtatctgcccacagggatgatgtgaagctcacctgccaggtggagcatgacgggcagccagcggtcagcaaaagccatgacctgaaggtctcagcccacccgaaggagcagggctcaaataccgccgctgagaacactggatctaatgaacggo所述的白血病干細胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa具有No3的氨基酸序列，并由No4的核酸序列編碼No3 hSIRPa胞外段的氨基酸序列
gvageeelqviqpdks vlvaagetatIrctatslipvgpiqwfrgagpgreIiynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfkngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstakvvltredvhsqvicevahvtlqgdplrgtanlsetirvpptlevtqqpvraenqvnvtcqvrkfypqrlqltwlengnvsrtetastvtenkdgtynwmswllvnvsahrddvkltcqvehdgqpavskshdlkvsahpkeqgsntaaentgsner0No4 :hSIRPa胞外段的核酸序列
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No5 =TrxHis的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapiIdeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlIlfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadi0No6 TrxHis 的核酸序列 atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatc
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圖UhSIRPa胞外段蛋白的結構、構建和作用模式 圖2、目的基因(hSIRP a )的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳； 圖3、表達載體pET32a_hSIRPa的酶切鑒定 圖4、TrxHis-hSIRP α融合蛋白表達的SDS-PAGE蛋白電泳 圖5、TrxHis-hSIRP α融合蛋白純化后的電泳圖！Western blot定性檢測 圖6、人U937細胞的誘導分化；
圖7、TrxHis-hSIRP α融合蛋白與腫瘤細胞的親和力檢測；
圖8、TrxHis-hSIRP α融合蛋白促進巨噬細胞的吞噬作用。圖9、TrxHis-hSIRP α融合蛋白促進巨噬細胞的吞噬作用。
具體實施例方式以下通過附圖結合實施例對本發明做詳盡的說明。I、構建表達載體。根據hSIRPa的序列設計引物Pl: 5’_GATATCATGGGAGTGGCGGGTGAGGAG-3’ ；P2: 5’ -GCTCGAGCCGTTCATTAGAT CCAGTGT-3’。以人淋巴結 cDNA 為模板，聚合酶鏈反應擴增編碼hSIRP α胞外段氨基酸的多核苷酸序列(圖2)，I. 5%瓊脂糖電泳回收后與PMD18-T載體16°C連接2小時，熱休克轉化大腸桿菌XL10，擴增后將目的片段亞克隆至表達載體pET32a(+)，構建pET32a_hSIRPa (圖3)，限制性酶切(圖4)、測序鑒定。圖UhSIRPa胞外段蛋白的結構、構建和作用模式圖。圖2、目的基因(hSIRP a )的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳，I道(M)是分子量標志(DL2000)，箭頭所指為擴增片段。圖3、為表達載體pET32a_hSIRPa的酶切鑒定圖；(質粒分別用限制性內切酶EcoRV+XhoI及Sac I +Bgl II雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。M道是marker DL2000)。2、誘導表達融合蛋白。將表達載體pET32a(+)、pET32a_hSIRPa分別以熱休克法轉化大腸桿菌BL21，涂布含100μ g/ml氨芐青霉素LB平板，37°C培養12小時后隨機挑取單克隆接種到含100μ g/ml氨芐青霉素LB液體培養基，220rpm，37°C培養12h，以I %轉接到新鮮LB(+)培養基中，220rpm，37°C培養至3h后，加入終濃度I. OmM的IPTG，200rpm，37°C培養5h。6500rpm離心IOmin收集細菌，200 μ I/ml培養基PBS重懸細菌，超聲裂菌，加入1% Triton-XlOO，混勻，4°C靜置30分鐘，4°C離心收集上清和沉淀，SDS-PAGE檢測發現，TrxHis-hSIRPa蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中(圖4)。圖4、為TrxHis-hSIRP α融合蛋白表達的蛋白電泳圖。將質粒pET32a (+)、pET32a-hSIRP α分別轉化大腸桿菌BL21，加入IPTG誘導融合蛋白的表達。取全細菌裂解物、裂解上清(可溶性組分)和裂解沉淀(即包涵體)分別進行SDS-PAGE分析。1-3為Trx的細菌裂解物、上清和沉淀，4-6為TrxHis-hSIRP α的細菌裂解物、上清和沉淀，M是蛋白分子3、重組蛋白的純化。pET32a(+)空載體蛋白TrxHis從細菌裂解上清中純化，TrxHis-hSIRP α以鎳離子螯合柱(Invitrogen ProBondTM)純化包涵體蛋白，所有純化步驟以ProBondTM純化手冊操作。純化后的蛋白進行SDS-PAGE，然后用抗His標簽抗體進行Western blot,可見在TrxHis-hSIRP α可檢測到大小正確的蛋白條帶(圖5)。圖5、為TrxHis-hSIRP α融合蛋白的純化及Western blot檢測。M道是蛋白分子量標志。下圖是空載體蛋白及融合蛋白Western blot檢測結果,一抗是抗His標簽抗體。4、巨噬細胞的誘導分化。將人單核細胞系U937細胞以2X IO5/孔的密度接種于24孔板中，同時加入乙酸肉豆蘧佛波酯(PMA) 160nM誘導3_5天，細胞由圓形懸浮狀態變為貼壁弓形蟲樣改變(圖6)。圖6、相差顯微鏡下人單核細胞系U937細胞誘導分化為人巨噬細胞。5、融合蛋白與腫瘤細胞的親和力檢測。將人T淋巴細胞白血病細胞系Jurkat細胞與純化的TrxHis-hSIRP α蛋白(10 μ g/ml)在37°C條件下共孵育2小時，PBS、Trx蛋白以及hCD47蛋白(專利公開號CN102070719A)作為對照。流式檢測poly-Histidine陽性細胞所占的比例。一抗為 poly-Histidine, 二抗為 anti-mouse IgG-FITC (圖 7)。圖7、為流式細胞術檢測TrxHis-hSIRPa蛋白與腫瘤細胞親和力。6、蛋白功能測定將人U937細胞以2X IO5/孔的密度接種于24孔板中，給予PMA160nM誘導3_5天。之后將DiI標記的Jurkat細胞以2 X IO4/孔的密度添加到預先接種有巨噬細胞的24孔板中，同時添加hSIRP α胞外段蛋白(10 μ g/ml), PBS、Trx蛋白以及h⑶47蛋白作為對照。處理組和對照組分別設三個復孔。蛋白作用2小時后熒光顯微鏡下計數吞噬有Jurkat細胞的巨噬細胞數，分別計數十個視野，并對結果進行統計學分析。(圖8、圖 9)
圖8、為熒光顯微鏡下觀察對照組與處理組巨噬細胞對Jurkat細胞的吞噬情況，箭頭所指為吞噬了 Jurkat細胞的巨噬細胞。圖9、為熒光顯微鏡下計數吞入Jurkat細胞的巨噬細胞數，分別計數十個視野，之后對數據進行統計學分析的結果，Student’ s t檢驗，*P〈0. 05，** P〈0. 01，有統計學意義。由以上可制備本發明這種白血病干細胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，它是由人SIRPa蛋白胞外段和融合的TrxHis表達標簽組成；其中hSIRPa蛋白胞外段是hSIRPa第26 370位氨基酸。所述的hSIRP α第26 370位氨基酸包含與⑶47結合的IgV樣結構域；所述的融合的TrxHis表達標簽是該可溶性蛋白的氨基末端。其中，氨基酸序列是Nol，并由No2的核酸序列編碼。Nol TrxHis-hSIRP α 的氨基酸序列
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No3 hSIRPa胞外段的氨基酸序列
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No5 =TrxHis的氨基酸序列
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Nol :TrxHis_hSIRP α的氨基酸序列
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gvageeelqviqpdksvlvaagetatIrctatslipvgpiqwfrgagpgreIiynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfkngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstakvvltredvhsqvicevahvtlqgdplrgtanlsetirvpptlevtqqpvraenqvnvtcqvrkfypqrlqltwlengnvsrtetastvtenkdgtynwmswllvnvsahrddvkltcqvehdgqpavskshdlkvsahpkeqgsntaaentgsner0No4 :hSIRPa胞外段的核酸序列
ggagtggcgggtgaggaggagctgcaggtgattcagcctgacaagtccgtgttggttgcagctggagagacagccactctgcgctgcactgcgacctctctgatccctgtggggcccatccagtggttcagaggagctggaccaggccgggaattaatctacaatcaaaaagaaggccacttcccccgggtaacaactgtttcagacctcacaaagagaaacaacatggacttttccatccgcatcggtaacatcaccccagcagatgccggcacctactactgtgtgaagttccggaaagggagccccgatgacgtggagtttaagtctggagcaggcactgagctgtctgtgcgcgccaaaccctctgcccccgtggtatcgggccctgcggcgagggccacacctcagcacacagtgagcttcacctgcgagtcccacggcttctcacccagagacatcaccctgaaatggttcaaaaatgggaatgagctctcagacttccagaccaacgtggaccccgtaggagagagcgtgtcctacagcatccacagcacagccaaggtggtgctgacccgcgaggacgttcactctcaagtcatctgcgaggtggcccacgtcaccttgcagggggaccctcttcgtgggactgccaacttgtctgagaccatccgagttccacccaccttggaggttactcaacagcccgtgagggcagagaaccaggtgaatgtcacctgccaggtgaggaagttctacccccagagactacagctgacctggttggagaatggaaacgtgtcccggacagaaacggcctcaaccgttacagagaacaaggatggtacctacaactggatgagctggctcctggtgaatgtatctgcccacagggatgatgtgaagctcacctgccaggtggagcatgacgggcagccagcggtcag caaaagccatgacctgaaggtctcagcccacccgaaggagcagggctcaaataccgccgctgagaacactggatctaatgaacggNo5 TrxHis的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlIlfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadi0No6 TrxHis 的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatc。
權利要求
1.一種白血病干細胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，其特征是它由人SIRPa蛋白胞外段和融合TrxHis的表達標簽組成；其中hSIRP a蛋白胞外段是hSIRP a第26 370位氨基酸。
2.根據權利要求I所述的白血病干細胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，其特征是所述的hSIRP a第26 370位氨基酸包含與CD47結合的IgV樣結構域；所述的融合的TrxHis表達標簽是該可溶性蛋白的氨基末端；其中，氨基酸序列是Nol，并由No2的核酸序列編碼； Nol :TrxHis_hSIRP a的氨基酸序列Msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkyg irgiptlIIfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadigvageeelqviqpdksvlvaagetatIrctatslipvgpiqwfrgagpgreIiynqkeghfpr vttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfkngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstakvvltredvhsqvicevahvtlqgdpIrgtanlsetirvpptlevtqqpvraenqvnvtcqvrkfypqrlqltwlengnvsrtetastvtenkdgtynwmswlIvnvsahrddvkltcqvehdgqpavskshdlkvsahpkeqgsntaaentgsner ； No2 :TrxHis_hSIRP α 的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatcggagtggcgggtgaggaggagctgcaggtgattcagcctgacaagtccgtgttggttgcagctggagagacagccactctgcgctgcactgcgacctctctgatccctgtggggcccatccagtggttcagaggagctggaccaggccgggaattaatctacaatcaaaaagaaggccacttcccccgggtaacaactgtttcagacctcacaaagagaaacaacatggacttttccatccgcatcggtaacatcaccccagcagatgccggcacctactactgtgtgaagttccggaaagggagccccgatgacgtggagtttaagtctggagcaggcactgagetgtctgtgcgcgccaaaccctctgcccccgtggtatcgggccctgcggcgagggccacacctcagcacacagtgagcttcacctgcgagtcccacggcttctcacccagagacatcaccctgaaatggttcaaaaatgggaatgagctctcagacttccagaccaacgtggaccccgtaggagagagcgtgtcctacagcatccacagcacagccaaggtggtgctgacccgcgaggacgttcactctcaagtcatctgcgaggtggcccacgtcaccttgcagggggaccctcttcgtgggactgccaacttgtctgagaccatccgagttccacccaccttggaggttactcaacagcccgtgagggcagagaaccaggtgaatgtcacctgccaggtgaggaagttctacccccagagactacagctgacctggttggagaatggaaacgtgtcccggacagaaacggcctcaaccgttacagagaacaaggatggtacctacaactggatgagctggctcctggtgaatgtatctgcccacagggatgatgtgaagctcacctgccaggtggagcatgacgggcagccagcggtcagcaaaagccatgacctgaaggtctcagcccacccgaaggagcagggctcaaataccgccgctgagaacactggatctaatgaacggo
3.根據權利要求I所述的白血病干細胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，其特征是所述的白血病干細胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa具有No3的氨基酸序列，并由No4的核酸序列編碼No3 hSIRPa胞外段的氨基酸序列Gvageeelqviqpdksvlvaagetatlrctatslipvgpiqwfrgagpgreliynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfkngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstakvvltredvhsqvicevahvtlqgdplrgtanlsetirvpptlevtqqpvraenqvnvtcqvrkfypqrlqltwlengnvsrtetastvtenkdgtynwmswllvnvsahrddvkltcqvehdgqpavskshdlkvsahpkeqgsntaaentgsner ； No4 hSIRPa胞外段的核酸序列ggagtggcgggtgaggaggagctgcaggtgattcagcctgacaagtccgtgttggttgcagctggagagacagccactctgcgctgcactgcgacctctctgatccctgtggggcccatccagtggttcagaggagctggaccaggccgggaattaatctacaatcaaaaagaaggccacttcccccgggtaacaactgtttcagacctcacaaagagaaacaacatggacttttccatccgcatcggtaacatcaccccagcagatgccggcacctactactgtgtgaagttccggaaagggagccccgatgacgtggagtttaagtctggagcaggcactgagctgtctgtgcgcgccaaaccctctgcccccgtggtatcgggccctgcggcgagggccacacctcagcacacagtgagcttcacctgcgagtcccacggcttctcacccagagacatcaccctgaaatggttcaaaaatgggaatgagctctcagacttccagaccaacgtggaccccgtaggagagagcgtgtcctacagcatccacagcacagccaaggtggtgctgacccgcgaggacgttcactctcaagtcatctgcgaggtggcccacgtcaccttgcagggggaccctcttcgtgggactgccaacttgtctgagaccatccgagttccacccaccttggaggttactcaacagcccgtgagggcagagaaccaggtgaatgtcacctgccaggtgaggaagttctacccccagagactacagctgacctggttggagaatggaaacgtgtcccggacagaaacggcctcaaccgttacagagaacaaggatggtacctacaactggatgagctggctcctggtgaatgtatctgcccacagggatgatgtgaagctcacctgccaggtggagcatgacgggcagccagcggtcagcaaaagccatgacctgaaggtctcagcccacccgaaggagcagggctcaaataccgccgctgagaacactggatctaatgaacggo
4.根據權利要求2所述的白血病干細胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，其特征是所述氨基末端融合TrxHis表達標簽，包含No5的氨基酸序列，并由No6的核酸序列編碼 No5 =TrxHis的氨基酸序列MsdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlIIfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamad ； No6 TrxHis的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatc0
5.根據權利要求I所述的白血病干細胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，其特征是所述白血病干細胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa在大腸桿菌BL21中實現可溶性表達，并用針對His標簽的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解后獲得純的TrxHis-hSIRP a蛋白。
全文摘要
本發明涉及一種可溶性蛋白，它是由人CD47受體SIRPα的胞外段，與其氨基末端融合的TrxHis表達標簽組成的一種白血病干細胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPα，其特征是它由人SIRPα蛋白胞外段和融合TrxHis的表達標簽組成；其中hSIRPα蛋白胞外段是hSIRPα第26~370位氨基酸。所述的hSIRPα第26~370位氨基酸包含與CD47結合的IgV樣結構域；所述的融合的TrxHis表達標簽是該可溶性蛋白的氨基末端。TrxHis-hSIRPα在體外可以通過基因工程進行大量生產，應用于體內時可與白血病細胞及LSC上高表達的CD47結合，阻止巨噬細胞上抑制性受體SIRPα與CD47結合，從而促進巨噬細胞對白血病細胞及LSC的吞噬作用，對于白血病的靶向治療以及清除微小殘留病變有著重要意義。
文檔編號C07K19/00GK102643347SQ20121008722
公開日2012年8月22日 申請日期2012年3月29日 優先權日2012年3月29日
發明者林燕, 梁英民, 江遜, 韓驊 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學