專利名稱：一種腦必舒凍干粉針劑及其制備方法
技術領域：
本發明屬生化制藥技術領域，具體涉及一種腦必舒凍干粉針劑及其制備方法。
背景技術：
腦必舒注射液又稱腦蛋白水解物注射液，起主要成分為腦蛋白水解物，為主要從豬腦中提取得到的無蛋白質、脂肪及其它抗原性物質的特異性氨基酸混合物，是一種良好的腦功能改善劑，內含游離氨基酸及低分子肽，包括各種必需氨基酸及非必需氨基酸，此外還有谷酰胺、門冬酰胺、鳥氨酸、γ-氨基丁酸和γ-氨酸β-羥丁酸等。腦活素約50％-80％的游離氨基酸可通過血-腦脊液屏障進入腦神經細胞，分子量在1萬以下的小分子肽也可透過血-腦脊液屏障并影響呼吸鏈。腦活素具有抗缺氧作用，可改善腦細胞缺氧癥狀，增強腦對缺氧的耐受性。還能促進神經細胞的蛋白質合成，使已損傷但未變性的神經細胞恢復功能。同時可加速葡萄糖通過血-腦脊液屏障的運轉速度，改善腦能量供應，增加腺苷酸環化酶的活性，催化其它激素系統，改善記憶功能。臨床用于腦血管病及腦動脈硬化、腦外傷后遺癥、腦軟化或中風后遺癥、大腦發育不全、癡呆癥或老年性癡呆、以記憶力減退為主要表現的神經衰弱、輕度嬰幼兒大腦發育不全等。
專利(ZL93103863.4)公開了一種從豬腦中提取腦蛋白水解液的方法，它是將豬腦加水均漿，用Ca(OH)2調pH，再加人豬或牛胰酶、甲苯、蒸餾水在37-50℃下攪拌，用磷酸調pH，再經一系列的煮沸調pH值，活性炭脫色，最后用透析袋對水透析，過濾分裝滅菌而成。該方法使用了毒性很大的有機溶劑甲苯，而透析的方法雖適宜實驗室操作，對于工業生產則有一定困難；專利(ZL94104516.1)公開了一種腦蛋白水解物，該方法將新鮮豬腦去除表面的粘膜及血漬等，勻漿，加5倍體積的丙酮沉淀，沉淀分離后再加等量乙醚洗滌浸泡1小時，再過濾、真空干燥制成腦粉；腦粉用水溶解后，依次用胃蛋白酶、胰酶雙酶水解，水解液離心取上清液，加熱沸騰并迅速冷卻，然后經板框過濾、超濾及減壓濃縮得水解液；水解液分批上Sephadex G-25凝膠層析柱層析，將活性峰收集液經減壓濃縮、微孔過濾制成精品液，制備無菌制劑。該方法使用了有機溶劑丙酮，丙酮沸點低，有一定毒性，而用層析柱的方法分離有效成分周期長、效率低。專利(ZL01130523.1)公開了一種腦蛋白水解物注射液生產方法，該方法雖然避免了有機溶劑的使用，但整個制備工藝步驟多、周期長，多次采用酸堿工藝，不利于活性成分的保存和穩定，而且超濾時使用了截留分子量為1000的超濾膜，使許多有效活性成分被截留。
專利檢索中未發現腦必舒凍干粉針劑的相關資料。
發明內容
基于上述原因，我們將新鮮豬腦反復凍融后采用超聲法破碎，該方法與傳統的勻漿法相比，顯著提高了破碎效率高，腦活性多肽提取率可達70％，超聲提取液離心后水解，水解液熱壓處理后，再用超濾膜依次純化，使用該制備工藝制得的腦蛋白水解物符合國家藥品標準的相關規定，且減少了工藝步驟，縮短了制備時間，更有利于有效活性成分的保存和穩定，本發明制劑的生物活性以100m mol氯化乙酰膽堿所致ΔMV計算大于9ΔMV/5min，藥理實驗表明本發明腦必舒凍干粉針劑具有更好的藥理作用。
本發明的目的是公開一種工藝簡單、穩定性好、活性高、療效好、方便使用的腦必舒凍干粉針制劑。
本發明的另一個目的是提供上述凍干粉針制劑的制備方法。
本發明通過以下技術方案實現。
一、制備工藝(1)取新鮮豬腦，去除腦膜和血管，粉碎，-15℃至-30℃冷凍，室溫下融化，重復4-6次，放入超聲提取器中，加水，控制提取器溫度0℃-5℃，低溫超聲裂解破碎15-30分鐘，冷凍離心機離心，吸取上清液備用；(2)向上清液中加入0.5％胰蛋白酶液，于37℃保溫6-8小時后離心，棄去沉淀物，得水解液；(3)水解液經90-110℃熱壓處理10分鐘，過濾；濾液通過截留分子量為50000的超濾膜進行粗濾；再通過截留分子量為10000的超濾膜進一步過濾純化，低溫干燥，得到半成品；(4)取半成品和生化輔料氨基酸混合，用注射用水溶解調整濃度后，分裝到西林瓶中，進行冷凍干燥，得到本發明腦必舒凍干粉針劑。
本發明研究人員對凍干粉針劑常用的輔料進行了實驗研究，通過大量實驗篩選，發現在本發明腦必舒制劑中加入酪氨酸，不僅能起到良好的成型作用，使制得的凍干粉針劑外觀、性狀符合規定，而且能起到對多肽活性的保護作用，有助于發揮制劑的藥效，因此，確定本發明腦必舒凍干粉針劑所用的生化輔料氨基酸為酪氨酸。
二、制劑含量分析儀器與試藥日立835-50型氨基酸測定儀。本發明腦必舒凍干粉針劑(按本發明制備方法制備，由廣東天之驕藥物開發有限公司實驗室提供)；1、制劑中氨基酸的含量測定取本品，用氨基酸測定儀進行測定，另取相應的氨基酸對照品制成相應濃度的對照品溶液，同法測定。結果見表1(本發明凍干粉1支相當于腦必舒注射液2m1)。
表1 制劑中氨基酸含量測定結果
2、制劑中總氮的含量測定取本品，依法測定(《中國藥典》2000版二部附錄VII D)，結果見表2。
表2制劑中總氮含量測定結果
以上含量測定結果表明，根據本發明方法制備的腦必舒凍干粉針劑的氨基酸和總氮含量都符合國家藥品標準腦蛋白水解物注射液(WS1-(X-018)-2001Z)項下含量測定項下的相關要求，而后述藥理實驗結果表明本發明腦必舒凍干粉針劑具有更好的藥理作用，說明本發明制備方法更加合理科學。
三、生物活性比較試藥樣品1(市售腦必舒注射液，廣州白云山制藥股份有限公司)；樣品2(腦蛋白水解物注射液，按專利ZL01130523.1方法制備，廣東天之驕藥物開發有限公司實驗室提供)；樣品3(本發明腦必舒凍干粉針劑，按本發明制備工藝制備，廣東天之驕藥物開發有限公司實驗室提供)；測定制劑的乙酰膽堿活性首先制備乙酰膽堿傳感器，取小鼠腦組織，在PBS[聚(丁二烯-苯乙烯)]中清洗多次，去除結締組織，濾紙上吸干，手磨勻漿，取勻漿液0.1川涂于pH電極泡，浸入火棉膠溶液中，取出冷干，將勻漿包被于電極泡上，然后浸入PBS中備用。取PBS40ml，插入傳感器及甘汞電極，5-10min后讀取平衡電位MV0，加入100m mol氯化乙酰膽堿1.5ml，再加樣品液液1.5ml，記錄每分鐘降低的電位值MV，計算ΔMV＝MV0-MV，各組分別放置，每樣品測定三批，共測定24個月內樣品的生物活性變化情況，取平均值，計算結果見表3。
表3制劑生物活性測定結果(ΔMV/5min)
以上實驗結果表明各樣品組的活性以100m mol氯化乙酰膽堿所致ΔMV計算，樣品3組，即本發明腦必舒凍干粉的生物活性明顯更好，而且隨時間放置活性比較穩定，而樣品1和2的生物活性相對較小，且隨時間放置活性下降明顯，因此說明本發明的凍干粉針劑的制備方法更科學，活性和穩定性更好。
四、藥理實施例試藥與動物樣品1(市售腦必舒注射液，廣州白云山制藥股份有限公司)；樣品2(腦蛋白水解物注射液，按專利ZL01130523.1方法制備，廣東天之驕藥物開發有限公司實驗室提供)；樣品3(本發明腦必舒凍干粉針劑，按本發明制備工藝制備，廣東天之驕藥物開發有限公司實驗室提供)；實驗動物健康小鼠，體重18-22g，雌雄各半。
1.對小鼠記憶損害改善的作用缺氧(通入CO2)引起小鼠學習、記憶障礙模型的方法參照新藥臨床指導原則匯編(43頁)。實驗裝置分明、暗兩室。兩室之間有一圓洞。將小鼠面部背向洞口放入明室，同時啟動計時器。動物穿過洞口進入暗室受到電擊。取出小鼠，記錄每鼠從放入明室至進入暗室遇到電擊所需的時間，此即潛伏期。24小時后重作測驗，記錄進入暗室的動物數，潛伏期和5分鐘內的受到電擊的次數叫錯誤次數。
正常對照組(NS組，無缺氧處理，生理鹽水0.1ml/10g，靜注)、缺氧鹽水組(CO2+NS組，NS0.2ml/10g，靜注)、陽性藥物對照組(CO2+樣品1組，CO2+樣品2組，腦蛋白水解物注射液0.2ml/10g，靜注)和本發明凍干粉組(CO2+本發明腦蛋白水解物凍干粉組，溶解成與注射液含藥量相同，0.2ml/10g，靜注)。所有用藥組小鼠均經每天1次缺氧處理，然后給各組小鼠按劑量靜注生理鹽水或藥液。連續缺氧及注射藥物7天。第8天用避暗法訓練回避性條件反射，訓練時間為5分鐘。24小時后重測，記錄小鼠從放入儀器至第一次電擊的時間(潛伏期)及5分鐘內錯誤次數。結果見表4表4對缺氧所致小鼠記憶獲得障礙的改善作用(X±SD)
注與生理鹽水組比較**p＜0.01，與缺氧鹽水組比較△p＜0.05，△△p＜0.01結果缺氧鹽水組小鼠的潛伏期比正常組小鼠潛伏期輕度縮短，而錯誤次數則明顯比正常組小鼠多。提示缺氧鹽水組小鼠的記憶獲得出現障礙。與缺氧鹽水組小鼠比較，樣品組均小鼠能延長潛伏期，顯著減少錯誤次數。提示樣品各組均可改善小鼠記憶獲得障礙，其中本發明腦必舒凍干粉針劑組作用更加顯著。
2.對雞胚背根神經節突起生長的促進作用取8.5-9d齡雞胚，在解剖鏡下摘取背根節，剝去背膜和神經殘根。用吸管將背根節種植于涂布鼠尾膠原生長基質的蓋玻片上，送入培養瓶中。每張蓋玻片上滴加50μl培養液。加入培養液后，將培養瓶翻轉，使神經節懸掛于培養瓶的頂部。同時調整水平，保證培養液淹及神經節。
實驗分3組，分別為樣品1組、樣品2組、樣品3組和陰性對照組。其中樣品組的背根節培養液中加入含相同藥物濃度(濃度40％)的各樣品溶液，陰性對照組的背根節培養液中未加入其它促生長物質。37℃培養72h，分別測量48h、72h在背根節周源8個方向上的突起長度并計算其平均值。結果見表5。
表5促雞胚背根神經節突起生長的實驗結果(X±SD)
注與陰性對照組比較*p＜0.05，**p＜0.01結論由上述實驗結果表明本發明腦必舒凍干粉針劑比樣品1和樣品2組比較具有更顯著的促雞胚背根神經節突起生長作用。
五、制備實施例實施例1(1)取新鮮豬腦，去除腦膜和血管，粉碎，-15℃冷凍，室溫下融化，重復4次，放入超聲提取器中，加水，控制提取器溫度0℃-5℃，低溫超聲裂解破碎15分鐘，冷凍離心機離心，吸取上清液備用；(2)向上清液中加入0.5％胰蛋白酶液，于37℃保溫6小時后離心，棄去沉淀物，得水解液；(3)水解液經90℃熱壓處理10分鐘，過濾；濾液通過截留分子量為50000的超濾膜進行粗濾；再通過截留分子量為10000的超濾膜進一步過濾純化，低溫干燥，得到半成品；(4)取半成品和酪氨酸混合，用注射用水溶解調整濃度后，分裝到西林瓶中，進行冷凍干燥，得到本發明腦必舒凍干粉針劑。
實施例2(1)取新鮮豬腦，去除腦膜和血管，粉碎，-20℃冷凍，室溫下融化，重復5次，放入超聲提取器中，加水，控制提取器溫度0℃-5℃，低溫超聲裂解破碎20分鐘，冷凍離心機離心，吸取上清液備用；(2)向上清液中加入0.5％胰蛋白酶液，于37℃保溫7小時后離心，棄去沉淀物，得水解液；(3)水解液經100℃熱壓處理10分鐘，過濾；濾液通過截留分子量為50000的超濾膜進行粗濾；再通過截留分子量為10000的超濾膜進一步過濾純化，低溫干燥，得到半成品；(4)取半成品和酪氨酸混合，用注射用水溶解調整濃度后，分裝到西林瓶中，進行冷凍干燥，得到本發明腦必舒凍干粉針劑。
實施例3(1)取新鮮豬腦，去除腦膜和血管，粉碎，-25℃冷凍，室溫下融化，重復6次，放入超聲提取器中，加水，控制提取器溫度0℃-5℃，低溫超聲裂解破碎25分鐘，冷凍離心機離心，吸取上清液備用；(2)向上清液中加入0.5％胰蛋白酶液，于37℃保溫8小時后離心，棄去沉淀物，得水解液；(3)水解液經110℃熱壓處理10分鐘，過濾；濾液通過截留分子量為50000的超濾膜進行粗濾；再通過截留分子量為10000的超濾膜進一步過濾純化，低溫干燥，得到半成品；(4)取半成品和酪氨酸混合，用注射用水溶解調整濃度后，分裝到西林瓶中，進行冷凍干燥，得到本發明腦必舒凍干粉針劑。
實施例4(1)取新鮮豬腦，去除腦膜和血管，粉碎，-30℃冷凍，室溫下融化，重復5次，放入超聲提取器中，加水，控制提取器溫度0℃-5℃，低溫超聲裂解破碎30分鐘，冷凍離心機離心，吸取上清液備用；(2)向上清液中加入0.5％胰蛋白酶液，于37℃保溫7小時后離心，棄去沉淀物，得水解液；(3)水解液經100℃熱壓處理10分鐘，過濾；濾液通過截留分子量為50000的超濾膜進行粗濾；再通過截留分子量為10000的超濾膜進一步過濾純化，低溫干燥，得到半成品；(4)取半成品和酪氨酸混合，用注射用水溶解調整濃度后，分裝到西林瓶中，進行冷凍干燥，得到本發明腦必舒凍干粉針劑。
權利要求
1.一種腦必舒凍干粉針劑，其特征在于將新鮮豬腦凍融后，低溫超聲提取、離心，上清液水解、熱壓處理、超濾，超濾液低溫干燥，與生化輔料氨基酸混合制備成凍干粉針劑，其中生化輔料氨基酸為酪氨酸；其特征還在于其生物活性以100m mol氯化乙酰膽堿所致ΔMV計算大于9ΔMV/5min。
2.根據權利要求1所述的一種腦必舒凍干粉針劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)取新鮮豬腦，去除腦膜和血管，粉碎，-15℃至-30℃冷凍，室溫下融化，重復4-6次，放入超聲提取器中，加水，控制提取器溫度0℃-5℃，低溫超聲裂解破碎15-30分鐘，冷凍離心機離心，吸取上清液備用；(2)向上清液中加入0.5％胰蛋白酶液，于37℃保溫6-8小時后離心，棄去沉淀物，得水解液；(3)水解液經90-110℃熱壓處理10分鐘，過濾；濾液通過截留分子量為50000的超濾膜進行粗濾；再通過截留分子量為10000的超濾膜進一步過濾純化，低溫干燥，得到半成品；(4)取半成品和生化輔料氨基酸混合，用注射用水溶解調整濃度后，分裝到西林瓶中，進行冷凍干燥，得到本發明腦必舒凍干粉針劑。
全文摘要
本發明公開了一種腦必舒凍干粉針劑及其制備方法。它是由冷凍新鮮豬腦經超聲提取、水解、超濾純化得到的腦蛋白水解物與生化輔料氨基酸混合制備而成的凍干粉針劑，本發明凍干粉制劑的生物活性以100m mol氯化乙酰膽堿所致ΔMV計算大于9ΔMV/5min，根據本發明工藝制得的腦必舒凍干粉具有更好的藥理作用。
文檔編號A61K35/30GK1686167SQ20051006456
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月15日 優先權日2005年4月15日
發明者張海峰 申請人:張海峰