專利名稱：包含熱休克蛋白和hpv16z蛋白抗原的無佐劑治療性蛋白疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及熱休克蛋白與HPV16Z E6/E7的融合蛋白，該融合蛋白的獲得方法，表達該融合蛋白的表達載體和轉化了該表達質粒的宿主，以及所述融合蛋白在治療和預防HPV相關疾病的藥物中的應用。
背景技術：
HPV與多種上皮來源的腫瘤和增生關系密切，高危型HPV的感染是女性宮頸癌形成的主要原因。在我國婦女宮頸癌組織中HPV感染檢出率大于99％，其中HPV16占90％以上。世界范圍內每年有40萬新發宮頸癌病例，20萬人死于該病，位居女性腫瘤死亡人數的第二位。目前宮頸癌的治療主要是手術和放療，其治療5年生存率僅50％左右，效果不理想，另外對宮頸的早期病變的治療尚缺乏理想的方法。因此研制新的藥物用于治療HPV感染尤其是HPV16型引起的相關疾病具有重要意義。流行病學資料證實，HPV感染有種屬地域分布不均勻性，且不同地區的同型HPV往往存在變異，所以疫苗的研究必須要對我國的HPV16具有較高的針對性。張偉教授在80年代末期于HPV高發省份山西省成功克隆了一株HPV16病毒—HPV16Z(中國病毒學，8(1)45-52，1993)。現經測序并與德國HPV16標準株進行比較，證實同源性為98％，E5基因部分和一段非編碼序列較大差異，E6基因發現點突變，E7基因完全一致，在此病毒基礎上研制的HPV治療性疫苗對我國的HPV16型感染性疾病將具有較高的針對性和臨床應用前景。
人乳頭瘤病毒是具有約8000bp的無包膜雙鏈環狀DNA病毒，廣泛感染生殖道粘膜和口腔、咽部粘膜上皮細胞等，目前已發現100多種型別HPV，其中35個型別與生殖道疾患有關，其基因組由早期基因編碼區、晚期基因編碼區和非編碼區組成。晚期基因區包含2個獨立的編碼病毒衣殼蛋白L1和L2的開放讀碼框。L1是主要衣殼蛋白，在不同HPV型別之間高度保守；而早期蛋白包括6個開放讀碼框，分別形成E1、E2、E4、E5、E6、E7蛋白。蛋白E6、E7為癌基因產物，是HPV感染導致細胞發生轉化的主要原因。E6是大小約17KD的多肽，能與P53結合引起P53經泛素化降解，E7是大小約11KD的多肽，能與成視網膜細胞瘤基因產物RB結合，阻礙RB與E2F的復合物的形成，P53和RB的正常功能被抑制是HPV致癌的機理。
由于HPV無法體外培養，難以獲得減毒或滅活疫苗，所以目前對于預防HPV感染的疫苗研究只能通過基因工程的方法來獲得，研究方向主要是針對病毒晚期蛋白L1或者L1與L2；而通過基因工程的途徑獲得的抗原必須具有正確的空間表位，在體內獲得抗HPV晚期蛋白的抗體，才能有效保護機體。目前已通過真核表達系統獲得了構象正確的病毒樣顆粒(VLP)，試驗證明能有效抗HPV的感染。但是這種疫苗對已感染HPV者無治療作用，所以有效治療HPV相關疾病的治療性疫苗的研發具有一定的意義。E6、E7由于其在轉化方面的特性被認為是治療HPV相關腫瘤和癌前病變理想的靶點，所以治療性疫苗多以E6、E7作為主攻方向。E7免疫原性強，易于表達，在HPV疫苗中常用作抗原部分，而E6沒有得到足夠重視，且部分疫苗采用野生型E6、E7，其具有潛在致癌性。單純的E6/E7融合蛋白免疫原性不足以激發細胞免疫反應，需要佐劑的配合，但是目前尚缺乏有效的被批準應用的佐劑。由于上述原因，目前治療性蛋白疫苗的研究正進入無危險、無佐劑的階段。
發明內容
本發明涉及應激蛋白與人乳頭瘤病毒蛋白抗原的融合蛋白。本發明使用的HPV16為本科室自我國山西宮頸癌高發區分離得到的HPV16常見亞型HPV16Z，從HPV16Z毒株中克隆出E6和E7基因片段用于構建疫苗，對我國的HPV16將具有較高的針對性。本發明的HPV蛋白抗原優選HPV16Z E6/E7融合蛋白，包括E6C端88個氨基酸和經修飾E7完整片段，E7基因編碼第24位的半胱氨酸和第26位的谷氨酸的密碼子可采用定點突變的方法進行基因突變，使其喪失導致抑癌基因失活能力，另外在優選的方案中通過將E7 58，91位密碼子同時突變，使其編碼的氨基酸由半胱氨酸突變成甘氨酸，降低E7蛋白穩定性，免疫呈遞效果更佳。本發明的應激蛋白為熱休克蛋白，優選牛結核桿菌來源的熱休克蛋白65(Hsp65)，熱休克蛋白在種屬間高度同源，健康人有識別自身應激蛋白的T細胞群，所以自身反應性T細胞的存在與正常健康相容，不會導致自身免疫病，這證實人體中應激蛋白的安全性；另外卡介苗(BCG)接種的成功和相對安全性也證實了此應激蛋白的安全。此融合蛋白在無佐劑的情況下在體內成功誘導了針對E6、E7的特異性細胞免疫反應。
本發明涉及融合蛋白的獲得方法，融合蛋白最好在大腸桿菌中表達，在一個優選的實施方案中，表達具有5-9個、最好6個組氨酸殘基的組氨酸尾的所述蛋白，這在純化中是有利的。包含了組氨酸尾(His)標志融合蛋白利用金屬親和層析柱純化(IMAC)，可以通過親和層析復性融合蛋白及達到部分純化效果。在IMAC柱產生高度純化的蛋白以后，可以利用離子交換進行第二步純化，利用簡單的二步純化，可以使目的蛋白的純度達到95％以上，達到藥用標準。
本發明同時也涉及了編碼融合蛋白的DNA序列及獲得表達該融合蛋白的表達載體和表達宿主的方法。
本發明還涉及到融合蛋白在醫學中應用。包含本文所述的應激蛋白和HPV抗原的融合物可用于增強對HPV或表達HPV抗原的HPV感染細胞或HPV轉化細胞的免疫應答反應，特別是細胞免疫反應，優選地以所述融合蛋白在治療和預防HPV感染相關疾病的藥物中的應用。
圖1SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳分析圖3經純化后的蛋白純度分析圖4融合蛋白對腫瘤生長的抑制作用圖5小鼠脾淋巴細胞的特異性殺傷作用圖6疫苗對TC-1腫瘤的治療作用圖7疫苗對荷瘤小鼠生存期的影響圖8腫瘤大小—時間曲線具體實施方式
實施例一 Hsp65-E6/E7融合蛋白表達質粒和菌株的構建1.1 E6/E7融合基因的合成使用張偉教授自山西克隆的HPV16Z病毒株全基因組序列作為模板，通過PCR的方法得到E6和E7片段，在此基礎上設計3對引物對E7的24、26、58、91位密碼子進行點突變，同時PCR擴增出E6C端88個氨基酸的密碼子，將獲得的部分E6片段和突變的E7片段進行融合。
1.2 PET28a-Hsp65的獲得從中國生物制品研究所購得卡介苗2支，用STE懸浮菌體，離心后再次懸浮于400μl 0.05MTris-HCl(PH 8.5)、0.05M EDTA、15％蔗糖中，加入0.4mg溶菌酶，37℃作用30分鐘，再加入2％蛋白酶K至終濃度0.1mg/ml，25℃作用10分鐘，再加入4mg SDS，60℃作用2小時，離心分離上清，并用酚氯仿抽提2次，加入RNAase37℃作用2小時，乙醇沉淀，最終溶解在20UL的去離子水中。設計一對引物，正向引物以包含一個Nde1限制性酶切位點，其編碼序列為5’CAGCC ATATGGCCAAGACAAT TGCG TACGAC，反向引物包括EcoR1和Nhe1限制性酶切位點，其編碼序列CTCGAATTCTTATCAGCTAGCGAAATCCATGCCACCCATGTCG。利用上述方法獲得的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，產物經常規純化并進行Nde1和EcoR1雙酶切，再與經Nde1/EcoR1雙酶切的PET28a進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5，在含有抗生素的平板上生長。挑取單克隆菌過夜培養，提取質粒測序，將序列和插入位點正確的質粒進行保種，并大量提取。
1.3 Hsp65-E6/E7表達質粒及高效表達工程菌的構建將上述獲得的E6/E7融合基因進行Nhe1和EcoR1雙酶切，并與經相同，酶切的PET28a-Hsp65進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5，挑取單克隆過夜培養，提取質粒測序，將序列和插入位點正確的質粒進行保種。并將表達質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，在含有卡那的平板上進行篩選，隨即挑選10個單克隆菌株，在含有相應抗生素的培養基中生長至對數期時加入誘導劑IPTG誘導，觀察融合蛋白的表達情況。
實施例二 融合蛋白表達產物的鑒定及表達條件的優化將上述轉化了表達質粒的大腸桿菌BL21(DE3)于含有卡那霉素的培養基中37℃生長至OD600為0.6-1.0之間時，取出部分菌液，其余加入IPTG至中濃度為1mmol/L，繼續培養37℃3小時，將誘導和未誘導的菌液各取1ml，離心收集菌體，加入上樣緩沖液100℃水浴5分鐘，離心取上清和直接進行SDS-PAGE電泳，同時也進行蛋白標準BSA的電泳，電泳完畢后，考馬斯亮藍染色2小時以上，再用脫色液進行脫色處理，可用加熱的方法加速脫色的過程，通過與BSA比較，有一分子量高于65KD的明顯高表達蛋白帶，其位置接近目的蛋白80KD，如附圖一所示經用抗Hsp65和E7抗體進行Western-Blot分析，該蛋白為目的蛋白。
在驗證了目的蛋白的表達以后，將表達菌株于5ml含Kan的LB培養基中，37℃，150轉/分震蕩4-6小時。重新取5支培養管，每管加含Kan的LB培養基10.5ml，分別加入500μl獲得的菌液，繼續培養至OD為0.4-1.0，取出1ml作為對照。分別加入20％IPTG 2μl、4μl、6μl、8μl、10μl，分別于3、4、5、6小時各取1ml菌液。分別離心收集菌體，收集菌體，進行SDS-PAGE電泳，結果IPTG濃度在1mM，誘導時間分別為2、3、4、5、6小時，隨著誘導時間的延長，蛋白表達量并未增加，而IPTG濃度分別為0.4、0.6、0.8、1、1.2mM時，IPTG在1mM時表達量達到最大值。結果說明最佳誘導條件是IPTG濃度為1mmol/L，誘導時間為2小時，如附圖2所示。
實施例三 融合蛋白的發酵表達及純化將保存好的表達菌種復蘇后，于10ml LB培養基中，37℃，150轉/分震蕩培養過夜，取5ml接種于500mlLB培養基中，培養24小時。在9.5L TB培養基中進行發酵培養，將PH值調至6.8，300轉/分，培養4小時，在此期間保證溶氧在50％以上。加入終濃度1mmol/L的IPTG，誘導3小時，收獲菌液，離心收集菌體，按菌體濕重每克三毫升的比例懸浮于裂解緩沖液A中(10mM Tris-Hcl，0.5mM β-巰基乙醇，pH8.0，200ug/ml溶菌酶)，保存于-70℃備用。使用時，將冷凍的細菌懸液在室溫中解凍，并加2ug/ml蛋白酶抑制劑PMSF，超聲破碎細菌，15000rpm離心10分鐘，收集沉淀，將沉淀用包涵體洗滌液B(20mM Tris-Hcl pH 8.0，2M尿素)洗滌2次，離心收集沉淀，沉淀最終熔解在溶液C中(20mM Tris-Hcl pH 8.0，8M尿素)，室溫放置一小時，充分溶解后。離心收集上清，4℃保存。
將上清上樣于溶液C平衡的CU2+整合柱，上樣后，溶液C洗滌2個柱體積，直至達到基線水平，然后進行蛋白的復性工作，具體為通過含溶液D(1M NaCl、20mMTris pH 8.0)與溶液C形成尿素逐漸降低的連續梯度，以逐漸降低流經層析柱中的尿素濃度，當溶液C被完全取代后，繼續3倍柱體積溶液D洗脫，完全去除殘余的尿素，以達到復性的目的。復性程序完成后，利用20-300mM的咪唑進行梯度洗脫目的蛋白。目的蛋白經SDS-PAGE電泳鑒定后脫鹽處理，利用20mM Tris(PH 8.0)平衡脫鹽柱，將樣品上樣(最大不超過柱體積的1/3)，3ml/min，收集第一個出現的蛋白峰，進行SOURCE 30Q陰離子洗脫，具體方法為用50mM Tris(PH8.0)平衡脫鹽柱后，樣品上樣，用50mM Tris(PH8.0)洗滌至基線穩定，利用A液(50mM Tris，PH7.5)與B液(50mM Tris PH7.5，1M NaCl)形成梯度，結果獲得純化的蛋白，經HPLC分析，純度高于95％，如附圖3所示。
實施例四 疫苗對免疫組和對照組脾淋巴細胞的增殖活性C57BL/6雌鼠6只分2組，每組3只，分別在頸背部皮下注射200μg/0.2ml Hsp65-E6/E7融合蛋白(疫苗組)和0.2ml緩沖液(緩沖液組)。14天后再次免疫，方法、劑量和部位同第一次免疫，第二次免疫10天后脫頸處死小鼠，70％酒精中浸泡3分鐘。在無菌操作臺上剪開腹部，取出脾臟，用玻璃注射器芯在200目不銹鋼網上輕輕研磨。PBS沖洗不銹鋼網，反復3次，制成單細胞懸液備用。取預先放置到室溫的淋巴細胞分離液3ml，加入15ml玻璃離心管中，將6～10ml單細胞懸液輕輕加到分離液上，在水平離心機中2000rpm，離心20min，中間的白色界面層即為淋巴細胞。吸取界面層細胞，PBS洗滌細胞2次，計數，重懸于含10％小牛血清的RPMI 1640培養液中，將疫苗組和緩沖液組淋巴細胞各分為4組，分別加入培養液(空白對照)、GST(終濃度為50μg/ml)、Hsp65-E6/E7融合蛋白(終濃度為100μg/ml)和Con A(終濃度為10μg/ml)。用MTT法檢測小鼠脾細胞的增殖，每組設3個復孔，每孔加入40萬脾淋巴細胞，總體積為150μl。在37℃，5％CO2條件下培養3天后，加入1mg/mlMTT溶液50μl。37℃孵育4-6小時后，用酶標儀測定波長為570nm時的吸光值(OD)。
此試驗結果顯示Hsp65-E6/E7重組疫苗對免疫后小鼠脾淋巴細胞增殖有較強的刺激作用，刺激指數為3.4；而對對照小鼠脾淋巴細胞的增殖作用刺激較弱，刺激指數為1.1，二者差異有顯著性意義(P＜0.01)。無關蛋白GST對免疫和對照二組小鼠脾淋巴細胞刺激增殖作用均較弱，二組的差異無顯著性意義。ConA對免疫和對照小鼠脾細胞增殖都有強烈刺激作用，二組的差異無顯著性意義。結果說明，疫苗激發小鼠的淋巴細胞的分裂，如附圖4所示。
實施例五 免疫和未免疫小鼠脾淋巴細胞的裂解活性從小鼠中取出脾細胞直接進行殺傷試驗可以反映當時體內的抗腫瘤能力。結果如附圖5所示，Hsp65-E6/E7重組疫苗免疫小鼠的脾細胞對HPV16陽性TC-1細胞的裂解明顯高于對照組，在效靶比為25∶1的情況下，殺傷率分別為13.28％和4.26％，差異有顯著性(P＜0.01)意義。另外我們還檢測了小鼠脾細胞對HPV16陰性L929細胞的殺傷作用。免疫組和對照組殺傷率均很低，效靶比為25∶1時分別為3.79％和2.5％，差異無顯著性意義。
實施例六 融合蛋白疫苗誘導的TC-1移植瘤的消退實驗動物采用C57BL/6小鼠，接種的腫瘤細胞TC-1腫瘤細胞系，TC-1細胞系是來源于C57BL/6的肺上皮細胞，經共轉染HPV16 E6/E7和激活的c-H-ras基因后轉化而得到的HPV16 E6/E7陽性細胞株，源于T-C Wu實驗室，該細胞在含10％小牛血清的RPMI 1640完全培養液中培養。具體實驗方案如下實驗動物35只，腋窩下接種1.3×105TC-1細胞，接種TC-1細胞4天后，即可觀察到部分小鼠腫瘤皮下生長。10天后，腫瘤形成率達100％。腫瘤大小均勻，體積約8mm3。我們選擇其中的32只小鼠，隨機分為4組，每組8只，分別注射PBS、50ug、100ug、200ug融合蛋白疫苗，14天后再次免疫接種。此后觀察腫瘤的消退以及小鼠的生存時間。觀察期間對照組小鼠腫瘤生長迅速。40天后，對照組小鼠由于腫瘤負荷過大開始死亡；而治療組小鼠的腫瘤生長受到抑制(附圖8)。在接種腫瘤細胞的第32天，對照組小鼠的平均腫瘤為7.5cm3，而治療組的50μg、100μg和200μg 3個劑量組的腫瘤體積分別為4.1、1.6、0.2cm3。3個劑量的融合蛋白都有顯著的抑瘤作用(與對照組相比，3組的P＜0.05)，而且較高劑量的融合蛋白抑瘤作用要好于較低劑量(200μg vs 100μg，100μg vs50μg，P＜0.05)(附圖7)，劑量效應關系明顯，特別是高劑量(200μg/只)治療組，7只小鼠中的2只在第二次免疫后的3～6天腫瘤完全消退，且持續20天以上(附圖6)。治療組(3個劑量)小鼠的生存期明顯長于對照組(P＜0.05)。到第64天，所有的對照小鼠(8只)全部死亡，而治療組的50μg、100μg和200μg組分別有30％、70％和100％的小鼠存活。到第120天，200μg組仍有5只存活。說明疫苗明顯延長了小鼠的生存期。
權利要求
1.用于在體內誘導針對HPV16Z蛋白抗原的特異性免疫應答的融合蛋白，其特征在于該融合蛋白至少包括應激蛋白與HPV16Z蛋白抗原。
2.權利要求1所要保護的目的蛋白，其中所述的應激蛋白為熱休克蛋白65，蛋白抗原為HPV16ZE6與E7的融合蛋白。
3.權利要求1和2所要保護的目的蛋白，其中所述的E6為截短的E6片斷，其至少包括E6蛋白C端88個氨基酸，E7為突變的E7蛋白，其24、26、58、91位氨基酸突變成苷氨酸。
4.權利要求1所要保護的目的蛋白，還至少包含4個組氨酸殘基的純化標記。
5.編碼本文要求保護的目的蛋白的DNA序列。
6.含權利要求3的DNA序列的載體。
7.權利4所要保護的載體轉化的宿主。
8.本文要求保護的融合蛋白的生產方法，包括表達所述序列并分離所需產物。
9.本文要求保護的融合蛋白的生產方法，包括將本文要求保護的蛋白與合適的稀釋劑或其他藥學上可接受的賦形劑混合。
10.本文要求保護的融合蛋白的用途，在治療和預防HPV相關疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及熱休克蛋白與HPV16Z E6/E7的融合蛋白，該融合蛋白的獲得方法，表達該融合蛋白的表達載體和轉化了該表達質粒的宿主，以及所述融合蛋白在治療和預防HPV相關疾病的藥物中的應用。此融合蛋白以包涵體的形式在大腸桿菌中表達后，通過柱上復性和層析純化后，純度大于95％，在無佐劑的情況下在小鼠體內成功誘導了針對E6、E7的特異性細胞免疫反應，對TC－1細胞小鼠移植瘤有顯著的治療作用。
文檔編號A61K39/12GK1900118SQ20051008546
公開日2007年1月24日 申請日期2005年7月21日 優先權日2005年7月21日
發明者王小兵, 張偉 申請人:張偉