專利名稱：旋毛蟲70KDa熱休克蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明為一種旋毛蟲新抗原基因熱休克蛋白基因，含有該基因的 栽體的構建及原核表達載體，以及所表達的蛋白及由蛋白免疫動物產 生的抗體。本發明還涉及所述基因和蛋白的應用。
背景技術：
旋毛形線蟲(7Wc/ // e/7fl "/ra/h，簡稱旋毛蟲)，可感染人 及150多種動物，它所引起的旋毛蟲病是一種人畜共患寄生蟲病，呈 全球性分布，嚴重地威脅了人類健康并對畜牧業造成巨大經濟損失。 旋毛蟲生活史簡述如下當人或動物宿主生食或半生食含旋毛蟲嚢包 的肉類(豬肉、狗肉等)，嚢包內幼蟲在胃液、腸液作用下逸出并在 小腸內發育為成蟲。雌、雄蟲交配后雌蟲產新生幼蟲。新生幼蟲侵入 腸粘膜淋巴管或靜脈，隨淋巴和血循環到達宿主橫紋肌繼續發育。旋 毛蟲的致病過程分為三期侵入期、幼蟲移行及囊包形成期，即在該 蟲生活史的每個環節均可使宿主致病。
旋毛蟲病臨床表現復雜多樣，診斷較困難，給及時的治療造成一定 難度，因此該病的免疫診斷及預防成為當務之急。由于病原體不能在 體外大量傳代培養，限制了抗原的獲取；加之旋毛蟲抗原的復雜性、 多樣性，造成目前尚無理想的高敏感度、高特異性的抗原作為診斷候 逸抗原分子。
發明內容
本發明的目的在于尋找和克隆旋毛蟲抗原新基因，對該基因的 基因重組蛋白進行免疫學功能的研究，為旋毛蟲病的免疫診斷及免疫 預防、治療提供新的候選抗原分子。本發明提供了分離的多核苷酸分子，其包含從如下組核苷酸序列
中選擇的核苷酸序列或者由該核苷酸序列組成
(A) 與SEQ ID NO: 1所示序列或SEQ ID NO: 1中開放閱讀框至 少70%、優選至少80%、更優選至少90%、尤其是至少95%或98%
同源的核苷酸序列；
(B) 與SEQ ID NO: 1所示序列或SEQ ID NO: 1中開放閱讀框的 互補序列在中等嚴格雜交條件、優選高嚴格雜交條件下可發生雜交的 核苷酸序列；
(C) 與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1中開放閱讀框編碼相同序 列的蛋白質、但因遺傳密碼的簡并性而在序列上有所不同的核苷酸序 列；
(D) 編碼如下氨基酸序列的核普酸序列SEQ ID NO: 2所示序列， 或者，由于一或多個(例如1 - 25個、l-20個，l-15個，l-10個， 1 - 5個，1 - 3個)氨基酸殘基的替代、缺失和/或插入而與SEQ ID NO: 2所示序列有所不同的氨基酸序列；
(E) SEQ ID NO: 1所示序列或SEQ ID NO: 1中開放閱讀框；
(F) (A)、 (B)、 (C) 、 (D)或(E)所述核普酸序列的片段；和
(G) 與(A)、 (B)、 (C)、 (D)、 (E)或(F)所述核苷酸序列互補的核 苷酸序列。
優選地，本發明的多核苷酸分子編碼具有免疫原性的多肽。
SEQ ID NO: 1中開放閱讀框是指SEQ ID NO: 1第208-1881位核
香酸所示的核苷酸序列。
在一個具體實施方案中，所述的多核苷酸分子具有SEQ ID NO: 1
所示核苷酸序列或者SEQ ID NO: 1第208-1881位核苷酸所示開放閱
讀框序列。
本發明還涉及上述多核苷酸分子編碼的多肽。 本發明還提供了分離的多肽，其包含從如下組氨基酸序列中選擇 的氨基酸序列或者由該氨基酸序列組成
(A)與SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列至少70%、優選至少80%、更優選至少90%、尤其是至少95%或98%同源的氨基酸序列；
(B) 由于一或多個(例如1-25個、l-20個，l-15個，1-10 個，1 - 5個，1 - 3個))氨基酸殘基的替代、缺失和/或插入而與SEQ ID NO: 2所示序列有所不同的氨基酸序列；
(C) SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列；和
(D) (A)或(B)或(C)所述氨基酸序列的免疫原性片段。
優選地，本發明的多肽具有免疫原性，特別是能夠誘發有效抵抗 旋毛蟲的免疫應答。在一個實施方案中，本發明多肽來自旋毛蟲。 本發明還涉及編碼該多肽的分離的多核普酸分子。 在一個具體實施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列。
本發明的一個方面提供了一種多核苷酸分子，其中包含SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列或者其高度同源序列。
在一個實施方案中，本發明不包括由SEQ ID NO: 1所示核苷酸序 列或者SEQ ID NO: 1第208-1881位核苷酸所示開放閱讀框序列組成 的多核苷酸分子，及由SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列組成的多肽。
在一個實施方案中，本發明不包括由GenBank注冊號AY046874 所示核普酸序列或者其第208-1881位核苷酸所示開放閱讀框序列組 成的多核苷酸分子，及由AY046874所示核苷酸序列第208-1881位核 苷酸編碼的氨基酸序列組成的多肽。
本發明還提供重組載體，其包含本發明所述多核苷酸分子。優選 所述重組栽體是表達載體，其包含并能夠表達本發明所述多核苷酸分子。
本發明還提供含有本發明重組表達載體的宿主細胞，包括原核細 胞如大腸桿菌細胞和真核細胞，還包括微生物細胞、植物細胞、動物 細胞等，例如常規的克隆和表達用宿主細胞。
本發明還提供生產多肽的方法，包括在能使所述多肽表達的條件 下培養本發明所述的宿主細胞和回收所表達的多肽。本發明還提供抗體，其可特異性結合本發明所述多肽。所述抗體可以是多克隆或者單克隆抗體。
本發明還提供用于預防或治療動物，尤其是牲畜和人的旋毛蟲感染的藥物組合物，所述的藥物組合物中含有本發明所述多肽或者多核苷酸或者抗體或者載體或者宿主細胞。
本發明還提供用于診斷動物，尤其是牲畜和人中的旋毛蟲感染的診斷試劑盒，其中含有本發明所述多核苷酸分子、可檢測本發明所述多核苷酸分子的核酸探針、可特異性擴增本發明所述多核苷酸分子的引物、本發明所述多肽、或者本發明所述抗體。
本發明提供本發明所述多核苷酸分子、可檢測本發明所述多核苷酸分子的核酸探針、可特異性擴增本發明所述多核苷酸分子的引物、本發明所述多肽、或者本發明所述抗體在制備用于診斷動物，尤其是牲畜和人中的旋毛蟲感染的診斷試劑中的用途。
本發明還提供本發明所述多核苷酸分子或者多肽或者抗體或者載體或者宿主細胞在制備用于預防或治療人畜旋毛蟲感染的藥物中的用途。
本發明還提供寡核苷酸，其含有SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列或SEQ ID NO: 1第208-1881位核苷酸所示開放閱讀框序列或者其互補序列中的至少15個、優選至少25個、更優選至少50個核苷酸或者其相似序列，所述相似序列能夠與SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列或者其互補序列在高度嚴格雜交條件下發生雜交。優選地，所述寡核苷酸是可檢測本發明所述多核苷酸分子的核酸探針、或者可特異性擴增本發明所述多核苷酸分子的引物。
本發明還提供本發明寡核苷酸用于診斷動物，尤其是牲畜和人中的旋毛蟲感染的用途。
本發明還提供融合蛋白，其包含本發明所述多肽及另一融合對象(即另一氨基酸序列)。在一個具體實施方案中，所述另一融合對象是(3-半乳糖普酶，谷胱苷肽-S-轉移酶或多組氨酸等。本發明還涉及編碼該融合蛋白的多核苷酸。本發明的多核苷酸分子可以用免疫篩選從旋毛蟲cDNA基因文庫中獲得。本發明還涉及該序列的變異體，例如一個或多個堿基的缺失、添加或替換，但不改變所編碼的蛋白質的功能。變異體可以是天然存在的等效變異體或非天然存在的變異體。
本發明的多肽可以通過構建上述基因的原核或真核表達載體，轉化到適合的宿主細胞中，從培養物中純化多肽來制備。本發明的多肽包括序列2的多肽，以及具有等效功能的它的衍生物、片段或類似物。
作為具體實例，本發明發明人利用分子生物學技術，如cDNA文庫免疫篩選、分子克隆、聚合酶鏈式反應(PCR) 、 DNA序列測定、Southern雜交、Western印跡雜交法，克隆鑒定了旋毛蟲抗原新基因70KDa熱休克蛋白基因；利用基因表達及免疫學技術獲得該基因的重組蛋白及高效價免疫血清；并對該蛋白免疫原性及免疫保護性進行了分析。
該基因達到的技術指標為
1. 在本發明中采用cDNA文庫免疫篩選獲得該基因的全長cDNA序列。全長2152bp，起始密碼子ATG位于序列第208bp處，TGA為終止密碼子，編碼的蛋白質含557個氨基酸。
2. 旋毛蟲70KDa熱休克蛋白基因的557個氨基酸重組蛋白在大腸桿菌BL21林中獲得表達并純化(圖1)。
3. 旋毛蟲70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白免疫動物獲高滴度抗70KDa熱休克蛋白免疫血清。
4. 旋毛蟲70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白為抗His抗體，感染旋毛蟲的病人血清、兔血清、豬血清、小鼠血清所識別，并與70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白人工免疫小鼠血清發生反應(圖2)。
5. 旋毛蟲70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白免疫動物后對攻擊感染產生有效的免疫保護性(表l)。
本發明發現了旋毛蟲70KDa熱休克蛋白抗原基因全長cDNA;獲得了純化的70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白及進行了免疫學功能的
9研究，為旋毛蟲病的免疫預防提供了新的保護性候選抗原分子，并且也可以用于制備診斷試劑。
圖1 SDS-PAGE電泳旋毛蟲70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白在大腸桿菌中的表達及其純化
1. 蛋白分子量標準
2. 未經IPTG誘導的全菌蛋白
3. IPTG誘導8小時的全菌蛋白
4. 純化的70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白箭頭所指為重組蛋白帶
圖2 Western免疫印跡鑒定旋毛蟲70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白的免疫特性
1. 純化的70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白與抗His抗體反應
2. 純化的70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白與旋毛蟲病人血清反
應
3. 純化的70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白與感染旋毛蟲的兔血清反應
4. 純化的70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白與感染旋毛蟲的豬血清反應
5. 純化的70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白與感染旋毛蟲的小鼠血清反應
6. 純化的70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白與該重組蛋白免疫小鼠血清反應
圖3不同刺激物刺'M BMDC表面CD86表達情況同型抗體對照A.陰性對照組DC;C. LPS陽性對照組DC; E.r7^-Hsp70實驗組DC; G.變性r7y"Hsp70組DC
CDllc+、 CD86+雙陽性細胞百分數B.陰性對照組DC; D.LPS陽性對
10照組DC; F. iTs^Hsp70實驗組DC; H.變性r 7^Hsp70組DC圖4不同組細胞中CDllc+、 CD86+雙陽性細胞數圖5不同刺激物培養24小時的DC培養上清中IL-12P70水平注"與不加刺激物(control)組DC比較，P〈0.01;'與LPS刺激物
組DC和rrs-Hsp70刺激物組DC比較，P<0. 05
圖6不同刺激物培養2 4小時的BMDC培養上清中TNF- oc水平
注'與不加刺激物(control)組BMDC比較，P<0. 05
圖7掃描電鏡下不同剌激物培養24小時的BMDC形態(放大倍數1500
x )。 A.陰性對照組DC; B. LPS陽性對照組DC; C. r7—Hsp70實驗組DC;
D.變性r7^"Hsp70組DC。
圖8透射電鏡下不同刺激物培養1天的DC形態(5000 x )
A.陰性對照組DC; B. LPS陽性對照組DC; C. rr5"Hsp70實驗組DC;
D.變性r7^Hsp70組DC
具體實施例方式
本文所用的術語"多核苷酸分子"、"多核苷酸序列"、"編碼序列"、"開放閱讀框(ORF)"等包括單鏈或雙鏈的DNA和RNA分子，可包含一個或多個原核序列，cDNA序列，包含外顯子和內含子的基因組DNA序列，化學合成的DNA和RNA序列，以及有義和相應的反義鏈。
生產和操作本文公開的多核苷酸分子及寡核苷酸分子的方法是本領域技術人員已知的，并可按照已描述的重組技術(參見Maniatis等，1989，分子克隆，實驗室手冊,冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Ausubel等，1989，分子生物學當前l支術，Greene PublishingAssociates & Wiley Interscience， NY; Sambrook等，1989， 分子克隆，實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Innis等(編)，1995， PCR策略，Academic Press ， Inc., San Diego;和Erlich(編)，1992， PCR技術，牛津大學出版社，New York)完成。
本發明提供了包含編碼旋毛蟲70KDa熱休克蛋白的核苷酸序列的一種分離多核苷酸分子。該多核苷酸分子可用于實施本發明。在進一步的優選實施方案中，本發明分離的多核苷酸分子包含選自下列成員
的核苷酸序列(1) SEQ ID NO: l所示的核苷酸序列；(2)與SEQ IDNO: 1所示核苷酸序列至少70%相同、優選至少80%相同、更優選至少90%相同、最優選95%或98°/。相同的核苷酸序列；(3)在中等嚴謹雜交條件下(即在0. 5M NaHP04、 7°/。十二烷基石危酸鈉(SDS) 、 lmM EDTA中于65匸與結合于濾膜的DNA雜交，并在0, 2xSSC/0. 1%SDS中于42。C洗滌的條件；參見Ausubel等(編)，1989，分子生物學當前技術，第1巻，Green Publishing Associntes， Inc. ， and John Wiley & Sons,Inc., NY, P. 2.10.3)、優選高度嚴謹雜交條件(即在0. 5M NaHP04、7%SDS、 lmM EDTA中于65匸與結合于濾膜的DNA雜交，并在0. lxSSC/0. 1% SDS中于68X:洗滌條件；參閱Ausubel等，1989，上述文獻)下與具有SEQ ID NO: 1或其互補序列的多核苷酸分子能雜交的核苷酸序列；(4)與SEQ ID NO: l編碼相同序列的蛋白質、但因遺傳密碼的簡并性而在序列上有所不同的核苷酸序列；或者(5)與(l)-(4)
中任一核苷酸序列互補的核苷酸序列。
在一個實施方案中，本發明多核苷酸分子包含編碼旋毛蟲70KDa
熱休克蛋白的核苷酸序列。
在一個實施方案中，本發明多核苷酸分子可用于以標準擴增技術擴增旋毛蟲特異性多核苷酸分子，或作為診斷試劑用以檢測被旋毛蟲感染的動物體液或組織樣品中旋毛蟲特異性多核苷酸的存在。
本發明進一步提供包含編碼同源于旋毛蟲70KDa熱休克蛋白或免疫原性多肽之多肽的核苷酸序列的一種分離多核苷酸分子。本文中提到同源于旋毛蟲70KDa熱休克蛋白或免疫原性多肽的多肽時所使用的術語"同源，，是指多肽本來具有旋毛蟲70KDa熱休克蛋白或免疫原性多肽的氨基酸序列，但其中一個或多個氨基酸殘基已被不同的氨基酸殘基保守地取代(例如1-25個、l-20個，1-15個，1-10個，1-5個)，并且所得到的多肽可用于實施本發明。保守氨基酸取代是本領域已知的。造成這樣的取代的規則包含由Dayhof， M. D. (1978，國家生物醫學研究基金，Washington, D. C.，第5巻，增刊3)等所述的取代規則。更具體地說，保守氨基酸取代發生在與其酸性、極性或 側鏈大小相關聯的氨基酸家族內。 一般可將遺傳編碼的氨基酸分為四
組(l)酸性氨基酸-天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性氨基酸=賴氨酸、 精氨酸、組氨酸；(3)非極性氨基酸-丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮 氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不帶電的極性氨基 酸-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪 氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸也共同分類為芳香氨基酸。任何特 定組內的一個或多個取代，例如用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、或 用谷氨酸取代天冬氨酸、或用絲氨酸取代蘇氨酸，或任何其他氨基酸 殘基結構上相關的氨基酸殘基，例如有相似酸性、極性、側鏈大小的， 或在其某些組合方面有相似性的氨基酸殘基取代， 一般對多肽的功能
或免疫原性不會有太大影響。
基本同源的蛋白質和多肽其特征在于具有一個或多個氨基酸取代
(倉寸:i口l一25個、l一20個，1一15個，1一10個，l一5個)、冊J除或 添加。這些改變優選影響較小的變換，即保守氨基酸取代(見表2)及 其它不會嚴重影響蛋白質或多肽的折疊和活性的取代；小的刪除，通 常是1-約30個氨基酸的小刪除；及小的氨基或羧基末端延伸，諸如 氨基末端甲硫氨酸殘基，長達約20-25個殘基的小連接肽，或便于純 化的小延伸(親和標記)，如多組氨酸束、蛋白A (Nilsson等，EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson等，酶學方法，198: 3， 1991)。編碼親和標記 的DNA可從產品供應商處購買到。
本文中所說的多肽"可用于實施本發明，，是指該多肽可用作診斷試 劑，以檢測新近被旋毛蟲感染的、或已被旋毛蟲感染的動物血液或血 清樣品中旋毛蟲特異性抗體的存在；或者可用作抗原產生旋毛蟲特異 性抗體(例如特異結合的抗體、中和性抗體、治療性抗體)；或者可
作為免疫原對動物進行預防性免疫或者治療性免疫，或者本文提到的 該多肽的任何用途。
本發明進一步提供與本發明上述多核苷酸分子能雜交，或與具有作 ^胡卜W容核吝酸A-
13雜交的多核苷酸分子。這樣的寡核苷酸分子較好是至少長約15nt，更 好是長約25 nt，尤其是至少50nt，并可在高度嚴緊條件下與一種或 多種上述多核苷酸分子雜交。所說的高度嚴緊條件是在6XSSC/0. 5%焦 磷酸鈉中洗膜，并且洗膜溫度對于長約14堿基者為大約37X:，長約 17堿基者為大約48X:，長約20堿基者為大約55C，長約23堿基者 為大約60X:。本發明的較長寡核苷酸分子的其他雜交條件可由本領域 技術人員按照標準技術來確定。在一優選實施方案中，本發明的寡核 苷酸分子互補于本發明上述多核苷酸分子至少之一的一部分。
本發明的寡核苷酸分子可用于多種目的，其中包括作為擴增旋毛 蟲特異性多核苷酸分子的引物以用于諸如疾病鑒別診斷，或者編碼或 用作基因調節的反義分子。就診斷方面來說，可使用適當設計的引物 檢測動物組織或體液等樣品中旋毛蟲特異性多核苷酸分子的存在。特 異性擴增產物的產生可支持旋毛蟲感染的診斷，而缺少擴增的產物則 可能指示沒有感染。例如Innis等人(1995 ，出處同前)和 Erlicch(1992,出處同前)編輯的前述文獻中描述了進行擴增的方法， 例如聚合酶鏈反應(PCR)方法。本領域已知的其他擴增技術也可使用， 例如連接酶鏈反應法。也可使用本文公開的多核苷酸分子的序列設計 用于從旋毛蟲的其他種或林系中分離同源基因的引物。
本發明進一步提供包含本發明多核苷酸分子的克隆載體、表達栽 體、包含任何所說載體的被轉化宿主細胞，以及由其衍生的新的林系 或細胞系。在一優選實施方案中，本發明提供包含一種多核苷酸分子 的重組栽體，所說多核苷酸分子具有編碼旋毛蟲70KDa熱休克蛋白或 免疫原性多肽的核苷酸序列。
優選地，本發明的重組載體，特別是表達載體的構建方式能使得 本發明多核苷酸分子的編碼序列與轉錄和翻譯編碼序列所需的一個或 多個調節元件可操作性地連接，以產生多肽。本文中使用的術語"調 節元件，，包括但不只限于編碼誘導型和非誘導型啟動子、增強子、操
其它元件的核苷酸序列。另外，本文所說的編碼序列與一個或多個調節元件"可操作性地連接"是指調節元件可有效地調節并允許轉錄編
碼序列或翻譯其mRNA,或發揮兩方面的功能。
構建包含與適當的調節元件可操作性地連接的特定編碼序列的重 組載體的方法是已知的，并可使用這些方法實現本發明。這些方法包 括體外重組技術、合成技術和體內遺傳重組(如參見Maniatis等人 (1989)的上述文獻)。
可用于表達本發明的旋毛蟲70KDa熱休克蛋白編碼序列的各種栽 體是本領域已知的，其中包括含有特定編碼序列的重組噬菌體DNA、 質粒DNA和粘粒DNA表達載體。可經加工而含有本發明的多核苷酸分 子的質粒包括pUC8、 pUC9、 pBR322和pBR329 (Biorad Laboratories, Richmond, CA) 、 pPL和pKK223 (Pharmacia， Piscataway, NJ)、 pQE50 (Qiagen， Chatsworth， CA)和pGEM -TEASY (Promega， Madison, WI)等。可經加工而含有本發明的多核苷酸分子的典型真核表達載體包 括蛻皮激素誘導型哺乳動物表達系統(Invitrogen， Carlsbad， CA )、 基于巨細胞病毒啟動子-增強子的系統(Promega， Madison， WI; Stratagene, La Jolla， CA; Invitrogen)，和基于桿狀病毒的表達 系統(Promega )等。
這些和其他載體的調節元件可在其強度和特異性方面各不相同。 基于所利用的宿主/載體系統，可以使用多種適當的轉錄和翻譯元件 中的任一種。例如，當在哺乳動物細胞系統中克隆時，可使用從哺乳 動物細胞基因組中分離的啟動子，如小鼠金屬疏蛋白啟動子，或從生 長于這些細胞內的病毒中分離的啟動子，如痘苗病毒7. 5K啟動子或莫 洛尼鼠類肉瘤病毒長末端重復序列。可使用以重組DNA或合成技術得 到的啟動子以轉錄被插入的序列。另外，在特定誘導子，例如適于金 屬硫蛋白啟動子的鋅和鎘離子的存在下，由某些啟動子啟動的表達可 以被增強。轉錄調節區或啟動子的非限制性例子包括用于細菌的P -gal啟動子、T7啟動子、TAC啟動子、trp和lac啟動子、trp- lac 融合啟動子等；用于酵母的糖酵解酶啟動子，如ADH-和ADH- II啟動 子、GPK啟動子、PGI啟動子、TRP啟動子等；以及用于哺乳動物細胞的SV40早期和晚期啟動子、腺病毒主要晚期啟動子等。本發明進一步 提供包含旋毛蟲70KDa熱休克蛋白基因之啟動子的核苷酸序列的多核 苷酸分子，其可用于在旋毛蟲中表達本發明的編碼序列。
為足夠地翻譯被插入的編碼序列，還需要特異性起始信號。這些 信號一般包括ATG起始密碼子及相鄰序列。在將包含其自身的起始密
情況下，可能不必加入另外的翻譯控制信號。然而，當只插入一部分 編碼序列時，可能需要包括ATG起始密碼子等的外源翻譯控制信號。 可從各種來源，即天然和合成來源，得到這些外源翻譯控制信號和起 始密碼子。再者，起始密碼子必須與編碼區的讀框一致，以確保整個 插入片段符合讀框地翻譯。
也可構建將表達包含本發明蛋白質或多肽和融合對象的融合蛋白 質的表達載體。這樣的融合蛋白質例如可用于產生抗旋毛蟲蛋白的抗 血清、研究旋毛蟲蛋白的生化性質、工程化修飾表現有不同免疫學或 功能性質的旋毛蟲蛋白、幫助鑒定或純化重組表達的旋毛蟲蛋白或改 善其穩定性。可能的融合蛋白表達載體包括但不只限于插入了編碼P 半乳糖苷酶和trpE融合體、麥芽糖結合蛋白融合體、谷胱甘肽-S-轉移酶融合體及多組氨酸融合體(載體區域)之序列的載體。可用于 構建編碼這些和其他融合蛋白的表達載體的方法是本領域已知的。
可用融合蛋白質幫助純化已表達的蛋白質。在一非限制性實施方 案中，可使用直鏈淀粉樹脂純化熱休克蛋白70-麥芽糖結合性融合蛋 白，可使用谷胱甘肽瓊脂糖小球純化熱休克蛋白7G-谷胱甘肽-S-轉移酶融合蛋白質，可使用二價鎳樹脂純化熱休克蛋白70-多組氨酸 融合蛋白質。或者，也可使用抗載體蛋白質或肽的抗體對融合蛋白質 進行親和層析純化。例如，可將編碼單克隆抗體之靶表位的核苷酸序 列工程化轉移到與調節元件可操作性地連接的表達載體中，并限定其 位置以使所表達的表位融合到本發明的旋毛蟲蛋白上。在一非限制性 實施方案中，可用標準技術在相當于熱休克蛋白70蛋白之氨基或羧基 末端的某個點上插入編碼FLAG 表位標記(其為親水性標記狀)(Znternational Biotechnologies Inc.)的核苦酸序歹'J中，然后 可使用市售的抗FLAGTM抗體檢測并親和純化所表達的熱休克蛋白70 -FLAGTM表位融合體產物。
也可以修飾表達載體使之含有編碼特定蛋白酶切割位點的多接頭 序列，從而可經特定蛋白酶處理而從載體區域或融合對象釋放出已表 達的旋毛蟲蛋白。例如，融合蛋白栽體可包含編碼凝血酶或因子Xa裂 解位點的核苷酸序列。
可使用已知方法將位于旋毛蟲蛋白編碼序列上游且讀框一致的信 號序列加工到表達載體中，以指導所表達之蛋白質的運輸和分泌。信 號序列的非限制性實例包括ot因子、免疫球蛋白、外膜蛋白質、青霉 素酶及T細胞受體等的信號序列。
為了有助于篩選出經本發明重組載體轉化或轉染的宿主細胞，可 以工程化修飾載體使之進一 步包含報道基因產物或其他選擇標志的編 碼序列。這樣的編碼序列較好是與上述調節元件可操作性地連接的。 用于實施本發明的報道基因是本領域熟知的，包括編碼氯霉素乙酰轉 移酶(CAT)、綠色熒光蛋白、熒火蟲熒光素酶和人生長激素等的基因。 編碼選擇標志的核苷酸序列是本領域已知的，包括編碼賦予抗生素抗 性或抗代謝物抗性，或提供營養缺陷型需要等的基因產物的那些核苷 酸序列。這些序列的例子包括編碼胸苷激酶活性，或抗氨甲喋呤、氨 芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、氨基糖苷或潮霉素等的那些序列。
本發明進一步提供包含本發明的多核苷酸分子或重組載體的已轉 化宿主細胞，以及由之衍生的細胞系。可用于實施本發明的宿主細胞 可以是真核或原核細胞。這樣的已轉化宿主細胞包括但不只限于微生 物，例如用重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA載體轉化的細菌，
或者用重組載體轉化的酵母，或者是動物細胞，如用重組病毒載體如 桿狀病毒感染的昆蟲細胞，或用重組病毒載體如腺病毒或痘苗病毒感 染的哺乳動物細胞等。例如，可使用大腸桿菌菌林，如DH5a菌林。真 核宿主細胞包括酵母細胞，但也可有效地利用小鼠、倉鼠、牛、猴或 人細胞系等哺乳動物細胞。可用于表達本發明的重組蛋白質的真核宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NIH/3T3等。
較好是將本發明的重組載體轉化或轉染到細胞的基本均一培養物 的一個或多個宿主細胞中。 一般可按照已知技術，例如原生質體轉化、 磷酸釣沉淀、氯化鉀處理、微量注射、電穿孔、經與重組的病毒接觸 進行感染、脂質體介導的轉染、DEAE-葡聚糖轉染、轉導、接合或微 粒轟擊等技術將載體導入宿主細胞內。可使用標準方法選擇轉化體， 例如通過選擇表達與重組表達載體相關的可選擇標志如抗生素抗性的 細胞的方法。
一旦將表達載體導入宿主細胞后，即可使用Southern雜交分析、 限制性酶切分析、包括反轉錄酶PCR (rt - PCR)的PCR分析等標準技術
證實本發明的多核苷酸分子是否整合并保留在宿主細胞基因組中或以 附加體形式存在，或者用免疫學檢測法檢測預期的蛋白質產物。可用 本領域已知的至少下列四種一般性方法中的一種鑒定含有和/或表達 本發明的多核苷酸分子的宿主細胞(i)DNA-DNA、 DNA-RNA、或RNA -反義RNA雜交；(ii)檢測"標志"基因功能的存在；(iii)檢測特異 性mRNA轉錄本在宿主細胞中的表達，以估計轉錄水平；或(iv)以本領 域已知的免疫檢測法檢測成熟多肽產物的存在。
一旦已將本發明的多核苷酸分子穩定導入到適當的宿主細胞中之 后，即可克隆增殖已轉化的宿主細胞，并在有助于最大量產生所編碼 的多肽的條件下培養所得到的細胞。這樣的條件一般包括培養已轉化 的細胞達到高密度。當表達載體含有誘導型啟動子時，可根據需要， 利用溫度改變、營養素耗盡、加入義務誘導劑(如糖類類似物，例如異 丙基p - D -硫代半乳糖苷(IPTG)、過量代謝付產物積聚等適當誘導條 件以誘導表達。
當多肽保留在宿主細胞內時，應收獲并裂解細胞，并在本領域已 知的盡可能減少蛋白質降解的提取條件下，例如于4。C和/或有蛋白酶 抑制劑存在條件下，從裂解物中基本上純化或分離產物。如多肽能從
宿主細胞中分泌出來，則可簡單地收集已耗竭的營養素培養基，并從 中基本上純化或分離多肽。
18必要時，可使用標準方法，包括但不只限于硫酸銨沉淀，大小分
級分離、離子交換層析、HPLC、密度梯度離心及親和層析法，從細胞 裂解物或培養基中基本上純化或分離多肽。如果多肽缺乏生物學活性， 則可作根據分子大小、或與多肽特異性抗體的反應性，或根據融合體
標記的存在檢測之。用于實施本發明時，多肽可以是已分泌到培養液 中或存在于細胞裂解物中的未純化狀態，但較好是已從中得到基本純 化或分離。本文中所說的多肽"基本上已純化"，是指該多肽構成特
定制劑中蛋白質的至少約2oy。(重量)。另外，本文中所說的多肽"已
分離"，指的是該多肽構成特定制劑中蛋白質的至少約80%(重量)。
因此，本發明提供由本發明多核苷酸編碼的基本上已純化或分離 的旋毛蟲70KDa熱休克蛋白。在一優選實施方案中，旋毛蟲70KDa熱 休克蛋白具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。
本發明進一步提供同源于所述旋毛蟲70KDa熱休克蛋白的多肽， 其中術語"同源，，具有上文就多肽所限定的含義。
本發明進一步提供由本發明任何一種上述多肽的基本部分組成的 多肽。本文使用的術語-本發明多肽的"基本部分"或"肽片段"意 指組成上小于相應全長度多肽之完整氨基酸序列、但包含其氨基酸序 列的至少約10%、較好至少約20%、并可用于實施本發明的多肽("可 用于"具有上文就多肽所限定的含義)。特別優選的是具有免疫原性 (即能夠誘導免疫反應而產生特異地抗相應的全長度旋毛蟲多肽的抗 體)的肽片段。
本發明進一步提供包含與本領域已知的載體或融合對象融合的任 一種上述多肽的融合蛋白質。
本發明的多肽可用于多種目的，包括作為診斷試劑，例如以ELISA 檢測等標準檢測法篩選動物血液或血清樣品中的旋毛蟲特異性抗體； 或如下所述用作產生多克隆或單克隆抗體的抗原，其中可以使用所述 抗體作為診斷試劑，例如以Western印跡檢測法等標準技術篩選動物 細胞、組織或體液樣品中的旋毛蟲特異性蛋白質。
可以在蛋白質水平上修飾本發明的任何多肽，以改善或改變其生
19物學或免疫學特征。可使用已知技術對多肽進行一種或多種化學修飾， 以制備其類似物。
可以在分子上連接一個或多個化學基團或另一種蛋白質如血清白
蛋白、匙孔蟲戚血蘭蛋白或BSA,或者多聚氨基酸(如多聚賴氨酸)，或 多糖(如Sepharose，瓊脂糖，或經過修飾或未經#"飾的纖維素)上等， 以制備本發明多肽的衍生物。進行這些連接反應的方法是蛋白質化學 領域中已知的。
本發明進一步提供抗本發明多肽的分離抗體。在一優選實施方案 中，可使用已知方法產生抗旋毛蟲70KDa熱休克蛋白的抗體。可用部 分或基本上純化或分離的旋毛蟲70KDa熱休克蛋白重組蛋白，或其如 上文描述的同系物、融合蛋白、基本部分、類似物或衍生物免疫選自 豬、牛、馬、兔、山羊、綿羊或小鼠等各種宿主動物。可使用下文描 述的佐劑提高抗體產生量。
可從被免疫動物的血清中得到和分離多克隆抗體，并使用常規方 法試驗其對抗原的特異性。或者，也可使用由培養的連續細胞系生產 抗體分子的任何技術制備并分離單克隆抗體。這些技術包括但不只限 于原先由Kohler和Milstein(自然，1975， 256 : 495 - 497)描述的雜 交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術(Kosbor等，1983,今日免疫學，4:72; Cote等，1983，美國國家科學院院報，80: 2026 - 2030)，以及EBV 雜交瘤技術(Cole等，1985，單克隆抗體和癌癥治療，Alan R. Liss, Inc., pp. 77 - 86)。或者，可釆用已述的生產單鏈抗體的技術(如參 見美國專利4， 946， 778)生產旋毛蟲抗原特異性單鏈抗體。
含有本發明多肽的特異性結合位點的抗體片段也包括在本發明范 圍內，并可用已知技術制備。這樣的片段包括但不只限于可由胃蛋白 酶消化完整抗體分子而產生的F(ab')2片段，和可經還原F(ab')2片段 的二硫橋而產生的Fab片段。或者，也可構建Fab表達文庫(Huse等， 1989,科學，246: 1275 - 1281 ),以迅速鑒定對旋毛蟲蛋白有所需特 異性的Fab片段。
生產和分離單克隆抗體及抗體片段的技術是本領域已知的，并在例如下列文獻中給出了更詳細的描述Harlow和Lane, 1988，抗體 實驗室手冊,冷泉港實驗室和J.W. Cooding， 1986，單克隆抗體原 理與實踐，Academic Press, London (其歹'J為本文參考文獻)。 下列實施例只是舉例描述，而不用來限制本發明的范圍。
實施例
實施例1 旋毛蟲70KDa熱休克蛋白基因的克隆及序列分析
1. 篩選血清(人工免疫兔血清)的制備
收集分離自豬體的黑龍江林旋毛蟲(國際標準蟲株編碼ISS533 ) 成蟲，將成蟲蟲體放于研磨器中，冰浴下快速研磨15分鐘。將研磨 后的液體移入10ml離心管，超聲(于水上)3次，3分鐘/次，中間 休息1分鐘。反復凍融數次，離心取上清即得全蟲可溶性抗原。免疫 曰本大耳白兔(1. 6mg/只)，每周加強1次，加強4次，獲得人工免 疫兔血清。經ELISA測定，人工免疫兔血清滴度達1 : 4000以上。
2. 免疫篩選表達文庫
旋毛蟲成蟲入ZAPIIcDNA表達文庫購自劉明遠(參考文獻《中國 旋毛蟲分離林成蟲和新生幼蟲基因文庫的構建和篩選》，中國獸醫學 報，1998， 18 ( 2 ) : 147-150.)。
1 p 1旋毛蟲成蟲入ZAP II cDNA表達文庫稀釋液加入600 y 1宿主 菌XL1-Blue中，37°C,吸附20分鐘加入頂層瓊脂，倒置于42T溫 箱中培養至有針尖大小的噬菌斑長出。把硝酸纖維素膜(Gelman公 司)鋪在平板上，放在37t:溫箱培養過夜。第二天在室溫下將膜做 好標記，從平板上揭下，浸入一抗工作液(人工免疫兔血清用TBST 以1: 1000稀釋)30分鐘，血清中加入了大腸桿菌噬菌體裂解液
(STRTAGENE公司)。把膜浸入二抗工作液一l: 7500堿性磷酸酶-羊抗兔IgG (Promega公司)，30分鐘。浸入顯色液NBT、 BCIP中
(Promega公司)，顯色充分后，加入ddH20終止。用1: 1000人工 免疫兔血清篩選文庫共獲得9個陽性克隆，經PCR及Southern Blot鑒定后，選取4號克隆進行DNA序列測定。 3. 4號克隆核苷酸序列與編碼的氨基酸分析
4號克隆核苷酸序列全長2152bp(見SEQ ID NO: 1)，開放閱讀框 (第208-1881位，共1674bp )，編碼557個氨基酸(見SEQ ID NO: 2)，其理論分子量為64. 05KDa。同源性分析結果顯示4號克隆編 碼的蛋白質與秀麗隱桿線蟲、班氏絲蟲、日本血吸蟲、剛地弓形蟲、 惡性痦原蟲的70KDa熱休克蛋白分別具有82%, 73%, 70%, 67%和61% 的同源性。我們推斷4號克隆是一個旋毛蟲70KDa熱休克蛋白基因。
實施例2 制備70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白及人工免疫小鼠血清
1. 70KDa熱休克蛋白基因原核表達及純化
根據4號克隆核苷酸序列，設計一對引物，上游引物為5 '-CGCAGGATCCATGGTCGGTCGAGAATG -3，(共27bp，含一個BamH I酶 切位點)，下游引物為5 '-GATACTCGAGACAGTTCATCTTTTTCTTCA -3' (共30bp，含一個Xho I酶切位點)。以免疫篩庫得到的4號克隆為 模板，進行PCR,產物經BamH I和Xho I雙酶切后，亞克隆于原核表 達載體pET-28a ( + ) (NovageiW^司)。正確的重組質粒轉化大腸桿 菌BL21林(Novagen公司)，經37。C、 150轉/分、1. OmM IPTG誘 導8小時，獲得70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白(全部開放閱讀框共 編碼557個氨基酸)，重組蛋白經His-Mnding親和層析柱(Novagen 公司)純化后獲得較高純度(圖1)。
2. 純化的70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白經皮膚多點注射免疫 BALB/c小鼠(20yg/只)，以后每隔14天以相同劑量抗原加等量不 完全弗氏佐劑，加強2次。5周后摘眼球取血。ELISA測定抗體效價 高達l: 128000以上。
實施例3 70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白的免疫特性 1.酶聯免疫吸附(ELISA)檢測以lUg 70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白(實施例2制備)為抗 原包被96孔酶標板， 一抗為抗His抗體和待檢血清，二抗為辣根過 氧化物酶標記的相應(羊抗人、羊抗兔、羊抗豬或羊抗小鼠)二抗， 正常人血清、正常兔血清、正常豬血清、正常小鼠血清分別作為陰性 對照。根據待測血清樣本OD值大于陰性對照2. 1倍者為陽性判斷結 果。經ELISA檢測，旋毛蟲病人血清(8份)陽性率為90%、旋毛蟲 病兔血清(2份)、旋毛蟲病豬血清(3份)及旋毛蟲感染的小鼠血 清(2份)均為陽性，說明該70KDa熱休克蛋白基因的重組蛋白具有 特異的抗原性，是具有應用潛力的診斷試劑。 2. Western印跡分析
純化的70KDa熱休克蛋白基因表達蛋白(實施例2制備)(200ng ) 經SDS-PAGE電泳后，轉移至PVDF膜，用ECL化學發光試劑盒 (Amersham公司)檢測，分別以病人血清l: 100、感染兔血清1: 100、感染豬血清1: 1000、感染小鼠血清l: 100、 70KDa熱休克蛋 白基因重組蛋白人工免疫小鼠血清(實施例2制備)1: 20000作為 第一抗體。結果顯示約70KDa處均呈現一明顯的蛋白印跡帶(圖2)， 表明70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白可為抗His抗體、感染旋毛蟲的 病人血清、感染旋毛蟲的兔血清、感染旋毛蟲的豬血清、感染旋毛蟲 的小鼠血清及70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白人工免疫小鼠血清所 識別。
實施例4 動物體內保護性實驗
BALB/c小鼠20只，隨機分為2組，每組10只。70KDa熱休克蛋 白基因重組蛋白免疫組以20pg/只的抗原(實施例2制備)加等量 的弗氏完全佐劑(FCA)皮下注射。以后每隔14天以相同劑量抗原加 等量不完全弗氏佐劑，加強2次。末次注射后10天，每只鼠用400 條旋毛蟲感染性幼蟲進行攻擊感染。對照組注射相同劑量的PBS，與 免疫組同時接受400條旋毛蟲感染性幼蟲攻擊。于攻擊46天后將小鼠處死，取全部肌肉用胃蛋白酶消化收集幼蟲，計數。經單因素方差
分析，70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白免疫組減蟲率(肌幼蟲減蟲率 %=對照組肌幼蟲數-免疫組肌幼蟲數)/對照組肌幼蟲數x 100%)為 37%，與對照組比較，有顯著性差異(P<0. 01)(表l)。
由于本實驗70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白在動物體內產生有 效的減蟲率，據此可作為保護性候選抗原，應用于旋毛蟲病的免疫預 防。
表1 70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白免疫BALB/c小鼠的保護性 結果
組別BALB/c平均肌幼蟲數肌幼蟲減蟲率P值
的數目又土SD%
免疫組104440±278. 21737<0. 01
對照組107072±410. 433一
實施例5 旋毛蟲70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白(r7^-Hsp70)對體 外培養的小鼠骨髓源樹突狀細胞(BMDC)的促成熟作用實驗 1.小鼠骨髓源樹突狀細胞(BMDC)的分離和培養
取4-6周齡雌性BABL/c小鼠，斷頸處死，95°/。酒精消毒。無菌條件 下分離并培養小鼠骨髓樹突狀細胞(BMDC)。將加入完全培養基進行細 胞培養的這一天定義為BMDC培養的第1天。然后每隔1天(即BMDC培 養第2天、第4天、第6天，以此類推)對培養細胞進行半量換液小心 將每孔內液體棄去lral，再補入37X:預溫的RPMI1640完全培養基lml， 使培養體系中各成分維持原有濃度不變，然后置于培養箱中繼續培養。 當細胞培養至第6天時，分組加入不同的刺激物，即6pg/mlr7^-Hsp70
24(旋毛蟲7OKDa熱休克蛋白基因重組蛋白按照實施例2所述進行表達 及純化)、ljig/mlLPS(細菌脂多糖，Sigma公司，貨號L6529 )和6pg/ml 煮沸變性的r7—Hsp70，另外不加刺激物的BMDC為對照組。分別于細胞 培養的第7天，通過反復吹吸收集疏松粘附細胞及懸浮細胞用于下一步實驗。
2.小鼠BMDC表面標志分子的流式細胞儀檢測
上述加入刺激物的BMDC，繼續培養24小時后，用RPMI1640液 (Hyclone公司，貨號SH30809. 01B )反復吹吸，收集疏松粘附和懸浮 生長的細胞至50ml離心管中，1200rpm離心10min。棄上清，用DPBS 將細胞漂洗2次，1000rpm離心10min。棄上清，定容至l或2ml，將細 胞沉淀混勻后計數，調整細胞濃度，將細胞分裝轉入1. 5mlEppendorf 管，使每管細胞數量為lxl()6個。每份標本分裝2管，即待檢管和對照 管。1000rpm離心10min。棄上清，向待檢管細胞沉淀中加入100ul已 用DPBS稀釋好的PE標記的倉鼠抗小鼠CDllc單克隆抗體(BD Pharmingen公司，貨號553802 )和FITC標記的大鼠抗小鼠CD86單克 隆抗體(BD Pharmingen公司，貨號553691 )，同時另取對照管細胞 沉淀加入單抗的同型對照(即PE標記的倉鼠抗小鼠IgG和FITC標記的 大鼠抗小鼠IgG (BDPharmingen公司，貨號分別是553954; 553929 ) lOOul,單抗和其同型對照的應用濃度均為0. 25ug/100ul體系。以上各 管混勻后4。C避光靜置30min。各管細胞再用DPBS漂洗2遍后將細胞懸 浮于0. 5mlDPBS液中。通過流式細胞儀檢測細胞表面CDllc分子及CD86 的表達情況。結果顯示不加刺激物組DC， LPS刺激24小時培養組DC， rrs-Hsp70刺激24小時培養組DC以及變性r7》-Hsp70刺激24小時培養 組DC的同型抗體對照，發生非特異結合的細胞數都很少。不加刺激物 組DC: CDllc+、 CD86+雙陽性細胞占培養細胞總數的15.0%; LPS刺激 24小時培養組DC: CDllc+、 CD86+雙陽性細胞占培養細胞總數的28. 6%; rrs-Hsp70刺激24小時培養組DC: CDllc+、 CD86+雙陽性細胞占培養細 胞總數的27%;變性rrs-Hsp70刺激24小時培養組DC: CDllc+、 CD86+雙陽性細胞占培養細胞總數的18. 7%(圖3和圖4)。
3. ELISA測定小鼠BMDC培養上清中細胞因子含量的測定
為了檢測不同組BMDC培養上清中IL-12P70和TNF-oc細胞因子含 量，我們采用了 IL-12P70 ELISA SET (BD Pharmingen/>司，貨號 555256 )和TNF-cc ELISA SET ( BD Pharmingen公司，貨號555268 ) 進行了雙夾心ELISA實驗，方法如下 3. 1標準品的準備
取小鼠細胞因子IL-12P70和TNFa標準品各一瓶，加lml無菌水， 充分混勻溶解，放置至少15min，分裝后;^-80X:備用。取7個1. 5ml 管順序標記最高濃度標準品、l:2稀釋、l:4稀釋、1: 8稀釋、1:16 稀釋、l:32稀釋、l:64稀釋；在最高濃度的標準品管內加入稀釋液， 使其與標準品最終總體積為500jal;在其余管內分別加入300|il稀釋液； 倍比稀釋取原倍標準品300pl，加入到1:2稀釋管中，充分混勻；取 1:2稀幹液300ili1,加入到1:4稀釋管中，充分混勻，依此類推，稀釋 液作為O對照。 3.2實驗步驟
包被每孔加入100 p 1用包被液稀釋的捕獲抗體(抗小鼠各細胞因 子單克隆抗體(1: 250) ， 4"C包被過夜；棄去孔中液體，PBST洗滌3次； 每孔加入200 u 1封閉液，25C孵育lh;棄去孔中液體，PBST洗滌3次；
每孔加入100 ja 1脾細胞培養上清(1: 1稀釋)以及梯度稀釋的標準 品，25TC孵育2h;每個樣本設1個復孔；棄去孔中液體，PBST洗滌3 次；每孔加100 n 1用封閉液稀釋的檢測抗體(生物素化的抗小鼠各細胞 因子單克隆抗體和鏈霉素-HRP親和素混合物，25"C孵育lh;棄去孔中 液體，PBST洗5次，每次至少持續30秒；每孔加入100 p 1 TMB顯色液， 室溫避光反應30min;每孔加50ial 2M 112304終止反應。酶標4義450 nm 讀數，與陰性對照比較0D值〉2. 1即判斷為測定樣品的OD值。結果顯 示LPS組BMDC的細胞因子IL-12P70含量較不加刺激物組BMDC明顯升 高，具有統計學意義(P〈0. 01);較煮沸變性的r7^Hsp70刺激組BMDC有所升高，具有統計學意義(P〈0. 05)。 LPS組的細胞因子TNF-ot含量 較不加刺激物組BMDC有所升高，具有統計學意義(P〈0. 05);較煮沸變 性的r7—Hsp70刺激組BMDC有所升高，具有統計學意義(P< 0. 05)。 r7，5"Hsp70組的細胞因子IL-12P70及TNF-oc含量較不加刺激物組有所 升高，具有統計學意義(P值分別為P<0. 01和P〈0. 05); r7》-Hsp70 刺激組BMDC的細胞因子IL-12P70的含量較煮沸變性的r7^Hsp70刺激 組BMDC有所升高，具有統計學意義(P〈0. 05); r7>-Hsp70組的細胞因 子IL-12P70及TNF-oc含量與LPS組比較無統計學差異(圖5和圖6)。 4. BMDC的形態觀察
分別用掃描電鏡和透射電鏡觀察同一方法培養的各組BMDC細胞的 形態。掃描電鏡下可以清晰地看到各組培養DC的表面形態。未加任何 刺激物而繼續培養1天的BMDC，表型上看胞體體積較大，細胞表面粗糙、 凹凸不平并有大量微小片狀的突起，細胞表面呈現密集的絨毛狀；LPS 刺激培養24小時的BMDC呈現出典型的成熟DC形態，即胞體變小，向 周圍伸出濃密的大量樹枝狀突起，很多突起有分叉出現，并且細胞之間 的突起有的已形成連接；r7^Hsp70刺激培養24小時的BMDC也呈現出 成熟DC的典型形態；變性r7—Hsp70刺激培養24小時BMDC細胞突起 則相對少些，說明r7>-Hsp70煮沸10min后已部分變性，影響了其對DC 的刺激作用(圖7 )。透射電鏡下可以更清晰地看到各組培養BMDC的內 部典型形態，比如細胞核、線粒體等細胞器，而且成熟DC的樹枝狀突 起更為清晰，并且相鄰的成熟DC之間的突起已經形成了連接(圖8)。
以上實驗結果提示r7—Hsp70刺激了體外培養的小鼠BMDC分化成 熟。r7^Hsp70可能通過誘導BMDC的成熟，從而激活了小鼠產生抗擊旋 毛蟲感染的免疫保護作用，其可以作為抗旋毛蟲感染的疫苗候選分子。
上文列出的所有專利、專利申請和出版物均全文引入本文作為參 考文獻。
本發明的范圍不只限于所述的特定實施方案，這些方案只是作為
27本發明個別方面的單一舉例說明給出的。功能等同的組合物和方法均 在本發明的范圍之內。確實，除了本文所示的和描述的內容外，對本
見的。這些改動將落入本發明待批權利要求的范圍之內。
核苷酸序列(SEQ ID N0: 1)(加下劃線的堿基說明開放閱讀框(SEQ ID NO: 1第208-1881位)的起始密碼子、終止密碼子位置)TTTTTTGAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
開放閱讀框內的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2):
TNGDTHLGGEDFDQRVMEYFMKLYKKKTGKDIRKDNRAVQKLRREVEKGKRVLSTQHQTKIEIESFFDGEDFSE
KQQKKELEDIVQPIIGKLYKNAGEGAPPPPPDAEEKDEL序列表
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ggcacgagcggUt tgaccttggaacaacaUt tct tgtgttggggttttcaaaaatggt60
cgtgttgaaattattgccaatgatcagggcaatcgaatcaccccgtcgtatgtagctttt120
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aUt tcagcaccgctgccgacaatcagcccaeggtcactattcaagttttegaaggegaa1320
cgaccaatgaccatcttcttgggaaattegatetgaceggcatacctccg1380
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cacgtcaccgccgaagacaaaggtaccggcaacsiagaacaagatcaccattaccaatgac1500
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tttgaaaaaaaagaaaaaaaaaaaaaaaaa2152
<210> 2 <211> 557 <212> PRT
30<213> 旋毛形線蟲(Trichinella spiralis ) <400> 2
Arg Glu Trp Ser Asp Lys Ser Leu
Met Val Gly 1
Met Trp Pro
Uu Thr Val 35
Ala Met Val 50
Lys Glu Val 65
Ala Gin Arg
Val Yal Arg
Leu Asp Lys 115
Gly Gly Thr
130 Glu Val Uu 145
Asp Gin Arg
Phe 20 Ser
Leu
Lys
Gin
Ala
Gly
Leu
Asn
Ala 85 lie
lie 100
Lys Glu
Phe Ser
Val
Asp Thr
Val
Glu
Lys
Ala 70 Thr
Asn
Gly
Val
Val
Lys
Met 55 Val
Lys
Glu
Glu
Thr
Glu
Lys 40 Lys
Val
Asp
Pro
Gin Ala Asp Arg Lys 10 15
Lys Ser Ser Lys Pro Asn Val Gin
25 30
Leu Phe Thr Pro Glu Glu lie Ser 45
lie Ala Glu Ala Tyr
Glu Thr Ala
Lys
120 Leu Eeu 135
Gly Asp Thr
Thr
105 Asn lie
Val Pro 75
Gly Thr lie
90 Ala Ala
60 Ala Tyr
Asn 150
Glu Tyr Phe Met
Thr His Lys
Leu lie
Ala Val
Ala lie Tyr
Phe Gly Ala
Leu Gly Asn Asp
80
Leu Asn 95
Tyr Gly 110
Asp Leu Gly
I>eu
155 Leu Ty
Asp
140 Gly Gly
125 Asn Gly
Glu Met Asp
Asp
235 Ala Gly 250 Gly Ser Thr
Met
165 170 Gly Lys Asp lie Arg Lys Asp Asn Arg Ala Val Gin 180 185 Lys Gly Lys Arg Val Uu Ser Thr Gin 200
Glu Ser Phe Phe Asp Gly Glu Asp 215
Lys Phe Glu Glu Leu Asn 230
Val Lys Gin Val乙eu Asp 245
Asp Val His Glu Val Val Leu Val Gly 260 265 Leu Leu Lys Glu Phe Phe Asn Gly Lys 280
Pro Asp Glu Ala Val Ala 295
Ser Gly Glu Glu Asp Thr 310
Leu Thr Leu Gly lie Glu
325 330 Lys Leu lie Pro Arg Asn Thr Val Val Pro Thr
340 345 Phe Ser Thr Ala Ala Asp Asn Gin Pro Thr Val
355 360 Glu Gly Glu Arg Pro Met Thr Lys Asp Asn His
370 375 Asp Uu Thr Gly lie Pro Pro Ala Pro Arg Gly 385 390 395
Glu Val Glu 195
lie Glu lie
210 Thr Arg Ala 225
Leu Ser Pro
Val Gin Gin 275
Gly lie Asn
290 Gly Val lie 305
Val Asn Pro
Lys Lys His
Glu Lys Leu
Val Phe Asp Phe
1
Lys Thr
175 Arg Arg
160
190 Gin Thr
205
Phe Ser Glu
220 Leu Phe Arg
Leu Lys Arg lie
Thr Ser Lys
Lys Leu Thr
240
Asp 255 Pro Lys
Tyr Gly Ala
300
Gly Asp Leu Val 315
Thr Val Gly Gly
270
Glu Pro Ser Arg 285
Ala Val Gin Ala
Leu Leu Asp
320
Val Met Thr 335
Lys Lys Ser Gin lie 350
Thr lie Gin Val Phe 365
Leu Leu Gly Lys Phe 380
Val Pro Gin lie Glu
400Val Thr Phe Asp lie Asp Val Asn Gly lie Leu
405 410 Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Asn Lys lie Thr
420 425 Asn Arg Leu Ser Pro Glu Asp lie Asp Arg Met
435 440 Lys Tyr Ala Glu Glu Asp Lys Lys Leu Lys Glu
450 455 Asn Glu Leu Glu Ala Leu Ala Tyr Ser 465 470 Ser Glu Lys Leu Gly Gly Lys Leu Ser 485
Glu Glu Ala Val Glu Glu Lys lie Lys
500 505 Ala Ser Thr Asp Asp Phe Lys Gin Gin Lys Lys
515 520 Val Gin Pro lie lie Gly Lys Leu Tyr Lys Asn
530 535 Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Glu Glu Lys Asp 545 550
His Val Thr Ala Glu 415
lie Thr Asn Asp His 430
lie Asn Asp Ala Glu 445
Arg Val Asp Ala Lys
Leu Lys 475
Ala Asp Glu
490 Trp Uu Glu
Glu
Ala
460 Ser Gin
Lys Ser Leu
lie Ser Asn
Ala Gly Lys
Asp
480
Val 495 Ala Glu 510 Glu Asp lie 525
Gly Glu Gly Ala
540 Glu Leu
555
3權利要求
1、一種分離的多核苷酸分子，其包含從如下組核苷酸序列中選擇的核苷酸序列(A)與SEQ ID NO1所示序列或SEQ ID NO1第208-1881位核苷酸所示序列至少70％、優選至少80％、更優選至少90％、尤其是至少95％或98％同源的核苷酸序列；(B)與SEQ ID NO1所示序列或SEQ ID NO1第208-1881位核苷酸所示序列在中等嚴格雜交條件、優選高嚴格雜交條件下可發生雜交的核苷酸序列；(C)與SEQ ID NO1或SEQ ID NO1第208-1881位核苷酸所示序列編碼相同序列的蛋白質、但因遺傳密碼的簡并性而在序列上有所不同的核苷酸序列；(D)編碼如下氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO2所示序列，或者，由于一或多個(例如1-25個、1-20個，1-15個，1-10個，1-5個，1-3個)氨基酸殘基的替代、缺失和/或插入而與SEQ ID NO2所示序列有所不同的氨基酸序列；(E)SEQ ID NO1所示序列或SEQ ID NO1第208-1881位核苷酸所示序列；(F)(A)、(B)、(C)、(D)或(E)所述核苷酸序列的片段；和(G)與(A)、(B)、(C)、(D)、(E)或(F)所述核苷酸序列互補的核苷酸序列。
2、 如權利要求1所述的多核苷酸分子，特征在于具有SEQ ID NO: 1 或SEQ ID NO: l第208-1881位核苷酸所示核苷酸序列。
3、 一種分離的多肽，其包含從如下組氨基酸序列中選擇的氨基酸 序列(A) 與SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列至少70%、優選至少80%、 更優選至少90%、尤其是至少95%或98%同源的氨基酸序列；(B) 由于一或多個(例如1-25個、l-20個，1-15個，1-10個，1-5個，l-3個)氨基酸殘基的取代、缺失和/或插入而與SEQID N0:2所示序列有所不同的氨基酸序列；(C) SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列；(D) (A)或(B)或(C)所述氨基酸序列的免疫原性片段；和(E) 權利要求1或2的多核苷酸分子編碼的氨基酸序列。
4、 權利要求3的分離的多肽，其包含SEQ IDN0:2所示氨基酸序列。
5、 一種核酸構建體或者重組表達載體，其包含權利要求1或2所 述多核苷酸分子。
6、 含有權利要求5的核酸構建體或者重組表達栽體的宿主細胞。
7、 一種生產多肽的方法，包括在能使所述多肽表達的條件下培養 權利要求6所述的宿主細胞和回收所表達的多肽。
8、 一種抗體，其能特異性結合權利要求3或4所述多肽。
9、 一種用于預防或治療動物，尤其是牲畜和人的旋毛蟲感染的藥 物組合物，所述的藥物組合物含有權利要求1或2所述多核苷酸分子 權利要求3或4所述多肽或者權利要求5的核酸構建體或者重組表達 載體。
10、 一種用于體外診斷動物，尤其是牲畜和人中的旋毛蟲感染的 診斷試劑盒，其中含有權利要求1或2所述多核苷酸分子或者權利要 求3或4所述多肽或者權利要求8所述抗體。
11、 權利要求1或2所述多核苷酸分子或者權利要求3或4所述 多肽或者權利要求5的核酸構建體或者重組表達載體或者權利要求8 所述抗體在制備用于預防或治療人畜旋毛蟲感染的藥物中的用途。
12、 一種寡核苷酸，其中含有SEQ IDN0: 1所示核苷酸序列或SEQ ID NO: l第208-1881位核苷酸所示序列或者其互補序列中的至少15 個、優選至少25個、更優選至少50個核苷酸或者其相似序列，所述 相似序列能夠與SEQ ID N0:1所示核苷酸序列或SEQ ID NO: 1第 208-1881位核苷酸所示序列或者其互補序列在高度嚴格雜交條件下發 生雜交。
13. 權利要求1或2所述多核苷酸分子或者權利要求3或4所述 多肽或者權利要求8所述抗體或者權利要求12的寡核苷酸在制備用于 診斷動物，尤其是牲畜和人的旋毛蟲感染的診斷試劑中的用途。
14. 一種融合蛋白，其包含權利要求3或4所述多肽及另一融合對象。
15. 權利要求14的融合蛋白，其中所述融合對象是(3-半乳糖苷酶， 谷胱苷肽-S-轉移酶或多組氨酸。
16. 權利要求1或2所述多核苷酸分子或者權利要求3或4所述 多肽或者權利要求5的核酸構建體或者重組表達載體用于刺激體外樹 突狀細胞分化成熟的用途，或者在制備用于刺激樹突狀細胞分化成熟的 藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及旋毛蟲新抗原基因70KDa熱休克蛋白基因，含有該基因的載體的構建及原核表達載體，以及所表達的蛋白。本發明還涉及所述基因及編碼的蛋白及其應用。旋毛蟲70KDa熱休克蛋白基因重組蛋白免疫動物后產生高滴度的抗體并對攻擊感染產生有效的免疫保護性。
文檔編號C12N15/12GK101481691SQ20081013279
公開日2009年7月15日 申請日期2008年7月14日 優先權日2008年4月30日
發明者靜 楊, 楊雅平, 王少華, 諸欣平, 冉 郝 申請人:首都醫科大學