專利名稱：一種腦功能改善藥物、其制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種腦功能改善藥物、其制備方法及其用途，具體地說，涉及一種由從除人以外的哺乳動物肌肉組織中提取的活性多肽、次黃嘌呤和從除人以外的哺乳動物腦組織中提取的神經節苷脂、其制備方法及其在制備治療心、腦部疾病引起的功能障礙方面的藥物用途。
背景技術：
神經節苷脂是一種含唾液酸的鞘糖脂類，其一個或多個末端糖基是N-乙酰基神經酸即唾液酸。腦灰質的膜脂中含神經節苷脂高達6％以上，在神經的傳導中起著重要作用。
神經節苷脂的臨床藥用價值有用于各種原因引起的中樞神經系統結構損害的功能恢復；用于腦血管意外創傷及創傷后的中樞神經系統后遺癥的治療；用于缺血性和出血性腦病變的治療。
目前上市的神經節苷脂類藥物有阿根廷生產的施捷因，為單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉鹽注射液，其由基因工程方法生產，為單一組分，不含活性多肽，不太利于吸收和利用。
意大利Fidia公司從牛腦組織中提取的單唾液酸四己糖基神經節苷脂(GM1)注射液(商品名Sygen)已于20世紀90年代正式在我國銷售。
中國專利申請93112578公開了一種腦保健營養品、其制造方法和用途，該保健品為含有神經節苷脂的營養液，神經節苷脂含量至少每毫升含有0.5mg，其制造方法主要使用水、氯仿、酒精提取，其用途在于增強人腦的學習、記憶功能，促進人腦的正常發育和腦損傷后的恢復。
中國專利申請95111569公開了一種含神經節苷脂為主的糖脂類物質的生產方法，包括粉碎、溶劑提取、過濾和濃縮，其特征是將干凈的動物腦經粉碎，加入40-100％含量的酒精和石油醚提取，或者在干凈的動物腦中加入40～100％含量的酒精后粉碎，加入石油醚提取，上述提取物過濾，清液濃縮，所述的動物腦、酒精和石油醚的重量比是1∶1～20∶0.5～8。
中國專利申請00133077公開了一種單唾液酸四己糖神經節苷脂的高純度制備工藝。
生物體內，小分子多肽、氨基酸廣泛參與各種生化過程，包括各種物質的合成、物質的轉運、信息物資的生成與傳遞，同時為所有的生命活動提供能量，尤其是對腦組織更為重要。次黃嘌呤是參與人體生命活動的重要物質。次黃嘌呤與小分子多肽、氨基酸配合，有促進機體代謝作用，對心血管系統疾病有改善血液循環障礙、降低血管阻力、增加心肌利用氧等作用，能促進造血系統活動增強，白血球數量增多，同時有增加血管彈性、防止血管硬化作用。
從國內外文獻報道的提取神經節苷脂的方法看，多采用不同比例有機溶劑抽提總脂，然后用分配萃取方法提取神經節苷脂混合物，再用離子交換層析、分子排阻及硅膠層析法分離神經節苷脂。
有報道，將組織勻漿用氯仿-甲醇溶液抽提、離心，上清液加水萃取、蒸干得粗脂。將粗脂溶于甲醇，過陰離子交換柱，收集神經節苷脂。
另有報道，將組織加入氯仿-甲醇溶液抽提，抽提液濃縮、旋轉蒸干得總脂。將總脂加入異丙醚-正丁醇溶劑溶解后用氯化納溶液萃取、離心，水相為酸性鞘糖脂提取物。凍干粗脂過Sepbadex G-50柱層析，收集混合神經節苷脂組分凍干。
目前，腦組織提取物類如腦復素注射液、活腦素注射液、腦組織注射液、熱藏大腦注射液、腦多肽注射液等，均為由各類腦組織蛋白水解制成，含神經組織活性多肽，但神經節苷脂檢測不出，。
專利申請01126465公開了一種治療神經系統疾病的藥物和保健品，含有神經節苷脂和銀杏葉提取物，提供了神經節苷脂作為組合物組分，與其它組分協同發揮作用的藥物組合物。
專利申請CN03137463.8公開了一種含有從除人以外的哺乳動物肌肉組織中提取的活性多肽和從除人以外的哺乳動物腦組織中提取的神經節苷脂的藥物組合物及其制備方法，根據該專利生產的產品在臨床上獲得了良好的效果，但由于其提取多肽的方法過于對當時工業化大生產適用，采用了霉菌蛋白酶水解，提取方法略粗糙，上市的部分批次產品質量不穩定，在臨床上也有不良反應出現。
目前已公開的腦提取液中的神經節苷脂的含量均較低，而且雖然也有神經節苷脂作為組合物組分，與其它組分協同發揮作用的藥物組合物的公開報道，但仍未有其與動物其他機體組織協同發揮作用的相關報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種腦功能改善藥物。
本發明的另一目的在于提供該藥物組合物的制備方法。
本發明的另一目的是提供藥物組合物制備治療心肌或腦部疾病引起的功能障礙方面藥物的用途。
本發明還涉及藥物組合物在制備治療老年性癡呆、腦血管意外創傷及創傷后的中樞神經系統后遺癥、冠心病、心絞痛、心肌疾病、腦血管病、以及缺血性和出血性腦病變治療藥物上的用途。
所述的腦功能改善藥物由多肽、次黃嘌呤和神經節苷脂組配而成，多肽和次黃嘌呤由從除人以外的哺乳動物肌肉組織中提取得到，神經節苷脂由從除人以外的哺乳動物腦組織中提取得到；神經節苷脂以其中含有的唾液酸計算含量，多肽為唾液酸含量的6.1～100倍，優選50～80倍，更優選為60～70倍，最優選為64倍；次黃嘌呤為唾液酸含量的0.1～100倍，優選0.5～20倍，更優選2～10倍，最優選2.5倍。
上述多肽分子量為5000-10000。
本發明所述腦功能改善藥物由動物肌肉組織提取物和腦組織提取物組配得到，腦組織提取物中神經節苷脂有多種形式單唾液酸四己糖基神經節苷脂(GM1)、雙唾液酸四己糖基神經節苷脂、三唾液酸四己糖基神經節苷脂等多種神經節苷脂。
本發明所述的藥物組合物與磺基水楊酸溶液反應無渾濁，茚三酮試液反應為陽性，與丙酮反應產生白色混濁；采用薄層色譜法，以單一神經節苷脂GM1為對照品，間苯二酚溶液顯色，譜圖顯示色譜圖主斑點的顏色及位置與對照品色譜圖的斑點一致。
哺乳動物中樞神經系統中的神經節苷脂含量豐富，例如可從豬、狗、牛、羊、鹿、馬、兔等新鮮腦組織中提取含有神經節苷脂的物質，上述哺乳動物的肌肉組織也可以提取活性多肽和次黃嘌呤。
上述哺乳動物肌肉組織優選為兔肌肉組織。
上述哺乳動物腦組織優選為牛腦組織。
在傳統治療中，兔肉組織用來治療心肌疾病已經有比較顯著的療效，而且從生產過程的可操作性和有效利用率方面考慮，多選用兔肉來提取活性多肽、次黃嘌呤；基于神經節苷脂的提取量考慮。本發明優選豬腦來提取神經節苷脂。
因此，從生產成本、生產工藝、產品質量穩定性、臨床療效等因素考慮，優選豬腦組織和兔肉組織作為生產原料。
上述動物肌肉組織可以是動物的任意部位肌肉。
一種制備所述的藥物組合物的方法，其特征在于包括如下步驟(1)肌肉提取液的制備D)將動物任意部位肌肉組織加水勻漿后冷凍，融化后加熱離心過濾除渣，保留濾液；E)濾液調節pH值保溫酶解，調節pH值呈酸性，加熱離心除沉淀，過濾除雜，保留濾液；F)將濾液調節呈中性，加熱離心除沉淀，上清液過濾，濾液用超濾膜超濾，超濾液為肌肉提取液；(2)神經節苷脂提取液的制備E)將動物腦組織加溶劑勻漿后過濾，濾渣用溶劑抽提提取，提取液與濾液合并后蒸干，得干燥物；F)將干燥物溶于溶劑中，向其中加入鹽的水溶液提取分液；G)分液的上、下層液相分別用至少兩種溶劑的混合水溶液洗滌，合并洗滌后的上層液相部分，減壓濃縮，然后用預冷丙酮沉淀，干燥后得干燥物；H)將干燥物溶于至少兩種溶劑的混合水溶液，層析柱分離，洗脫液濃縮后用預冷丙酮沉淀、分離，得到的沉淀經后處理，得到神經節苷脂提取液；(3)將上述提取液混合，使混合液中多肽的重量為神經節苷脂中唾液酸重量的6.1～100倍，使混合液中次黃嘌呤重量為神經節苷脂中唾液酸重量的0.1～100倍，經后處理，得成品制劑。
其中，肌肉提取液的制備過程中，加0.6～2.5倍重量水勻漿，勻漿后冷凍。
酶解采用胰蛋白酶，控制pH7.5～8.5條件下加熱保溫水解。
水解液經兩次調節pH值加熱離心過濾后，濾液用截留分子量為5000-10000的超濾膜超濾上，得多肽含量為0.5～15mg/ml，次黃嘌呤含量為0.05～2mg/ml；的肌肉提取液。
在腦提取液的制備過程中，勻漿所用溶劑為丙酮，濾渣用氯仿-甲醇(1～20∶1～20，V/V)的混合液充分抽提，合并的濾液用旋轉蒸發器蒸干，得干燥物。
溶解干燥物的溶劑為體積比為2～30.1～20的鹵代烴和醇的混合溶劑，鹽的水溶液優選KCl水溶液。
分液的上、下層液相分別用鹵代烴和醇的混合水溶液洗滌，減壓濃縮至初始體積的1/8～1/2，然后用低于0℃預冷丙酮沉淀。
將干燥物溶于鹵代烴和醇的混合水溶液，用鹵代烴和醇的混合水溶液梯度洗脫柱層析分離。
更具體地說，本發明的制備方法包括(1)肌肉提取液的制備D)將動物任意部位肌肉組織加0.6～2.5倍重量水勻漿，勻漿后冷凍，融化后加熱70～90℃，保溫15～
30分鐘，降溫后離心，離心條件為3000～4000轉/分，離心時間為15～30分鐘，保留上清液，上清液過濾，得濾液；E)在濾液中加入胰蛋白酶保溫水解，胰蛋白酶濃度為0.03～0.5％，水解條件為pH＝7.5～8.5，保溫35～50℃，保溫時間為0.5～4小時；酶解后，酶解液調pH值為3.5-4.5，加熱至80-95℃，保持15-30分鐘，降溫后離心，離心條件為3000～4000轉/分，離心時間為15～30分鐘，保留上清液，上清液過濾得濾液。
F)濾液調pH值為6.5-7.5，加熱至80-95℃，保持15-30分鐘，降溫后離心，離心條件為3000～4000轉/分，離心時間為15～30分鐘，保留上清液，上清液過濾，濾液用截留分子量為5000-10000的超濾膜超濾，超濾液為肌肉提取液，其中多肽含量為0.5～15mg/ml，其中次黃嘌呤含量為0.05～2mg/ml；(2)神經節苷脂提取液的制備A)將動物腦組織加3～4倍重量的丙酮勻漿后過濾，保留濾渣和濾液；濾渣用3～5倍重量的氯仿-甲醇(1～20∶1～20，V/V)混合液抽提三次，分別過濾；將上述濾液合并后在旋轉蒸發器中37℃減壓蒸干，得干燥物；B)干燥物溶于氯仿-甲醇(2～30∶1～20，V/V)混合液，然后向混合液中加入1/20～1/80體積的0.1mol/L的KCl溶液，室溫下攪拌1小時，靜置8～16小時后分液；C)分液后，上層液相用等體積的氯仿-甲醇-水(50～150∶5～40∶0.5～5，V/V/V)混合液洗滌，下層液相用等體積的氯仿-甲醇-水(1～10∶30～80∶35～85，V/V/V)混合液洗滌，合并兩次洗滌后的上層液相部分，在37℃減壓濃縮至初始體積的1/8～1/2，然后用-20℃預冷丙酮沉淀，真空干燥，得干燥物；D)將干燥物溶于的氯仿-甲醇-水(30～80∶10～50∶1～90，V/V/V)混合液，制成1～5％濃度的溶液，加入層析柱，調整流速5mL/分鐘，用氯仿-甲醇-水(60～90∶15～40∶1～10，V/V/V)混合液10～30L洗脫，然后改用氯仿-甲醇-水(40～80∶20～50∶5～15，V/V/V)混合液8～15L洗脫，收集后洗脫液6～12L，減壓濃縮后用3～5倍體積的-20℃預冷丙酮沉淀，-20℃靜止2小時后傾去上層清液，余下部分在1000轉/分下離心10分鐘，得到的沉淀用適量丙酮洗2次，真空干燥，將干燥物溶于水得神經節苷脂提取液，濃度為每1ml含神經節苷脂以唾液酸計0.01～0.5mg腦提取液腦提取液；(3)將上述提取液混合，使混合液中多肽的重量為神經節苷脂中唾液酸重量的6.1～100倍，使混合液中次黃嘌呤重量為神經節苷脂中唾液酸重量的0.1～100倍，經后處理，得成品制劑。
更為優選的，本發明的制備方法包括如下步驟(1)肌肉提取液的制備A)將動物任意部位肌肉組織加1～1.5倍重量水勻漿，勻漿后冷凍，融化后加熱75～85℃，保溫20分鐘，降溫后離心，離心條件為4000轉/分，離心時間為20～30分鐘，保留上清液，上清液過濾，得濾液；B)在濾液中加入胰蛋白酶保溫水解，胰蛋白酶濃度為0.03～0.5％，水解條件為pH＝7.8～8.2，保溫37～42℃，保溫時間為1.5～3小時；酶解后，酶解液調pH值為3.8-4.2，加熱至80-85℃，保持20分鐘，降溫后離心，離心條件為4000轉/分，離心時間為20～30分鐘，保留上清液，上清液過濾得濾液。
C)濾液調pH值為6.8-7.2，加熱至80-85℃，保持20分鐘，降溫后離心，離心條件為4000轉/分，離心時間為20～30分鐘，保留上清液，上清液過濾，濾液用截留分子量為8000的超濾膜超濾，超濾液為肌肉提取液，其中多肽含量為0.5～15mg/ml，其中次黃嘌呤含量為0.05～2mg/ml；(2)神經節苷脂提取液的制備A)將動物腦組織加3～4倍重量的丙酮勻漿后過濾，保留濾渣和濾液；濾渣用3～5倍重量的氯仿-甲醇(1∶1，V/V)混合液抽提三次，分別過濾；將上述濾液合并后在旋轉蒸發器中37℃減壓蒸干，得干燥物；B)干燥物溶于氯仿-甲醇(2∶1，V/V)混合液，然后向混合液中加入1/80體積的0.1mol/L的KCl溶液，室溫下攪拌1小時，靜置8～16小時后分液；C)分液后，上層液相用等體積的氯仿-甲醇-水(86∶14∶1，V/V/V)混合液洗滌，下層液相用等體積的氯仿-甲醇-水(3∶48∶47，V/V/V)混合液洗滌，合并兩次洗滌后的上層液相部分，在37℃減壓濃縮至初始體積的1/4，然后用-20℃預冷丙酮沉淀，真空干燥，得干燥物；D)將干燥物溶于的氯仿-甲醇-水(65∶25∶4，V/V/V)混合液，制成2.5％濃度的溶液，加入層析柱，調整流速5mL/分鐘，用氯仿-甲醇-水(65∶25∶4，V/V/V)混合液20L洗脫，然后改用氯仿-甲醇-水(60∶35∶8，V/V/V)混合液12L洗脫，收集后洗脫液10L，減壓濃縮后用4倍體積的-20℃預冷丙酮沉淀，-20℃靜止2小時后傾去上層清液，余下部分在1000轉/分下離心10分鐘，得到的沉淀用適量丙酮洗2次，真空干燥，將干燥物溶于水得神經節苷脂提取液，濃度為每1ml含神經節苷脂以唾液酸計0.01～0.5mg腦提取液腦提取液；(3)將上述提取液混合，使混合液中多肽的重量為神經節苷脂中唾液酸重量的6.1～100倍，使混合液中次黃嘌呤重量為神經節苷脂中唾液酸重量的0.1～100倍，經后處理，得成品制劑。
上述步驟(1)的B)中，使用的胰蛋白酶為常規市售產品，為了使本發明生產工藝、產品質量穩定，應盡可能由固定生產商提供；酶解pH值優選為7.8～8.2，酶解溫度優選為37～42℃；為保持溫度穩定，可采取夾層水浴保溫的方法。保溫結束后應調節pH3.8～4.2后再加熱。
上述步驟(1)的C)中，超濾膜優選為截留分子量為6000-10000的超濾膜，更優選截留分子量為8000的超濾膜。使用的超濾膜為市售產品，其生產商應為行業認可的生產單位，使用的濾膜型號與尺寸可根據具體的生產量、選用的超濾器尺寸來確定。
上述步驟(2)的B)中，氯仿-甲醇混合液加入量以完全溶解干燥物為準。
上述步驟(2)中丙酮的加入量以不再有沉淀析出為準。
上述步驟(2)的D)中，所用的層析柱通過如下過程制備將硅膠顆粒過篩選60～80目的均勻顆粒，在110℃下干燥1小時，使其活化，然后用5倍柱體積的氯仿-甲醇(5～20∶0.5～3，V/V)混合液作為載體，將硅膠調成糊狀，使其均勻分散后裝入80×10cm的層析柱，即得。其中優選的氯仿-甲醇混合比為9∶1(V/V)。
本發明的減壓蒸發的壓力控制在0.04～0.08MPa左右。
上述步驟(3)中成品制劑的劑型為藥劑學上可接受的劑型，比如片劑、膠囊、口服液、小容量注射劑、大輸液或凍干粉針等，優選為小容量注射劑、大輸液或凍干粉針，最優選為小容量注射劑。因此，所述步驟(3)所述的后處理可以是按照制備藥劑學上可接受的劑型的常規方法進行。
本發明的制備方法采用硅膠柱一步純化得混合神經節苷脂，先減壓濃縮后用預冷丙酮沉淀，真空干燥后溶于蒸餾水，作為神經節苷脂提取液備用，使制得的提取物有效成分收率較高，組分更合理，同時也節省了操作時間，降低了原輔料消耗。神經節苷脂具有感知、傳遞細胞內外信息的功能，參與細胞的識別、粘著、生長、分化以及細胞信息傳遞等過程。作為某些神經遞質、激素、病毒和干擾素的受體，具有參與神經組織的分化、再生、修復，與神經沖動的傳導、細胞間的識別作用。能加速損傷的神經組織的再生修復，促進神經支配功能恢復，減低興奮性氨基酸的釋放，從而減輕細胞毒性和血管水腫，是腦血管意外治療的良藥，用于治療老年性癡呆及其它神經性疾病取得良好療效。
次黃嘌呤是參與人體生命活動的重要物質。次黃嘌呤與小分子多肽、氨基酸配合，有促進機體代謝作用，對心血管系統疾病有改善血液循環障礙、降低血管阻力、增加心肌利用氧等作用，能促進造血系統活動增強，白血球數量增多，同時有增加血管彈性、防止血管硬化作用。
本發明所述的藥物組合物中含有活性多肽、次黃嘌呤和多種神經節苷脂，同時本發明藥物組合物中含有活性多肽、次黃嘌呤和多種神經節苷脂利于吸收和利用，能促進心、腦組織的新陳代謝，參與腦組織神經元的生長、分化和再生過程，改善心腦血液循環和心腦代謝功能，可應用于制備治療心肌和腦部疾病引起的功能障礙藥物方面，可用于治療心肌梗死、癡呆、腦外傷、腦水腫等癥；本發明藥物組合物作為制備治療老年性癡呆、腦血管意外創傷及創傷后的中樞神經系統后遺癥、冠心病、心絞痛、心肌疾病、腦血管病、以及缺血性和出血性腦病變等藥物中的應用。
本發明研究人員進行大量實驗發現，當該藥物組合物中活性多肽重量為神經節苷脂中唾液酸的64倍時，當該藥物組合物中次黃嘌呤重量為神經節苷脂中唾液酸2.5倍時，三者的協同作用最好，更利于人體的吸收和利用。本發明優選藥物組合物注射液的常規用量為規格2ml∶6.4mg(多肽)∶100μg(唾液酸)∶0.25mg(次黃嘌呤)；5ml∶16.0mg(多肽)∶250μg(唾液酸)∶0.625mg(次黃嘌呤)；10ml∶32.0mg(多肽)∶500μg(唾液酸)∶1.25mg(次黃嘌呤)；肌肉注射2～4ml/次，2次/日或遵醫囑；靜脈滴注10-20ml/次，加入300ml 0.9％氯化鈉注射液或5％葡萄糖注射液，緩慢滴注(每分鐘2ml)，1次/日，兩周為一療程。
本發明所述的藥物組合物含有營養肌體組織特別是心腦組織的活性物質，采用神經節苷脂與多肽及次黃嘌呤的協同作用，達到了最佳的臨床效果。
本發明藥物組合物注射液含有營養肌體組織特別是心腦組織的活性物質，包括活性多肽、神經節苷脂、次黃嘌呤等物質，能促進心、腦組織的新陳代謝，參與腦組織神經元的生長、分化和再生過程，改善心腦血液循環和心腦代謝功能，可用于治療心肌和腦部疾病引起的功能障礙；用于治療心肌梗死、癡呆、腦外傷、腦水腫等癥；本發明藥物組合物在制備治療老年性癡呆、腦血管意外創傷及創傷后的中樞神經系統后遺癥、冠心病、心絞痛、心肌疾病、腦血管病、以及缺血性和出血性腦病變治療藥物上的用途。
具體實施例方式
實施例1步驟(1)取新鮮兔肌肉10kg，加10L水勻漿，勻漿后冷凍，融化后加熱75～80℃，保溫20分鐘，降溫后離心，離心條件為4000轉/分，離心時間為20分鐘，保留上清液，上清液過濾，得濾液；在濾液中加入胰蛋白酶保溫水解，胰蛋白酶濃度為0.2％，水解條件為pH＝7.8～8.2，保溫37～42℃，保溫時間為2小時；酶解后，酶解液調pH值為3.8-4.2，加熱至80-85℃，保持20分鐘，降溫后離心，離心條件為4000轉/分，離心時間為20分鐘，保留上清液，上清液過濾得濾液。
濾液調pH值為6.8-7.2，加熱至80-85℃，保持20分鐘，降溫后離心，離心條件為4000轉/分，離心時間為20分鐘，保留上清液，上清液過濾，濾液用截留分子量為8000的超濾膜超濾，超濾液為肌肉提取液，濾液減壓濃縮至800ml，其中多肽含量為5mg/ml，其中次黃嘌呤含量為0.2mg/ml；步驟(2)取10kg新鮮豬腦用40L丙酮勻漿，勻漿液用濾紙過濾，得濾渣2500g，濾渣用10L氯仿-甲醇(1∶1)混合液抽提三次，分別過濾后合并濾液，使用旋轉蒸發器，在37℃減壓蒸干，得干燥物1.25g。干燥物用20L氯仿-甲醇混合液(2∶1，V/V)溶解，加入250ml的0.1mol/LKCl溶液。室溫攪拌1小時，轉移到分液漏斗中靜置8小時。分液后，上相用等體積的氯仿-甲醇-水(86∶14∶1，V/V/V)洗1次；下相用等體積的氯仿-甲醇-水(3∶48∶47，V/V/V)洗1次；合并2次上相于37℃減壓濃縮至約5L，-20℃預冷丙酮沉淀，真空干燥。
層析柱通過如下過程制備將硅膠顆粒過篩選80目的均勻顆粒，在110℃下干燥1小時，使其活化，然后用5倍柱體積的氯仿-甲醇(9∶1，V/V)混合液作為載體，將硅膠調成糊狀，使其均勻分散后裝入80×10cm的層析柱，即可。
將前述真空干燥物1.2g溶于氯仿-甲醇-水(65∶25∶4，V/V/V)50ml加入層析柱，調整流速5ml/分鐘，用氯仿-甲醇-水(65∶25∶4，V/V/V)20L溶液洗脫，然后改用氯仿-甲醇-水(60∶35∶8)12L洗脫，收集后洗脫液10L，減壓濃縮后用40L的-20℃預冷丙酮沉淀，-20℃靜止2小時，傾去上層清液，離心10分鐘(1000rpm)，沉淀用適量丙酮洗2次，沉淀真空干燥過夜。
將1.2g干燥物溶于1200ml注射用水，作為神經節苷脂提取液備用，濃度為每1ml含神經節苷脂以唾液酸計1mg/ml。
步驟(3)將兔肌肉提取液1280ml和豬腦神經節苷脂提取液100ml混合，加注射用水到2L，無菌過濾后灌裝成2ml/支，高壓滅菌，包裝入庫，每支含有6.4mg多肽、100μg唾液酸、0.25mg次黃嘌呤。
實施例2步驟(1)取新鮮鹿肌肉肌肉10kg，加16L水勻漿，勻漿后冷凍，融化后加熱75～80℃，保溫25分鐘，降溫后離心，離心條件為3500轉/分，離心時間為30分鐘，保留上清液，上清液過濾，得濾液；在濾液中加入胰蛋白酶保溫水解，胰蛋白酶濃度為0.8％，水解條件為pH＝7.8～8.2，保溫39～45℃，保溫時間為3小時；酶解后，酶解液調pH值為3.9-4.1，加熱至80℃，保持15分鐘，降溫后離心，離心條件為4000轉/分，離心時間為30分鐘，保留上清液，上清液過濾得濾液。
濾液調pH值為6.9～7.1，加熱至85℃，保持20分鐘，降溫后離心，離心條件為4000轉/分，離心時間為30分鐘，保留上清液，上清液過濾，濾液用截留分子量為10000的超濾膜超濾，超濾液為肌肉提取液，濾液減壓濃縮至800ml，其中多肽含量為8mg/ml，其中次黃嘌呤含量為0.5mg/ml；步驟(2)取10kg新鮮牛腦用35L丙酮勻漿，勻漿液用濾紙過濾，得濾渣2500g，濾渣用7.5L氯仿-甲醇(5∶1)混合液抽提三次，分別過濾后合并濾液，使用旋轉蒸發器，在37℃減壓蒸干，得干燥物1.25g。干燥物用20L氯仿-甲醇混合液(10∶1，V/V)溶解，加入1000ml的0.1mol/LKCl溶液。室溫攪拌1小時，轉移到分液漏斗中靜置10小時。分液后，上相用等體積的氯仿-甲醇-水(50∶10∶0.5，V/V/V)洗1次；下相用等體積的氯仿-甲醇-水(1∶30∶35，V/V/V)洗1次；合并2次上相于37℃減壓濃縮至約2.5L，-20℃預冷丙酮沉淀，真空干燥。
層析柱通過如下過程制備將硅膠顆粒過篩選70目的均勻顆粒，在110℃下干燥1小時，使其活化，然后用5倍柱體積的氯仿-甲醇(20∶3，V/V)混合液作為載體，將硅膠調成糊狀，使其均勻分散后裝入80×10cm的層析柱，即可。
將前述真空干燥物1.2g溶于氯仿-甲醇-水(30∶50∶40，V/V/V)120ml加入層析柱，調整流速5ml/分鐘，用氯仿-甲醇-水(90∶15∶6，V/V/V)30L溶液洗脫，然后改用氯仿-甲醇-水(80∶20∶5)8L洗脫，收集后洗脫液12L，減壓濃縮后用35L的-20℃預冷丙酮沉淀，-20℃靜止2小時，傾去上層清液，離心10分鐘(1000rpm)，沉淀用適量丙酮洗2次，沉淀真空干燥過夜。
將1.16g干燥物溶于800ml注射用水，作為神經節苷脂提取液備用，濃度為每1ml含神經節苷脂以唾液酸計1.45mg/ml。
步驟(3)將鹿肌肉提取液800ml和牛腦神經節苷脂提取液200ml混合，加水注射用水至2L，無菌過濾后灌裝成2ml/支，高壓滅菌，包裝入庫，每支含有6.4mg多肽、290μg唾液酸、0.4mg次黃嘌呤。
實施例3步驟(1)取新鮮兔肌肉10kg，加25L水勻漿，勻漿后冷凍，融化后加熱75℃，保溫25分鐘，降溫后離心，離心條件為3800轉/分，離心時間為30分鐘，保留上清液，上清液過濾，得濾液；在濾液中加入胰蛋白酶保溫水解，胰蛋白酶濃度為0.2％，水解條件為pH＝8.1～8.4，保溫39～42℃，保溫時間為2小時；酶解后，酶解液調pH值為3.9-4.0，加熱至85℃，保持20分鐘，降溫后離心，離心條件為4000轉/分，離心時間為20分鐘，保留上清液，上清液過濾得濾液。
濾液調pH值為7.2～7.4，加熱至85℃，保持20分鐘，降溫后離心，離心條件為4000轉/分，離心時間為20分鐘，保留上清液，上清液過濾，濾液用截留分子量為6000的超濾膜超濾，超濾液為肌肉提取液，濾液減壓濃縮至800ml，其中多肽含量為4mg/ml，其中次黃嘌呤含量為0.4mg/ml；步驟(2)取10kg新鮮馬腦用30L丙酮勻漿，勻漿液用濾紙過濾，得濾渣2500g，濾渣用12.5L氯仿-甲醇(20∶1)混合液抽提三次，分別過濾后合并濾液，使用旋轉蒸發器，在37℃減壓蒸干，得干燥物1.25g。干燥物用20L氯仿-甲醇混合液(30∶1，V/V)溶解，加入500ml的0.1mol/LKCl溶液。室溫攪拌1小時，轉移到分液漏斗中靜置16小時。分液后，上相用等體積的氯仿-甲醇-水(120∶35∶5，V/V/V)洗1次；下相用等體積的氯仿-甲醇-水(10∶68∶77，V/V/V)洗1次；合并2次上相于37℃減壓濃縮至約10L，-20℃預冷丙酮沉淀，真空干燥。
層析柱通過如下過程制備將硅膠顆粒過篩選80目的均勻顆粒，在110℃下干燥1小時，使其活化，然后用5倍柱體積的氯仿-甲醇(15∶2，V/V)混合液作為載體，將硅膠調成糊狀，使其均勻分散后裝入80×10cm的層析柱，即可。
將前述真空干燥物1.2g溶于氯仿-甲醇-水(80∶10∶20，V/V/V)24ml加入層析柱，調整流速5ml/分鐘，用氯仿-甲醇-水(75∶15∶10，V/V/V)20L溶液洗脫，然后改用氯仿-甲醇-水(40∶50∶15)15L洗脫，收集后洗脫液8L，減壓濃縮后用40L的-20℃預冷丙酮沉淀，-20℃靜止2小時，傾去上層清液，離心10分鐘(1000rpm)，沉淀用適量丙酮洗2次，沉淀真空干燥過夜。
將1.25g干燥物溶于500ml注射用水，作為神經節苷脂提取液備用，濃度為每1ml含神經節苷脂以唾液酸計2.5mg/ml。
步驟(3)將兔肌肉提取液800ml和馬腦神經節苷脂提取液200ml混合，加水注射用水至2L，無菌過濾后灌裝成2ml/支，高壓滅菌，包裝入庫，每支含有3.2mg多肽、500μg唾液酸、0.32mg次黃嘌呤。
實施例4步驟(1)取新鮮鹿肌肉10kg，加25L水勻漿，參照實施例1步驟(1)制備鹿肌肉提取液備用，其中多肽含量為1.6mg/ml。超濾液為肌肉提取液，濾液減壓濃縮至800ml，其中多肽含量為5.4mg/ml，其中次黃嘌呤含量為0.25mg/ml；步驟(2)取10kg新鮮馬腦用45L丙酮勻漿，參照實施例1步驟，制備神經節苷脂提取液備用，濃度為每1ml含1含神經節苷脂以唾液酸計10mg/ml。
步驟(3)按照實施例3的操作，制得注射液。
實施例5步驟(1)參照實施例1步驟(1)，其中多肽含量為5mg/ml，其中次黃嘌呤含量為0.2mg/ml；步驟(2)取10kg新鮮狗腦用40L丙酮勻漿，參照實施例1步驟，制備神經節苷脂提取液備用，濃度為每1ml含1含神經節苷脂以唾液酸計100μg/ml。
步驟(3)肌肉提取液800ml和狗腦神經節苷脂提取液800ml混合，加注射用水至2L，無菌過濾后灌裝成2ml/支，高壓滅菌，包裝入庫，每支含有4.0mg多肽、80μg唾液酸、0.16mg次黃嘌呤。
實施例6步驟(1)同實施例1步驟(1)。
步驟(2)同實施例1步驟(2)。取10kg新鮮豬腦用35L丙酮勻漿，參照實施例1步驟，制備豬腦神經節苷脂提取液備用，濃度為每1ml含唾液酸400μg唾液酸。
按照實施例5的操作，制得注射液。
實施例7步驟(1)同實施例1步驟(1)。
步驟(2)取10kg新鮮羊腦用35L丙酮勻漿，參照實施例1步驟，制備羊腦神經節苷脂提取液備用，濃度為每1ml含唾液酸400μg唾液酸。
步驟(3)將兔肌肉提取液2000ml和羊腦神經節苷脂提取液250ml混合，無菌過濾后灌裝成2ml/支，高壓滅菌，包裝入庫，每支含有10mg多肽、100μg唾液酸、0.4mg次黃嘌呤。
實施例7～11參照實施例1～9中步驟(1)和(2)，步驟(3)將肌肉提取液和腦神經節苷脂提取液進行混合后，按本領域技術人員公知的方法，制成顆粒，干燥后壓制成片，即得藥物組合物的片劑。
實施例12～21參照實施例1～9中步驟(1)和(2)，步驟(3)將肌肉提取液和腦神經節苷脂提取液進行混合后，加入適宜的賦型劑(如右旋糖酐40、甘露醇等)，進行除菌灌裝后，按本領域技術人員公知的方法，經冷凍干燥制成凍干粉針產品。
實施例22～28參照實施例1～9中步驟(1)和(2)，步驟(3)將肌肉提取液和腦神經節苷脂提取液進行混合后，加入適量注射用水投入到稀配罐中；在濃配罐中按最終配制總體積的0.9％加入氯化鈉，加入0.4‰活性碳煮沸脫炭過濾，冷卻后，將藥液過濾至稀配罐中，在稀配罐中補加注射用水至配液量，調PH為7.2～7.5，過濾。灌封于輸液瓶中，100℃流通蒸汽滅菌45分鐘，即得輸液產品。
實驗例1本實驗例為本發明最優選藥物組合物小容量注射液(實施例1，每ml含3.2mg多肽、50μg唾液酸、0.125mg次黃嘌呤)外觀、pH值、蛋白質項目的檢測。
本發明藥物組合物注射液為無色或微黃澄明液體。
按照中國藥典2000年版二部附錄VIH測定，本發明藥物組合物注射液pH值為6.0-8.0，符合注射液標準。
取本發明藥物組合物注射液1ml，加20％磺基水楊酸溶液1ml，沒有渾濁產生，說明本發明注射液蛋白質檢查符合規定。
實驗例2本實驗例為本發明最優選藥物組合物小容量注射液(實施例1，每ml含3.2mg多肽、50μg唾液酸、0.125mg次黃嘌呤)多肽的定性測定。
取本發明藥物組合物注射液1ml，加茚三酮試液3滴，加熱，呈紫色，為肽鍵(-CO-NH-)的特征反應，說明本發明藥物組合物注射液含有多肽。
實驗例3本實驗例為本發明最優選藥物組合物小容量注射液(實施例1，每ml含3.2mg多肽、50μg唾液酸、0.125mg次黃嘌呤)神經節苷脂的定性測定。
按照中國藥典2000年版二部附錄VB試驗，采用薄層色譜法，以單一神經節苷脂GM1為對照品，加磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)，制成每1ml含0.2mg的溶液，作為對照品溶液。分別取本發明藥物組合物注射液及對照品溶液各50ul，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-0.2％氯化鈣溶液(60∶45∶10，V/V/V)為展開劑，展開后，晾干，噴以間苯二酚溶液，噴后即加玻片封蓋(兩玻片間需用夾夾緊)，120℃加熱至斑點清晰，譜圖顯示本發明藥物組合物注射液色譜圖主斑點的顏色及位置與對照品色譜圖的斑點一致。此實驗結果表明，本發明藥物組合物注射液中含有神經節苷脂，主要為神經節苷脂GM1。
實驗例4本實驗例為本發明最優選藥物組合物小容量注射液(實施例1，每ml含3.2mg多肽、50μg唾液酸、0.125mg次黃嘌呤)毒性實驗參數□細菌內毒素測定依照中國藥典2000年版二部附錄XIE進行檢查，本發明藥物組合物注射液每1ml中含細菌內毒素的量小于4EU。
□異常毒性測定依照中國藥典2000年版二部附錄XIC靜脈注射法檢查，符合規定。
□毒性實驗測定LD50為298±79mg/Kg，最大耐受量超過成人用量的250倍。
□長期毒性測定連續給藥三個月觀察血、尿指標，病理檢查均未見異常。
□過敏性試驗取體重250-350g健康豚鼠6只，間日腹腔注射本發明藥物組合物注射液0.5ml，連續3次，在第三次注射后的第十四天，自靜脈注射本品1.0ml，注射后15分鐘內觀察動物，均不出現連續干咳、連續前爪抓鼻、明顯聳毛、四肢發軟、躺臥、呼吸困難、痙攣、虛脫及死亡現象。連續觀察3天，動物健存。
結論本發明藥物組合物注射液符合注射液要求，無任何毒性作用，應用人體安全。
實驗例5本實驗例為本發明最優選藥物組合物小容量注射液(實施例1，每ml含3.2mg多肽、50μg唾液酸、0.125mg次黃嘌呤)高分子量物質測定按照中國藥典2000年版二部附錄VD中高效液相色譜法進行測定。
色譜條件與系統適用性試驗用凝膠色譜柱(TSK GEL2000SWxl 7.8mm*300mm，5um)；流動相為三氟醋酸-乙腈-水(0.05∶10∶90)；檢測波長為214nm。理論板數按胰島素峰計算應不得低于3000。
對照品溶液的制備取胰島素(分子量5800)適量，用流動相制成每1ml中含1mg的溶液，作為對照品溶液。
測定法取對照品溶液和本發明藥物組合物注射液各20ul，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖2、3，小于胰島素峰保留時間的峰面積，按面積歸一化法計算，不得超過4.0％。
該藥物組合物注射液通過靜脈滴注途徑給藥，根據專家意見，增加高分子量物質檢查。根據三批樣品的測定結果，高分子量物質限定為“小于胰島素峰保留時間的峰面積，按面積歸一化法計算，不超過4.0％”。
實驗例6本實驗例定量測定本發明本發明最優選藥物組合物小容量注射液(實施例1，每ml含3.2mg多肽、50μg唾液酸、0.125mg次黃嘌呤)的多肽含量。
取注射液適量，加水制成每1ml中約含0.15mg的多肽的溶液，作為供試品溶液，精密量取1.0ml，照福林酚測定法測定。
按照實施例1所述的方法進行小試得到三組產品，測定結果參見下表，多肽含量為標示量的85-115％。
Folin-酚測定法試劑堿性銅溶液取氫氧化鈉10g，碳酸鈉50g，加水400ml使溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5g，加水50ml使其溶解，另取硫酸銅0.25g，加水30ml使其溶解，將兩液混合，作為乙液。
臨用前，合并甲、乙兩液，并加水至500ml。
操作法對照品溶液的制備取牛血清白蛋白對照品，加水制成每1ml中含0.3mg的溶液。
供試品溶液的制備照各品種項下規定的方法制備。
標準曲線的制備精密量取對照品溶液0.0ml、0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml，分別置具塞試管中，各加水至1.0ml，再分別加入堿性銅試液1.0ml，搖勻，各加入福林酚試液(取福林試液中的貯備液1→16)4.0ml，立即混勻，置55℃水浴中準確反應5分鐘，置冷水浴10分鐘，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IV B)在650nm的波長處測定吸收度；以0號管作為空白。以對照品溶液濃度與相應吸收度計算回歸方程。
測定法精密量取供試品溶液1.0ml，照標準曲線的制備項下的方法，“自加入堿性銅試液”起，依法測定，從回歸方程計算多肽的含量，并乘以稀釋倍數，即得。
實驗例7本實驗例定量測定本發明本發明最優選藥物組合物小容量注射液(實施例1，每ml含3.2mg多肽、50μg唾液酸、0.125mg次黃嘌呤)的唾液酸含量。
采用間苯二酚測定法測定，唾液酸含量為標示量的85～115％。參見下表。
間苯二酚測定法試劑1、間苯二酚貯存液取間苯二酚2g，加水100ml溶解，作為貯存液(可4℃保存數月)。
2、硫酸銅溶液(0.1mol/L)取硫酸銅2.5g，加水100ml溶解，即得。
3、間苯二酚溶液取間苯二酚貯存液10ml，加硫酸銅溶液0.25ml，加鹽酸80ml，加水至100ml。操作法(1)參比溶液的制備取唾液酸參比試劑適量，加0.9％氯化鈉溶液制成每1ml中含50μg的溶液。
(2)標準曲線的制備精密量取參比溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0ml，分別置具塞試管中，各加水至2.0ml，再分別加入間苯二酚溶液2.0ml，搖勻，置水浴中反應15分鐘，取出置冷水中10分鐘。分別加醋酸正丁酯-正丁醇(85∶15)5ml，劇烈振搖后放置15分鐘。取上層液于585nm波長處測定吸收度；同時以0管作為空白。以測得的吸收度與對應的濃度計算回歸方程，其相關系數應大于0.995。
(4)測定法精密量取本品2.0ml，照標準曲線的制備項下的方法，自“精密加入間苯二酚溶液”起，依法測定，從回歸方程求得供試品溶液的濃度，并乘以稀釋倍數，即為唾液酸含量。
實驗例8本實驗例定量測定本發明最優選藥物組合物小容量注射液(實施例1，每ml含3.2mg多肽、50μg唾液酸、0.125mg次黃嘌呤)的次黃嘌呤含量。
采用高效液相色譜法測定，次黃嘌呤含量為標示量的85～115％。參見下表。
高效液相色譜法色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；磷酸二氫鉀(0.001mol/L，pH6.9)-甲醇(100∶0.2)為流動相；檢測波長為260nm，理板數按次黃嘌呤峰計算應不低于5000，次黃嘌呤峰與黃嘌呤峰的分離度應符合規定。
對照品溶液的制備取次黃嘌呤對照品適量，加水制成每1ml中含次黃嘌呤10μg的溶液作為對照品溶液。另取次黃嘌呤和黃嘌呤適量加水制成每ml中含次黃嘌呤25μg及黃嘌呤2.5μg的溶液，作為系統適用性試驗用溶液。
供試品溶液的制備取本品適量，加水制成每1取本品適量，加水制成每1ml中含次黃嘌呤10μg的溶液作為對照品溶液。
測定法取系統適用性試驗用溶液20μl注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，計算分離度應符合規定。另取對照品溶液、供試品溶液各20μl分別注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算。
實驗例9本實驗例定性測定本發明本發明最優選藥物組合物小容量注射液(實施例1，每ml含3.2mg多肽、50μg唾液酸、0.125mg次黃嘌呤)的次黃嘌呤。
本法按次黃嘌呤含量測定項下方法測定，記錄色譜圖，次黃嘌呤峰的保留時間應與對照品峰的保留時間相同。根據三批樣品檢測，次黃嘌呤峰的保留時間與對照品峰的保留時間相同。
取本品1ml，加丙酮數毫升，應產生白色混濁。
比較例1本比較例說明本發明實施例1所述藥物組合物治療腦血管病(腦卒中)的臨床效果優于腦復素注射液(吉林大學白求恩制藥廠)。
1、資料與方法采用盲目隨機對照分為治療組和對照組各36例。
治療組(實施例1注射液)23例，女13例，年齡40-75歲，平均56歲。
對照組(腦復素注射液)24例，女12例，年齡40-80歲，平均61歲。
2、結果治療組在治療后神經體征明顯改善(p＜0.05)，而對照組改善不明顯(p＞0.05)，證明治療組效果優于對照組。
治療中未見近期副反應及并發癥。
3、討論研究結果表明，從治療結束時神經功能缺損積分減少數結果看，經統計學處理，治療組效果優于對照組(p＞0.05)，在從臨床療效比較，治療組有效率為87％，對照組有效率為21％，經x2檢驗治療組療效明顯高于對照組(p＜0.01)，以上結果證明本發明藥物組合物注射液對腦血管病有明顯療效，并使死亡率明顯降低。
比較例2本比較例說明在治療老年性急性腦卒中，本發明藥物組合物注射液療效優于專利申請CN03137463.8實施例1所述的注射液以下簡稱(對照產品1)。
1、對象所有人選病例均按中華醫學會第2次腦血管學術會議制定的標準，經詳細詢問病史，神經系統檢查及頭顱CT和(或)MR檢查確診。所有病人均為首次發病，按改良愛丁堡斯堪的納維亞(改良SSS評分)，疾病程度為中、重度，均未給予溶栓治療，因經濟問題未完成治療療程的不參與評價。治療組36例，男22例，女14例，平均年齡72歲(54-82歲)，其中腦梗塞20例，腦出血11例，蛛網膜下腔出血5例；隨機選擇以往用腦苷肌肽注射液治療的患者30例為對照組，男21例，女9例，平均年齡76歲(62-90歲)，其中腦梗塞18例，腦出血10例，蛛網膜下腔出血2例。兩組基線資料有可比性。
2、治療方法治療組本發明藥物組合物注射液一次10-20ml加入300ml氯化鈉注射液中或5％葡萄糖注射液中，每日1次，緩慢滴注，維持4-6周。
對照組對照產品1，每次20ml，每日1次，15天為一療程，一般用2個療程以上。
對兩組患者伴有糖尿病及高血壓者給予相應對癥治療。治療組治療前后均檢查肝腎功能、血常規及心電圖。
3、療效評定根據改良SSS評分法，對入院時和出院時患者的神經功能損傷進行評價。
基本痊愈SSS評分減少90％以上；顯著進步SSS評分減少46-89％；進步SSS評分減少18-45％；無變化SSS評分變化在18％以下；惡化SSS評分增加大于18％。
4、結果治療組治療前后，肝腎功能、血常規及心電圖無明顯變化。
兩組療效見表9
以上說明在治療老年性急性腦卒中，本發明藥物組合物注射液療效優于含有多肽和神經節苷脂的注射液。
權利要求
1.一種腦功能改善藥物，其特征在于，所述藥物由多肽、次黃嘌呤和神經節苷脂組配而成，神經節苷脂以其中含有的唾液酸計算含量，多肽為唾液酸含量的6.1～100倍，優選50～80倍，更優選為60～70倍，最優選為64倍；次黃嘌呤為唾液酸含量的0.1～100倍，優選0.5～20倍，更優選2～10倍，最優選2.5倍；多肽和次黃嘌呤由從除人以外的哺乳動物肌肉組織中提取得到，神經節苷脂由從除人以外的哺乳動物腦組織中提取得到。
2.根據權利要求1所述的腦功能改善藥物，其特征在于，所述多肽分子量為5000-10000。
3.根據權利要求1或2所述的腦功能改善藥物，其特征在于，所述從除人以外的哺乳動物為豬、狗、牛、羊、鹿、馬或兔。
4.根據權利要求3所述的腦功能改善藥物，其特征在于，所述從除人以外的哺乳動物肌肉組織為兔肌肉組織；所述從除人以外的哺乳動物腦組織優選為牛豬腦組織。
5.權利要求1-4任意一項藥物組合物的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟(1)肌肉提取液的制備A)將動物任意部位肌肉組織加水勻漿后冷凍，融化后加熱離心過濾除渣，保留濾液；B)濾液調節pH值保溫酶解，調節pH值呈酸性，加熱離心除沉淀，過濾除雜，保留濾液；C)將濾液調節呈中性，加熱離心除沉淀，上清液過濾，濾液用超濾膜超濾，超濾液為肌肉提取液；(2)神經節苷脂提取液的制備A)將動物腦組織加溶劑勻漿后過濾，濾渣用溶劑抽提提取，提取液與濾液合并后蒸干，得干燥物；B)將干燥物溶于溶劑中，向其中加入鹽的水溶液提取分液；C)分液的上、下層液相分別用至少兩種溶劑的混合水溶液洗滌，合并洗滌后的上層液相部分，減壓濃縮，然后用預冷丙酮沉淀，干燥后得干燥物；D)將干燥物溶于至少兩種溶劑的混合水溶液，層析柱分離，洗脫液濃縮后用預冷丙酮沉淀、分離，得到的沉淀經后處理，得到神經節苷脂提取液；(3)將上述提取液混合，使混合液中多肽的重量為神經節苷脂中唾液酸重量的6.1～100倍，使混合液中次黃嘌呤重量為神經節苷脂中唾液酸重量的0.1～100倍，經后處理，得成品制劑。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟(1)肌肉提取液的制備A)將動物任意部位肌肉組織加0.6～2.5倍重量水勻漿，勻漿后冷凍，融化后加熱70～90℃，保溫15～30分鐘，降溫后離心，離心條件為3000～4000轉/分，離心時間為15～30分鐘，保留上清液，上清液過濾，得濾液；B)在濾液中加入胰蛋白酶保溫水解，胰蛋白酶濃度為0.03～0.5％，水解條件為pH＝7.5～8.5，保溫35～50℃，保溫時間為0.5～4小時；酶解后，酶解液調pH值為3.5-4.5，加熱至80-95℃，保持15-30分鐘，降溫后離心，離心條件為3000～4000轉/分，離心時間為15～30分鐘，保留上清液，上清液過濾得濾液；C)濾液調pH值為6.5-7.5，加熱至80-95℃，保持15-30分鐘，降溫后離心，離心條件為3000～4000轉/分，離心時間為15～30分鐘，保留上清液，上清液過濾，濾液用截留分子量為5000-10000的超濾膜超濾，超濾液為肌肉提取液，其中多肽含量為0.5～15mg/ml，其中次黃嘌呤含量為0.05～2mg/ml；(2)神經節苷脂提取液的制備A)將動物腦組織加3～4倍重量的丙酮勻漿后過濾，保留濾渣和濾液；濾渣用3～5倍重量的氯仿—甲醇(1～20∶1～20，V/V)混合液抽提三次，分別過濾；將上述濾液合并后在旋轉蒸發器中37℃減壓蒸干，得干燥物；B)干燥物溶于氯仿—甲醇(2～30∶1～20，V/V)混合液，然后向混合液中加入1/20～1/80體積的0.1mol/L的KCl溶液，室溫下攪拌1小時，靜置8～16小時后分液；C)分液后，上層液相用等體積的氯仿—甲醇—水(50～150∶5～40∶0.5～5，V/V/V)混合液洗滌，下層液相用等體積的氯仿—甲醇—水(1～10∶30～80∶35～85，V/V/V)混合液洗滌，合并兩次洗滌后的上層液相部分，在37℃減壓濃縮至初始體積的1/8～1/2，然后用-20℃預冷丙酮沉淀，真空干燥，得干燥物；D)將干燥物溶于的氯仿—甲醇—水(30～80∶10～50∶1～90，V/V/V)混合液，制成1～5％濃度的溶液，加入層析柱，調整流速5mL/分鐘，用氯仿—甲醇—水(60～90∶15～40∶1～10，V/V/V)混合液10～30L洗脫，然后改用氯仿—甲醇—水(40～80∶20～50∶5～15，V/V/V)混合液8～15L洗脫，收集后洗脫液6～12L，減壓濃縮后用3～5倍體積的-20℃預冷丙酮沉淀，-20℃靜止2小時后傾去上層清液，余下部分在1000轉/分下離心10分鐘，得到的沉淀用適量丙酮洗2次，真空干燥，將干燥物溶于水得神經節苷脂提取液，濃度為每1ml含神經節苷脂以唾液酸計0.01～0.5mg腦提取液腦提取液；(3)將上述提取液混合，使混合液中多肽的重量為神經節苷脂中唾液酸重量的6.1～100倍，使混合液中次黃嘌呤重量為神經節苷脂中唾液酸重量的0.1～100倍，經后處理，得成品制劑。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟(1)肌肉提取液的制備A)將動物任意部位肌肉組織加1～1.5倍重量水勻漿，勻漿后冷凍，融化后加熱75～85℃，保溫20分鐘，降溫后離心，離心條件為4000轉/分，離心時間為20～30分鐘，保留上清液，上清液過濾，得濾液；B)在濾液中加入胰蛋白酶保溫水解，胰蛋白酶濃度為0.03～0.5％，水解條件為pH＝7.8～8.2，保溫37～42℃，保溫時間為1.5～3小時；酶解后，酶解液調pH值為3.8-4.2，加熱至80-85℃，保持20分鐘，降溫后離心，離心條件為4000轉/分，離心時間為20～30分鐘，保留上清液，上清液過濾得濾液；C)濾液調pH值為6.8-7.2，加熱至80-85℃，保持20分鐘，降溫后離心，離心條件為4000轉/分，離心時間為20～30分鐘，保留上清液，上清液過濾，濾液用截留分子量為8000的超濾膜超濾，超濾液為肌肉提取液，其中多肽含量為0.5～15mg/ml，其中次黃嘌呤含量為0.05～2mg/ml；(2)神經節苷脂提取液的制備A)將動物腦組織加3～4倍重量的丙酮勻漿后過濾，保留濾渣和濾液；濾渣用3～5倍重量的氯仿—甲醇(1∶1，V/V)混合液抽提三次，分別過濾；將上述濾液合并后在旋轉蒸發器中37℃減壓蒸干，得干燥物；B)干燥物溶于氯仿—甲醇(2∶1，V/V)混合液，然后向混合液中加入1/80體積的0.1mol/L的KCl溶液，室溫下攪拌1小時，靜置8～16小時后分液；C)分液后，上層液相用等體積的氯仿—甲醇—水(86∶14∶1，V/V/V)混合液洗滌，下層液相用等體積的氯仿—甲醇—水(3∶48∶47，V/V/V)混合液洗滌，合并兩次洗滌后的上層液相部分，在37℃減壓濃縮至初始體積的1/4，然后用-20℃預冷丙酮沉淀，真空干燥，得干燥物；D)將干燥物溶于的氯仿—甲醇—水(65∶25∶4，V/V/V)混合液，制成2.5％濃度的溶液，加入層析柱，調整流速5mL/分鐘，用氯仿—甲醇—水(65∶25∶4，V/V/V)混合液20L洗脫，然后改用氯仿—甲醇—水(60∶35∶8，V/V/V)混合液12L洗脫，收集后洗脫液10L，減壓濃縮后用4倍體積的-20℃預冷丙酮沉淀，-20℃靜止2小時后傾去上層清液，余下部分在1000轉/分下離心10分鐘，得到的沉淀用適量丙酮洗2次，真空干燥，將干燥物溶于水得神經節苷脂提取液，濃度為每1ml含神經節苷脂以唾液酸計0.01～0.5mg腦提取液腦提取液；(3)將上述提取液混合，使混合液中多肽的重量為神經節苷脂中唾液酸重量的6.1～100倍，使混合液中次黃嘌呤重量為神經節苷脂中唾液酸重量的0.1～100倍，經后處理，得成品制劑。
8.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述方法步驟1)中，肌肉組織加0.6～2.5倍重量水勻漿；酶解采用胰蛋白酶，控制pH7.5～8.5條件下加熱保溫水解；水解液經兩次調節pH值加熱離心過濾后，濾液用截留分子量為5000-10000的超濾膜超濾上，得多肽含量為0.5～15mg/ml，次黃嘌呤含量為0.05～2mg/ml的肌肉提取液；所述方法步驟2)中，勻漿所用溶劑為丙酮，濾渣用氯仿—甲醇(1～20∶1～20，V/V)的混合液充分抽提，合并的濾液用旋轉蒸發器蒸干，得干燥物；溶解干燥物的溶劑為體積比為2～30∶1～20的鹵代烴和醇的混合溶劑，鹽的水溶液優選KCl水溶液；分液的上、下層液相分別用鹵代烴和醇的混合水溶液洗滌，減壓濃縮至初始體積的1/8～1/2，然后用低于0℃預冷丙酮沉淀；將干燥物溶于鹵代烴和醇的混合水溶液，用鹵代烴和醇的混合水溶液梯度洗脫柱層析分離；酶解pH值優選為7.8～8.2，酶解溫度優選為37～42℃；為保持溫度穩定，可采取夾層水浴保溫的方法；保溫結束后應調節pH3.8～4.2后再加熱；所述步驟(1)的C)中，超濾膜優選為截留分子量為6000-10000的超濾膜，更優選截留分子量為8000的超濾膜；本發明的減壓蒸發的壓力控制在0.04～0.08MPa左右。
9.根據權利要求3或4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)的D)中所用的層析柱通過如下過程制備將硅膠顆粒過篩選60～80目的均勻顆粒，在110℃下干燥1小時，使其活化，然后用5倍柱體積的氯仿-甲醇(5～20∶0.5～3，V/V)混合液作為載體，將硅膠調成糊狀，使其均勻分散后裝入80×10cm的層析柱，即得；所述氯仿-甲醇混合比優選為9∶1(V/V)；步驟(3)中成品制劑的劑型為藥劑學上可接受的劑型，比如片劑、膠囊、口服液、小容量注射劑、大輸液或凍干粉針，優選為小容量注射劑、大輸液或凍干粉針，最優選為小容量注射劑。
10.權利要求1-4所述的腦功能改善藥物在制備治療腦功能改善藥物方面的用途；在制備治療心肌和腦部疾病引起的功能障礙藥物方面的用途；作為治療心肌梗死、癡呆、腦外傷、腦水腫藥物中的應用；以及作為制備治療老年性癡呆、腦血管意外創傷及創傷后的中樞神經系統后遺癥、冠心病、心絞痛、心肌疾病、腦血管病、以及缺血性和出血性腦病變等藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種腦功能改善藥物，含有從除人以外的哺乳動物肌肉組織中提取的活性多肽、次黃嘌呤和從除人以外的哺乳動物腦組織中提取的神經節苷脂，藥物組合物中多肽重量為神經節苷脂中唾液酸的6.1～100倍，藥物組合物中次黃嘌呤重量為神經節苷脂中唾液酸的0.1～100倍，還公開了藥物組合物的制備方法及其在制備治療心、腦功能改善藥物方面的用途，本發明的藥物組合物能促進心、腦組織的新陳代謝，參與腦組織神經元的生長、分化和再生過程，改善腦血液循環和腦代謝功能，可用于治療心、腦部疾病引起的功能障礙。
文檔編號A61K9/20GK1824292SQ200510132789
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月26日 優先權日2004年12月27日
發明者彭瑞平 申請人:阿爾貝拉醫藥控股(通化)有限公司