專利名稱：治療眼新生血管化疾病的RNAi治療藥物的制作方法
本申請要求2004年2月5日提交的美國臨時申請系列號60/541,775的優先權，該臨時申請的內容通過引用整體結合到本文。
背景技術：
許多不同的眼病是過度新生血管化(NV)——眼內部血管的異常增殖和生長的結果。眼NV本身的發展不但對視力產生不利后果，而且還是許多嚴重眼病中的早期病理步驟；盡管已引入新的治療藥物，但它在美國和歐洲仍是造成永久失明的最普遍原因。有幾種主要的眼病會促進異常的新生血管形成，導致引起失明的進一步損害。遺憾的是，對于患有任一這類眼NV疾病的患者，只存在很少幾種治療選擇。最常用的認可療法是維速達爾(Visudyne)光動力療法，該法使用光線來激活新生血管化附近的光敏劑，以破壞不需要的血管。它對許多試驗對象是無效的，即使有效也不能防止復發。最近批準的藥物Macugen有些益處，但對大多數試驗對象仍無效。另外，Macugen的眼內給藥會導致發生刺激和感染風險，這兩方面都是不利的因為會加重新生血管化的病狀。因此，存在對有效治療法極大和增長的未滿足的臨床需求，這種治療要么是抑制疾病的進展，因為疾病進展往往遷延過久，要么是逆轉不需要的血管發生。
美國國家衛生研究院(NIH)的國家眼科學院(National Eye Institute)估計有400,000名美國人患有某種形式的眼皰疹，而且美國每年診斷出將近50,000個新病例和復發病例，其中較為嚴重的基質角膜炎約占25％。從更大規模的研究發現，眼皰疹復發率一年內為10％，兩年內為23％，二十年內為63％。盡管應用現有的抗病毒藥物能在一定程度上控制HSV感染，但仍沒有能治療HSV引起的基質角膜炎和保護試驗對象免于失明的有效藥物。
眼新生血管化疾病可分為影響眼前部或眼睛前部和影響眼后部或視網膜的疾病。這些不同區域的NV的發生可能有不同的起源，但不論是眼睛的哪個區域，NV過程的生化和生理特征本質上近乎相同。因此，用以干預眼NV生化特征的有效方法展示的前景，是給以眼NV為主要病理癥狀或潛在病理癥狀的任何眼病提供有效治療法，而不論這些眼病作用于眼前部還是眼后部。盡管如此，眼前部和眼后部的組織差別是相當大的，這些差別可顯著影響便于治療劑到達組織和細胞的給藥治療法的這種最有效方法。
眼后部NV疾病當為視網膜供氧的微小血管受到損害時會發生眼糖尿病性視網膜病(DR)。這種損害會讓血液和分泌液逸出到視網膜中，而且還導致新血管生長。這些新血管較脆，往往會出血到眼睛的玻璃體區域，干擾視力。患有最嚴重型DR的試驗對象不加治療將有導致嚴重視力喪失的重大風險。在這些疾病中，新生血管化是主要的疾病病理。
年齡相關性黃斑變性(AMD)是60歲以上人群的最主要失明原因，且這個問題每年都變得更嚴重。在AMD中，中央視覺的喪失使得清晰識別成為不可能。就個人和社會負擔的AMD數量整體而言，造成這種疾病的原因及其如何發展沒有被更多地認識到或許令人奇怪。不過人們還是清楚，視網膜色素上皮細胞(RPE)起著關鍵的作用。異常廢物在RPE底下和內部積累，致使RPE細胞最終死亡。視網膜的視桿細胞和視錐細胞的存活依賴于正常執行功能的RPE，因此RPE功能的失效會導致逐漸失明。這種疾病引起眼睛后部發生結疤過程，導致新生血管的形成(新血管化)。在一大部分患有“濕性AMD”的試驗對象中，視網膜前部的滲漏新血管系統持續過度增殖，這也會使視力模糊和扭曲。在這種疾病中，試驗對象群體的大部分人在疾病稍后的嚴重階段有破壞性新生血管持續增生。
眼色素層炎是起源于眼睛內部組織過度或持續發炎的一種眼病。隨著時間推移色素層炎會導致新生血管化，從而損害視力。這種疾病可在眼睛的幾個不同區域發展，如局限于眼后部，或者彌散于包括眼后部區域的眾多區域各處。這種疾病起源于炎癥，而炎癥可由包括病毒感染的多種原因引起。共通性是過度和持續的炎癥，導致破壞性病理過程(包括新生血管化)和最終失明。
眼前部NV疾病虹膜紅變是描述虹膜和眼前部結構上異常血管生長的術語。通常該區域的血管不可見。當視網膜缺氧或局部缺血如糖尿病性視網膜病或靜脈阻塞的情況時，會有異常血管形成，以給眼睛供氧。遺憾的是，這些血管的形成阻礙房水從眼前部排出，使眼壓升高。這通常會導致新生血管性青光眼。
眼色素層炎是起源于眼睛內部組織發炎的一大類疾病。這種疾病在解剖學上最常分成前色素層炎、中色素層炎、后色素層炎或彌漫性色素層炎。眼色素層炎的眼并發癥會引起深度的和不可逆的失明，尤其是未被識出或未得到適當治療時。最常見的并發癥包括白內障、青光眼、視網膜脫離，及視網膜、視神經或虹膜的新生血管化等。
脈絡膜新生血管化(CNV)是一大類眼病的潛在病理，該眼睛區域具有新生血管化的特征。相關的一類眼病是眼睛感染的結果，包括結膜炎、角膜炎、瞼炎、瞼腺炎、瞼板腺囊腫和虹膜炎，而且這些全是眼新生血管化的主要原因并導致失明。在美國，復發性HSV感染是角膜失明的最常見感染原因。這種病毒感染造成稱之為基質角膜炎(SK)的致盲性損傷。角膜NV是皰疹性SK引起的視力喪失過程中的早期步驟。
眼NV生物化學和生理學如同其他組織一樣，眼組織常處于需要新生血管化的連續維護狀態。這個必需過程由促進因子和抑制因子之間的平衡來維持平衡。遺憾的是，在許多眼新生血管化疾病中沒有恰當的維持這種平衡，結果造成破壞性新血管過度生長。不管是什么眼睛區域和疾病，盡管病理的起因及其在視力喪失中的作用差別很大，但這種過度新生血管化的過程幾乎完全相同。病理過程的共同特征為這些不同眼部疾病的有效治療干預提供了方法。
正常角膜是無血管的，HSV本身并不表達任何血管生成蛋白質，但被感染的眼組織表達誘導角膜NV的血管生成因子。血管生成因子的產生最初出現在被病毒感染的角膜上皮非炎性細胞，然后在臨床階段由基質中的炎性細胞(PMN和巨噬細胞)表達。通過移植純化的HSV病毒DNA片段(HSV DNA，富含CpG基序)或合成的CpG寡核苷酸(CpG ODN)建立了HSV誘導角膜NV的小鼠模型。這個模型被認為能提供角膜NV和皰疹性SK疾病的臨床相關模型，且可用于測試抑制眼NV疾病的治療方式的有效性。
一種引人注意的治療干預方法是抑制這些疾病的共同病理條件。從許多研究中已確定，VEGF介導的新生血管化和血管發生是許多眼新生血管化疾病的共同病理途徑之一。VEGF介導的血管發生途徑在所有這些NV相關眼病的血管發生中起主要作用。VEGF家族由五種結構上相關的生長因子組成VEGF-A、胎盤生長因子(PIGF)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。已知的受體包括三種結構上同源的酪氨酸激酶受體VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR或Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)，它們與不同VEGF成員具有不同親和性或相關功能。雖然對四種VEGF成員的功能和調節知之甚少，但已知VEGF-A能結合VEGFR-1和VEGFR-2，誘導新生血管化和血管發生以及增加血管通透性。VEGFR-1和VEGFR-2在增生的內皮中均被上調，這可能是對VEGF-A或低氧的直接響應。VEGFR-1對VEGF-A的親和性比VEGFR-2高。VEGFR-2據認為負責血管生長的血管生成信號，而對VEGFR-1的功能卻知之甚少。一些研究提示其在轉導血管生成信號中的直接作用及在能動性和通透性方面的作用。對血管發生的VEGF途徑中的關鍵參與者的這種認識，促使了對以VEGF-A抑制劑作為候選治療藥物(包括macugen，一種抑制VEGF與其受體結合的適體寡核苷酸)的研究。雖然在眼血管發生以及在其他血管發生疾病如腫瘤生長方面的研究已證實VEGF途徑對臨床療效的價值，但實驗藥物對許多試驗對象遠未能奏效。顯然，如果我們要為這些主要的眼病開發出治療法，則需要有更好的VEGF途徑抑制劑。
發明概述本發明提供使用RNAi藥物，包括小干擾RNA或siRNA(雙鏈RNA寡核苷酸)及給藥系統來抑制促血管生成因子的表達從而抑制眼NV疾病的組合物和方法。
因此本發明的一個目標是提供包含至少一種dsRNA寡核苷酸和藥物載體的組合物，其中當對患有新生血管化或血管發生有關的眼病的試驗對象給藥時，所述dsRNA抑制與眼病中新生血管化或血管發生有關的基因的表達。
本發明的又一個目標是提供用以治療試驗對象眼病的方法，其中所述疾病特征至少部分是新生血管化，該方法包括給予所述試驗對象包含dsRNA寡核苷酸和藥學上可接受載體的組合物，其中所述dsRNA寡核苷酸抑制能促進所述試驗對象眼新生血管化的基因的表達。
在一個實施方案中，藥物載體選自聚合物、脂質或膠束。載體可選自例如聚陽離子粘合劑、陽離子脂質、陽離子膠束、陽離子多肽、親水聚合物接枝聚合物、非天然陽離子聚合物、陽離子聚縮醛、親水聚合物接枝聚縮醛、配體官能化陽離子聚合物和配體官能化親水聚合物接枝聚合物。
眼病可選自基質角膜炎、色素層炎、發紅、結膜炎、角膜炎、瞼炎、瞼腺炎、瞼板腺囊腫、虹膜炎、黃斑變性和視網膜病。眼病可至少發生在眼前部。可在眼遠端部位給予組合物，例如可結膜下、靜脈內和皮下給藥，和/或可在眼睛局部給予組合物。
在另一個實施方案中，dsRNA抑制選自以下的基因的表達促炎途徑基因、促血管發生途徑基因、促細胞增殖途徑基因及病毒感染介質基因組RNA和病毒感染介質基因。組合物可包含至少兩種dsRNA分子，其中每種dsRNA分子均抑制選自以下的基因的表達促炎途徑基因、促血管發生途徑基因、促細胞增殖途徑基因及病毒感染介質基因組RNA和病毒感染介質基因。組合物可包含至少三種dsRNA分子，其中至少一種dsRNA分子抑制VEGF的表達，至少一種dsRNA分子抑制VEGF R1的表達，至少一種dsRNA分子抑制VEGF R2的表達。組合物可包含至少兩種dsRNA分子，其中至少一種dsRNA分子抑制堿性FGF的表達，至少一種dsRNA分子抑制FGF R的表達。
dsRNA分子可抑制一種或多種VEGF途徑基因、FGF途徑基因或它們的組合的表達。dsRNA分子可抑制一種或多種促血管發生基因、促炎基因或它們的組合的表達。dsRNA分子可抑制一種或多種促血管發生基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合的表達。dsRNA分子可抑制一種或多種促血管發生基因、內皮細胞增殖基因或它們的組合的表達。dsRNA分子可抑制一種或多種促炎基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合的表達。
組合物可包含至少三種能抑制至少兩種或多種基因的表達的dsRNA分子。所述基因可編碼VEGF、VEGF R1和VEGF R2、堿性FGF、FGF R和/或它們的組合。所述基因可為促血管發生基因、內皮細胞增殖基因、單純皰疹病毒基因、促炎基因或它們的組合。
在這些組合物中，dsRNA分子可為dsRNA寡核苷酸。
附圖簡述
圖1顯示含三個功能域陽離子核心、立體聚合物和肽配體的TargeTranTM(TT)的結構示意圖。TT與核酸發生電相互作用，引發自組裝形成納米顆粒，納米顆粒將有效載荷選擇性遞送到具有配體受體的細胞。
圖2顯示siRNA介導的對VEGF途徑基因的體外敲減。35mm孔中的RAW264.7 gamma NO(-)細胞(A)和SVR細胞(B)分別用靶向mVEGFA和mVEGFR1的siRNA以指示量轉染。293細胞(C)用靶向mVEGFR2的siRNA和表達mVEGFR2的質粒以指示量共轉染。轉染48小時后，分離細胞RNA，通過mVEGFA的RT-PCR或mVEGFR1和mVEGFR2)的RS-PCR判斷內源表達的mVEGFA或mVEGFR1的敲減情況，或mVEGFR2的外源表達敲減情況。
圖3顯示FITC標記的siRNA的眼部給藥。CpG植入后六小時，分別通過局部途徑(左)或全身途徑(右)將FITC標記的siRNALuc與PT或TT一起給予小鼠。采用每眼10μg siRNA(局部給藥)或每尾40μg(全身給藥)一次的劑量。siRNA給藥24小時后在熒光顯微鏡下檢查眼球、肝臟和肺的冷凍切片。只顯示了眼切片的結果。
圖4顯示在被感染并用siVEGFmix通過局部或全身給藥治療的角膜中VEGF mRNA水平下降。用1×105pfu HSV-1 RE感染小鼠，并在感染后第1天和第3天用靶向VEGF途徑基因的siRNA通過局部(10μg/眼)或全身(40μg/尾)給藥治療后，在感染后第4天和第7天收集角膜，然后通過RT-PCR(A)或實時定量PCR(B)測量VEGF mRNA水平。
圖5顯示在被感染并用siVEGFmix通過局部或全身給藥治療的角膜中VEGF蛋白質水平下降。在感染后第7天處理兩張角膜/小鼠，以測量VEGF蛋白質水平。如在材料和方法中所述，小鼠用HSV-1感染并用靶向VEGF途徑基因的siRNA治療，通過抗體捕捉ELISA估測其角膜裂解液上清的VEGF水平。結果以四只單獨小鼠(每鼠2張角膜)的平均值±SD表示。在各組之間觀察到VEGF蛋白質水平有統計學顯著性差異(p＜0.05)。
圖6顯示靶向VEGF途徑基因的siRNA的局部給藥能抑制CpGODN誘導的血管發生。將CpG ODN(1μg)植入到小鼠角膜中的微袋24小時后，通過結膜下注射將10μg/眼的siLacZ、siVEGFA、siVEGFR1、siVEGFR2或siVEGFmix(靶向VEGF途徑基因的總siRNA的等摩爾混合物)隨PT一起給予小鼠。在CpG微球(pellet)植入(每組四只小鼠)后第4天和第7天測量血管發生面積。在各組之間觀察到血管發生面積有統計學顯著性差異(*p＜0.05，**p＜0.01)(A)。NV由第7天攝取的照片顯示(40x)(B)。
圖7顯示針對VEGF途徑基因的siRNA的全身給藥能抑制CpGDNA誘導的血管發生。在CpG ODN誘導后6小時和24小時，將針對VEGF途徑基因的單個siRNA或總siRNA混合物通過尾靜脈注射給藥。在CpG微球植入(每組四只小鼠)后第4天和第7天測量血管發生面積。在各組之間觀察到血管發生面積有統計學顯著性差異(*p＜0.05，**p＜0.01)(A)。NV由第7天攝取的照片顯示(40x)(B)。
圖8顯示TargeTranTM介導的全身給藥增強了siRNA的功效，并在CpG ODN誘導后6小時和24小時顯示劑量反應。將被測抗生血管siRNA的混合物或非相關siLuc對照分別隨TT一起全身給藥。siVEGFmix還隨PBS一起給藥。在CpG微球植入后第4天和第7天測量血管發生面積；在各組(每組四只小鼠)之間觀察到統計學顯著性差異(*p＜0.05)(A)。以每鼠10、20、40和80μg總siRNA的劑量全身給藥靶向EGF途徑基因的混合siRNA，進行劑量反應實驗。在CpG微球植入后第4天和第7天測量血管發生面積，比較不同劑量之間的抗生血管效率(B)。
圖9顯示siRNA介導的HSK和血管發生嚴重程度的降低。以每眼1×105pfu HSV-1 RE感染小鼠，在感染后第1天和第3天分別用siVEGF mix或siLuc局部和全身治療。在感染后第10天計算HSK臨床評分的平均值(A)或臨床生血管評分的平均值(B)。每個點代表每只眼睛的臨床評分。橫棒和括號內的數字表示每組的平均值。數據收集兩組平行實驗，每組6只眼睛。在各組之間觀察到HSK或血管發生評分有統計學顯著性差異(p＜0.05)。感染后第14天，在siLuc治療的小鼠受感染角膜中可見血管過度生長和潰瘍形成，而siVEGF mix治療的小鼠在接近角膜緣的區域顯示較少的NV。局部和全身給藥均顯示NV面積明顯減少。全身給藥結果見照片(C)。
圖10顯示綠色熒光標記的siRNA在荷瘤小鼠中的組織分布。小鼠通過靜脈注射以P-nanoplex(左列)或RPP-nanoplex(中列)或水溶液(右列)形式接受40mg熒光標記的siRNA。注射后一小時，解剖組織并在熒光顯微鏡上檢查。每個組織均以相等的曝光時間拍照。P-nanoplex在所有器官中均顯示點狀熒光，在肺和肝臟中尤其強烈。RPP-nanoplex在肺中顯示較弱的熒光水平，為點狀分布，而在肝臟中則是較弱的非點狀熒光。相比于P-nanoplex，在腫瘤中觀察到較高的熒光水平。與兩種nanoplex制劑的任一種相比，給予游離siRNA后所有器官中熒光水平都非常低。
圖11顯示靜脈給予復合于納米顆粒中的導向VEGFR2的siRNA對腫瘤新生血管化和VEGFR2蛋白質水平的抑制作用。(B-D)用siRNARPP-nanoplex治療的腫瘤中的新生血管化。對腫瘤生長抑制實驗結束時切除的代表性腫瘤進行低倍光學顯微鏡檢。對腫瘤和周圍皮膚組織的透照顯示，在不進行治療的小鼠(B)和用帶siRNA-LacZ的RPP-nanoplex治療的小鼠(C)中有強烈的新生血管化。相反，用帶VEGFR2siRNA的RPP-nanoplex治療的小鼠顯示較低的新生血管化和雜亂的血管分支(D)。星號表示腫瘤組織。標尺＝2mm。(E)siRNA RPP-nanoplex治療后腫瘤組織中的VEGFR2表達。將腫瘤生長抑制實驗結束時切除的代表性腫瘤(A)均漿，通過蛋白質印跡法測量VEGFR2表達水平。左泳道是未進行治療的腫瘤，中間泳道是用LacZ siRNA治療的腫瘤，右泳道是用VEGF R2 siRNA治療的腫瘤。
圖12顯示陰性對照siRNA(siLuc)治療的眼睛視網膜中滲漏新生血管化抑制情況的綠色熒光測量結果與VEGF途徑活性siRNA(siMix)治療的眼睛視網膜中滲漏新生血管化抑制情況的綠色熒光測量結果的對比。鋪片揭示給予靶向VEGF、VEGF R1和VEGF R2的活性siRNA抑制劑對NV有抑制作用，但對熒光素酶表達有特異性的陰性siRNA卻沒有抑制作用。綠色熒光染料在滲漏新生血管化部位的滲入由鋪片鏡檢方法獲得的圖像中的綠色觀察到。左邊圖像獲自陰性對照siRNA寡核苷酸即siLuc治療的眼睛，顯示由于滲漏新生血管化造成的綠色熒光。右邊圖像獲自活性siRNA寡核苷酸即siMix治療的眼睛，顯示與陰性對照相比，由于滲漏新生血管化減少造成的綠色熒光減少。
發明詳述本發明提供用以治療眼新生血管化疾病如糖尿病性視網膜病(DR)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、色素層炎、基質角膜炎(SK)和癌癥的組合物和方法。在一個實施方案中，本發明采用RNAi介導的對細胞和生化途徑的抑制來實現對眼病的抑制。本發明提供包括siRNA寡核苷酸在內的RNAi藥物來抑制1)病毒感染的基因表達，2)炎性細胞和生化途徑，3)促血管發生細胞和生化途徑，包括VEGF、VEGF受體、FGF、FGF受體、PDGF和PDGF受體，4)介導眼新生血管化的細胞增殖，和5)它們的組合。在一個實施方案中，本發明采用全身給藥的化學合成載體來遞送合成的siRNA寡核苷酸。本發明提供siRNA介導的局限于眼組織和發生新生血管化疾病的組織的抗血管發生效應。本發明為核酸藥物、蛋白質或肽和為小分子抑制眼病的過度新生血管化提供方法。本發明還對誘導不需要的眼新生血管化的多個因子和多個生化途徑的抑制提供藥物組合。本發明還提供將治療藥物給予眼組織的臨床手段。本發明的方法和組合物可用以治療由眼睛感染、糖尿病性視網膜病、年齡相關性黃斑變性和眼癌癥引起的眼新生血管化。
VEGF是負責正常血管生成和血管再塑的必需生長因子。在某些疾病條件下，例如在腫瘤狀況下(其中形成新生血管以向快速生長的異常組織傳送足夠的氧和營養物)，VEGF生血管途徑將被激活。在美國，大多數嚴重視力喪失由局部缺血性眼病如糖尿病性視網膜病、視網膜靜脈阻塞和早產兒視網膜病試驗對象中聯合視網膜新生血管化的并發癥引起。生血管蛋白質VEGF的眼內表達與這些人類病癥中的新生血管化和與小鼠中局部缺血誘導的視網膜新生血管化密切相關。因此，由VEGF和VEGF受體組成的的VEGF途徑是抑制視網膜血管發生的合理靶標。
可獲得公布的臨床相關動物模型，以便評估抗生血管藥物，開發出針對眼NV疾病的新型治療藥物。一種視網膜血管發生臨床相關動物模型采用低氧來誘導過度血管發生。另一種視網膜血管發生模型采用激光燒傷來造成出現血管發生的視網膜損傷。一種角膜NV臨床相關動物模型采用通過預先植入到小鼠角膜基質的微袋中的CpG或通過HSV感染進行的疾病誘導，這樣可容易地測量對血管發生的抑制作用。可首先在細胞培養物中測試候選治療藥物的效果，然后在疾病的臨床相關動物模型中有選擇的進行研究。
RNAi治療方法RNAi，雙鏈RNA(dsRNA)誘導序列特異性的信使RNA(mRNA)的降解，常稱為基因沉默，它已被證明是發現基因或驗證基因的一種強有力工具，且在開發新型基因特異性藥物中擁有極大的潛力。在我們為抑制眼NV而進行的抗生血管RNAi設計中，選擇了VEGF生血管途徑的關鍵參與者mVEGF-A、mVEGF-R1和mVEGF-R2作為靶基因。小干擾RNA(siRNA)根據Tuschl的研究小組建議的一般指導方針進行設計。該siRNA是21核苷酸長的雙鏈RNA，在任一3′末端均帶2-nt突出端，負鏈與靶mRNA序列互補。單獨或組合敲減這些基因，具有阻斷生血管途徑、導致NV被抑制，從而減輕SK癥狀的效果。相同的方法適用于其他NV相關眼病。
迄今為止，尚沒有給予RNAi藥物至靶向眼新生血管化的合適技術報道。因此，針對眼新生血管化疾病的RNAi藥物的專利核酸給藥系統存在極大的需求。RNA干擾(RNAi)的應用在細胞培養和模式生物如果蠅、線蟲、紋斑魚中已取得飛速的發展。對RNAi的研究已發現，長dsRNA由切酶(一種細胞核糖核酸酶III)加工，產生帶3′-突出端的約21nt雙鏈體，稱為短干擾RNA(siRNA)，其介導序列特異性的mRNA降解(4，5，6)。對RNAi的機制及其快速擴大的應用的認識，代表了生物醫學領域近十年來的重大突破。應用siRNA雙鏈體來干擾特定基因的表達需要靶標可接近性的知識，但還受阻于缺乏給予siRNA到眼NV疾病的靶細胞的有效手段。隨著有關siRNA作為功能基因組工具的文獻的飛速增多，人們對將siRNA用作新型治療藥物的興趣不斷涌現。治療應用顯然要依賴于有效的局部和全身給藥方法。使用siRNA作為治療藥物的優點顯然應歸于其特異性、穩定性、效力、自然作用機制，以及靶向不同基因靶標的藥物的一致化學特性，因為這些藥物只在核苷酸序列上有所不同。
我們已用siRNA使腫瘤模型中的促血管生成因子沉默，并已證實了強烈的基因沉默效應(10)。這個進展證實了RNAi在體外和體內使促血管生成因子沉默的可行性和有效性，并證明我們的分子設計和專利給藥系統適用于siRNA介導的基因沉默來治療眼新生血管化。已將稱之為TargeTranTM的全身給藥系統用于siRNA的給藥(11)。siRNA給藥載體是基于Woodle等(WO 01/49324，其內容通過引用整體結合到本文中)描述技術的陽離子聚合物。本文所用的“合成載體”指多功能合成載體，其最少含有核酸結合結構域和配體結合(即組織靶向)結構域，并與核酸序列復合。合成載體還可含有其他結構域，例如親水聚合物結構域、內體破壞或解離結構域、核靶向結構域和核酸凝縮結構域。用于本發明的合成載體優選能使非特異性相互作用減少，但仍能有效地參與配體介導的(即特異性的)細胞結合。另外，用于本發明的合成載體能夠與一種或多種治療核酸形成復合物，并隨后可給予試驗對象。我們已用這種全身方法通過尾靜脈注射在嚙齒類動物中給予這些siRNA。對VEGF A、VEGF R1和VEGF R2的敲減作用導致眼新生血管化明顯被抑制(13)。
我們還使用了另一種稱之為PolyTranTM的基于聚合物的載體來在體外和體內給予siRNA。這種技術(參見WO 0147496，其內容通過引用整體結合到本文中)能夠極大地減少由CpG在本應無血管的小鼠眼角膜中誘導的新血管系統形成。我們在siRNA設計和實驗中取得的成功顯示了開發RNAi治療藥物以治療皰疹性SK和其他生血管眼病的巨大可能性(圖1-3)。
RNAi和治療藥物本發明提供能抑制基因表達和干預眼新生血管化的干擾RNA藥物。本發明提供許多形式的干擾RNA分子作為治療藥物，包括雙鏈RNA(dsRNA)寡核苷酸、小發夾RNA(shRNA)和DNA衍生的RNA(ddRNA)。本發明還提供因其序列而有活性，但未必被認為是“RNA干擾”的核酸藥物，包括誘殺性寡核苷酸、反義、核酶、基因表達和適體。這些核酸和其他治療藥物具有凈負電荷或其他物理特性，這樣本發明的制劑和組合物可被眼組織和細胞接觸并在需要時吸收。
RNAi是可用來敲減基因表達，從而以序列特異性方式破壞mRNA的有效方法。可操縱RNAi，以快速和持續的方式提供生物功能。本發明提供對基因進行選擇性干預的RNAi藥物來治療眼NV或其他NV相關眼病，以此作為控制人類眼病的手段。
干擾RNA的設計RNAi藥物設計成具有與靶向基因的一段序列匹配的核苷酸序列。選定的靶向基因的RNAi序列可在由該基因表達所產生的mRNA的任何部分。RNAi包含能與來自靶基因的mRNA雜交的序列，即RNAi序列的“反義鏈”。RNAi序列包含能與反義鏈雜交的序列，即RNAi序列的“有義鏈”。所選靶向序列的RNAi序列不應與細胞所產生的任何其他mRNA同源，也不應與不被轉錄成mRNA的靶向基因的任何序列同源。已知有多種設計規則，包括市售的方法，是從靶mRNA序列選擇20-27堿基的序列。這些設計方法不斷發展，可采用當前最流行的方法。可從至少三個方法獲得設計方案，然后從這些方法構建和裝配最高優先的單一共有序列表。本發明發明人發現制備至少6個最高優先的候選序列，然后進行細胞培養以測試其基因抑制能力，幾乎都能夠揭示出至少兩個活性RNAi序列。如果不是這樣，則可進行第二輪的獲取6個最高優先的候選序列并用于試驗。
設計工作除需要鑒定活性RNAi序列外，還必須確保只與所需的mRNA序列有同源性。RNAi序列與靶基因mRNA的基因組序列之外的基因組序列同源性差，能在mRNA水平或基因水平減少脫靶反應(off-target effect)。同樣，RNAi序列的“有義鏈”同源性差，也能減少脫靶反應。通過用Clone Manager Suite(SciEd Software，Cary NC)進行DNA比較和通過在線Blast檢索，可確認選定基因的靶向序列是獨特的，且缺乏與其他基因(包括人類對等基因)的序列同源性。例如，與mVEGF-A的mRNA匹配的序列經確認對mVEGF-A是獨特的，與mVEGF-B mRNA、mVEGF-C mRNA、mVEGF-D mRNA或人類對等基因(包括hVEGF165-a(AF486837))沒有同源性。但是，匹配的序列會靶向mVEGF-A的多個同種型，例如分別編碼190氨基酸(aa)、141aa、146aa和148aa mVEGF-A蛋白質的mVEGF(M95200)、mVEGF115(U502791)、mVEGF-2(S38100)、mVEGF-A(NM_192823)。所有這些公開的mVEGF-A同種型的cDNA序列，除mVEGF-A(NM_192823，蛋白質的成熟形式)之外，其N端均包含26aa信號肽。mVEGF的靶向序列不是選擇在信號肽部分，而是選擇在所有這些mVEGF-A同種型共有的成熟蛋白質部分。mVEGF-R1和mVEGF-R2的靶向序列也被證實分別對這兩個基因是獨特的。本發明包括不同形式的干擾RNA。例如，小干擾RNA(siRNA)采用已知的指導方針按上述靶序列進行設計。這些siRNA是21nt雙鏈RNA寡核苷酸，3′突出端為2nt(TT)。靶向序列(mRNA序列)和siRNA的序列在表1中列舉。
RNAi藥物對靶基因序列具有特異性，這取決于基因的物種。大多數哺乳動物基因具有很高的同源性，這樣可選擇RNAi藥物，以對所有帶有基因mRNA的該同源區段的物種中的基因產生活性。本發明的優選RNAi藥物設計與人基因mRNA序列有完全的同源性，與至少一種用于毒性試驗的動物物種的基因mRNA有足夠同源性，以對該動物物種基因產生活性。
RNAi藥物對靶基因序列具有特異性，這可包括對單核苷酸多態性(SNP)的特異性。本發明優選的RNAi藥物設計是與疾病病理相關的全部多態性的靶基因的所有人基因mRNA序列有完全的同源性，與疾病病理無關的全部多態性的靶基因的所有人基因mRNA序列有較少的同源性。
表1.基因及部分靶向mRNA序列(顯示反義鏈)
臨床相關動物模型最近的小鼠眼模型提供了可行的角膜NV臨床相關模型。在這個模型中，用純化的HSV DNA(富含CpG)和/或合成的CpG基序-寡核苷酸(CpG ODN)，而不是用HSV干擾或VEGF蛋白質，來誘導角膜中的VEGF表達，從而誘導NV和角膜SK。在這個模型中，易于誘導新生血管化并加以測量。本發明采用這個模型來測試干擾RNA并收集有關CpG誘導SK的RNAi療法的數據，以提供定量數據，產生接近于HSV感染相關的人眼SK的環境。
對病毒感染的抑制眼新生血管化的一種已確立的原因是皰疹和其他病毒感染。一種干預病毒感染衍生的眼新生血管化的手段是抑制病毒感染的起源。RNAi藥物利用的是對dsRNA病毒感染有活性的內源過程，但事實上可用來具有高度選擇性的抑制幾乎任何mRNA的表達。本發明提供用以抑制眼病毒感染的RNAi藥物作為干預眼新生血管化的手段。本發明的RNAi藥物包括短dsRNA寡核苷酸——siRNA，其具有與病毒基因序列匹配的序列，缺乏對人類基因的序列特異性。本發明的RNAi藥物能抑制由DNA或RNA病毒感染所表達的mRNA，能降解dsRNA病毒感染的基因組。本發明的RNAi藥物所抑制的一種DNA病毒感染是引起皰疹性基質角膜炎的HSV。這種病毒具有相對較大的保持游離的基因組，病毒mRNA的表達水平隨時間推移有升有降。連續低水平的HSV病毒mRNA表達導致持續的(盡管是潛伏的)感染，這種感染不時會發作。本發明的RNAi藥物可用來抑制感染復發引起的HSVmRNA表達升高。通過降低感染出現發作的能力，RNAi藥物能防止眼新生血管化疾病被誘發。RNAi藥物還可用于將連續的低水平HSVmRNA表達減少至更低的水平，這能降低HSV感染出現發作的能力。RNAi藥物能有效地抑制導致眼新生血管化的眼組織DNA和RNA病毒感染。
對促進眼NV的炎性細胞和途徑的抑制炎癥是涉及許多細胞和生化因子的過程，這個過程盡管復雜，但在各種組織中卻是高度保守的。炎癥中的一個早期事件是組織低氧、損傷或其他傷害所引起的激活因子分泌。這些因子能激活細胞，誘導炎性細胞募集到組織中，炎性細胞再分泌出另外的激活因子。炎癥的誘導的一個共同生化途徑是TNF和IL-1的分泌。這些因子主要以并行的方式起作用，因此要強烈抑制它們對炎癥級聯的激活作用需要同時干預它們兩者。在此點下游，炎癥級聯導致誘導新生血管化的因子的分泌，炎癥過程提供了許多可供干預的點引發級聯的分泌性因子的上游；和負責激活級聯中的特定細胞的因子的下游，如內皮細胞從血液募集嗜中性粒細胞和內皮細胞誘導新生血管化。本發明提供能有效抑制因子上調的RNAi藥物，所述因子在炎癥中的作用取決于其基因的表達。雖然許多分泌性因子存在于細胞中并被釋放出來引發炎癥，但對于炎癥的不斷發展和對于炎癥的持續存在來說，對上述這些因子的表達進行上調是重要的。本發明的RNAi藥物提供了對持續性炎癥的抑制，而持續性炎癥是造成眼新生血管化疾病的更強因素。有多種因子參與到炎癥途徑中，特別是導致眼新生血管化疾病的持續性眼炎癥，重要的是包括內皮細胞激活。
對介導眼NV的生血管途徑的抑制血管發生過程和炎癥一樣，雖然復雜但在各種組織中卻高度保守。另一個相似性是幾種分泌性因子所起的主要作用。有一個早期步驟由涉及VEGF生長因子的分泌的VEGF途徑驅動，所述VEGF生長因子結合并激活攜帶VEGF家族不同成員的受體的細胞。這些生長因子還與其他受體(例如NP-1)發生相互作用，從而刺激攜帶這些受體的細胞，包括腫瘤細胞。另一種主要的分泌性生血管生長因子是bFGF，其激活單獨一套受體。這兩種途徑均激活鄰近血管系統中的內皮細胞，刺激它們發生增殖和遷移，從而在分泌生長因子刺激物的區域形成新的血管系統。但是，VEGF誘導的胞內激酶信號轉導途徑和bFGF途徑在與c-RAF或其下游靶轉錄因子如NFkB有關的公共點合并。因此，VEGF途徑和bFGF途徑在它們合并前以略為并行的方式起作用。新生血管化的這些分泌性生長因子途徑代表了供進行本發明所提供的治療干預的非常有用的點，所述治療干預可通過抑制生長因子或其受體或兩者來進行。本發明還提供同時抑制兩種途徑，以及抑制這些途徑所誘導的胞內信號，如誘導的信號轉導激酶，或者在優選的實施方案中為轉錄因子。轉錄因子已被確立為有用的治療干預點，但常規治療方式對其卻難以對付。本發明提供抑制蛋白質(包括轉錄因子)的表達的RNAi藥物，這使得現在能夠在新生血管化的這些關鍵胞內步驟進行治療干預。
VEGF家族由五個結構上相關的成員組成VEGF-A、胎盤生長因子(PIGF)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。VEGF受體家族中存在三種結構上同源的酪氨酸激酶受體VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR或Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)，它們與不同VEGF成員具有不同親和性或相關的功能。雖然對其他四種VEGF成員的功能和調節知之甚少，但已知VEGF-A能結合VEGFR-1和VEGFR-2，誘導新生血管化、血管發生和血管通透性。為在功能上與其特異性受體發生相互作用，VEGF自然形成同型二聚體。VEGFR-1和VEGFR-2在腫瘤和增生的內皮中均被上調，這可能是對VEGF-A或部分上對低氧的直接響應。普遍認為VEGFR-2介導血管生長的血管生成信號，且為增殖所必需。但是，VEGFR-1的功能卻不甚明確。VEGFR-1對VEGF-A的親和性比VEGFR-2高，且能介導運動性和通透性，因此在轉導血管生成信號中發揮作用。對VEGF和VEGF受體的基本生物學性質的認識，為設計靶向VEGF信號傳導途徑的方法提供了堅實的基礎。本發明提供能特異性抑制鼠和人形式的VEGF、VEGF受體和胞內信號轉導途徑的RNAi藥物。
bFGF途徑是幾種FGF途徑之一。bFGF因子是血管發生的強刺激物，因此，它和它的受體是治療干預的重點。本發明提供能特異性抑制bFGF及其受體和胞內信號轉導途徑的RNAi藥物。
對眼NV內皮細胞增殖的抑制新血管系統形成的一個關鍵步驟是鄰近血管系統中激活的內皮細胞的增殖。這個步驟是治療干預的重點。已知許多胞內因子對于內皮細胞存活和/或增殖是必不可少的。本發明提供的兩個實施方案是1)阻斷內皮細胞增殖和2)誘導激活內皮細胞的凋亡。這兩個實施方案任一個或兩者導致因內皮細胞增殖和遷移被抑制造成的新血管系統減少。本發明提供抑制細胞周期從而抑制增殖的RNAi藥物。本發明還提供引發激活內皮細胞凋亡的RNAi藥物。本發明提供能通過與新血管系統激活有關的ανβ3/ανβ5整聯蛋白上調選擇性結合激活內皮細胞的配體靶向納米顆粒。本發明提供的納米顆粒能將RNAi藥物給予到內皮細胞的胞內區室，以誘導凋亡或抑制增殖，或者這兩方面同時發生。
抑制眼NV疾病的組合方式導致過度和不需要的眼新生血管化的過程是復雜的，通常涉及并行的生化途徑。因此，在一個靶標乃至一個途徑上進行治療干預不能完全控制疾病病理(新生血管化)。本發明提供組合干預在生化途徑的多個靶標上干預，或者在多個途徑上干預，或者兩方面同時進行。例如，本發明提供對VEGF途徑的多個靶標的干預，包括針對VEGF-A、VEGF-R1和VEGF-R2的siRNA組合。本發明進一步提供在多個途徑上的干預，包括siRNA VEGF途徑靶標和bFGF途徑靶標的組合。本發明還提供這些組合的組合，例如針對VEGF途徑和bFGF途徑的siRNA組合。本發明還提供在疾病病理的多個方面上進行組合干預，如引發包括病毒感染介質在內的各種因子，引發炎癥途徑、生血管途徑和內皮細胞增殖途徑。
治療藥物的給藥，包括定位、局部和全身給藥本發明提供用以給予治療藥物以治療眼新生血管化疾病特別是治療眼前部的疾病的組合物和方法。本發明還提供用以給予治療藥物以治療眼睛任何部位(包括眼后部)的眼新生血管化疾病的組合物和方法。眼睛任何部位的組織，可根據本發明用新血管系統靶向給藥的治療藥物通過局部給予到眼睛和通過在遠側部位靜脈內給予來治療。眼前部的組織，可根據本發明通過局部給予到結膜下組織、通過局部給予到眼睛、通過眼周注射、通過眼內注射和通過在遠側部位靜脈內給予來治療。本發明提供的組合物包含1)通過靜電相互作用結合核酸的陽離子劑(cationic agent)，包括非天然合成聚合物、接枝聚合物、嵌段共聚物、肽、脂質和膠束，2)降低與組織和細胞的非特異性結合的親水劑(hydrophilic agent)，包括非天然合成聚合物、肽和碳水化合物，3)組織和細胞穿透劑(penetrating agent)，包括表面活性劑、肽、非天然合成聚合物和碳酸化合物。
優選的一類肽是組氨酸-賴氨酸共聚物，其為一大類堿性陽離子肽，在一些情況下稱為PolyTranTM。優選的另一類肽是線型聚賴氨酸，其中組氨酸或咪唑單體偶聯到賴氨酸單體的ε氨基部分。優選的組合物具有帶負電荷的治療藥物如核酸與陽離子肽的自組裝復合物，其中陽離子電荷過量2倍至10倍，更優選陽離子電荷過量2倍至6倍。優選的一類與組氨酸或咪唑單體偶聯的聚賴氨酸，其賴氨酸單體的伯胺偶聯度達30-70％。優選的另一類肽是其單體由組氨酸-組氨酸-賴氨酸三肽或組氨酸-組氨酸-賴氨酸-賴氨酸四肽組成的聚合物，其中所述聚合物為線型聚合物或支鏈聚合物，支鏈聚合物中的一個單體偶聯到另一個單體的α或ε氨基或均偶聯。聚賴氨酸類聚合物的優選分子量范圍為5,000-100,000，更優選分子量為10,000-30,000。
優選的一類接枝聚合物是與親水聚合物接枝的肽，其中所述親水聚合物包括PEG、聚唑啉(polyoxazoline)、聚縮醛(在一些情況下稱為Fleximer)、HPMA和聚甘油。優選的組合物具有帶負電荷的治療藥物如核酸與陽離子接枝聚合物的自組裝復合物，其中陽離子電荷過量2倍至10倍，更優選陽離子電荷過量2倍至6倍。親水聚合物的優選分子量范圍為2,000-10,000。優選的另一類接枝聚合物是與親水聚合物接枝的肽，其進一步包含接枝到親水聚合物的配體，其中所述配體包括肽、碳水化合物、維生素、營養物和抗體或它們的片段。
優選的一類非天然合成陽離子聚合物是具有乙基-氮(-C-C-N-)主鏈重復單元的聚合物，包括聚唑啉和聚乙烯亞胺(PEI)。優選的組合物具有帶負電荷的治療藥物如核酸與陽離子聚合物的自組裝復合物，其中陽離子電荷過量2倍至10倍，更優選陽離子電荷過量2倍至6倍。在一個實施方案中，本發明提供用組氨酸或咪唑單體衍生化的線型聚唑啉或PEI。優選的另一類聚合物是用組氨酸或咪唑單體衍生化的支鏈聚唑啉或PEI。優選的一類與組氨酸或咪唑單體偶聯的聚合物其30-70％的堿性部分是咪唑。所述聚合物的優選分子量在5,000-100,000的范圍，更優選分子量為10,000-30,000。
優選的一類接枝聚合物是與親水聚合物接枝的聚合物，其中所述親水聚合物包括PEG、聚唑啉、聚縮醛(在一些情況下稱為Fleximer)、HPMA和聚甘油。優選的組合物具有帶負電荷的治療藥物如核酸與陽離子接枝聚合物的自組裝復合物，其中陽離子電荷過量2倍至10倍，更優選陽離子電荷過量2倍至6倍。優選的另一類接枝聚合物是與親水聚合物接枝的聚合物，其進一步包含接枝到親水聚合物的配體，其中所述配體包括肽、碳水化合物、維生素、營養物和抗體或它們的片段。
優選的另一類陽離子聚合物是具有聚縮醛主鏈的聚合物。優選的組合物具有帶負電荷的治療藥物如核酸與陽離子聚縮醛聚合物的自組裝復合物，其中陽離子電荷過量2倍至10倍，更優選陽離子電荷過量2倍至6倍。在一個實施方案中，本發明提供用堿性部分衍生化的線型聚縮醛，其中所述堿性部分類別包括賴氨酸、伯胺、組氨酸和咪唑單體的混合物。優選的另一類聚合物是用堿性部分(同樣包括賴氨酸、胺、組氨酸和咪唑單體類別)衍生化的支鏈聚縮醛。優選的一類與賴氨酸、胺、組氨酸和咪唑單體偶聯的聚縮醛聚合物其30-70％的堿性部分是咪唑。所述聚合物的優選分子量在5,000-100,000的范圍，更優選分子量為10,000-30,000。優選的一類接枝聚合物是用親水聚合物接枝的聚合物，其中所述親水聚合物包括PEG、聚唑啉、聚縮醛(在一些情況下稱為Fleximer)、HPMA和聚甘油。優選的另一類接枝聚合物是用親水聚合物接枝的聚縮醛聚合物，其進一步包含接枝到親水聚合物的配體，其中所述配體包括肽、碳水化合物、維生素、營養物和抗體或它們的片段。
優選的一類脂質是Woodle等(WO 01/49324，其內容通過引用整體結合到本文中)所公開的取代的乙醇胺。優選的組合物具有帶負電荷的治療藥物如核酸與陽離子脂質的自組裝復合物，其中陽離子電荷過量2倍至10倍，更優選陽離子電荷過量2倍至6倍。優選的另一類脂質是用親水聚合物接枝的脂質，優選的又一類脂質是聚合物接枝的脂質，其進一步包含接枝到親水聚合物的配體，其中所述配體包括肽、碳水化合物、維生素、營養物和抗體或它們的片段。
優選的一類膠束是其中一種嵌段包含親水聚合物、另一種嵌段包含疏水聚合物的嵌段共聚物，包括聚環氧丙烷、疏水聚唑啉、用伯胺或咪唑或兩者衍生化的疏水聚合物、用能與治療藥物形成可裂解的鍵的部分衍生化的疏水聚合物，所述部分包括形成二硫化物的巰基、形成席夫堿的醛以及形成酯的酸或醇。優選的組合物具有帶負電荷的治療藥物如核酸與膠束的自組裝復合物，其中膠束質量比治療藥物質量過量2倍至50倍，更優選質量過量4倍至20倍。優選的另一類膠束是進一步包含接枝到親水聚合物的配體的嵌段共聚物，其中所述配體包括肽、碳水化合物、維生素、營養物和抗體或它們的片段。
本發明的一個實施方案包括由以下三個功能域組成的共軛聚合物陽離子聚合物如25kD PEI、親水聚合物如3.4kD聚乙二醇(PEG)和配體如二硫化物穩定化的折疊RGD-肽。陽離子聚合物域能縮合培養哺乳動物細胞的常規轉染中所采用的核酸(DNA或RNA)。親水聚合物功能域保護被給藥的核酸免受降解，而且屏蔽表面電荷，從而防止核酸與細胞表面上或血液中存在的蛋白質之間發生非特異性電荷介導相互作用。這些非特異性相互作用往往誘導治療藥物分布不利或者有害的生物活性。第三種域即RGD-肽配體提供對在有新生血管化的組織中被上調的細胞表面整聯蛋白(如ανβ3和ανβ5整聯蛋白)的組織和細胞特異性尋靶作用。這個實施方案可用來進行siRNA全身給藥，以靶向新血管系統和抑制不需要的血管發生(包括在眼部)。
本發明提供配制成制劑的治療藥物(包括siRNA)以給予細胞中組織中。制劑能保護核酸免受降解，促進治療藥物的組織和細胞吸收。通過用本發明的制劑組合物給予RNAi或其他帶負電荷的治療藥物，本發明實現了治療藥物的細胞吸收和對內源靶基因表達的抑制。通過使用制劑進行局部給藥，本發明提供將siRNA和其治療藥物局部給予眼睛以治療眼病，包括基質內感染、角膜新生血管化、基質角膜炎、色素層炎等。盡管局部給藥可能比遠處全身給藥侵入性更強，而且招致會導致炎癥的感染或刺激風險，但在許多臨床情況下，例如在嚴重NV病情或在快速生長的腫瘤的情況下，還是優選局部給予siRNA。本發明還提供摻入能提高對組織的黏附力和對角膜內皮的通透性的藥物。這種組合提供滴眼劑形式的局部應用。
通過使用本發明的組合物和方法，可將siRNA和其他治療藥物通過局部注射或靜脈注射給藥用于治療眼新生血管化。
實施例實施例1.局部和全身給予VEGF途徑抑制劑以治療眼前部NV疾病小鼠SK模型、病毒和組織培養眼基質角膜炎(SK)BALB/c小鼠模型已被報道，其角膜NV通過微袋方法將CpG DNA寡核苷酸(CpG ODN，含有HSV DNA基因組的NV誘導基序等價物)植入到基質中來誘導，或者通過角膜劃痕法進行HSV-1病毒感染來誘導。本研究中所用刺激性ODN的序列是1466，TCAACGTTGA和1555，GCTAGA CGTTAGCGT(由美國FDA生物制品評價和研究中心的Dr.Dennis M.Klinman博士提供)。用于植入到角膜微袋的微球含有ODN 1466和1555的等摩爾混合物以及先前所報道的hydron聚合物。用HSV-1 RE株(由Uni.Alabama，Mobile的RobertLausch博士提供)以每眼2-μl 1×105蝕斑形成單位的劑量誘導HSK。為測試體外RNAi效果，使用了以下三種細胞系RAW264.7 gamma NO(-)，ATCC CRL-2278，為表達內源mVEGF-A的小鼠巨噬細胞系。SVR，ATCC CRL-2280，為荷mVEGF受體(mVEGFR1和mVEGFR2)的小鼠內皮細胞系。293細胞系，用于由cmv啟動子驅動的表達mVEGFR2的pCImVEGFR2質粒轉染，以檢測外源mVEGFR2的敲減。
小干擾RNA(siRNA)設計雙鏈siRNA，以靶向VEGF途徑因子mVEGF-A(XM_192823)、mVEGFR1(D88689)和mVEGFR-2(MN010612)。從每個基因選取兩個靶序列。這些序列是(從5′到3′)mVEGF-A1)AAGCCGTCCTGTGTGCCGCTG；mVEGF-A 2)AACGATGAAGCCCTGGAGTGC；mVEGFR1 1)AAGTTAAAAGTGCCTGAACTG；mVEGFR1 2)AAGCAGGCCAGACTCTCTTTC；mVEGFR2 1)AAGCTCAGCACACAGAAAGAC；mVEGFR2 2)AATGCGGCGGTGGTGACAGTA。為合成非相關siRNA對照，還選擇了LacZ(E00696)和螢火蟲熒光素酶(Luc，AF434924)各自的兩個靶序列。它們是LacZ1)AACAGTTGCGCAGCCTGAATG；LacZ 2)AACTTAATCGCCTTGCAGCAC；Luc 1)AAGCTATGAAACGATATGGGC；2)AACCGCTGGAGAGCAACTGCA。Blast序列檢索確認這些siRNA對它們的靶向序列的特異性，mVEGF-A靶標設計成由不同mVEGF-A異構體所共有。所有siRNA均按Tuschl的研究小組建議的公認指導方針委托設計成21-nt雙鏈RNA寡核苷酸，其任一RNA鏈的中間為19-nt雙鏈體，3’-末端為dTdT突出端；并由Qiagen合成。為獲得更好的RNAi效果，我們例行使用靶向單個mRNA分子上的不同序列的兩個雙鏈21-核苷酸RNA雙鏈體的混合物。
RNA模板特異性PCR(RS-PCR & RT-PCR)進行RS-PCR，以檢測siRNA體外對mRNA的敲減作用。細胞質RNA通過RNAwiz(Ambion，#9736)按廠商說明書進行分離，另進行DNA酶處理，然后用專門設計的引物進行RS-PCR。RT反應的mRNA特異性反向引物均為47-mer寡核苷酸，其5′-末端30-mer的獨特序列(稱為“TS1”序列，以下用大寫字母表示)與對每個mRNA分子獨特的17-mer序列(以下用小寫字母表示)連接。它們是(從5′到3′)1)mVEGFA DnGAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAcaagctgcctcgccttg；2)mVEGFR1 DnGAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAtagattgaagattccgc；3)mVEGFR2 DnGAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAggtcactgacagaggcg。
RT試驗后對所有被測基因進行的PCR試驗使用相同的反向引物，TS 1GAACATC GATGACAAGCTTAGGTATCGATA。PCR的正向引物是30-mer寡核苷酸，均對每個基因獨特1)mVEGFA UpGATGTCTACCAGCGAA GCTACTGCCGTCCG；2)mVEGFR1 UpGTCAGCTGC TGGGACACCGCGGTCTTGCCT；3)mVEGFR2 UpGGCGCTGCTAGCTGTCGCTCTGTGGT TCTG。
持家基因GAPDH的RT-PCR用作RS-PCR中所用RNA量的對照。寡脫氧胸苷(dT)引物(19-mer)用于GAPDH的RT試驗。用于PCR的引物是20-mer寡核苷酸1)GAPDH UpCCTGGTCACCA GGGCTGCTT；2)GAPDH DnCCAGCCTTCTCCATGGTGGT。
還根據前述方案使用RT-PCR。為檢測mVEGF-A表達，所用引物是5′-GCGGGCTGCCTCGCAGTC-3′(有義鏈)和5′-TCACCGCCTTGGCTTGTCAC-3′(反義鏈)。
定量實時PCR用DNA Engme Opticon(MJ Research Inc.)進行QRT-PCR。用SYBR Green I試劑(Qiagen，CA)按照廠商方案進行PCR。在引物的優選程序中，1％瓊脂糖凝膠分析證實了一個預測大小的產物的擴增，無引物二聚體帶。通過建立解鏈曲線圖形也確認每個寡核苷酸組無引物二聚體形成。如下進行計算，以作樣品之間的半定量比較對于每個樣品，通過扣除目的基因的CT(循環閾值)與“持家”基因GAPDH的CT之差(目的基因CT-GAPDH CT＝ΔCT)使數據歸一化。然后將此ΔCT與載體對照樣品的表達水平比較(樣品ΔCT-載體ΔCT)。為確定目的基因的相對增強表達，進行以下計算改變倍數＝2(樣品ΔCT-載體ΔCT)。所用的引物是mGAPDH有義鏈5′-CATCCTGCACCACCAACTGCTTAG-3′，GAPDH反義鏈5′-GCCTGCTTCACCACCTTCTTGATG-3′，mVEGF164有義鏈GCCAGCACATAGAGAGAATGAGC和mVEGGF165反義鏈CAAGGCTCACAGTGATTTTCTGG。
siRNA的體內給藥用PolyTranTM(PT)和TargeTranTM(TT)分別通過結膜下和尾靜脈注射局部和全身給藥siRNA。PT是一類能通過其帶正電荷的顆粒表面高效率地轉化細胞的陽離子多肽。TT屬于配體靶向的nanoplex，其與不需要的生物分子和細胞的非特異性相互作用大為減少。TT由以下三個功能層組成結構上與先前報道的含RGD肽類似的H-ACRGDMFGCA-OH肽的RGD配體、PEG立體層和聚集siRNA或其他大分子的陽離子PEI核心(圖1)。通過設計，TT-siRNA制劑能靶向RGD特異性整聯蛋白被上調的生血管組織。先前研究已在異種移植乳腺癌小鼠腫瘤模型中證明了TT-siRNA制劑的功效，在所述小鼠腫瘤模型中給予靶向人VEGF和小鼠VEGFR2的siRNA獲得了相當大的腫瘤生長抑制作用。
siRNA體內抗生血管功效的評估siRNA抑制角膜NV和HSK的功效通過三種方式進行評估。
1)測量生血管區域在CpG ODN微球植入后第4天和第7天，用測徑器在立體顯微鏡下測量NV區域的長度和寬度。起源于角膜緣血管環并長向角膜中央的新血管以角膜圓周鐘點數描述，每個鐘點數等于圓周的1/12。NV面積按橢圓的公式計算。A＝[(鐘點數)×0.4(血管長度mm)]/2。
2)HSK嚴重程度的臨床評分在HSV感染后不同日子用裂隙燈檢查眼睛臨床損傷的發展。角膜炎損傷的臨床嚴重程度按以下體系評分0，正常角膜；+1，輕度角膜混濁；+2，中度角膜不透明或結疤；+3，炎癥角膜不透明但虹膜可見；+4，不透明角膜和角膜潰瘍；+5，角膜破裂和壞死性基質角膜炎。
3)NV嚴重程度的臨床評分血管發生的嚴重程度如前所述進行記錄。簡單的說，眼睛的特定四分之一圓周評分為4代表1.5mm朝向角膜中央的向心生長。將眼睛的四個四分之一圓周的分數加和，得到每只眼特定時間點的新生血管化指數(范圍0-16)。
xx.RNA模板特異性RT-PCR針對三個鼠VEGF途徑基因的siRNA序列的體外測量為評估候選siRNA序列的基因抑制作用，在細胞培養物中進行了一系列的轉染，siRNA對mRNA水平的作用確定為siRNA活性的量度。用上述RS-PCR和RT-PCR進行測量。如圖2所示，獲得了siRNA序列敲減所有三個VEGF途徑基因的證據。抑制作用在一些情況下是針對內源表達，在另一些情況下則是針對內源表達。
mVEGF-A的體外抑制如圖2A所示，在RAW264.7 NO(-)細胞——內源表達VEGF-A的小鼠巨噬細胞系中評估siRNA序列抑制VEGF-A的能力。如RT-PCR所測出，mVEGF-A的120和164同種型的表達均按劑量依賴性方式降低，而對照siRNA的轉染沒有作用。
mVEGF-R1的體外抑制siRNA序列抑制VEGF R1的活性在內源表達此種VEGF受體的SVR細胞中評估。如圖2B所示，由RS-PCR測出，轉染48小時后mVEGFR1表達按劑量依賴性方式降低，而對照siRNA的轉染對mVEGFR1水平沒有作用。
mVEGF-R2的體外抑制最后，siRNA序列抑制VEGF R2的活性在293細胞中用供質粒pCImEGFR2進行外源表達的共轉染方法來評估。圖2C顯示mVEGFR2表達降低，而對照siRNA的轉染沒有作用。
這些體外研究結果表明，所有三種被研究的鼠VEGF途徑基因均能被通過生物信息學方法鑒定的siRNA序列所抑制。現適合根據此研究成果評估siRNA在眼組織中的體內給藥和活性。
熒光siRNA向鼠眼組織的給藥進行了這樣的研究將FITC標記siRNA給予眼組織，然后摘除組織，觀察siRNA的分布。局部給藥的結果在圖3A(左圖)中顯示。這些結果證明將siRNA摻入到PolyTran陽離子肽聚合物促進其向角膜組織的吸收(左上圖)，而siRNA水溶液(非配成制劑)的熒光快速消失(左下圖)。
鼠眼新血管組織中的VEGF siRNA基因抑制進行了有關研究，以確定局部給予VEGF siRNA是否能抑制VEGFmRNA的表達水平。用HSV感染小鼠角膜誘導眼新生血管化，并用針對mVEGF-A基因的siRNA通過局部給藥進行治療，以此作為檢查RNA或蛋白質水平上的可能變化的實例。用1×105pfu HSV-1感染小鼠，并在第1天和第3天用siRNA治療后，在第4天和第7天收集角膜。通過RT-PCR或QRT-PCR測量mVEGF-A mRNA水平。由RT-PCR所測出(圖4A)，與非相關siLuc對照相比，用siVEGFmix治療的角膜在第4天和第7天mVEGF-A mRNA的表達下降。同樣，如QRT-PCR所測出(圖4B)，與用對照siRNA序列治療的角膜相比，用VEGF siRNA治療的角膜在第7天顯示顯著的mVEGF-A mRNA表達下降。在這里，全身給藥比局部給藥顯示出更強的功效。
與用對照siRNA治療相比，用siRNA治療HSV感染小鼠，在第7天p.i.經ELISA監測蛋白質水平也顯示mVEGF-A被抑制(p＜0.05)(圖5)。在RNA或蛋白質水平上所觀察到的mVEGF-A表達下降，證實siRNA對HSV誘導的NV和HSK的抗生血管作用(待在下文描述)與siRNA介導的對靶向VEGF途徑因子的敲減作用有關。
用siRNA局部治療CpG誘導的角膜新生血管化將hydron微球中含CpG的ODN植入到鼠眼組織(角膜微袋)中，猶如HSV感染介導的HSK一樣會誘導VEGF介導的血管發生。這個模型系統避免要處理HSV。采用這個系統來測量局部給予由聚合物載體PolyTranTM攜帶的siRNA的抑制作用。對所有三對分別靶向mVEGF-A、mVEGFR1和mVEGFR2的siRNA的體外活性(圖2)進行了研究。在將CpG ODN插入到微袋中24小時后，通過結膜下注射給予10μg/10μl/眼的siRNA單劑量。每對siRNA雙鏈體(分別靶向VEGF-A、VEGF R1和VEGF R2)以相同的總RNA劑量(即10μg/10μl/眼)單獨或組合(以等摩爾比)進行檢測。起源于角膜緣的新生血管化(角膜NV)在微球植入后第4天和第7天進行監測。如圖6所示，與非相關siRNA對照(LacZ)相比，在微球植入后第4天和第7天在所有三個被測siRNA對上均觀察到角膜NV被顯著抑制(p＜0.05)。靶向所有三個被測基因的siRNA雙鏈體組合顯示最有效的抑制作用，在第4天測出NV減少大約60％(p＜0.01)。在第7天抑制作用最有效。這些體內研究結果證明了被測siRNA的體內功效；提示了PolyTranTM是作為將siRNA局部給予動物眼睛的給藥運載體的合理選擇；而且表明了組合使用靶向不同基因的siRNA以實現對病理的協同抑制作用的潛力。
對CpG ODN誘導的血管發生HSK模型的全身治療通過全身治療證明siRNA在眼NV部位的定位，研究了全身給藥siRNA的治療潛力。在微球植入后24小時通過尾靜脈注射給予小鼠40μg/100μl單劑量的分別靶向mVEGF-A、mVEGFR1和mVEGFR2的siRNA。按上述局部給藥研究相同的方式以相同的siRNA總劑量單獨或組合給予siRNA。在微球植入后第4天和第7天，按方法中所述對血管發生面積進行測量。如圖7所示，與siLacZ治療組相比，所有被測siRNA雙鏈體單獨使用時在微球植入后第4天，均顯示對NV的顯著抑制作用(p＜0.05)。與在局部給藥中所觀察到的相似，相比于單獨使用只靶向一個靶基因的siRNA，給予靶向所有三個靶基因的siRNA混合液提供最有效的抑制作用(大約60％抑制，p＜0.01)。再且，盡管第7天的抑制效率通常低于第4天，但相比于單獨應用的抗生血管siRNA，混合siRNA是最有效的。為證實所觀察到的TargeTranTM介導給藥的功效是由于給藥制劑引起的，我們比較了siRNA在相同的小鼠模型中用TargeTranTM或只用PBS全身給藥時的抗生血管功效。顯然，在植入后第4天或第7天，TargeTranTM介導的iRNA給藥比只用PBS運載體給藥實現更有效的抗血管發生作用(p＜0.05)(圖8A)。為進一步證實所觀察到的TargeTranTM-siRNA制劑的功效，還在相同的CpG-SK小鼠模型進行了抗生血管功效的劑量反應研究。帶有含CpG ODN微袋的小鼠，在微球植入后6小時和24小時以10、20、40和80μg的劑量尾靜脈注射組合siRNA雙鏈體兩劑進行治療。在第4天和第7天評估出的抗生血管作用均顯示明顯的劑量依賴性模式(圖8B)。
用siRNA治療HSV感染誘導的角膜新生血管化已知了VEGF siRNA在CpG-ODN HSK模型中抑制角膜NV的功效，再用更有臨床相關性的HSV感染介導的HSK模型進行研究。在這個研究中，用這個模型系統再次進行siRNA的局部給予。每對siRNA雙鏈體(分別靶向VEGF-A、VEGF R1和VEGF R2)以相同的總RNA劑量單獨或組合(以等摩爾比)進行試驗。在HSV感染后14天中監測到基質角膜炎和新生血管化。如圖9所示，與用Luc siRNA對照處理的動物相比，所有三個局部或全身給予的被測siRNA對中均觀察到對兩個測量項(SK和角膜NV)的顯著抑制作用(p＜0.05)。Luc siRNA對照治療的眼睛有80％發展臨床上明顯損傷(在感染后第10天評分為2或更高)，而用靶向VEGF途徑基因的siRNA治療的眼睛只有42％(局部給藥)或50％(全身給藥)發展這種損傷，在這當中局部給藥比全身給藥顯示更強的抗生血管功效。這些結果匯總在一起表明，給予針對VEGF途徑基因的siRNA，可通過抑制血管發生來減少HSK的發展。如在CpG微袋模型中所觀察到(圖7)，靶向所有三個VEGF途徑基因的siRNA雙鏈體組合提供最有效的抑制作用。
FITC-siRNA向生血管眼睛的定向給藥為測試用RGD肽靶向納米顆粒全身給藥siRNA是否能提供對眼新生血管化的定位，在CpG-ODN HSK模型中用TargeTranTM給予FITC標記的siRNA進行研究。圖3(右圖)所示結果證明局部方法和全身方法產生相似的吸收效果。再且，用納米顆粒全身給予FITC標記的siRNA結果是熒光主要分布在生血管眼中，在肝臟、腎臟或肺中水平很低(數據未顯示)。全身給予siRNA鹽水溶液沒有顯示siRNA分布到生血管眼中(圖3右圖)，這并不意外。結膜下注射PolyTranTM所觀察到的FITC-siRNA向生血管眼中的分布很可能歸因于在接近新生血管化的地方(角膜緣)局部給藥。不過，在PolyTranTM所觀察到向眼新血管的給藥，正是RGD配體靶向的nanoplex靶向在新生血管化部位被上調的整聯蛋白表達的預期特征(圖1)。
雞尾酒式siRNA應用我們反復試驗了“雞尾酒方法”來組合應用siRNA雙鏈體。當靶向相同mRNA的不同序列(組織培養物中，數據未顯示)或靶向所有三個被測VEGF途徑基因(體內，圖4-8)的混合siRNA同時使用時，獲得比使用靶向單個基因的siRNA要高的效價。
在小鼠SK模型中通過局部或全身給藥siRNA實現了靶向mVEGFA、mVEGFR1和mVEGFR2的siRNA對角膜NV和SK的極大抑制作用。這種siRNA介導的抑制作用在被測小鼠HSK模型中以劑量依賴性方式(圖8)在CpG誘導的角膜NV和SK(圖6、7、8)或HSV感染引起的角膜NV和SK(圖4、5和9)中實現。這種抑制作用與由RS-PCR、RT-PCR和QRT-PCR測出的siRNA介導的體外和體內對靶向mRNA的敲減作用(圖2、4)相一致，與ELISA測出的體內對靶向基因的蛋白質表達的敲減作用(圖5)也相一致。還觀察到同時給予靶向所有三個被測VEGF途徑基因的siRNA所顯示的抗生血管作用比單獨使用siRNA時更強(圖4-8)。這些體外或體內實驗在非相關Luc siRNA或LacZ siRNA對照和鹽水對照上得到的觀察結果證實，靶向VEGF途徑的siRNA和給藥試劑造成所觀察到的角膜NV抑制。
在角膜給藥試驗中，PolyTranTM和TargeTranTM似乎都能有效給予FITC標記的siRNA到CpG處理的眼睛。PolyTranTM相關的眼給藥似乎可歸因于給藥的位置，但TargeTranTM相關的眼給藥可能要歸因于nanoplex的RGD配體靶向作用。雖然不清楚所檢測出的熒光是否來自完整或降解的siRNA分子，且所給予的RNA雙鏈體的半壽期不能由熒光檢測揭示，但還是可以適當地得出如下結論，即siRNA向生血管眼睛的選擇性給藥是通過TargeTranTM介導的全身途徑實現的。
上述多重靶向方法使siRNA介導的基因敲減作用得以改進。當靶向所有三個被測VEGF途徑基因的混合siRNA在組織培養物或小鼠中同時使用時，結果顯示的效價總是比使用靶向單一基因的siRNA時要強(圖4-8)。這種我們稱之為“雞尾酒方法”的方法可用來敲減單一基因的多個靶序列、多個靶向某個途徑的不同基因(或序列)的siRNA、多個感染介質基因和宿主基因(例如病毒蛋白質和宿主受體蛋白質基因)等。這種方法適用于角膜SK、其他生血管疾病(包括腫瘤)，其原理還適用于其他疾病和生物過程。
本實施例證明，VEGF途徑特異性siRNA與臨床給藥系統一起使用，是治療眼NV疾病，包括HSV誘導的角膜SK、糖尿病性視網膜病(DR)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、色素層炎和發紅的新方法。配體靶向性非病毒給藥試劑在安全性、無損傷性以及siRNA治療給藥和眼NV疾病治療的組織特異性方面具有優勢。
實施例2.局部給予VEGF途徑抑制劑治療眼后部NV疾病材料和方法將同一代孕母親的幼鼠在P7至P12進行低氧(75％)處理，在P12至P16轉換到正常空氣(正常氧)。(P數指天數)。采用結膜下給藥與陽離子聚合物試劑PolyTran PT73復合的siRNA。siRNA與PT73之比為1∶8(重量)。用5mM HEPES溶液將混合物稀釋至所需體積。siRNA劑量為每眼4μg siRNA(PT73復合物中)分散于5μl體積中。在P12和P13各進行一次注射。每只小鼠左眼用陰性對照siRNA即siLuc處理，右眼用活性siRNA即siMix處理。陰性對照siLuc為兩種寡核苷酸(siLuc-a和b)的等量混合物。siMix為simVEGFA、simVEGFR1和simVEGFR2的等量混合物，它們各自為兩種寡核苷酸(例如simVEGF-a和b、simVEGFR1-a和b、simVEGFR2-a和b)的混合物。在P16處死小鼠，進行熒光灌注/鋪片和冷凍切片分析，以鑒定新生血管化。
結果雙眼的鋪片在圖5中顯示。一個鋪片結果顯示強烈熒光，熒光由出現過度新生血管化時灌注染料而產生，這是用siLuc處理的眼睛。另一個鋪片結果顯示相當弱的熒光，這是用siMix處理的眼睛中新生血管化被抑制的標志。
實施例3.遠側全身給予VEGF途徑抑制劑治療腫瘤模型系統的新生血管化材料和方法核酸基于Elbashir等(2)的研究，設計siRNA標記siLuc、siLacZ、siGFP和siVEGFR2的短雙鏈RNA寡核苷酸，經BLAST分析證實缺乏顯著的干擾同源性，并由Dharmacon(Lafayette，CO)合成和純化。每個靶標合成兩個序列，以1∶1摩爾比合并。所用的靶序列為，siLucaaccgctggagagcaactgca和aagctatgaaacgatatgggc，siLacZaacagttgcgcagcctgaatg和aacttaatcgccttgcagcac，siGFPaagctgaccctgaagttcatc和aagcagcacgacttcttcaag，siVEGFR2aatgcggcggtggtgacagta和aagctcagcacacagaaagac(已描述了此siRNA對VEGF R2的抑制作用(28))。靶向熒光素酶的siRNA在有義鏈的3′位置用熒光素通過標準鍵化學綴合作用標記(FITC-siRNA)，以作FACS分析和組織分布實驗。編碼熒光素酶的pCI-Luc質粒(pLuc)獲自LofstrandLabs(Gaithersburg，MD)。
RGD-PEG-PEI(RPP)和PEG-PEI(PP)的合成制備了兩種聚乙二醇化形式的支鏈PEI(P)，一種是其中的PEG在其遠側末端帶RGD肽(RPP)，另一種是其中的PEG沒有肽(PP)。這三種化合物在本文所用的縮寫為，P代表支鏈PEI，PP代表聚乙二醇化PEI，RPP代表RGD-PEG-PEI。
合成了序列為H-ACRGDMFGCA-OH的環化10-mer RGD-肽，經氧化形成分子內二硫鍵，由Advanced ChemTech(Louisville，KY，USA)純化至＞95％純度。這個序列衍生自經噬菌體展示鑒定結合RGD肽的整聯蛋白，且發現對細胞結合和內化有效(23，29)。
RPP的合成如下分兩步進行。在第一步，在氮氣下向攪拌中的RGD(60mg)的DMSO(600μL)溶液加入TEA(8.54μL于20μL THF中)。攪拌1分鐘后，一次加入NHS-PEG-VS(212mg于THF∶DMSO；300μL∶100μL中)溶液。將反應混合物在室溫下攪拌4小時，用TFA(用量相當于TEA)猝滅，然后將混合物凍干。中間體RGD-PEG-VS通過反相HPLC或對水透析進行純化，然后將混合物凍干，得率為50-90％。綴合作用通過質譜分析(MALDI)確認。
在合成的第二步，將100mg(21.7μmole)純化的RGD-PEG-VS中間體溶于1ml純DMSO中。向此溶液中加入6當量TEA(溶于0.5mlTHF中)并混合。將9.4mg(218μmole，以胺計)溶于DMF(0.5ml)中的PEI加入到以上溶液中，在室溫下攪拌12小時。綴合作用的完成通過TLC上RGD-PEG-VS的消失來確認。反應通過加入過量的TFA終止并凍干。產物通過HPLC純化為TFA鹽。在500MHz分光計(Varian)上通過質子NMR光譜測定法，由對應于PEI(2.8-3.1ppm)和PEG(3.3-3.6ppm)的-CH2-質子的峰面積比，確定RGD-PEG與PEI的綴合度。根據這一估計，有約7％的PEI胺與RGD-PEG綴合，或者說每25KD PEI分子有大約40個RGD-PEG分子連接于其上，使得每個PEI分子的胺平均數從580降低至540。不同合成的百分綴合度在7-9之間。
Nanoplex的制備如下制備nanoplex混合等體積的陽離子聚合物水溶液和核酸水溶液，使可電離氮(聚合物)相對于磷酸鹽(核酸)的凈摩爾過量在2-6的范圍。陽離子聚合物與核酸之間的靜電相互作用導致形成平均顆粒大小分布約為100nm的多聚物(polyplex)，本文稱nanoplex。
根據以下三種形式的PEI制備了三種形式的nanoplex支鏈PEI(P)、聚乙二醇化PEI(PP)和RGD-PEG-PEI(RPP)。較早的研究揭示，用于DNA縮聚的聚陽離子與其他大分子的綴合作用會導致不完全縮聚和形成非球形結構(30，31)。雖然我們在本研究所用的綴合物中沒有觀察到任何這些問題，但為避免出現這種潛在問題，將一部分縮聚所需的聚陽離子用非綴合PEI代替。因此所有的RPP和PP nanoplex均含有摩爾數(以胺濃度表示)與綴合物相當的PEI。因此如下制備這些nanoplex首先用5mM Hepes緩沖液(pH 7)制備含1∶1摩爾比的RGD-PEG-PEI(RPP)或PEI-PEG(PP)與PEI(P)的陽離子聚合物水溶液。在單獨的管中，將核酸(質粒DNA和/或siRNA)以與陽離子聚合物相同的總體積溶于相同的緩沖液中。然后將兩個溶液合并在一起，旋渦攪拌30秒鐘，制成nanoplex。平均顆粒大小分布用Coulter N4plus顆粒大小測定儀(Beckman Coulter)測定，ζ-電勢在Coulter Delsa 440 SX測定儀上進行測量。兩種儀器均用確定大小和遷移率的膠乳珠(Beckman Coulter，Miami，FL)作為標準進行校準。
小鼠腫瘤新生血管化模型雌性裸鼠(6-8周齡)獲自Taconic(Germantown，NY)，關在頂部有濾膜的籠中(filter-topped)，不限制標準的嚙齒動物食物(rodent chow)和水，并接受12小時的光/暗周期。實驗按照國際法規和地方動物實驗倫理委員會(local animal experiments ethical committee)的批準進行。通過在小鼠脅腹接種1×106N2A細胞誘導皮下N2A腫瘤。腫瘤在體積約0.5-1cm3時開始顯示新生血管化，此時小鼠通過尾靜脈注射0.2ml溶液接受nanoplex或游離siRNA。在組織分布實驗中，注射40μg游離形式或者P-nanoplex或RPP-nanoplex形式的熒光標記siRNA。注射后一小時，解剖組織并用適合熒光的解剖顯微鏡檢查。組織的鏡檢用Olympus SZX12熒光顯微鏡進行，該顯微鏡裝備有數碼相機并與運行MagnaFire 2.0相機軟件(Optronics，Goleta，CA)的PC連接。每個組織均以相等的曝光時間拍照。
在腫瘤新生血管化表型研究中，當接種腫瘤細胞后第7天可觸知腫瘤時開始實驗。每鼠每3天通過尾靜脈注射用40μg siRNA(RPP-nanoplex中)進行處理。每隔一定時間由對處理分配不知情的觀測者用數字測徑器測量腫瘤生長。每個測量包括相隔大約90度的兩個方向上的腫瘤直徑。腫瘤體積如下計算0.52×最長直徑×最短直徑2(32)。在實驗結束時，處死動物，切除腫瘤組織和周圍皮膚，置顯微鏡載玻片上，測定新生血管化。用以上對熒光組織測量所述的Olympus顯微鏡和相機設備，通過顯微鏡檢術進行新生血管化和血管發生的組織檢查。透照組織以顯示皮膚中的血管，攝取數字圖像并如上所述進行保存。然后立即將組織速凍，待進行蛋白質印跡分析。
蛋白質印跡分析腫瘤樣品中的鼠VEGF受體2表達通過蛋白質印跡法檢測。將腫瘤組織與M-Per哺乳動物蛋白質提取試劑(Pierce)一起放入lysingMatrix D(Bio-Rad，Cambridge，MA)中。將組織均漿，離心，收集上清。將相當含量的提取蛋白質(50μg)與含5％2-巰基乙醇(Bio-Rad)的樣品緩沖液混合，煮沸，冷卻后加樣到6％聚丙烯酰胺凝聚的各泳道上。在30mA下進行電泳，隨后將蛋白質轉移到Immunblot PVDF膜(Bio-Rad)。用3％明膠(于Tris緩沖鹽水(TBS)中)將膜封閉過夜。隨后將膜轉移到1％明膠(于TTBS(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％吐溫20)中)，與1μg單克隆抗mVEGFR2抗體(R&D Systems)溫育過夜。在TTBS中洗滌兩次后，將山羊抗小鼠IgG過氧化物酶綴合物加入到1％明膠中保持1小時，用TTBS洗滌膜兩次，然后用TBS洗滌一次。抗體用Bio-Rad顏色試劑盒染色30分鐘。
結果siRNA Nanoplex膠體特性用定型設計法開發siRNA nanoplex，以設計出結合以下三個功能要求的分子綴合物自組裝、形成立體聚合物保護性表面層和暴露配體。為設計siRNA nanoplex，我們重新研究了原先質粒DNA所用的材料，包括聚陽離子絡合劑用聚乙烯亞胺(PEI)、立體穩定用聚乙二醇(PEG)和含Arg-Gly-Asp(RGD)基序的肽配體，所述肽配體因其靶向在腫瘤血管系統中的激活內皮細胞上表達的整聯蛋白的能力而提供腫瘤選擇性。雖然含有RGD基序的肽能結合幾種整聯蛋白，但它們的特異性是由側翼氨基酸序列以及結合結構域的構象決定的。在本研究中，我們使用了“環狀”RGD肽，其整聯蛋白結合結構域在構象上受到二硫鍵的約束。這個肽具有被證明當在絲狀噬菌體上表達時通過受體介導途徑造成細胞結合和內化的肽的環狀區域當中的完全相同氨基酸序列。這個肽被證明以序列特異性方式抑制細胞附著于纖連蛋白和玻連蛋白包被的板。此外，當偶聯到寡賴氨酸時，這個肽在多種細胞(包括內皮細胞)中顯示受體介導的DNA給藥。在這些研究中，為促進與PEG的化學綴合，將丙氨酸殘基添加到這個肽的環狀區域外部的每個末端。靶向性siRNA nanoplex如下制備化學合成帶陽離子聚合物、立體聚合物和肽配體(RPP)的三聯聚合物綴合物，然后在水溶液中與核酸混合進行納米顆粒自組裝。這個RPP綴合物允許對每個功能域進行個別優化或化學置換。
當將純化RPP與核酸水溶液混合時，綴合物的陽離子結構域結合帶負電荷的核酸，驅動自組裝形成那么顆粒分散液。研究發現，胺(PEI)與磷酸鹽(核酸)之比(N/P)為2∶1時可形成穩定的nanoplex。此比例下的顆粒大小和ζ-電勢結果在表I中給出。RPP-nanoplex或PP-nanoplex的平均大小都比較小，在0.07-0.10μm之間。在監測顆粒大小的9天時間內，顆粒大小基本保持不變。相反，P-nanoplex的平均顆粒大小較大，在0.12-0.17μm之間，且在24小時內發生聚集。發現帶siRNA的P-nanoplex的ζ-電勢如同質粒DNA通常所見的那樣為高正電勢，達35±4mV，但PEI的PEG綴合物的摻入導致PP-nanoplex和RPP-nanoplex的ζ-電勢分別下降至5±6mV和6±1mV。表面電荷極性和數量取決于兩種成分的比例，但在相同的比例下，當存在PEG時表面電荷數量(數據未顯示)下降，表明在nanoplex表面上形成了立體聚合物層。
這些顆粒大小和ζ-電勢測量結果表明，與siRNA形成的RPPnanoplex顯示膠體表面特性，這種膠體表面特性表示了立體聚合物外層和潛在暴露的介導細胞結合特異性的RGD配體。只需簡單地將RPP綴合物水溶液與siRNA混合，就可發生這種nanoplex自組裝(RPP-nanoplex)。它們的膠體特性和生物特性比得上不含RGD肽的前體綴合物的制劑(PP-nanoplex)，或者比得上非綴合PEI(P-nanoplex)。
腫瘤吸收、靶向基因抑制、表型作用選擇RPP-nanoplex，在荷瘤小鼠中進行有關新生血管化的抑制的體內研究。進行研究是為了確定通過靜脈注射給予荷瘤動物的siRNAnanoplex造成siRNA在腫瘤新生血管化水平的提高。通過對FITC標記的siRNA向裸鼠中的確立成神經細胞瘤N2A腫瘤的吸收進行成像，觀察腫瘤新生血管化積累情況。被給予siRNA、P-nanoplex和RPP-nanoplex水溶液的動物中腫瘤、肺和肝臟FITC熒光的熒光顯微鏡檢結果在圖中顯示。靜脈給予siRNA水溶液并沒有在腫瘤中產生可觀的FITC-siRNA熒光。同樣，對于這個樣品，在肝臟中只觀察到極少的FITC熒光，在肺中還更少。這些結果極可能是FITC-siRNA被快速降解到尿中、組織積累不足(肝臟除外)和導致FITC被快速排泄或被肝臟代謝的潛在代謝不穩定性的反映。腫瘤中缺乏來自FITC-siRNA水溶液的熒光表明，會導致FITC從nanoplex制劑中損失的任何FITC鍵不穩定性都將不產生腫瘤熒光。這個結論由給予P-nanoplex時缺乏腫瘤FITC熒光得到證實。這種腫瘤FITC熒光缺乏證明，P-nanoplex在腫瘤中沒有積累到任何可檢測程度，siRNA nanoplex中也沒有任何FITC鍵穩定性使人為腫瘤熒光得以產生。另一方面，P-nanoplex中的FITC-siRNA的確在肝臟中特別是在肺中產生可觀的點狀FITC-siRNA熒光。相反，RPP-nanoplex在腫瘤新血管系統中產生可觀的FITC-siRNA熒光，但其在肝臟和肺中積累不足，表現為點狀熒光較弱。這提供了強有力的證據，即RPP-nanoplex顯示出非特異性組織相互作用減少，從而減少肝臟和肺的吸收，同時顯示出由于靶向作用造成的在腫瘤新血管系統中的積累。由于FITC熒光標記通過寡核苷酸所常規使用的具有已知體內穩定性的鍵共價連接到siRNA，在這些組織中觀察到的熒光分布對應于siRNA的分布，而不是對應于FITC不穩定性。此外，即使以水溶液形式給予對血清降解更為敏感的FITC綴合siRNA，也不在任何被測量的組織中造成任何顯著積累。這些結果表明RPP siRNA nanoplex造成siRNA分子在腫瘤新血管系統中水平提高，這導致下文描述的在腫瘤中進行的siRNA生物活性研究。
用靶向內源治療基因的siRNA，確定siRNA是否通過RPP介導的向腫瘤中的給藥來抑制新生血管化。在這些研究中，選擇了靶向鼠血管內皮生長因子受體-2(VEGF R2)的siRNA，并將其與RPP nanoplex一起使用，因為該受體是血管發生中的關鍵因素。不過，為對此基因產生治療作用，需要將siRNA給予至腫瘤中的宿主(鼠)內皮細胞中，以引起對腫瘤生長的表型作用。用抑制鼠VEGF R2表達的siRNA通過在細胞培養物鑒定進行了功效研究(數據未顯示)。用這種治療性基因siRNA，每3天以RPP-nanoplex形式靜脈給予進行研究。在圖中顯示的結果表明了對腫瘤VEGF R2水平、新生血管化和生長速率的抑制作用，并且這種抑制作用是序列特異性的。腫瘤血管發生與VEGF R2表達水平一起作了鑒定。腫瘤生長速率下降與緊靠腫瘤周圍的血管減少并行發生。另外，在用mVEGF R2 siRNA治療的腫瘤中可見血管很少，這是使VEGFR2表達沉默所預期出現的無規律分支的證據。VEGFR2在受治療腫瘤中的表達也是以序列特異性方式減少(圖6E)。這些結果匯總一起支持了這樣的說法，即RPP-nanoplex中的siVEGFR2對腫瘤的抑制作用是因為siRNA被有效給予至腫瘤血管系統中，產生對VEGFR2表達、腫瘤血管發生和生長的序列特異性抑制而發生的。這些結果證明siRNA nanoplex通過新血管靶向和抑制機制起作用。
實施例4.遠側全身給予VEGF途徑抑制劑治療眼后部NV疾病材料和方法將同一代孕母親的幼鼠在P7至P12進行低氧(75％)處理，然后在P12至P16轉換到正常空氣(正常氧)。采用靜脈給藥遞送與陽離子聚合物試劑PolyTran RPP復合的siRNA。siRNA與RPP之比為1∶2-1∶8(重量)。用5mM HEPES溶液將混合物稀釋至所需體積。siRNA劑量為每鼠10μg-100μg siRNA(RPP復合物中)分散于100μl體積中。在一些情況下在P12開始給藥，在另一些情況下早些給藥，而在又一些情況下晚些給藥。按不同時間表從連續一周每天給藥到每周一次給藥，反復進行給藥。對于每個研究，一組小鼠用陰性對照siRNA即siLuc治療，另一組小鼠用活性siRNA即siMix治療。陰性對照siLuc為兩種寡核苷酸(siLuc-a和b)的等量混合物。siMix為simVEGFA、simVEGFR1和simVEGFR2的等量混合物，它們各自為兩種寡核苷酸(例如simVEGF-a和b、simVEGFR1-a和b、simVEGFR2-a和b)的混合物。從P16起在不同時間處死小鼠，進行熒光灌注/鋪片和冷凍切片分析，以鑒定新生血管化。
結果當小鼠用siLuc處理時，雙眼的鋪片顯示強烈熒光，熒光由過度新生血管化出現時灌注染料而產生。當小鼠用siMix處理時，新生血管化被抑制，雙眼的鋪片結果顯示相當弱的熒光。
RNAi藥物siRNA藥物按照本發明的方法和實施例1的說明設計和制備siRNA藥物。合適的siRNA藥物的序列在以下附錄II中顯示。
1)RNA特異性PCR(RS-PCR)用RS-PCR來檢測靶向基因的mRNA合成的減少。RS-PCR包括兩個連續反應RNA特異性反轉錄(RT)和PCR。從被測哺乳動物中摘除被轉染細胞或組織，用RNAwiz(Ambion)從中分離總細胞RNA轉錄物，并按Promega的T7RiboMAX手冊所述的方式用DNA酶處理。無DNA的RNA用作RT反應的模板，以合成mRNA特異性cDNA分子的第一鏈。為RT設計的mRNA特異性引物從5′到3′方向包含特殊30nt序列，其與靶向基因編碼序列不互補，接著是與AUG密碼子下游約400nt的部分編碼序列互補的14nt序列。RT反應用MuLv反轉錄酶(retrotranscriptase)(Applied Biosystems)在20μl體積中進行。反應在37℃進行30秒，接著42℃進行15秒，然后94℃加熱5秒。PCR反應用GeneAmp試劑盒(PE Biosystems)進行。PCR所用的每對引物包括正向引物和反向引物，前者與從AUG密碼子下游約10nt開始的編碼序列互補，后者只具有上述特殊30nt序列。50μl反應中含有每對引物的1μl 20μm原液、5μl 10x PCRII緩沖液、3μl 25mM MgCl2、1μl10mM dNTPs和0.5μl(5u/μl)TaqDNA聚合物酶。如下進行PCR反應94℃2秒，然后94℃1秒-72℃2秒兩步反應35個循環，接著72℃10秒后，在4℃下浸泡。反應樣品隨DNA大小標準一起通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。合理大小(約400bp)的DNA片段的密度反映了靶基因特異性mRNA在被感染細胞中的起始水平。siRNA由Dharmacon合成，引物由Elim Biopharmaceuticals合成。
2)RS-PCR引物的設計對于mVEGF-A(參考序列XM 192823)引物1mVEGF-A Up(30-mer，mVEGF-A編碼序列的4-33nt或克隆序列的64-93nt)。
5′---GAT GTC TAC CAG CGA AGC TAC TGC CGT CCG---3′引物2mVEGF-A Dn(47-mer，前面30-mer同“TS1引物”，后面17-mer與mVEGF-A編碼序列的403-387nt或克隆序列的463-447nt互補)。
5′---GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA caa gct gcctog cct tg---3′對于mVEGFR-1(參考序列D88689)引物3mVEGFR-1 Up(30-mer，mVEGFR-1編碼序列的4-33bp或克隆序列的255-284)5′---GTC AGC TGC TGG GAC ACC GCG GTC TTG CCT---3′引物4mVEGFR-1 Dn(47-mer，前面30-mer同“TS1引物”，后面17-mer與mVEGFR-1編碼序列的377-361nt或克隆序列的628-612nt互補)。
5′---GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA tag att gaa gattcc gc---3′
對于mVEGFR-2(參考序列D88689)引物5mVEGFR2/400Dn(47-mer，3′17-mer與mVEGFR2 400-384nt互補)5′---GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA ggt cac tgacag agg cg---3′引物6mVEGFR2/12up(30-mer，mVEGFR2的12-41)5′---GGC GCT GCT AGC TGT CGC TCT GTG GTT CTG---3′表2.RS-PCR靶向基因和產物大小
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附錄II.眼病的siRNA靶向序列和抗血管發生活性SS1.VEGF途徑SS1.1.VEGF-AVEGF基因人VEGF，檢索號XM_052681，基因ID14781453，小鼠VEGF，檢索號M95200，基因ID202350。
選擇了以下20個候選siRNA
位置 序列VEGF-A-1 64-84AAGTGGTCCCAGGCTGCACCCVEGF-A-2 467-487 AAGATCCGCAGACGTGTAAATVEGF-A-3 498-518 AAACACAGACTCGCGTTGCAAVEGF-A-4 499-519 AACACAGACTCGCGTTGCAAGVEGF-A-5 517-537 AAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAVEGF-A-6 537-557 AAACGAACGTACTTGCAGATGVEGF-A-7 538-558 AACGAACGTACTTGCAGATGTVEGF-A-8 542-564 AACGTACTTGCAGATGTGACAVEGF-A-9 162-182 AATCGAGACCCTGGTGGACATVEGF-A-10338-358 AAGGCCAGCACATAGGAGAGAVEGF-A-1192-112 AAGGAGGAGGGCAGAATCATCVEGF-A-12386-406 AATGCAGACCAAAGAAAGATAVEGF-A-13380-400 AATGTGAATGCAGACCAAAGAVEGF-A-14301-321 AACATCACCATGCAGATTATGVEGF-A-15451-471 AAGCATTTGTTTGTACAAGATVEGF-A-16116-136 AAGTGGTGAAGTTCATGGATGVEGF-A-17401-421 AAGATAGAGCAAGACAAGAAAVEGF-A-18421-441 AATCCCTGTGGGCCTTGCTCAVEGF-A-19379-499 AAATGTGAATGCAGACCAAAGVEGF-A-20262-282 AATGACGAGGGCCTGGAGTGTSS1.2.VEGF-BVEGF-B基因人VEGF-B，檢索號NM_003377.3，基因ID39725673選擇了以下10個候選siRNA位置 序列VEGF-B-1 140-160 AAAGTGGTGTCATGGATAGATVEGF-B-2 141-163 AAGTGGTGTCATGGATAGATGVEGF-B-3 236-258 AAACAGCTGGTGCCCAGCTGCVEGF-B-4 327-349 AAGTCCGGATGCAGATCCTCAVEGF-B-5 390-412 AAGAACACAGCCAGTGTGAATVEGF-B-6 393-415 AACACAGCCAGTGTGAATGCAVEGF-B-7 424-446 AAAGGACAGTGCTGTGAAGCCVEGF-B-8 425-447 AAGGACAGTGCTGTGAAGCCAVEGF-B-9 440-462 AAGCCAGACAGGGCTGCCACTVEGF-B-10670-692 AACCCAGACACCTGCAGGTGCSS1.3.
VEGF R-1基因人VEGF-R1，(hFLT-1)，檢索號AF063657，基因ID3132830，小鼠VEGF-R1，(mFLT-1)，檢索號D88689，基因ID2809068)，選擇了以下20個候選siRNA
位置 序列VEGFR1-1 1706-1728AAGGAGAGGACCTGAAACTGTVEGFR1-2 2698-2720AAGCAAGGAGGGCCTCTGATGVEGFR1-3 2702-2724AAGGAGGGCCTCTGATGGTGAVEGFR1-4 2755-2777AACTACCTCAAGAGCAAACGTVEGFR1-5 3014-3036AAGTGGCCAGAGGCATGGAGTVEGFR1-6 3048-3070AAAGTGCATTCATCGGGACCTVEGFR1-7 3049-3071AAGTGCATTCATCGGGACCTGVEGFR1-8 2140-2160AGCACGCTGTTTATTGAAAGAVEGFR1-9 568-588 AAGGGCTTCATCATATCAAATVEGFR1-10215-235 AAAGGCTGAGCATAACTAAATVEGFR1-112352-2372AAGGTCTTCTTCTGAAATAAAVEGFR1-123517-3537AATGCCATACTGACAGGAAATVEGFR1-131190-1210AAGAGGATGCAGGGAATTATAVEGFR1-14834-854 AAGGCGACGAATTGACCAAAGVEGFR1-1589-109 AAGATCCTGAACTGAGTTTAAVEGFR1-16216-236 AAGGCTGAGCATAACTAAATCVEGFR1-173429-3449AAGGCCAAGATTTGCAGAACTVEGFR1-18967-987 AACACCTCAGTGCATATATATVEGFR1-19567-587 AAAGGGCTTCATCATATCAAAVEGFR1-201938-1958AATCCTCCAGAAGAAAGAAATSS1.4.
VEGF R-2基因人VEGF-R2，(hKDR)，檢索號AF063658，基因ID3132832，小鼠VEGF-R2，(mFLK-1)，檢索號X70842，基因ID57923)，選擇了以下20個候選siRNA位置 序列VEGFR2-1 523-545 AACAGAATTTCCTGGGACAGCVEGFR2-2 2387-2409AACTGAAGACAGGCTACTTGTVEGFR2-3 2989-3011AAGGACTTCCTGACCTTGGAGVEGFR2-4 3032-3054AAGTGGCTAAGGGCATGGAGTVEGFR2-5 3040-3062AAGGGCATGGAGTTCTTGGCAVEGFR2-6 3401-3423AAATGTACCAGACCATGCTGGVEGFR2-7 3632-3654AATTCCATTATGACAACACAGVEGFR2-8 3676-3698AACAGTAAGCGAAAGAGCCGGVEGFR2-9 3641-3661ATGACAACACAGCAGGAATCAVEGFR2-10357-377 AAGCTCAGCACACAGAAAGACVEGFR2-11493-513 AATGCGGCGGTGGTGACAGTASS2.EGF途徑SS2.1.
EGF基因人EGF，檢索號NM_001963，基因ID6031163。
選擇了以下20個候選siRNA位置 序列EGF-12042-2062AAGTGGATAGAGAGAGCTAATEGF-23873-3893AAGGCTGCTGGATTCCAGTATEGF-32426-2446AAGCAGTCTGTGATTGAAATGEGF-42621-2641AAGCCCTCATCACTGGTTGTGEGF-51273-1293AAAGGACATGGTTAGAATTAAEGF-62328-2348AAGGCCTTGGCCGTCTGGTTAEGF-7174-194 AAGGGTGTCAGGTATTTCTTAEGF-83922-3942AATGGAGCGAAGCTTTCATATEGF-91496-1516AAGTACTGTGAAGATGTTAATEGF-10 1274-1294AAGGACATGGTTAGAATTAACEGF-11 531-551 AAGGTACTCTCGCAGGAAATGEGF-12 2686-2706AAACGGAGGCTGTGAACATATEGF-13 2263-2283AATGGCCAAGAGATTATTCTGEGF-14 1292-1312AACCTCCATTCATCATTTGTAEGF-15 261-281 AAGGTCTCTCAGTTGAAGAAAEGF-16 3218-3238AATGCCAGCTGCACAAATACAEGF-17 1019-1039AAGGCTCTGTTGGAGACATCAEGF-18 2576-2596AAGAGGACTGGCAAAGATAGAEGF-19 760-780 AAGGCAAGAGAGAGTATGTAAEGF-20 765-785 AAGAGAGAGTATGTAATATAGSS2.2.
EGF R基因人EGF-R，檢索號NM_005228，基因ID41327737)，小鼠EGF-R，檢索號NM_207655，基因ID46560581，選擇了以下5個候選siRNA位置 序列EGFR-1 483-505 AAAGACCATCCAGGAGGTGGCEGFR-2 2869-2889AAAGTGCCTATCAAGTGGATGEGFR-3 2870-2890AAGTGCCTATCAAGTGGATGGEGFR-4 3751-3771AACCCTGACTACCAGCAGGACEGFR-5 3755-3775CTGACTACCAGCAGGACTTCTSS2.3.
HER-2基因人HER-2，檢索號M11730，基因ID183986，小鼠HER-2，檢索號BC053078，基因ID31419374，選擇了以下5個候選siRNA位置 序列
HER2-1 1255-1275AAGATCTTTGGGAGCCTGGCAHER2-2 1253-1273AAGAAGATCTTTGGGAGCCTGHER2-3 2797-2817AAGGTGCCCATCAAGTGGATGHER2-4 3019-3039AAATGTTGGATGATTGACTCTHER2-5 3805-3825AACCTCTATTACTGGGACCAGSS2.4.
HER-3基因人HER-3，檢索號M34309，基因ID183990，小鼠HER-3，檢索號XM125954，基因ID38091004，選擇了以下13個候選siRNA位置 序列HER3-1 678-698 AATTGACTGGAGGGACATCGTHER3-2 1264-1284AAGATCCTGGGCAACCTGGACHER3-3 1537-1557AAGGAAATTAGTGCTGGGCGTHER3-4 2404-2424AAGATTCCAGTCTGCATTAAAHER3-5 2857-2877AAATACACACACCAGAGTGATHER3-6 2858-2878AATACACACACCAGAGTGATGHER3-7 3770-3790AAGATGAAGATGAGGAGTATGHER3-8 3776-3796AACCTCTATTACTGGGACCAGHER3-9 1118-1138CTGACAAGATGGAAGTAGATAHER3-10 1119-1139TGACAAGATGGAAGTAGATAAHER3-11 2402-2422TCAAGATTCCAGTCTGCATTAHER3-12 2403-2423CAAGATTCCAGTCTGCATTAAHER3-13 2805-2825TGAGGCCAAGACTCCAATTAASS2.5.
HER-4基因人HER-4，檢索號NM_005235，基因ID4885214，小鼠HER-4，檢索號XM_136682，基因ID38049556。
選擇了以下7個候選siRNA位置 序列HER4-1 462-482 AAATGGTGGAGTCTATGTAGAHER4-2 463-483 AATGGTGGAGTCTATGTAGACHER4-3 731-751 AATGTGCTGGAGGCTGCTCAGHER4-4 838-860 AATCCAACCACCTTTCAACTGHER4-5 1227-1247AACAGGTTTCCTGAACATACAHER4-6 1450-1470AACTGGACAACACTCTTCAGCHER4-7 1909-1929AACGGTCCCACTAGTCATGACSS3.FGF途徑SS3.1.
FGF-2基因人FGF-2(堿性FGF)，檢索號NM_002006，基因ID41352694。
選擇了以下20個候選siRNA位置 序列FGF-2-1 630-650 AAGAGCGACCCTCACATCAAGFGF-2-2 661-681 AAGCAGAAGAGAGAGGAGTTGFGF-2-3 849-869 AAACGAACTGGGCAGTATAAAFGF-2-4 880-900 AAACAGGACCTGGGCAGAAAGFGF-2-5 854-874 AACTGGGCAGTATAAACTTGGFGF-2-6 648-668 AAGCTACAACTTCAAGCAGAAFGF-2-7 850-870 AACGAACTGGGCAGTATAAACFGF-2-8 881-901 AACAGGACCTGGGCAGAAAGCFGF-2-9 667-687 AAGAGAGAGGAGTTGTGTCTAFGF-2-10 723-743 AAGGAAGATGGAAGATTACTGFGF-2-11 734-754 AAGATTACTGGCTTCTAAATGFGF-2-12 781-801 AACGATTGGAATCTAATAACTFGF-2-13 690-710 AAAGGAGTGTGTGCTAACCGTFGF-2-14 818-838 AAGGAAATACACCAGTTGGTAFGF-2-15 804-824 AATACTTACCGGTCAAGGAAAFGF-2-16 750-770 AAATGTGTTACGGATGAGTGTFGF-2-17 822-842 AAATACACCAGTTGGTATGTGFGF-2-18 655-675 AACTTCAAGCAGAAGAGAGAGFGF-2-19 823-843 AATACACCAGTTGGTATGTGGFGF-2-20 798-818 AACTACAATACTTACCGGTCASS3.2.
FGF-1基因人FGF-1(酸性FGF)，轉錄物變體1，檢索號NM_000800，基因ID15055546；轉錄物變體2，檢索號NM_033136，基因ID15055540；轉錄物變體3，檢索號NM_033137，基因ID15055544。
選擇了以下20個候選siRNA位置 序列
FGF-1-1 447-467 AAGGCTGGAGGAGAACCATTAFGF-1-2 214-234 AAGCCCAAACTCCTCTACTGTFGF-1-3 190-210 AATCTGCCTCCAGGGAATTACFGF-1-4 114-134 AAGCGCCACAAGCAGCAGCTGFGF-1-5 484-504 AAGAAGCATGCAGAGAAGAATFGF-1-6 539-559 AACGCGGTCCTCGGACTCACTFGF-1-7 460-480 AACCATTACAACACCTATATAFGF-1-8 97-117 AAGCTCTTTAGTCTTGAAAGCFGF-1-9 469-489 AACACCTATATATCCAAGAAGFGF-1-10221-241 AACTCCTCTACTGTAGCAACGFGF-1-11288-308 AAGGGACAGGAGCGACCAGCAFGF-1-12487-507 AAGCATGCAGAGAAGAATTGGFGF-1-13113-133 AAAGCGCCACAAGCAGCAGCTFGF-1-14502-522 AATTGGTTTGTTGGCCTCAAGFGF-1-15520-540 AAGAAGAATGGGAGCTGCAAAFGF-1-16211-231 AAGAAGCCCAAACTCCTCTACFGF-1-17538-558 AAACGCGGTCCTCGGACTCACFGF-1-18526-546 AATGGGAGCTGCAAACGCGGTFGF-1-19220-240 AAACTCCTCTACTGTAGCAACFGF-1-20424-444 AATGAGGAATGTTTGTTCCTGSS3.3.
FGFR2基因人FGFR2，轉錄物變體1，檢索號NM_000141，基因ID13186239；轉錄物變體2，檢索號NM_022969，基因ID13186252；轉錄物變體3，檢索號NM_022970，基因ID13186254；轉錄物變體4，檢索號NM_022971，基因ID13186256；轉錄物變體5，檢索號NM_022972，基因ID13186258；轉錄物變體6，檢索號NM_022973，基因ID13186260；轉錄物變體7，檢索號NM_022974，基因ID13186262；轉錄物變體8，檢索號NM_022975，基因ID27754768；轉錄物變體9，檢索號NM_022976，基因ID13186266；轉錄物變體10，檢索號NM_023028，基因ID13186268；轉錄物變體11，檢索號NM_023029，基因ID13186242；轉錄物變體12，檢索號NM_023030，基因ID13186270；轉錄物變體13，檢索號NM_023031，基因ID13186272；選擇了以下20個候選siRNA
位置 序列FGFR2-1 1368-1388AAGCCGGACTGCCGGCAAATGFGFR2-2 2610-2630AAGCCCTGTTTGATAGAGTATFGFR2-3 2088-2108AAGCAGTGGGAATTGACAAAGFGFR2-4 2297-2317AAAGGCAACCFCCGAGAATACFGFR2-5 1753-1773AATCGCCTGTATGGTGGTAACFGFR2-6 2010-2030AATGGGAGTTTCCAAGAGATAFGFR2-7 699-719 AAGAGCCACCAACCAAATACCFGFR2-8 2843-2863AAGCAGTTGGTAGAAGACTTGFGFR2-9 1187-1207AAGCAGGAGCATCGCATTGGAFGFR2-10 1082-1102AAGCGGCTCCATGCTGTGCCTFGFR2-11 1557-1577AAGAGATTGAGGTTCTCTATAFGFR2-12 1771-1791AACAGTCATCCTGTGCCGAATFGFR2-13 2762-2782AAGCCAGCCAACTGCACCAACFGFR2-14 1178-1198AAGGAGTTTAAGCAGGAGCATFGFR2-15 2151-2171AAGATGATGCCACAGAGAAAGFGFR2-16 2745-2765AAGGACACAGAATGGATAAGCFGFR2-17 1171-1191AAACGGGAAGGAGTTTAAGCAFGFR2-18 1222-1242AAACCAGCACTGGAGCCTCATFGFR2-19 2732-2752AAGCTGCTGAAGGAAGGACACFGFR2-20 1556-1576AAAGAGATTGAGGTTCTCTATSS3.4.
FGFR1基因人FGFR1轉錄物變體1，檢索號NM_000604，基因ID13186232；轉錄物變體2，檢索號NM_015850，基因ID13186250；轉錄物變體3，檢索號NM_023105，基因ID13186233；轉錄物變體4，檢索號NM_023106，基因ID13186235；轉錄物變體5，檢索號NM_023107，基因ID13186237；轉錄物變體6，檢索號NM_023108，基因ID13186240；轉錄物變體7，檢索號NM_023109，基因ID13186244；轉錄物變體8，檢索號NM_023110，基因ID13186246；轉錄物變體9，檢索號NM_023111，基因ID13186248；選擇了以下20個候選siRNA位置 序列
FGFR1-1 2701-2721AACGGCCGACTGCCTGTGAAGFGFR1-2 2275-2295AAGTCGGACGCAACAGAGAAAFGFR1-3 2422-2442AAGGGCAACCTGCGGGAGTACFGFR1-4 2255-2275AAGTGGCTGTGAAGATGTTGAFGFR1-5 2319-2339AATGGAGATGATGAAGATGATFGFR1-6 2237-2257AACCCAACCGTGTGACCAAAGFGFR1-7 2887-2907AAGCCCAGTAACTGCACCAACFGFR1-8 1540-1560AACGTGGAGTTCATGTGTAAGFGFR1-9 2236-2256AAACCCAACCGTGTGACCAAAFGFR1-10 2332-2352AAGATGATCGGGAAGCATAAGFGFR1-11 1153-1173AACACCAAACCAAACCGTATGFGFR1-12 1303-1323AATGGCAAAGAATTCAAACCTFGFR1-13 2905-2925AACGAGCTGTACATGATGATGFGFR1-14 1636-1656AACCTGCCTTATGTCCAGATCFGFR1-15 2857-2877AAGCTGCTGAAGGAGGGTCACFGFR1-16 1596-1616AAAGCACATCGAGGTGAATGGFGFR1-17 2230-2250AAGGACAAACCCAACCGTGTGFGFR1-18 2968-2988AAGCAGCTGGTGGAAGACCTGFGFR1-19 2254-2274AAAGTGGCTGTGAAGATGTTGFGFR1-20 1444-1464AACCACACATACCAGCTGGATSS3.5.
FGFR3基因人FGFR3，檢索號M58051，基因ID182568轉錄物變體1，檢索號NM_000142，基因ID13112046；轉錄物變體2，檢索號NM_022965，基因ID13112047；選擇了以下20個候選siRNA位置 序列
FGFR3-1 1969-1989AACCTCGACTACTACAAGAAGFGFR3-2 1627-1647AAGATGATCGGGAAACACAAAFGFR3-3 1588-1608AAGGACCTGTCGGACCTGGTGFGFR3-4 865-885 AAGGTGTACAGTGACGCACAGFGFR3-5 2263-2283AAGCAGCTGGTGGAGGACCTGFGFR3-6 652-672 AAGCTGCGGCATCAGCAGTGGFGFR3-7 1540-1560AAGCCTGTCACCGTAGCCGTGFGFR3-8 1571-1591AAGACGATGCCACTGACAAGGFGFR3-9 1321-1341AACGCGTCCATGAGCTCCAACFGFR3-10 1297-1317AAGCGACAGGTGTCCCTGGAGFGFR3-11 2191-2211AACTGCACACACGACCTGTACFGFR3-12 994-1014 AAGGAGCTAGAGGTTCTCTCCFGFR3-13 1570-1590AAAGACGATGCCACTGACAAGFGFR3-14 982-1002 AACACCACCGACAAGGAGCTAFGFR3-15 1873-1893AAGTGCATCCACAGGGACCTGFGFR3-16 331-351 AATGCCTCCCACGAGGACTCCFGFR3-17 1813-1833AAGGACCTGGTGTCCTGTGCCFGFR3-18 2152-2172AAGCTGCTGAAGGAGGGCCACFGFR3-19 1723-1743AACCTGCGGGAGTTTCTGCGGFGFR3-20 265-285 AAGGATGGCACAGGGCTGGTGSS3.6.
FGFR4基因人FGFR4，檢索號L03840，基因ID182570轉錄物變體1，檢索號NM_002011，基因ID47524172；轉錄物變體2，檢索號NM_022963，基因ID47524176；轉錄物變體3，檢索號NM213647，基因ID47524174；選擇了以下20個候選siRNA位置 序列
FGFR4-1 726-746 AAGGATGGACAGGCCTTTCATFGFR4-2 2403-2423AAGGTCCTGCTGGCCGTCTCTFGFR4-3 1743-1763AAGCTGATCGGCCGACACAAGFGFR4-4 1085-1105AAAGACTGCAGACATCAATAGFGFR4-5 292-312 AAGAGCAGGAGCTGACAGTAGFGFR4-6 1657-1677AAGCCAGCACTGTGGCCGTCAFGFR4-7 753-773 AACCGCATTGGAGGCATTCGGFGFR4-8 1833-1853AAGGGAAACCTGCGGGAGTTCFGFR4-9 1392-1412AAGCTCTCCCGCTTCCCTCTGFGFR4-10 1078-1098AAGTCCTAAAGACTGCAGACAFGFR4-11 1692-1712AACGCCTCTGACAAGGACCTGFGFR4-12 604-624 AAGCACCCTACTGGACACACCFGFR4-13 1086-1106AAGACTGCAGACATCAATAGCFGFR4-14 1686-1706AAAGACAACGCCTCTGACAAGFGFR4-15 666-686 AACACCGTCAAGTTCCGCTGTFGFR4-16 1454-1474AAGCTCATCCCTGGTACGAGGFGFR4-17 984-1004 AAGGTGTACAGCGATGCCCAGFGFR4-18 1687-1707AAGACAACGCCTCTGACAAGGFGFR4-19 1764-1784AACATCATCAACCTGCTTGGTFGFR4-20 504-524 AATCTCACCTTGATTACAGGTSS4.1.其他途徑I
HP BRCA2-AAAGTCAACCACAGAGTCGTAT247-268HP BRCA2-BAAGTAACGAGTGAGCCACGCT215-235NOXA-AAAGTCGAGTGTGCTACTCAAC238-258NOX AACTGAACTTCCGGCAGAAAC277-297新型ZF蛋白AATGCGGAGAACACTAATTAT345-365新型ZF蛋白AACTTCCATAAATGTGAAATC381-401NFAT4 AAGTGATACTCCCGCCTCAGC726-746NFAT4 AAGTAGCTGGCACTACGGGCA752-772SP1的輔因子 AATCAGGTTCCAATGTGATGA200-221SP1的輔因子 AAGGCTTAGCTCCCAAGCCTC145-165Ets2抑制蛋白 AAGGCAGATCCAGCTGTGGCA194-214Ets2抑制蛋白 AAGCCAGAGTCGTCCCCTGGC171-191PKC相關 AAGTCTTCCGTTTTCTGAGAA69-89PKC相關 AATGGTGCAGCAGAAATTGGA126-136PKC eta AAGAAGGGCCACCAGCTGCTG269-289PKC eta AACGTCACCGACGGCGGCCAC389-409線粒體F0 AACCTCGGGCAGAAGAGGAGA164-184線粒體F0 AACTGAAACGGATTGCCAGAG211-231Bcl-2 TF AAGAAGCGATACAGGTCTCGT91-111Bcl-2 TF AAGGTCTCGTAGTAGAGATCG126-146Bcl-2 A1 AACCTGGATCAGGTCCAAGCA257-277Bcl-2 A1 AATCTGAAGTCATGCTTGGAC334-354RAP1 AACAGAGGAGGACTACATTCC267-287RAP1 AACCACGAAATCACCAGCATC379-399SS5.1.其他途徑II
EGFR-RP-A AK026010AAGCTGGACATTCCCTCTGCGEGFR-RP-B AAGAGCCCAGCTTCCTGCAGC內質蛋白94-AAK025862AACTGTTGAGGAGCCCATGGA內質蛋白94-BAATCTGATGATGAAGCTGCAG葉酸BP-AAF000381AACCGCGGTCCTATTCCATTA葉酸BP-BAACACTCCAATTFTTCAAAGTA-RAF-A U33821 AAGAGTTACCTTCCTAATGCAA-RAF-B AAGATTGGGTTGGTATATTCANOVEL-1-A NM_017873 AATCCTTGTTCTCACTGAGCTNOVEL-1-B AAGATGGCTGAGCTGGGGCTGEGF因子8-A NM_005928 AACCCCTGCCACAACGGTGGTEGF因子8-B AACCACTGTGAGACGAAATGTAPRIL-A AK090698AACTGCCCCAGCGATCTCTGCAPRIL-B AACCTAATTCTCCTGAGGCTGPGF前體-A AK023843AAGAGTGACACTGTGGCTTCCPGF前體-B AATGGGCTGAGCTGCTGCTCCSS6，TNF途徑TNF途徑SS6.1.
TNF基因人TNF(同義詞DIF，TNFA，TNFSF2，TNF-α)，檢索號NM 000594，基因ID 25952110選擇了以下10個候選siRNA位置 序列hTNF-1 428-448 AAGCCTGTAGCCCATGTTGTAhTNF-2 512-532 AATGGCGTGGAGCTGAGAGAThTNF-3 671-691 AACCTCCTCTCTGCCATCAAGhTNF-4 533-553 AACCAGCTGGTGGTGCCATCAhTNF-5 731-751 AAGCCCTGGTATGAGCCCATChTNF-6 497-517 AATGCCCTCCTGGCCAATGGChTNF-7 779-899 AAGGGTGACCGACTCAGCGCThTNF-8 181-201 AAGCATGATCCGGGACGTGGAhTNF-9 665-685 AAGGTCAACCTCCTCTCTGCChTNF-10 180-200 AAAGCATGATCCGGGACGTGGSS6.2.
hTNFR1基因人TNF受體，1A(同義詞TNFRSF1A，FPF，p55，p60，TBP1，TNF-R，TNFAR，TNFR1，p55-R，CD120a，TNFR55，TNFR60，TNF-R-I，TNF-R55，MGC19588)，檢索號NM_001065，
基因ID23312372選擇了以下20個候選siRNA位置 序列hTNFR1-1 666-686 AAGAACCAGTACCGGCATTAThTNFR1-2 1005-1025AAGCTCTACTCCATTGTTTGThTNFR1-3 1320-1340AAGCCACAGAGCCTAGACACThTNFR1-4 841-861 AAAGCCTGGAGTGCACGAAGThTNFR1-5 472-492 AAGGAACCTACTTGTACAATGhTNFR1-6 714-734 AATTGCAGCCTCTGCCTCAAThTNFR1-7 605-625 AATGGGTCAGGTGGAGATCTChTNFR1-8 669-689 AACCAGTACCGGCATTATTGGhTNFR1-9 471-491 AAAGGAACCTACTTGTACAAThTNFR1-10462-482 AAGTGCCACAAAGGAACCTAChTNFR1-11604-624 AAATGGGTCAGGTGGAGATCThTNFR1-12810-830 AACGAGTGTGTCTCCTGTAGThTNFR1-13888-908 AAGGGCACTGAGGACTCAGGChTNFR1-14809-829 AAACGAGTGTGTCTCCTGTAGhTNFR1-15991-1011 AACGGTGGAAGTCCAAGCTCThTNFR1-16768-788 AACACCGTGTGCACCTGCCAThTNFR1-17732-752 AATGGGACCGTGCACCTCTCChTNFR1-181089-1109AACCCAAGCTTCAGTCCCACThTNFR1-19476-496 AACCTACTTGTACAATGACTGhTNFR1-20444-464 AATTCGATTTGCTGTACCAAGSS6.3.
hTNFR2基因人TNF受體，1B(同義詞TNFRSF1B，p75，TBPII，TNFBR，TNFR2，CD120b，TNFR80，TNF-R75，p75TNFR，TNF-R11)，檢索號Nom001066，基因ID23312365。
選擇了以下20個候選siRNA位置 序列
hTNFR2-1 844-864 AAGGGAGCACTGGCGACTTCGhTNFR2-2 957-977 AAGCCCTTGTGCCTGCAGAGAhTNFR2-3 412-432 AAGCCTGCACTCGGGAACAGAhTNFR2-4 1362-1382AAGGAGGAATGTGCCTTTCGGhTNFR2-5 294-314 AAGACCTCGGACACCGTGTGThTNFR2-6 351-371 AACTGGGTTCCCGAGTGCTTGhTNFR2-7 784-804 AACCCAGCACTGCTCCAAGCAhTNFR2-8 1301-1321AATGGGAGACACAGATTCCAGhTNFR2-9 979-1099 AAGCCAAGGTGCCTCACTTGChTNFR2-10914-934 AATAGGAGTGGTGAACTGTGThTNFR2-111227-1247AATGTCACCTGCATCGTGAAChTNFR2-12600-620 AACACGACTTCATCCACGGAThTNFR2-131288-1308AAGCCAGCTCCACAATGGGAGhTNFR2-14432-452 AACCGCATCTGCACCTGCAGGhTNFR2-15984-1004 AAGGTGCCTCACTTGCCTGCChTNFR2-16800-820 AAGCACCTCCTTCCTGCTCCChTNFR2-17954-974 AAGAAGCCCTTGTGCCTGCAGhTNFR2-181245-1265AACGTCTGTAGCAGCTCTGAChTNFR2-191369-1389AATGTGCCTTTCGGTCACAGChTNFR2-20776-796 AACTCCAGAACCCAGCACTGCSS6.4.
小鼠IL-1b AGGCTCCGAGATGAACAACAA小鼠IL-1b TACCTGTCCTGTGTAATGAAA小鼠IL-1r ACCATCGAGGTTACTAATGAA小鼠IL-1r TCGGAATATCTCCCATCATAA小鼠IL-1a TCGGGAGGAGACGACTCTAAA小鼠IL-1a CCAGAGTGATTTGAGATACAA小鼠IL-1r2 CACGTTTATCTCGGCTGCTTA小鼠IL-1r2 AAGACTGATAGTCCCGTGCAA小鼠TNF受體aAAGGAAAGTATGTCCATTCTA小鼠TNF受體aCCGCAACGTCCTGACAATGCA小鼠TNF受體bCCAGGTTGTCTTGACACCCTA小鼠TNF受體bCTGGCTATTCCCGGAAATGCA小鼠TNF CACGTCGTAGCAAACCACCAA小鼠TNF CAGCCGATTTGCTATCTCATA
權利要求
1.一種包含至少一種dsRNA寡核苷酸和藥物載體的組合物，其中當給予患有與新生血管化或血管發生有關的眼病的受試者時，所述dsRNA抑制與眼病中的新生血管化或血管發生有關的基因的表達。
2.根據權利要求1的組合物，其中所述藥物載體選自聚合物、脂質或膠束。
3.根據權利要求1或權利要求2的組合物，其中所述眼病選自基質角膜炎、色素層炎、發紅、結膜炎、角膜炎、瞼炎、瞼腺炎、瞼板腺囊腫、虹膜炎、黃斑變性和視網膜病。
4.根據權利要求1-3中任一項的組合物，其中所述dsRNA抑制選自促炎途徑基因、促血管發生途徑基因、促細胞增殖途徑基因以及病毒感染介質基因組RNA和病毒感染介質基因的基因的表達。
5.根據權利要求4的組合物，所述組合物包含至少兩種dsRNA分子，其中每種dsRNA分子能抑制選自促炎途徑基因、促血管發生途徑基因、促細胞增殖途徑基因以及病毒感染介質基因組RNA和病毒感染介質基因的基因的表達。
6.根據權利要求5的組合物，所述組合物包含至少三種dsRNA分子，其中至少一種dsRNA分子能抑制VEGF的表達，至少一種dsRNA分子能抑制VEGF R1的表達，至少一種dsRNA分子能抑制VEGF R2的表達。
7.根據權利要求5的組合物，所述組合物包含至少兩種dsRNA分子，其中至少一種dsRNA分子能抑制堿性FGF的表達，至少一種dsRNA分子能抑制FGF R的表達。
8.根據權利要求5的組合物，其中所述dsRNA分子能抑制一個或多個VEGF途徑基因、FGF途徑基因或它們的組合的表達。
9.根據權利要求5的組合物，其中所述dsRNA分子能抑制一個或多個促血管發生基因、促炎基因或它們的組合的表達。
10.根據權利要求5的組合物，其中所述dsRNA分子能抑制一個或多個促血管發生基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合的表達。
11.根據權利要求5的組合物，其中所述dsRNA分子能抑制一個或多個促血管發生基因、內皮細胞增殖基因或它們的組合的表達。
12.根據權利要求5的組合物，其中所述dsRNA分子能抑制一個或多個促炎基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合的表達。
13.根據權利要求5的組合物，所述組合物包含至少三種能抑制至少兩個或多個基因的表達的dsRNA分子。
14.根據權利要求13的組合物，其中所述基因編碼VEGF、VEGFR1和VEGF R2。
15.根據權利要求13的組合物，其中所述基因編碼堿性FGF和FGF R的表達。
16.根據權利要求13的組合物，其中所述基因編碼VEGF途徑基因、FGF途徑基因或它們的組合。
17.根據權利要求13的組合物，其中所述基因是促血管發生基因、促炎基因或它們的組合。
18.根據權利要求13的組合物，其中所述基因是促血管發生基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合。
19.根據權利要求13的組合物，其中所述基因是促血管發生基因、內皮細胞增殖基因或它們的組合。
20.根據權利要求13的組合物，其中所述基因是促炎基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合。
21.根據權利要求2的組合物，其中所述載體選自聚陽離子粘合劑、陽離子脂質、陽離子膠束、陽離子多肽、親水聚合物接枝聚合物、非天然陽離子聚合物、陽離子聚縮醛、親水聚合物接枝聚縮醛、配體官能化陽離子聚合物和配體官能化親水聚合物接枝聚合物。
22.根據任一前述權利要求的組合物，其中所述dsRNA分子是dsRNA寡核苷酸。
23.一種治療受試者的眼病的方法，其中所述疾病至少部分特征是新生血管化，所述方法包括給予所述受試者包含dsRNA寡核苷酸和藥學可接受載體的組合物，其中所述dsRNA寡核苷酸能抑制促使所述受試者發生眼新生血管化的基因的表達。
24.根據權利要求23的方法，其中所述眼病至少位于眼前部。
25.根據權利要求23的方法，其中所述組合物在選自結膜下、靜脈和皮下的眼睛遠側部位給予。
26.根據權利要求23的方法，其中所述組合物局部給予眼睛。
27.根據權利要求23的方法，其中所述藥物載體選自聚合物、脂質或膠束。
28.根據權利要求23的方法，其中所述眼病選自基質角膜炎、色素層炎、發紅、結膜炎、角膜炎、瞼炎、瞼腺炎、瞼板腺囊腫、虹膜炎、黃斑變性和視網膜病。
29.根據權利要求23的方法，其中所述dsRNA能抑制至少一個選自促炎途徑基因、促血管發生途徑基因、促細胞增殖途徑基因以及病毒感染介質基因組RNA和病毒感染介質基因的基因的表達。
30.根據權利要求23的方法，其中所述dsRNA能抑制不只一個基因的表達。
31.根據權利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制VEGF、VEGF R1和VEGF R2的表達。
32.根據權利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制堿性FGF和FGF R的表達。
33.根據權利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制VEGF途徑基因、FGF途徑基因或它們的組合的表達。
34.根據權利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制促血管發生基因、促炎基因或它們的組合的表達。
35.根據權利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制促血管發生基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合的表達。
36.根據權利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制促血管發生基因、內皮細胞增殖基因或它們的組合的表達。
37.根據權利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制促炎基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合的表達。
38.根據權利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制不只兩個基因的表達。
39.根據權利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制VEGF、VEGF R1和VEGF R2的表達。
40.根據權利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制堿性FGF和FGF R的表達。
41.根據權利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制VEGF途徑基因、FGF途徑基因或它們的組合的表達。
42.根據權利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制促血管發生基因、促炎基因或它們的組合的表達。
43.根據權利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制促血管發生基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合的表達。
44.根據權利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制促血管發生基因、內皮細胞增殖基因或它們的組合的表達。
45.根據權利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制促炎基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合的表達。
46.根據權利要求2的方法，其中所述載體選自聚陽離子粘合劑、陽離子脂質、陽離子膠束、陽離子多肽、親水聚合物接枝聚合物、非天然陽離子聚合物、陽離子聚縮醛、親水聚合物接枝聚縮醛、配體官能化陽離子聚合物和配體官能化親水聚合物接枝聚合物。
47.根據權利要求23-46中任一項的方法，其中所述受試者是人。
全文摘要
提供了治療眼病的組合物和方法。具體的說，提供了能抑制眼睛血管發生和/或新生血管化的siRNA分子和siRNA分子的混合物。所述組合物和方法適合用于治療與血管發生和/或新生血管化有關的眼病。
文檔編號A61K48/00GK101052644SQ200580011952
公開日2007年10月10日 申請日期2005年2月7日 優先權日2004年2月5日
發明者Q·唐, P·Y·盧, F·Y·謝, M·C·伍德爾 申請人:因特拉迪格姆公司