組織材料和肌肉來源的基質的制作方法

專利名稱：組織材料和肌肉來源的基質的制作方法
背景技術：
發明領域總的來說，本發明涉及對促進或利于細胞和組織的生長、發育和分化有用的組織制劑，包括組織細胞及其提取物。更具體而言，本發明提供了包括完整的或提取的細胞外基質和/或細胞以及細胞因子、生長因子及其他組分的肌肉來源的材料。本發明的肌肉制劑類似基底膜并且來源于基于細胞的材料。該肌肉制劑可以在體外或體內使用，尤其是在各種組織工程應用中作為細胞支架并在其他細胞培養系統中用于營養并富集一系列細胞類型，包括但不限于，前體和干細胞例如前脂肪形成細胞(pre-adipogenic ceu)。該肌肉制劑還在例如化妝品和局部治療劑工業中用作乳膏的基礎并在食品工業中用作基質或添加劑。
現有技術描述本說明書中的參考文獻的目錄細節也列在本說明書的結尾處。
本說明書中對任何現有技術的參考不是也不應被視為承認或任何形式的暗示所述現有技術構成任何國家的公知常識的一部分。
基底膜是將上皮細胞與基質及周圍的神經、肌纖維、平滑肌細胞以及脂肪細胞分開的連續的薄片。電子顯微鏡分析表明基底膜的組分是網狀結構的細絲，所述細絲相互作用形成膜。這個網狀結構部分地由膠原IV分子的存在引起，所述膠原IV分子由分子間的二硫鍵互相連接(Inoue等人，J Cell Biol，971524-1539，1983)。
已知基底膜的各種組分彼此相互作用。例如，基底膜的組分之一，層粘連蛋白，與膠原蛋白IV以及硫酸乙酰肝素蛋白聚糖結合。
基底膜制劑可以提供具有細胞生長、發育和分化特征的生理學相關環境。這些制劑通常在組成和活性上是異質的。例如，某些制劑是可溶性的并缺乏作為細胞基質的適合性(Terranova等人，Cell22719-726，1980)。
一種來源于Engelbreth Holm-Swarm(EHS)鼠肉瘤的制劑是以商品名“Matrigel”[商標，BD Biosciences]出售的富含基底膜的基質并由Kleinman等人，Biochem 218188-6193，1982描述。Matrigel已成為促進細胞生長、發育和分化的有用產品。然而，在某些情況下，某些細胞與鼠類來源的Matrigel在互相作用的水平上可能存在種屬特異性差異，這使得這種產品不適合用于非鼠科動物細胞例如人細胞。它還可以在非鼠科動物宿主中不正當的引發免疫應答。
依照本發明，提供在一系列細胞包括人細胞中具有特別有用的生長、形態學和分化促進活性的新型富含基底膜的組織制劑。
發明概述本說明書自始至終，除非上下文以別的方式要求，單詞“包括”或“包含”將被理解為暗示包含所陳述的元件或整體或一組元件或整體但不排除其他任何元件或整體或一組元件或整體。
本發明提供細胞的以及完整的和提取的細胞外基質材料，它用作支架以支持細胞的生長、發育和分化并支持或實現細胞的形態學改變。組織材料優選來源于肌肉組織并包括包含基底膜組分的制劑。這些組分包括一種或多種下列成分，所述成分例如但不限于，層粘連蛋白、膠原蛋白I、膠原蛋白IV、觸覺蛋白/巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖以及一種或多種的細胞因子或生長因子，所述細胞因子或生長因子例如但不限于，表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、神經生長因子(NGF)、血小板來源的生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、轉化生長因子-β(TGF-β)、血管內皮生長因子(VEGF)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。一般地，組織材料包括基于細胞的制劑或完整的或提取的細胞外基質。一般利用例如尿素或SDS提取或冷凍/融解或冷凍干燥隨后洗滌的方法來制備完整的或提取的無細胞制劑。一般利用例如切碎、戊二醛固定和/或在二甲基亞砜(DMSO)或其他冷凍保存劑中冷凍的技術來制備基于細胞的制劑。冷凍干燥不能保存完整的細胞但臨界點干燥可以。
為了方便起見，組織材料在本文中也稱為肌肉基質、肌肉基底膜基質、myomatrix、myotrix、肌肉支架、myogel和細胞培養組合物。術語“肌肉基質”為了方便簡潔而使用，應理解它涵蓋了基于細胞的制劑和無細胞的制劑。無細胞制劑包括完整的和提取的細胞外基質。
本發明的肌肉基質具有各種用途，例如在組織工程中促進大量組織產生用于組織修復、增加和/或替代療法。該肌肉基質也用作工程化組織的支架，所述組織例如但不限于肌肉和脂肪。它也用作富集并營養來自適當干細胞部位的適當前脂肪形成細胞的手段。作為研究工具，本發明的肌肉基質用于細胞的生長、發育和分化研究，所述細胞例如內皮細胞、上皮細胞、神經膠質、神經元、肌細胞和前脂肪細胞。在化妝品和食品工業，該肌肉制劑用作乳膏的基礎和作為食品添加劑以及在治療上作為細胞修復組合物。
本發明的肌肉基質特別優于其他基底膜制劑，因為它誘導或以其他方式促進更加廣泛范圍的細胞活性并可以種類保守方式應用。
本文所使用的縮寫定義于表1中。
表1縮寫
附圖簡述附

圖1的照片顯示了Matrigel與各種其他組織基質的SDS PAGE比較。(從左往右)泳道1和2代表預先染色的分子量標準；泳道3和4代表商購的Metrigel(BD Biosciences)；泳道5代表大鼠肌肉基質；泳道6代表豬肌肉基質；泳道7代表人肌肉基質。所有樣品均以大約10μg總蛋白濃度上樣。
附圖2的照片顯示了(a)來自人骨骼肌的肌肉基質制劑。圖(b)和(c)舉例說明了肌肉基質的一種其它形式，即肌肉基質經TIPS處理形成的海綿狀物。圖(c)是附圖2(b)中海綿狀物的掃描電子顯微照片。
附圖3的照片是(a)豬肌肉來源的粗肌肉基質和(b)Matrigel。
附圖4的顯微照片顯示了組織(包括脂肪組織)在大鼠中的成功產生。附圖4(a)和(b)是來自大鼠組織工程腔室模型的代表性切片，所述模型在植入前用MyoGel覆蓋。
附圖5A的照片顯示了在組織培養塑料制品上的對照前脂肪細胞，顯示有分化。5B顯示在Myogel上的前脂肪細胞，顯示脂質積聚以及向成熟脂肪細胞的分化。插入的圖顯示單個細胞積聚脂質的高倍放大圖像。5C顯示小鼠腔室的低倍顯微照片，所述腔室已充滿誘導脂肪形成的肌肉提取物。
附圖6的照片是不同MyoGel種類中各種ECM組分的蛋白質印跡的代表性實例。所有的箭頭和數字代表分子量(MW)水平。6A涉及大鼠肌肉提取物中膠原蛋白I的免疫印跡，標記3條鏈(100、200、300kD)。泳道1-10是十種不同的大鼠肌肉提取物制劑。6B顯示大鼠肌肉提取物中的層粘連蛋白α4(180kD)和α2(80kD片段以及在300kD處的少許彌散)。泳道1為Matrigel對照而泳道2-11為相同的大鼠肌肉提取物制劑，顯示特別是關于α4鏈的強帶。6C顯示在大鼠MyoGel硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)凝膠中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖結合，泳道1為分子量標準，泳道2為Matrigel，在200kD條帶上有基底膜蛋白聚糖染色而泳道3-11為大鼠肌肉提取物。6D顯示在大鼠肌肉提取物樣品中結合的纖連蛋白片段，泳道1為Matrigel對照而泳道2-11為相同的大鼠肌肉提取物。
優選實施方案的詳細描述本發明提供了尤其是對脂肪形成應用以及與組織工程、增加、修復和研究相關的其他應用有用的組織制劑。該制劑還在局部治療劑、化妝品和食品工業中有著應用。材料的一種優選形式包括溶解的、提取的來源于肌肉的基底膜材料。另一形式包括含溶解的細胞和基底膜材料的完整基質。再一優選形式包括完整組織和細胞。因此，組織材料以不同的方式被稱為肌肉提取物材料、肌肉基質、myomatrix、myotrix、肌肉基底膜基質、肌肉支架、myogel和細胞組合物或制劑。這些術語在本說明書自始至終互換使用但由術語“肌肉基質”涵蓋。
因此，肌肉基質制劑可以是基于細胞的或完整的或提取的細胞外基質。一般利用例如尿素或SDS提取方法來制備無細胞提取物。一般通過冷凍/融解隨后洗滌來制備完整的細胞提取物材料，但可以包括提取后的殘渣。一般利用例如切碎、戊二醛固定和/或冷凍干燥技術來制備基于細胞的制劑。還可采用其他類似方法并且所有此類方法均由本發明涵蓋。這些方法包括臨界點干燥、利用除戊二醛以外的固定劑的蛋白質交聯以及機械破碎新鮮肌肉。此外，存在各種提取前提取后技術，所述技術可以用于進一步增強產品或可以單獨使用。這些技術包括通過各種物理化學程序(例如研磨、粉碎、TIPS等)處理材料、在冷凍且漂洗后和改變的冷凍后洗滌固定組織。甚至可以改變起始組織例如使用平滑肌或心肌。所有此類改變均在本發明的范圍之內。
本發明的優選組織材料一般包括一種或多種下列組分，所述組分例如但不限于，層粘連蛋白、膠原蛋白I、膠原蛋白IV、觸覺蛋白/巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖以及其他組分，包括細胞因子和生長因子例如，但不限于，一種或多種EGF、bFGF、NGF、PDGF、IGF-1、TGF-β、VEGF和TNF-α。組織材料富含肌肉基底膜組分。本發明的組織材料具有一系列的效用，包括特別是組織研究和組織工程，所述組織包括但不限于脂肪、肌肉、肝臟和胰腺。它還為體外生物測定來源材料的脂肪形成潛力提供了基礎，所述材料即來自不同部位的脂肪和脂肪前體細胞。該制劑進一步在局部治療劑、化妝品和食品工業中有著應用。
相應地，本發明提供了物質組合物用于促進細胞或組織中的細胞生長，包括分化、增殖、分裂和/或形態學改變，所述組合物包括基于細胞的或無細胞提取物的肌肉組織制劑，這種制劑提供了下列組分的來源，所述組分例如但不限于，層粘連蛋白、膠原蛋白I、膠原蛋白IV、觸覺蛋白/巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖以及其他組分，包括細胞因子和生長因子例如，但不限于，一種或多種EGF、bFGF、NGF、PDGF、IGF-1、TGF-β、VEGF和TNF-α或其同源物。
在一個優選實施方案中，組織材料包含層粘連蛋白、觸覺蛋白/巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、膠原蛋白IV、bFGF、PDGF、TGF-β、VEGF和TNF-α。
為了方便起見，術語“細胞效應”將用于涵蓋細胞分化的生長和分裂、增殖以及形態學改變。
組織材料的來源可以來自任何動物并優選哺乳動物，例如，但不限于，人、非人靈長類(例如大猩猩(gorilla)、狨猴(marmoset)或猩猩(orangoutang))、家畜類動物(例如奶牛、綿羊、豬、馬、驢、山羊、駱駝)、實驗室試驗動物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、倉鼠)或伴侶動物(例如狗、貓)。本發明還擴展至鳥類來源，例如雞、鴨、鵝、火雞以及其他家禽或獵禽，爬行動物來源例如蛇和蜥蜴以及兩棲動物來源例如青蛙和蟾蜍。
在一個特別優選的實施方案中，使用來自豬、小鼠、大鼠或人的肌肉組織。
相應地，本發明的另一方面提供了包括來自哺乳動物的肌肉制劑的物質組合物，所述組合物包括(i)基于細胞或無細胞的材料；
(ii)選自列表的組分，所述列表包括一種或多種，但不限于，層粘連蛋白、膠原蛋白IV、觸覺蛋白/巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖；(iii)選自列表的細胞因子或生長因子，所述列表包括一種或多種，但不限于，EGF、bFGF、NGF、PDGF、IGF-1、TGF-β、VEGF和TNF-α或其同源物；以及(iv)約1μg/ml-約100mg/ml的總蛋白含量。
提到上述組分例如層粘連蛋白、膠原蛋白IV、觸覺蛋白/巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或EGF、bFGF、NGF、PDGF、IGF-1、IGF-2、TGF-β、VEGF和TNF-α應被認為是那些組分，但不必限于那些組分，換句話說，該制劑可以包含未列出的其他組分。
組織材料的組分可以完全來源于肌肉組織或者可以在制備過程中加入額外因子，例如但不限于，額外的膠凝劑(例如鹽溶質和/或糖)、細胞因子、抗生素、生長強化因子、基因表達增強子、增殖抑制劑和/或干細胞分化促進因子。
在一個實施方案中，組織材料可以被認為是在體外或體內促進細胞培養、細胞分化、去分化或生長的組合物。
在一個特別優選的實施方案中，組織材料促進細胞生長和分化，所述細胞選自特別是干細胞、上皮細胞、皮膚細胞、器官細胞和內皮細胞。
“無細胞材料”包括單獨的提取基質或細胞已被溶解并大部分去除的制劑。
本發明進一步提供細胞培養組合物用于促進細胞生長和分化或實現細胞或組織形態學改變，其中所述細胞培養組合物包括一種或多種下列組分，所述組分例如但不限于，層粘連蛋白、膠原蛋白I、膠原蛋白IV、觸覺蛋白/巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖以及其他組分，包括細胞因子和生長因子，例如但不限于，一種或多種EGF、bFGF、NGF、PDGF、IGF-1、IGF-2、TGF-β、VEGF和TNF-α或其同源物，并且細胞培養組合物聚合成凝膠。
“細胞因子”包括選自所提供列表的單個或多個細胞因子。當然，也可存在或包括其它細胞因子。同樣地，可以存在層粘連蛋白、膠原蛋白IV、觸覺蛋白/巢蛋白和/或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖之一或可以存在這些組分的兩種或多種。還可存在或添加其它細胞外基質材料。
聚合作用一般發生在約15℃-約50℃的溫度，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃。還可以采用波動溫度。
術語“凝膠”以其最廣泛的含義使用并包括半流體、半硬式材料、可變形的材料、稠密的液體、乳膏、固體支持體或其組合，包括適合用作食品添加劑的材料。
在一個優選的實施方案中，存在的細胞因子的量如下bFGF約0.3ng/ml-約4ng/ml例如0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0ng/ml。
PDGF約1pg/ml-約3000pg/ml例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、1390、1400、1410、1420、1430、1440、1450、1460、1470、1480、1490、1500、1510、1520、1530、1540、1550、1560、1570、1580、1590、1600、1610、1620、1630、1640、1650、1660、1670、1680、1690、1700、1710、1720、1730、1740、1750、1760、1770、1780、1790、1800、1810、1820、1830、1840、1850、1860、1870、1880、1890、1900、1910、1920、1930、1940、1950、1960、1970、1980、1990、2000、2010、2020、2030、2040、2050、2060、2070、2080、2090、2100、2110、2120、2130、2140、2150、2160、2170、2180、2190、2200、2210、2220、2230、2240、2250、2260、2270、2280、2290、2300、2310、2320、2330、2340、2350、2360、2370、2380、2390、2400、2410、2420、2430、2440、2450、2460、2470、2480、2490、2500、2510、2520、2530、2540、2550、2560、2570、2580、2590、2600、2610、2620、2630、2640、2650、2660、2670、2680、2690、2700、2710、2720、2730、2740、2750、2760、2770、2780、2790、2800、2810、2820、2830、2840、2850、2860、2870、2880、2890、2900、2910、2920、2930、2940、2950、2960、2970、2980、2990、3000pg/ml。
TGF-β約1pg/ml-約2000pg/ml例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、1390、1400、1410、1420、1430、1440、1450、1460、1470、1480、1490、1500、1510、1520、1530、1540、1550、1560、1570、1580、1590、1600、1610、1620、1630、1640、1650、1660、1670、1680、1690、1700、1710、1720、1730、1740、1750、1760、1770、1780、1790、1800、1810、1820、1830、1840、1850、1860、1870、1880、1890、1900、1910、1920、1930、1940、1950、1960、1970、1980、1990、2000pg/ml。
EGF約0ng/ml-約100ng/ml例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100ng/ml。
VEGF約1pg/ml-約3000pg/ml例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、1390、1400、1410、1420、1430、1440、1450、1460、1470、1480、1490、1500、1510、1520、1530、1540、1550、1560、1570、1580、1590、1600、1610、1620、1630、1640、1650、1660、1670、1680、1690、1700、1710、1720、1730、1740、1750、1760、1770、1780、1790、1800、1810、1820、1830、1840、1850、1860、1870、1880、1890、1900、1910、1920、1930、1940、1950、1960、1970、1980、1990、2000、2010、2020、2030、2040、2050、2060、2070、2080、2090、2100、2110、2120、2130、2140、2150、2160、2170、2180、2190、2200、2210、2220、2230、2240、2250、2260、2270、2280、2290、2300、2310、2320、2330、2340、2350、2360、2370、2380、2390、2400、2410、2420、2430、2440、2450、2460、2470、2480、2490、2500、2510、2520、2530、2540、2550、2560、2570、2580、2590、2600、2610、2620、2630、2640、2650、2660、2670、2680、2690、2700、2710、2720、2730、2740、2750、2760、2770、2780、2790、2800、2810、2820、2830、2840、2850、2860、2870、2880、2890、2900、2910、2920、2930、2940、2950、2960、2970、2980、2990、3000pg/ml。
TNF-α約0pg/ml-約1000pg/ml例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000pg/ml。
在一個實施方案中，缺少IGF-1。
因此本發明提供了基于細胞或無細胞制劑形式的組織來源的材料，用于細胞生長和發育并用于實現細胞或組織形態學改變，所述材料來源于人、非人靈長類、家畜動物、伴侶動物、鳥類、爬行動物或兩棲動物的肌肉并包括一種或多種選自列表的細胞因子和/或生長因子，所述列表包括，但不限于，約1.0ng/ml-約4ng/ml bFGF、約1pg/ml-約3000pg/ml PDGF、約1pg/ml-約2000pg/ml TGF-β、約1pg/ml-約3000pg/ml VEGF、約0pg/ml-約1000pg/ml TNF-α以及約0ng/ml-約100ng/ml EGF，所述材料進一步包括一種或多種組分，所述組分選自，但不限于，層粘連蛋白、膠原蛋白IV、觸覺蛋白/巢蛋白和/或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。
組織材料優選為具有類似基底膜和/或其組分的層狀結構的凝膠形式。組織材料可以是凝膠形式或者它可以是可聚合為凝膠形式的“前體”形式或者它可以是基于細胞的。便利地，當組織材料是前體形式時，它是可重建為凝膠或基質形式的。甚至更便利地，重建前體的基質形式在本文中被稱為“肌肉基質”。凝膠形式或前體形式(包括基于細胞制劑)的本發明肌肉基質也可被制成或摻合到珠、海綿、乳膏等中。盡管凝膠形式是制劑的一種優選形式，本發明還預期了具有與凝膠類似“膠凝作用”特征的基于細胞的制劑。
相應地，本發明的肌肉基質用于促進各種細胞的細胞生長和分化并實現細胞或組織形態學改變。上皮細胞、內皮細胞、神經細胞和干細胞特別響應肌肉基質而生長和分化。它還幫助細胞粘附以及幫助細胞生長、發育、分化和/或增殖，所述細胞選自，但不限于，神經元、肝細胞、支持細胞、毛囊、甲狀腺細胞等。如上所述，“肌肉基質”應被理解為涵蓋基于細胞的制劑和無細胞的制劑。
細胞可以在體外的肌肉基質上進行培養并隨后回到它們所源自的動物或免疫抑制或組織相容的動物中。在這個上下文中，“動物”包括人、非人哺乳動物、家畜動物、伴侶動物或鳥類、爬行類或兩棲類。同樣地，肌肉基質可在特定位點或在腔室內或其他植入身體的支架中單獨用于體內促進細胞生長或組織生長。
本發明的肌肉基質一般在低溫下制備，例如約1℃-約10℃例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10℃或在這個范圍內的非整數溫度。4℃的溫度特別有用。收集新鮮肌肉。約10-約100g便于處理。從肌肉上剪去可見脂肪并讓組織在緩沖液中(例如NaCl緩沖液)接觸蛋白酶抑制劑。為了制備無細胞提取物，對所得到的組織進行勻漿處理并隨后進行離心以去除上清液。將組織沉淀重懸浮在緩沖液(例如NaCl)中并重新進行勻漿處理。重復這兩個洗滌步驟。在最后一次洗滌后，在尿素緩沖液中重懸浮沉淀。組織勻漿攪拌過夜并完成一系列洗滌，每次收集上清液。隨后用紗布過濾上清液以去除游離的漂浮脂肪。隨后對溶劑(例如氯仿)透析過夜以滅菌材料。將溶劑換成緩沖液并繼續透析以去除溶劑。最后一次透析后，使用的最終緩沖液是DMEM或其等同物。將所得到的前基質材料進行分配并保存在-20℃。
需要時，取回前基質材料的樣品并在約20-約50℃例如大約37-42℃進行孵育，在所述溫度下基質聚合成凝膠狀形式。還可以加入幫助膠凝作用的添加劑，包括但不限于血漿。
利用SDS也可制備提取物。可替代地，可以利用冷凍干燥/融解隨后洗滌來制備制劑。這被稱為完整基質。利用切碎、冷凍干燥和/或戊二醛固定可以很方便地制備基于細胞的制劑(即完整組織)。
本發明的組織提取物材料或肌肉基質可以被包裝為前基質或基質的形式出售，并且可以與關于如何使用的說明書一起供應。附加組分可以在包裝或試劑盒內并且在使用前被包括或在使用時被混合。
如上所述，肌肉基質特別適合于培養各種細胞，所述細胞包括但不限于脂肪細胞、3T3-L1細胞、HUVEC、MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞、PC-12細胞和NG-108神經細胞以及一系列通過標準程序分離的前脂肪細胞。
肌肉基質還用于體外生物測定來源材料的脂肪形成潛力。該制劑還具有體外生物測定其他基底膜響應細胞類型的分化以及許多發病狀態例如癌癥和糖尿病的能力，所述細胞例如上皮細胞、神經元、內皮細胞。
根據這個方面，對肌肉基質實施體外測定以測定誘導脂肪形成的組成成分，包括細胞和/或分子組分。測定包括用一層或多層待測的潛在脂肪形成組分例如肌肉基質的提取物覆蓋在容器表面，接種具有潛力以經歷脂肪形成分化的細胞并隨后檢查脂肪形成。可替代地，將肌肉基質覆蓋在表面上并添加其他化合物并隨后檢查該系統中增強或減少的脂肪形成。在另一實施方案中，將具有潛力經歷脂肪形成分化的細胞維持在懸浮培養中并向培養基中補充待測的潛在脂肪形成組分例如肌肉基質的提取物或級分。細胞懸浮的優點是允許從培養基中快速分離細胞以測定它們是否已經歷分化。可替代地，測定包括產生包含潛在脂肪形成組分或提取物的三維支架，接種具有潛力經歷脂肪形成分化的細胞并隨后檢查脂肪形成。因此，本發明的測定系統還可具有附加優點，所述優點為提供或選擇或開發用于組織工程的最優化前脂肪細胞群體。測定可以方便地在體外適當的容器中進行。在這種情況下，可以用細胞材料制劑覆蓋在基質的表面。容器還可與使用說明書一起被包裝出售。
相應地，本發明預期體外測定調節脂肪形成的組分、提取物或細胞系統，所述測定包括檢查肌肉制劑以鑒別具有脂肪細胞分化傾向的細胞群，產生或獲得潛在調節脂肪形成的組分或提取物或細胞系統，將所述具有脂肪細胞分化傾向的細胞群接種在所述組分或提取物上，將所述細胞孵育足夠時間使脂肪形成產生，并隨后在所述細胞中檢查脂肪細胞的分化。在這個上下文中的“細胞系統”具有與基于細胞的制劑相同的含義。
在某些實施方案中，潛在調節脂肪形成的組分或提取物或細胞系統促進脂肪形成。在其他實施方案中，調節脂肪形成的組分或提取物或細胞系統抑制脂肪形成。
“調節”是指直接或間接地增加或減少脂肪形成水平。
可以獲得或產生潛在調節脂肪形成的組分或提取物或細胞系統層。可替代地，可以獲得或產生包含潛在調節脂肪形成的組分或提取物或細胞系統的三維支持基質。在某些實施方案中，可以將具有潛力經歷脂肪細胞分化的細胞維持在懸浮培養中并向培養基中補充潛在調節脂肪形成的組分或提取物。術語“層”包括兩層或多層。本方法擴展至向肌肉基質中加入潛在脂肪形成促進劑。
本發明的再一方面提供了產生適合移植到受體內的供體血管化組織的方法，所述方法包括制造包含功能循環系統的血管蒂并且有組織或組織提取物或其組分注入、附著或以其他方式與所述血管蒂關聯；將血管蒂結合在支持基質內部和/或上方；在支持基質中接種被分離的細胞或組織碎片，所述細胞或組織利用體外測定鑒別為促進脂肪形成；或某些其他有用的端點，將包含血管蒂的支持基質植入到受體某個部位，在所述部位上功能循環系統與局部的動脈或靜脈吻合；并將支持基質留在植入部位足夠的時期以允許血管化新組織生長，其中根據特定的標準選擇注入材料或接種材料，例如，通過測定法測定時它促進脂肪形成，所述測定法包括檢查組織或組織提取物以鑒別具有脂肪形成分化傾向的細胞群，產生或獲得潛在促進脂肪形成的組分或提取物，將具有脂肪細胞分化傾向的細胞群接種在所述組分或提取物上，將所述細胞孵育足夠時間使脂肪形成發生并隨后在所述細胞中檢查脂肪細胞的分化。
在一個優選實施方案中，血管蒂包括附著脂肪或其他脂肪組織或包含下列細胞的組織，所述細胞有成肌細胞、成纖維細胞、前脂肪細胞和脂肪細胞、心肌細胞、角質化細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、軟骨細胞、周細胞、骨髓來源的基質前體細胞、胚胎干細胞、間充質干細胞或造血干細胞、許旺(Schwann)細胞及外周和中樞神經系統的其他細胞、嗅細胞、肝細胞及其他肝臟細胞、腎小球系膜及其他腎細胞、胰島β細胞及導管細胞、甲狀腺細胞、其他內分泌器官的細胞以及上述細胞的球狀體。在選擇之前，所有這些細胞在體外測試其在基質上生長/存活的潛力或分化成其他有用組織的能力例如脂肪形成潛力。血管蒂上附著組織的存在進一步促進新脂肪組織在支持基質內部或周圍生長。在一個替代實施方案中，組織提取物或組織的重組、合成或純化組分與血管蒂相聯。例如，在一個優選實施方案中，這些組分和提取物來源于基質材料并在體外檢查脂肪形成潛力。
基質被允許設定并且在完全培養基(例如含FCS的DMEM)或分化培養基(補充有1μM地塞米松、胰島素、吲哚美辛和IBMX的完全培養基)的存在下將有脂肪細胞分化能力的細胞覆蓋在單層基質上。經過14天的時間段觀察到脂肪形成。適當的脂肪細胞的實例包括3T3-L1細胞或通過標準程序分離的前脂肪細胞。
因此，本發明預期體外測定促進脂肪形成的組分或提取物，所述測定包括在容器表面產生或獲得來自肌肉基質的潛在脂肪形成提取物層，在所述層上接種具有脂肪細胞分化傾向的細胞群，將所述細胞孵育足夠時間使脂肪形成發生并隨后在所述細胞中檢查脂肪細胞的分化。
在另一實施方案中，測定在三維支持基質中進行，所述三維支持基質可以基本上由肌肉基質構成或包含由肌肉基質覆蓋的支架，關于這點執行本領域技術人員已知的三維細胞培養技術，例如轉瓶技術(Mueller-Klieser J Cancer Res Clin Oncol 13101-122，1986)、流體鍍層技術(Yuhas，等人，Cancer Res 373639-3643，1977)。三維細胞培養技術的另一實例是經過特別改造的旋轉培養瓶，通過圍繞水平軸旋轉流體填充的培養瓶以使重力矢量隨機化，同時用最小的流體剪切力懸浮細胞和細胞團塊。這些裝置已在美國專利號5,153,131；5,153,132；5,153,133；5,153,034,和5,155,035中得到描述。
三維基質的優點之一是它維持培養細胞活性增殖的時期比單層系統更長。這可能部分由于三維基質的面積增加導致細胞活性增殖周期延長。基質提供維持培養細胞長期活性增殖所需的支持物、生長因子和調節因子。通過向支持物本身加入蛋白質、糖蛋白、糖胺聚糖、細胞基質以及其他材料或通過用這些材料覆蓋支持物可進一步增強在該支持物存在下的細胞生長。基質的三維性允許形成有助于細胞成熟和遷移的微環境。當生長在這種三維系統中時，增殖細胞成熟并適當地分離以形成類似于體內的成熟組織組分。
為了使三維結構能夠維持活細胞的活性，三維基質應當展示適當的空間和組成特性。此類基質包括水凝膠或多孔基質例如基于纖維的或海綿樣基質。三維基質中常用材料為天然聚合物或“生物基質”、合成聚合物以及無機合成物。在本實施方案中，該方法預期三維基質用于體外測定時，基質的生物相容性不是特別重要。
生物基質的優選實例是從肌肉基質提取的那些或與肌肉基質相似的那些或具有包含肌肉基質的細胞系統。
本發明進一步預期了肌肉基質在促進細胞生長的組合物產品中的用途。本發明的肌肉制劑還有利于基于所選擇的對肌肉制劑特異的生長和形態學特征對復雜的細胞混合物選擇性純化具體細胞類型(例如前脂肪細胞)。
冠詞“a”和“an”在本文中用來指超過一個(即至少一個)語法目標的物品。例如，“組分”指一個和超過一個的組分。
通過下列非限制性實施例來進一步描述本發明。
實施例1基質提取I收集來自新近宰殺的動物(大鼠和豬)或來自經歷整形外科手術的患者的肌肉樣品。所有的樣品均在適當的倫理委員會批準下并完全征得同意進行收集。所有程序步驟均在冰上或在4℃進行。
肌肉被收集、稱重并在提取基質前剪去脂肪。樣品隨后被洗滌并在加入蛋白酶抑制劑(0.5mM PMSF、2mM EDTA、0.1M EACA、2mM NEM)的冰冷的3.4M NaCl緩沖液中勻漿。組織勻漿隨后在4℃ 10,000rpm離心15分鐘，隨后棄去上清液并且在3.4M NaCl緩沖液中重懸浮沉淀。這個步驟重復2-3次。
沉淀隨后在與原始組織體積相等體積的2M尿素緩沖液中重懸浮，勻漿并在4℃攪拌過夜。這之后，提取物在4℃ 14,000RPM離心30分鐘并保存上清液。沉淀在原始體積一半的2M尿素緩沖液中重新勻漿隨后重復離心步驟。隨后將上清液與以前保存的上清液合并并進行過濾。
提取物隨后在0.05M Tris/0.15M NaCl緩沖液(TBS)中4℃對0.5％ v/v氯仿透析過夜作為滅菌步驟。提取物隨后只對TBS進行幾次透析，隨后為DMEM進行透析。等分量的提取物保存于-20℃。
實施例2基質提取II所有步驟均在4℃或在冰上進行。收集盡可能新鮮的肌肉組織(優選最少約20-30g)并稱重。在鋼制解剖盤中盡可能快地從肌肉上剪去所有可見脂肪。以2∶1的體積比(例如100ml緩沖液對50g肌肉)往冰上的燒杯中加入含蛋白酶抑制劑的冷的3.4M NaCl緩沖液并加入肌肉。樣品隨后徹底勻漿。肌肉組織勻漿在4℃ 10,000RPM離心15分鐘。隨后棄去上清液并在等量的3.4M NaCl緩沖液中將沉淀重懸浮且重新勻漿。這個步驟重復2次，使得在NaCl中總共洗滌3-4次。第3次洗滌后沉淀在1∶1體積含0.5M NaCl、蛋白酶抑制劑的50mMTris-HCl(pH7.4)中重懸浮并勻漿(例如50ml對50mg肌肉)。在4℃利用磁力攪拌器將樣品旋轉過夜。樣品隨后在4℃ 14,000RPM離心30分鐘，棄去上清液并保存樣品。沉淀隨后在含2.0M鹽酸胍)、0.2mM二硫蘇糖醇的50mM Tris-HCl(pH7.4)中進行勻漿。將組織勻漿攪拌過夜并在4℃ 14,000rpm離心30分鐘并去除上清液并保存。
所有下述步驟均在兩種上清液中進行，所述兩種上清液在這些步驟中自始至終保持分離。
通過紗布過濾上清液以去除游離的漂浮脂肪等。提取物在磁力攪拌器上4℃對1-2升的TBS緩沖液(5mls/升)中的0.2％ v/v氯仿透析過夜。這是一個滅菌步驟。將緩沖液換成干凈的TBS并透析至少8小時。這個步驟重復3次。更換透析緩沖液時，將管末端旋轉數次以確保混勻。最后一次TBS透析后，將緩沖液換成DMEM并透析過夜。較稠的溶液例如豬肌肉基質需要更長時間。隨后將這兩種提取物混合在一起產生不同結構的基質以便改進膠凝作用。隨后將樣品等分至無菌試管中。在流通櫥內在冰上執行這個操作。樣品隨后保存于-20℃。
實施例3SDS-PAGE通過二喹啉甲酸(BCA蛋白質測定試劑盒)測量蛋白質濃度。基質樣品在SDS-PAGE凝膠上分離之前在Laemmli溶液(Laemmli，Nature227680-685，1970)中制備成0.5-1.0mg/mL并煮沸5分鐘。在4-12％w/v梯度的聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen)上，將15μL體積的樣品加入泳道中并通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。凝膠在200V的恒壓下電泳50分鐘，這之后取下凝膠并用考馬斯亮藍(BrilliantBlue)染色或轉移用于免疫印跡分析。
實施例4免疫印跡分析如實施例3所述在SDS-PAGE凝膠上分離蛋白質并將未經染色的凝膠轉移至硝酸纖維素膜片。依照濕法轉移程序通過施加100V恒壓1小時，起始電流為220mA，進行轉移。首先在含5％w/v脫脂干乳粉、0.1％v/v Tween 20的Tris緩沖鹽水(TBS)(TTBS)中將印跡孵育過夜以減少非特異性反應。第一抗體在室溫下孵育1小時，用TTBS漂洗3次并隨后用結合過氧化物酶的第二抗體(1∶5000-1∶10000)孵育1小時。在免疫活性蛋白通過增強化學發光型免疫印跡檢測系統(Amersham Pharmacia)顯現之前，印跡再次在TTBS中漂洗3次。使用六種第一抗體HSPG 1∶5000(Seikagaku Corporation)、層粘連蛋白1∶5000(Dako)、巢蛋白1∶10000(Chemicon)、以及膠原蛋白IV 1∶10000(Dako)、纖連蛋白1∶10000以及SPARC 1∶10000。
實施例5肌肉基質分析對肌肉基質與來自BD Biosciences的制劑(Matrigel)進行組分比較分析且結果顯示于表2、3和4中。
生長因子的鑒定利用QuantikineELISA試劑盒(R&D System)并根據試劑盒說明書測量生長因子/細胞因子水平。待測的生長因子包括血管內皮生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉化生長因子β(TGF-β)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)以及神經生長因子(Chemicon試劑盒)(NGF)。簡言之，將提取物進行稀釋(1∶5-1∶10)并與標準和對照一起在抗體涂層板中孵育2-3小時。對板進行洗滌并加入結合辣根過氧化物酶(HRP)的多克隆第二抗體。孵育后，去除多余結合物并且用顏色底物對板進行第3次孵育。加入終止溶液后，利用微板閱讀器(Axion，Mutliskan，USA)來讀板，所述微板閱讀器的吸光度設定在λ450nm處、校正讀數設定在λ550nm處。利用Genesis 2.0板閱讀軟件(詳細的)執行所有的測量和計算，并將數值轉化成pg/mg基質。表2包含如廠商所報告的以及按照ELSA測量的Matrigel(注冊商標)中的生長因子水平。
表2
BD Full＝商購Matrigel(注冊商標)BD GFR＝生長因子減少的Matrigel(注冊商標)KK Full＝我們自己的Matrigel(注冊商標)制劑KK GFR＝我們自己的生長因子減少的制劑NR＝未記錄表3和表4包含按照ELISA測量的由大鼠、豬和人制成的肌肉基質中的生長因子水平。表3代表數值范圍。表4代表數據的平均值和平均標準誤(SEM)。
表3
表4
#＝一個非常高的讀數-其他所有讀數均低于339pg/mg。
##對這些樣品進行檢驗并察看跨種結合是否存在NB使用這些ELISA在這些樣品中沒有觀察到結合NM未測量總蛋白濃度的測量利用二喹啉甲酸測定(Amersham Biosciences Corporation NewJersey，USA)來測量基質的總蛋白水平。樣品以1∶10稀釋進行測量并依照試劑盒說明書對照一系列BSA標準進行測定。孵育后利用分光光度計t在562nm波長處分析樣品。大鼠和豬肌肉基質每種分析10個樣品，而人肌肉基質則分析6個。表5顯示按照BCA總蛋白測定測量的肌肉基質和Matrigel(注冊商標)中的總蛋白水平表5
附圖1至4中也描述了肌肉基質。附圖1提供了Matrigel與其他組織基質的SDS-PAGE比較。附圖2是來自骨骼肌的肌肉基質的照片。附圖3是豬肌肉來源的肌肉基質的照片。附圖4的顯微照片顯示了大鼠中組織的成功產生。附圖5。
ECM組分的測量1，9-二甲基亞甲基藍、Direct Red 80(Sirius Red)、硫酸軟骨素A、木瓜蛋白酶、二硫蘇糖醇和膠原蛋白I全部購自Sigma-Aldrich。硫酸化糖胺聚糖(GAGs)通過與染料1，9-二甲基亞甲基藍(DMMB)的沉淀作用在MyoGel樣品中被定量。通過加入等體積的包含0.6mg/ml木瓜蛋白酶、2mM EDTA和4mM DTT的40mM磷酸鈉緩沖液(pH6.8)來消化干擾蛋白，隨后在60℃孵育60分鐘。(Farndale等人Biochimica ET Biophysica Acta 882173-177，1986)。等分量(100uL)的每種樣品隨后與1mL的DMMB溶液(在0.2M鹽GuHCl、1g/L甲酸鈉和1ml/L甲酸中的16mg/L DMMB)孵育30分鐘，并在旋轉輪上連續混合。GAG-DMMB復合物沉淀后，通過離心(10,000×g 10分鐘)將不可溶解的材料與上清液分開并去除上清液。通過添加1mL的解絡緩沖液(50mM 乙酸鈉緩沖液，pH6.8，含10％正丙醇和4M GuHCl)從沉淀中釋放出染料(Barbosa等人Glycobiology 13647-653，2003)。隨后在微板閱讀器(Multiskan RC；Labsystems)中測定緩沖液的吸光度(λ650nm)。采用硫酸軟骨素A作為標準。
將層粘連蛋白從1mL肝素親和層析柱(Amersham Biosciences；Uppsala，Sweden)中洗脫后對其進行評估(Talts等人EMBO J18863-870，1999)(Talts等人J Biol Chem 27535192-35199，2000)。簡言之，通過與等體積的含4M GuHCl+2mM DTT的50mMTris-HCl(pH7.4)在4℃孵育24小時來溶解MyoGel樣品。對50mMTris-HCl(pH7.4)+0.15M NaCl透析過夜后，將1mL的等分量應用于親和層析柱。用5mL的50mM Tris-HCl(pH7.4)+0.15M NaCl從柱中沖洗出非層粘連蛋白，并用5mL的含0.5M NaCl的50mMTris-HCl(pH7.4)洗脫出層粘連蛋白。隨后用Bio-Rad蛋白質測定法利用如上所述的微板微測定程序來評估層粘連蛋白通過其與多偶氮染料Sirius Red的沉淀作用來測定膠原蛋白(Marotta and Martino Analytical Biochemistry 15086-90，1985)。等分量的MyoGel(100μL)與1mL的含50μM Sirius Red的0.5M乙酸在室溫下孵育30分鐘。離心(10,000×g 10分鐘)后，在微板閱讀器中測定上清液的吸光度(λ550nm)。使用來自大鼠尾部的膠原蛋白I作為標準。
通過ELISA(Echelon，UT，USA)按照試劑盒說明書來測量透明質素的水平。
表6和7顯示由大鼠、豬和人制成的肌肉基質的細胞外基質組分。表6代表數值范圍，而表7代表數據的平均值和平均標準誤(SEM)。
表6
表7
SDS-PAGE/免疫印跡分析基質樣品在SDS-PAGE凝膠上分離之前在Laemmli溶液(Laemmli，1970，)中制備成0.5-1.0mg/mL并煮沸5分鐘。在3-8％或4-12％梯度的聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)上，將10μL體積的樣品加入泳道中并通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。凝膠在200V的恒壓下電泳45分鐘，這之后取下凝膠并用考馬斯亮藍染色或轉移用于免疫印跡分析。
對于免疫印跡，如上所述在SDS-PAGE凝膠上分離蛋白質并將未經染色的凝膠轉移至硝酸纖維素膜片。通過濕法轉移程序施加30V恒壓1小時進行轉移。轉移后，在含5％脫脂干乳粉(Homebrand，SafewaysAUS]、0.1％ Tween 20的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(TPBS)中將印跡孵育過夜以減少非特異性結合。印跡在室溫下在第一抗體中孵育1小時，用TPBS漂洗3次并隨后與適合于所用一抗的使用適當的紅外標記的第二抗體(Molecular Probes，UT，USA或Rocklands，CA，USA)(1∶10000)孵育1小時。在免疫活性蛋白通過Odyssey紅外檢測系統(Licor Biosciences，USA)顯現之前，印跡再次在TPBS中漂洗3次。使用的第一抗體包括抗HSPG 1∶5000(Seikagaku Corporation，Japan)、層粘連蛋白α4和α2 1∶1000(Dr Lydia Soroken友情贈與)、巢蛋白1∶3000(Chemicon，USA)、纖連蛋白1∶5000、膠原蛋白I 1∶10000、膠原蛋白IV 1∶10000以及SPARC 1∶10000(Dr HKleinman友情提供，NIH USA)。
附圖6是不同MyoGel種類中各種ECM組分的蛋白質印跡的代表性實例。所有的箭頭和數字代表分子量水平。6A涉及大鼠肌肉提取物中膠原蛋白I的免疫印跡，標記3條鏈(100、200、300kD)。泳道1-10是十種不同的大鼠肌肉提取物制劑。6B顯示大鼠肌肉提取物中的層粘連蛋白α4(180kD)和α2(80kD片段以及在300kD處的少許彌散)。泳道1為Matrigel對照而泳道2-11為相同的大鼠肌肉提取物制劑，顯示特別是關于α4鏈的強帶。6C顯示在大鼠MyoGel HSPG凝膠中結合的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，泳道1為分子量標準，泳道2為Matrigel，在200kD條帶上有基底膜蛋白聚糖染色而泳道3-11為大鼠肌肉提取物。6D顯示大鼠肌肉提取物樣品中結合的纖連蛋白片段，泳道1為Matrigel對照而泳道2-11為相同的大鼠肌肉提取物。
體外細胞分化測定利用大鼠附睪的前脂肪細胞開展測定。在24孔板中執行用于形態學分析的測定。在24孔板中加入300μl細胞外基質(ECM)/孔。基質處于37℃ 20-30。隨后，向每個孔中加入細胞(對于24孔培養板為0.3×106細胞/孔)。37℃/5％CO2下過夜允許細胞附著在基質上。經過14天的時間段(伴隨每4-5天照相)觀察到分化。使用單獨接種在組織培養塑料制品上的細胞作為對照。
附圖5顯示了在組織培養塑料制品上的對照前脂肪細胞，顯示無分化。5B顯示在MyoGel上的前脂肪細胞，顯示脂質積聚以及向成熟脂肪細胞的分化。插入的圖顯示單個細胞積聚脂質的高倍放大圖像。5C顯示小鼠腔室的低倍顯微照片，所述腔室已充滿誘導脂肪形成的肌肉提取物。
本領域技術人員將理解本文所述的本發明容許除具體描述的那些之外的改變和修改。還應當理解本發明包括所有此類改變和修改。本發明還包括本說明書中個別或共同提及或暗示的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及任何及所有任何兩種或多種所述步驟或特征的組合。
BIBLIOGRAPHYBarbosa et al.Glycobiology 13647-653，2003Farndale et al.Biochimica ET Biophysica Acta 882173-177，1986Inoue et al.，J Cell Biol，971524-1539，1983Kleinman et al.，Biochem 216188-6193，1982Laemmli，Nature 227680-685，1970Marotta and Martino Analytical Biochemistry 15086-90，1985Mueller-Klieser，J Cancer Res Clin Oncol 13101-122，1986Talts et al.EMBO J 18863-870，1999Talts et al.J Biol Chem 27535192-35199，2000Terranova et al.，Cell 22719-726，1980Yuhas，et al.，Cancer Res 373639-3643 197權利要求
1.一種用于促進細胞效應的物質組合物，所述組合物包括基于細胞的或無細胞的肌肉組織制劑提取物，所述制劑提供了下列組分的來源，所述組分例如但不限于，層粘連蛋白、膠原蛋白I、膠原蛋白IV、觸覺蛋白/巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖以及其他組分，包括細胞因子和生長因子，例如但不限于，EGF、bFGF、NGF、PDGF、IGF-1、TGF-β、VEGF和TNF-α或其同源物中的一種或多種。
2.權利要求1的組合物，其中所述制劑是層粘連蛋白、觸覺蛋白/巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、膠原蛋白IV、bFGF、PDGF、TGF-β、VEGF和TNF-α的來源。
3.權利要求1的組合物，其中所述細胞來自肌肉組織。
4.權利要求3的組合物，其中所述肌肉組織來自人、非人靈長類、家畜動物、實驗室試驗動物、伴侶動物、鳥類、爬行動物或兩棲動物。
5.權利要求3的組合物，其中所述肌肉組織來自人、豬或大鼠。
6.權利要求1的組合物，其中所述制劑是基于細胞的制劑。
7.權利要求1的組合物，其中所述制劑包括完整的細胞外基質。
8.權利要求1的組合物，其中所述制劑包括提取的細胞外基質。
9.權利要求1的組合物，其中所述制劑包含約1μg/ml-約100mg/ml的總蛋白含量。
10.權利要求1-9中任何一項的組合物，其中所述制劑聚合成凝膠。
11.權利要求1的組合物，其進一步包括一種或多種外源性細胞因子、抗生素、生長強化因子、基因表達增強子、增殖抑制劑和/或干細胞分化促進因子。
12.權利要求1的組合物，其中所述組合物促進細胞效應，所述細胞選自干細胞、上皮細胞、皮膚細胞、器官細胞和內皮細胞。
13.權利要求1的組合物，其中存在的bFGF為約0.3ng/ml-約4ng/ml；PDGF為約1pg/ml-約3000pg/ml；TFG-β為約1pg/ml-約2000pg/ml；EGF為約0ng/ml-約100ng/ml；VEGF為約1pg/ml-約3000pg/ml；以及TNF-α為約0pg/ml-約1000pg/ml。
14.權利要求1-13中任何一項的組合物在對某些材料的脂肪形成潛力進行生物測定中的用途。
15.權利要求14的用途，用于體外測定調節脂肪形成的組分、提取物或細胞系統，所述測定包括篩查肌肉制劑以鑒別具有脂肪細胞分化傾向的細胞群，產生或獲得潛在調節脂肪形成的組分或提取物或細胞系統，將所述具有脂肪細胞分化傾向的細胞群接種在所述組分或提取物上，將所述細胞孵育足夠時間使脂肪形成發生并隨后在所述細胞中檢查脂肪細胞的分化。
16.權利要求15的用途，用于產生適合移植到受體內的供體血管化組織的方法，所述方法包括制造包含功能循環系統的血管蒂，所述血管蒂有組織或組織提取物或其組分注入、附著或以其他方式與所述血管蒂相聯；將所述血管蒂結合在支持基質內部和/或上面；在所述支持基質中接種被分離的細胞或組織碎片，所述細胞或組織碎片利用體外測定鑒別為促進脂肪形成；或某些其他有用的端點，將包含所述血管蒂的所述支持基質植入到受體某個部位，在所述部位所述功能循環系統與局部的動脈或靜脈吻合；并將所述支持基質留在所述植入部位足夠的時期以允許血管化新組織生長，其中根據特定的標準選擇所述注入材料或接種材料，例如，通過測定法測定時它促進脂肪形成，所述測定法包括檢查組織或組織提取物以鑒別具有脂肪細胞分化傾向的細胞群，產生或獲得潛在促進脂肪形成的組分或提取物，將具有脂肪細胞分化傾向的細胞群接種在所述組分或提取物上，將所述細胞孵育足夠時間使脂肪形成發生并隨后在所述細胞中檢查脂肪細胞的分化。
17.權利要求16的方法，其中所述血管蒂包括附著的脂肪或其他脂肪組織或包含下列細胞的組織，所述細胞為成肌細胞、成纖維細胞、前脂肪細胞和脂肪細胞、心肌細胞、角質化細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、軟骨細胞、周細胞、骨髓來源的基質前體細胞、胚胎干細胞、間充質干細胞或造血干細胞、許旺細胞及外周和中樞神經系統的其他細胞、嗅細胞、肝細胞及其他肝臟細胞、腎小球系膜及其他腎細胞、胰島β細胞及導管細胞、甲狀腺細胞、其他內分泌器官的細胞以及上述細胞的球狀體。
18.權利要求17的方法，其中所述血管蒂構成對于促進脂肪形成的組分或提取物的體外測定，所述測定包括在容器表面產生或獲得來自肌肉基質的潛在脂肪形成提取物層，在所述層上接種具有脂肪細胞分化傾向的細胞群，將所述細胞孵育足夠時間使脂肪形成發生并隨后在所述細胞中檢查脂肪細胞的分化。
全文摘要
本發明一般涉及對促進或利于細胞和組織的生長、發育和分化有用的組織制劑，包括組織細胞及其提取物。更具體而言，本發明提供了包括完整的或提取的細胞外基質和/或細胞以及細胞因子、生長因子和其他組分的肌肉來源的材料。本發明的肌肉制劑類似基底膜并且來源于基于細胞的材料。該肌肉制劑可以在體外或體內使用，尤其是在各種組織工程應用中作為細胞支架并在其他細胞培養系統用于營養和富集一系列細胞類型，包括但不限于，前體細胞和干細胞例如前脂肪形成細胞。該肌肉制劑還在例如化妝品和局部治療工業中用作乳膏的基礎并且在食品工業中用作基質或添加劑。
文檔編號A61K35/34GK1969039SQ200580019143
公開日2007年5月23日 申請日期2005年6月10日 優先權日2004年6月11日
發明者S·K·博托羅托, A·梅西納, K·M·阿伯頓 申請人:伯納德·奧布賴恩顯微外科研究院