專利名稱：將活性成份摻入紅細胞的裂解/再封方法和裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及允許實施所謂裂解/再封(resealing)技術的方法，其允許將活性成分并入紅細胞中。本發明也涉及可實施該方法的裝置。
本發明進一步涉及含有天冬酰胺酶等、或肌醇六磷酸的紅細胞組合物，并且所述組合物可以通過實施根據本發明的方法而獲得。
背景技術：
裂解/再封技術在專利EP-A-101 341和EP-A-679 101中進行過描述。后者描述了一種相對復雜的裝置，這種裝置首先包含用于裂解部分的冷卻結構，其中安置有一次性使用的組件，包括透析筒(cartridge)、管、曲折型(chicanetype)或彎曲(serpentine)囊袋以及可移除金屬元件，比如彎曲型冷卻裝置；其次是用于再封的結構，此結構提供有再加熱裝置，里面裝有一次性使用塑料組件。
事先從血漿中分離出紅血球并置于弱離子力(在低滲介質中)，使之脹到臨界體積，此時其膜脹到了容許離子和大分子透過的點。在顯微鏡下檢查紅細胞膜，顯示孔的外觀，其大小在20至500nm，因此血紅蛋白可外逸(P.Seeman J.Cell.Biol.1967，32(1)55-70)。恢復懸浮介質的等滲性將使孔關閉，使得大分子不能透過膜。僅維持了對離子的通透性。
通過使紅血球在透析裝置(優選有中空纖維)的“血液”室中循環，并使低滲溶液在該裝置的“透析”室逆流循環從而進行低滲休克。這項技術的優點在于在低滲休克期間紅血球被限制，使得這些細胞中生命必需組份的喪失顯著減少。這樣紅血球的體內半衰期就不會明顯改變。
與其它技術諸如封裝于脂質體或微球中相比，用紅血球作為藥物載體的優點主要在于這些血球具有“天然”的生物兼容性，通過眾所周知的方法可被完全生物降解，有相對較長的體內預期壽命(大約120天)，許多化學物質和治療性分子都可以封裝其中。
對紅細胞裂解和再封的內化過程是一種復雜的多因素現象。與結果變異性有關的一些重要物理/化學參數是透析前血紅蛋白濃度，紅細胞懸液在透析裝置中的流速，低滲透析緩沖液的摩爾滲透壓濃度(osmolarity)，透析溫度，再封溫度以及透析裝置的跨膜壓力。紅細胞的滲透脆性在不同的血液樣品間有變化，這可能是一種首要生物因素。因此，L.Boucher等在Biotechnol.Appl.Biochem.1996，24，73-78中研究了不同群體紅血球的滲透脆性變化對肌醇六磷酸的分布及終濃度的影響。在結論中作者指出紅血球的起始滲透脆性對裂解程度以及活性成分內化差異起決定性作用，并且滲透脆性取決于許多因素，如紅血球的滲透性、表面積/體積與離子含量之間的關系、供體的生理狀態和年齡(也見A.AHussain et al.，Br.J.Haematol.1984，57(4)716-718)、血液貯存時間的長短、藥物的存在、疾病(也見K.Kolanjiappan et al.，Clin.Chim.Acta 2002，326(1-2)143-149)和治療。所得結果、以及紅細胞懸液流速的變化證明了操作條件的極度敏感性，根據紅血球是屬于低水平脆組還是高水平脆性組，流速在12-14ml/分鐘。
因此，這些文章提供了影響紅血球滲透脆性的多種因素以及通過裂解/再封技術摻入的有效性的初步信息。它們讓我們認識到在實踐中碰到的困難，解釋了這項技術不能常規用于人的保健。
一篇最近發表的文章很好地總結了目前的狀況。作者是C.G.Millan等，發表于Journal of Controlled Release 2004，9527-49，總體評述了紅細胞作為藥物載體的應用，文中作者認為盡管紅細胞給人類醫學帶來了極大驚喜，然而由于保存困難、污染風險以及缺乏已驗證的產業性制備方法，目前它們的發展依然十分有限。
天冬酰胺酶是一種由細菌微生物(大腸桿菌或歐文氏菌(Erwinia))產生的酶，它可以水解并消耗天冬酰胺，這是合成細胞生命尤其是成纖維細胞所必需蛋白質的不可缺少的氨基酸。不象正常細胞那樣，一些癌性淋巴母細胞不能自己合成天冬酰胺，需要依賴于細胞外來源。因此天冬酰胺酶處理從這些細胞中去除該組分，導致其死亡。這種抗有絲分裂劑對于腫瘤細胞有選擇性。
然而對于人類，天然的天冬酰胺酶誘導產生抗體，其平均存在于70％以上的患者，這導致天冬酰胺酶的清除增加以及過敏反應，有時過敏反應甚至十分嚴重(B.Wang et al.，Leukaemia 2003 17，81583-1588)。這樣，盡管天冬酰胺酶對于治療急性淋巴母細胞白血病十分有效，其毒性卻十分大，可導致超敏反應，包括從簡單的風疹型到全身性過敏性休克。此外，還觀察到神經型(意識紊亂)、凝血型(低纖維蛋白原血癥，抗凝血酶III和其它凝血因子的血清水平降低，導致出血和/或血栓性并發癥)、胃腸型和胰腺型(包括胰腺的急性炎癥)。
將天冬酰胺酶封裝至紅細胞中使得治療指數得以提高(D.Schrijvers et al.，Clin.Pharmacokinet.2003，42(9)779-791)。因此，提供將天冬酰胺酶以可重復性和工業化方式封裝至紅細胞中的方法將是大有裨益的。
此外，肌醇六磷酸被認為是紅細胞中2，3-DPG(2，3-二磷酸甘油酸)的替代物，用于顯著降低氧與血紅蛋白的親合力，增加組織中的氧釋放(EP-A-0 101341)。專利US 4,321,259、US 5,612,207以及US 6,610,702描述了將該替代物摻入紅細胞以及它的多種治療應用。它們包括作為癌癥放射療法輔助治療的適應癥，用以提高缺氧腫瘤的供氧以及它們對放射治療的敏感性。然而該適應癥并未伴隨任何可行性要素。
為進行包封，US 4,321,259將紅細胞與含肌醇六磷酸的脂質體融合。US5,612,207利用電穿孔技術。US 6 610 702提供了電穿孔改進技術，通過肌醇六磷酸與陽離子銨結合以形成生物相容性水溶性復合物，其能促進向紅細胞的導入。最后在Biotechnol.Appl.Biochem.1996，24，73-78中，如前所述，L.Boucher等研究了用裂解/再封技術將肌醇六磷酸導入紅細胞。因此，本領域技術人員有多種途徑將該化合物導入紅細胞。然而，正如C.G.Millan等(見上)參考肌醇六磷酸用于一般性氧傳輸時所提及的，利用紅細胞摻入諸如肌醇六磷酸的分子目前遇到缺乏已驗證的產業化方法的問題。
因此，在本申請中，建立一種以可重復性和產業化方式將肌醇六磷酸摻入紅細胞的方法是十分有益的。
綜上所述，申請人關注的問題是提供一種以可重復方式生產摻入期望量活性成分的紅細胞的工業化裂解/再封方法，并獲得符合輸血標準(無菌、無病原體和熱源)的產品。
發明內容
本發明的一個重要目的是提供一種可用于符合輸血要求標準的血球(globular)濃縮物的方法。
另一個目的是提供一種能使天冬酰胺酶或肌醇六磷酸以有效、可重復、可靠和穩定方式包封入紅細胞中的方法。
這些及其它目的可通過制備包含至少一種活性成分的紅細胞的裂解/再封方法來實現，該方法包含下列步驟1.將血球濃縮物(globular concentrate)懸于紅細胞壓積(haematocrit)水平等于或大于65％的等滲溶液中，并維持在+1至+8℃，2.基于來自該相同血球濃縮物的紅細胞樣品測量滲透脆性，步驟1和2能夠以任意順序進行(包括平行)，3.在相同腔室中，恒定保持在+1至+8℃的溫度下進行的活性成分的裂解和內化步驟，包括允許紅細胞壓積水平等于或高于65％的紅細胞懸液與溫度冷至+1至+8℃的低滲裂解溶液在透析筒(cartridge)中循環；根據先前測量的滲透脆性調節裂解參數；和4.在適于再封的溫度、優選+30至+40℃下在第二個腔室中在高滲溶液存在下進行的再封步驟。
在優選實施方案中，步驟2所使用的懸液樣品由步驟1制備。正如后面所所解釋的，懸液可能是從經過常規處理比如用鹽水溶液洗滌的血球濃縮物制備的。此外，待內化的活性成分可以存在于懸液中。因此，用該懸液樣品并在活性成分處于初始懸液中的條件下實施步驟2是有利的，用含活性成分的懸液樣品進行步驟2。
術語“內化”指的是將活性成分導入紅細胞。
根據本發明的特征，血球濃縮物被懸浮在具有高紅細胞壓積水平的等滲溶液中，所述紅細胞壓積水平等于或大于65％，優選等于或大于70％，并將懸液低溫保存在+1至+8℃，優選+2至+6℃，典型地在+4℃。根據具體方法，紅細胞壓積水平在65％至80％，優選70％至80％。
根據本發明的重要特征，滲透脆性是相對于裂解步驟前短時間的紅細胞測量的。紅細胞或者含紅細胞的懸液有利地處于與裂解所選溫度接近或相等的溫度。根據本發明的另一個有利的特征，迅速進行滲透脆性測量，也就是說裂解步驟在取樣后短時間內進行。在取樣和開始裂解之間的時間間隔優選少于或等于30分鐘，更優選少于或等于25分鐘，或者甚至20分鐘。
允許控制透析的兩個參數是細胞在透析器中存在的時間(根據其特征)以及透析液的摩爾滲透壓濃度。這兩個參數必須根據被處理以便用于裂解/再封步驟的紅血球的滲透強度或者反過來根據滲透脆性來調節。該滲透強度可用下列參數的至少一種來表征a.出現溶血也即開始形成孔洞的介質摩爾滲透壓濃度。
b.溶血速度V，其通過溶血％＝f(介質的摩爾滲透壓濃度)曲線線性部分的梯度建立。
c.給定摩爾滲透壓濃度的溶血百分比。
d.達到50％溶血(H50)的摩爾滲透壓濃度。
e.獲得給定溶血百分比(例如50％)需要的時間。
根據優選實施方案，滲透強度用參數b、d或b和d來表征。
因此，滲透脆性必須在短時間內測量，這與取樣和開始裂解之間的短時間間隔相容。根據本發明的特征，通過半透膜對具有已知等滲性的低滲溶液，例如水(蒸餾水等)測量一或多個溶血參數。可以考慮手工方法。然而，根據本發明的一個優選實施方案，滲透脆性通過自動測量裝置進行測量，該裝置被設置為在少于15分鐘的時間內、更具體地在12分鐘內、優選在10分鐘內測量紅細胞樣品的滲透脆性，所得結果在短期內使用以調節裂解參數并開始裂解。
滲透脆性的測量可用一種裝置來完成，其已將J.V.Dacie在PracticalHaematology第二版(Churchill，London 1956)中描述的手工技術至少部分實現了自動化。J.Didelon等在Clinical Hemorheology and Microcirculation 23(2003)31-42中描述了這種裝置的一個例子。其原理是基于使用一種裝置，其將在半透膜一側和另一側的待測紅細胞懸液樣品、以及合適體積的已知等滲性的低滲溶液例如蒸餾水集合到一起，使得隨著NaCl離子擴散到溶液例如蒸餾水時產生紅細胞的緩慢溶血。溶血隨時間的進展通過用波長808nm的激光束測量透光率進行跟蹤(見J.Didelon et al.，Biorheology 37，2000409-416)。光電池測量透過懸液的光的變化。例如，在10分鐘期間測量。該裝置允許獲得一或多個上述參數a-e。
根據第一種方法，在溫度變化對測量沒有不利影響的條件下，對起始溫度為+1至+8℃的樣品進行滲透脆性測量，優選也使用該溫度的蒸餾水。根據第二種方法，對溫度保持在+1至+8℃的樣品進行滲透脆性測量。這樣，以上由J.Didelon等描述的測量裝置可以調整以允許控制溫度。優選地，該溫度與裂解溫度相似或一致。
一旦已經確定一或多個這些參數，可應用考慮這些參數的關系，以建立細胞在透析器中的流速、或者透析液的摩爾滲透壓濃度，這足以獲得包封有活性成分和/或其期望量的紅血球紅細胞流速＝[A×(H50)]+[B×(V)]+K-A和B＝可根據透析器和裂解溶液的摩爾滲透壓濃度調節的變量-K＝調節常數透析液的摩爾滲透壓濃度＝[C×(H50)]+[D×(V)]+K-C和D＝可根據透析器和透析器中紅細胞流速調節的變量-K＝調節常數根據一個優選實施方案，測量導致約50％溶血的NaCl濃度(g/L)(參數d)，并根據測量的濃度值調節透析筒中紅細胞懸液的流速。
根據本發明的一個方面，當紅細胞懸液溫度在+1至+8℃時開始裂解步驟，已經測量滲透脆性并記錄裂解參數。
根據一個有利的特征，將待處理的起始懸液放于前面提到的裂解/內化室中。根據本發明的一個實施方案，本方法使用帶溫控的低溫模塊，保持低溫在+1至+8℃的紅細胞懸液袋被置于該模塊上并連接或準備連接至無菌一次性使用可移除組件上，其包含透析筒、用于將透析筒一端連接至小袋和另一端連接至裂解溶液的管，模塊還包含使紅細胞懸液和裂解溶液循環的裝置，模塊內部的溫度穩定在+1至+8℃。低溫模塊的尺寸可適應小袋和可移除一次性組件。實際上，將由很多管連接起來的小袋、透析筒、和裂解溶液提供在單個此類型的低溫模塊上，這是根據本發明方法的一個有利特征。
術語“小袋”指的是通常用于輸血和血制品領域的彈性小袋。
根據本發明的一個重要方面，采取措施確保紅細胞在袋中處于均勻懸液中以使通過透析器時懸液的紅細胞壓積水平保持穩定。根據本發明的一個特征，為此給小袋提供外環式循環，這可使懸液進出小袋來回循環。
術語透析筒(cartridge)指的是包含兩個由透析壁分隔的隔室的器件，通過該透析壁可進行離子交換，通過將含鹽的水溶液導入一個隔室，允許以受控方式來調節位于另一隔室的水溶液的滲透壓。這種類型的筒被廣泛用于醫藥領域。根據一種優選方法，采用具有中空纖維的透析筒，例如具有下列具體特征的這種類型的筒纖維內徑在100至400μm，纖維的總外表面積為0.3至2m2，纖維長度為10至40cm，超濾系數為1.5至8ml/h.mmHg。
根據上述所給細節，當袋中懸液溫度為+1至+8℃時可開始裂解。依照一個便利方法，懸液溫度通過安置于外環型循環器的傳感器來控制。
根據檢測的滲透脆性，可調節兩個主要參數，即紅細胞懸液在透析筒中的流速和裂解溶液的摩爾滲透壓濃度，在兩種情況下都優選固定裂解溶液于恒定流速。流速的值并不重要。典型地對有中空纖維的透析筒，如前所述，裂解溶液的流速固定在50至300ml/分鐘，優選150至250ml/分鐘。
裂解溶液是一種鹽溶液，其相對于紅血球懸液來說是低滲的。當其被固定在恒定值時，其摩爾滲透壓濃度典型的是20至120mOsm，優選70至110mOsm，例如90mOsm量級。
作為實例，裂解溶液可包含Na2HPO4和/或NaH2PO4和糖，比如葡萄糖。
根據第一種方法，調節通過透析筒的紅細胞懸液的流速，同時固定裂解緩沖液的流速和摩爾滲透壓濃度。滲透脆性越高，懸液的流速增加越多。典型地，對于以上指出規格的筒，流速在5至200ml/分鐘范圍內變化，優選10至40ml/分鐘。
根據第二種方法，調節裂解溶液的摩爾滲透壓濃度，同時固定懸液和裂解溶液的流速。滲透脆性越高，裂解溶液的摩爾滲透壓濃度增加越多。典型地，摩爾滲透壓濃度在10至200mOsm/l范圍內變動，優選20至150mOsm/l。
根據第三種方法，通過透析筒的紅細胞懸液的流速和裂解溶液的摩爾滲透壓濃度均被調節。
根據本發明，可引入一或多種活性成分摻入紅細胞中。活性成分可以存在于懸液袋中，和/或導入(優選逐漸導入)透析筒上游或下游的懸液循環中。由于導入的體積小，活性成分的冷卻并非必須。
紅血球懸液優選產自與受體血型相配的血球濃縮物，其中已除去白細胞，未檢測到病原，特別是以袋裝方式提供，例如含500ml。當紅血球意圖用于可能經歷移植物/宿主型免疫反應的高度免疫缺陷患者時，紅血球可能已經放射處理(R.J.Davey Immunol.Invest.1995，24(1-2)143-149)。
根據本發明的具體特征，用于制備懸液的起始血球濃縮物事先已經過處理以去除紅細胞以外的其它血液組分。這種類型的處理是本領域技術人員已知的，例如用鹽水溶液清洗以去除血漿或保存溶液。
根據具體方法，洗滌是在一或多種待摻入活性成分存在下進行的。
洗滌可以用任何常規技術來實施，例如洗滌紅血球的四袋技術(MacroPharma法和轉移袋)。使用COBE 2991 Cell Processor型自動紅血球洗滌裝置也是可以的。
根據本發明的另一個特征，紅細胞可以預先用可增加和/或均化其滲透強度的溶液進行處理。這種溶液對本領域技術人員是已知的。例如，含L-肉毒堿的溶液可使待獲得的紅血球的滲透強度增加。其它實例包括肝素、檸檬酸-磷酸-葡萄糖(CPD)和甘露醇溶液。
在裂解步驟中溫度優選維持在+2至+6℃，更優選大約在+4℃。
優選通過再加熱裂解的懸液并添加高滲再封溶液來進行再封操作。再封溫度可以在+30至+40℃之間，優選是+35至+38℃，例如大約+37℃。孵育時間典型地持續15至45分鐘。
優選地，將從透析筒中排出的懸液和高滲再封溶液導入(優選連續導入)中間袋。懸液在此再加熱并在期望溫度孵育足以保證再封的一段時間。根據特定方面，中間袋放在一個加熱了的腔室或模塊中，其內部溫度控制在選定溫度。
作為另一種變化形式，懸液以及再封溶液被導至中間袋。當所有懸液都收集至該袋中時，密封并轉移到允許加熱至期望溫度并在此溫度孵育的模塊上。
然后再封的紅血球懸液可用鹽水進行一或多步洗滌，以去除未密封或封得不好的細胞、剩余物和細胞外血紅蛋白。
根據另一個特征，紅細胞在用于保藏紅細胞的溶液中處理紅細胞，比如含L-肉毒堿的溶液。
生產出的紅細胞優選保存在+1至+8℃，更優選+2至+6℃，典型地約+4℃。
待用產品最終的紅細胞壓積水平實際為40-70％。
本發明也涉及可用于實施根據本發明制備紅細胞的方法的裂解/再封裝置，該裝置包含-可冷卻至+1至+8℃的模塊，其包含冷卻和控溫裝置，-無菌一次性使用的可移除組件，其配置成能放于模塊中并且包含透析筒，該透析筒能在一側連接至裂解溶液入口、在另一側連接至紅細胞懸液入口，-根據待加工紅細胞的滲透脆性，調節通過裂解筒的紅細胞懸液流速和/或調節裂解溶液摩爾滲透壓濃度的裝置。
根據一個實施方案，本身構成本發明一個方面的可移除組件是一次性使用的試劑盒，包含可含有紅細胞懸液的小袋以及連接該小袋至透析筒的管，該模塊包含有泵，該泵能與所述管協作使紅細胞懸液從袋中循環至并通過筒，該泵任選地連接了調節流速的裝置。該組件可保持無菌。
根據有利的特征，所述小袋還帶有環形管與袋子兩端相連，并且模塊包含有泵，其可與該管協作使袋中內容物循環起來。這種帶有環形管和至少一個入口或出口點的柔性袋自身也構成本發明的一個方面。該袋可包含至少一個其它柔性管，其與每個入口/出口相連。袋子可與泵相連(例如蠕動泵)，泵配置成與環形管和/或用于袋以及任選地泵的支持物協作。由于合乎需要的是保持組合物、例如用于胃腸道外供應的組合物的給定程度均一性，因此這種小袋可用于向人或動物施用組合物(例如懸液、乳液)。
根據另一個有利特征，溫度探測器安置在環形管上。
根據另一個特征，用于注射活性成分的管連接至將小袋連接至透析筒的血液入口的管。
根據另一個特征，透析筒由管子連接至可含有裂解溶液的瓶(flask)，并且冷卻模塊包含用于該瓶的接收裝置和可與該管協作使裂解溶液在透析筒中循環的泵。
根據本發明的一個優選特征，冷卻裝置和控溫裝置能將模塊內溫度維持在+2至+6℃，優選為約+4℃。
根據另一個特征，透析筒的“血液”出口與流出管相連，該管開口或可開口于模塊外。根據另一個特征，用于注射活性成分的管連接至該流出管。流出管可連于第二個小袋(中間袋)，該袋可收集從裂解溶液以及再封溶液(優選由第二根管導入，該管開口入流出管中，位置在其開口于中間袋中位點的稍上游)中流出的紅細胞懸液。該袋有利地安置在第二個模塊中，該模塊配有能將模塊溫度控制在+30至+40℃、優選控制在+35至+38℃的裝置。
根據一個有利的實施方案，一次性使用的可移除組件在一個單元中包含小袋、循環管、注入管(配有注入裝置或旨在與該裝置協作的接受器)、透析筒以及優選地裂解溶液瓶。
優選地，可移除組件本身不包含專用于冷卻或加熱的裝置。這些功能僅由放置該組件此兩部分的模塊或腔室來實現。
用于本發明方法和裝置的泵優選是蠕動泵(閉塞泵)；根據一個實施方案，使懸液在起始小袋再循環的泵和使裂解緩沖液循環的泵具有恒定、預設的轉速，而傳送懸液至透析筒的泵具有可根據待處理紅細胞的滲透脆性調節的轉速。
活性成分可通過任何合適方式導入，例如，固定速率的活塞注射器，其任選地是受控制的、并連于相應的注入管。作為一種變化形式，活塞注射器可用蠕動泵代替。
所述裝置包含根據待處理紅細胞的滲透脆性來調節通過裂解筒的紅細胞懸液流速和/或調節裂解溶液摩爾滲透壓濃度的器件。
根據一個特征，流速調節器件被配置成控制傳輸懸液至透析筒的泵。根據另一種替代特征，調節器件被配置成控制裂解溶液的摩爾滲透壓濃度，以稀釋和降低摩爾滲透壓濃度或者通過導入合適的溶質以增加摩爾滲透壓濃度。作為一種變化形式，任選地可以將具有相對于待處理紅細胞的滲透脆性進行調節的摩爾滲透壓濃度的裂解溶液引入模塊。
根據一種優選的方法，所述裝置包含可根據操作者輸入的指令(例如，操作者直接輸入關于紅細胞懸液流速的數據)、或者根據操作者的數據輸入針對滲透脆性(電子器件配置成建立和調節裂解參數，例如紅細胞懸液的流速)來控制裂解過程和任選地再封過程的電子器件。這些電子器件優選連接于溫度傳感器(以控制模塊內和/或用于紅細胞懸液的溫度傳感器處的溫度)。這些器件可以控制并操作泵，例如，通過透析筒的懸液的壓力和流速。
優選地，這些模塊至少有一面是玻璃表面，其允許對裝置、以及溶液和懸液的循環進行可視控制。
根據本發明的方法和裝置可用于摻入多種活性成分，特別是選自用于人或動物治療的藥物、疫苗、酶、肽、抗原和造影劑(見例如C.G.Millan，J.ControlledReleased 2004，9527-49)。
本發明也涉及根據本發明方法來有效、可重復、可靠和穩定地摻入天冬酰胺酶的應用。根據本發明，術語天冬酰胺酶是指任何來源的任何天冬酰胺酶，不管是天然的、合成的、人工的還是重組的，以及摻入它的衍生物，例如，天冬酰胺酶與聚合物如聚乙二醇(PEG)的組合(例如，PEG化天冬酰胺酶或peg天冬酰胺酶，這是包封在PEG中的一類天冬酰胺酶；例如Oncaspar，其由Enzon和Medac銷售)。
根據多種可能的方法，將天冬酰胺酶引入初始袋和/或透析筒上游和/或下游懸液的循環。優選引入透析筒上游懸液的循環。最好用含有天冬酰胺酶的懸液測定滲透脆性。然后對懸液進行再封、洗滌、任選地向其加入保護溶液，再保存備用，優選保存于柔性袋中。
計量懸液中天冬酰胺酶的方法是已知的，這樣可以根據治療要求的劑量調節最終袋中的懸液體積。
根據一個優選實施方案，起始濃縮液去除了白細胞，和/或經過輻照。
根據一個具體方面，也可導入意圖用于組合治療的活性成分，例如，長春新堿和/或氨甲喋呤，和/或任選地除天冬酰胺酶以外還有其它有利的活性成分。
本發明也涉及可通過實施本發明方法獲得的含天冬酰胺酶的紅細胞懸液或濃縮物。該懸液可制備于制藥可接受的鹽水溶液中(通常是紅細胞的標準介質，含NaCl和選自葡萄糖、右旋糖、腺嘌呤和甘露醇中的一或多種成分的溶液；例如SAG-甘露醇或ADsol)。這種溶液能夠確保對紅細胞的保護作用并且可包括保護添加劑如L-肉毒堿。紅細胞也可包含長春新堿和/或氨甲喋呤、和/或任選地任何與天冬酰胺酶聯合有益的其它活性成分。懸液或濃縮物也可處理以在使用前稀釋。懸液也可處理以備使用。備用產品的最終紅細胞壓積水平優選在40％至70％。
本發明也涉及通過施用有效量的含天冬酰胺酶并可根據本發明方法獲得的紅細胞懸液以治療急性淋巴母細胞白血病和淋巴瘤的方法。本發明的一個特別方面包括從患者或一或多個供體獲取一或多個血液樣品，制備紅細胞濃縮物，根據本發明摻入天冬酰胺酶、和生產一批摻入天冬酰胺酶的紅細胞，然后將懸液通過靜脈內途徑施用給患者。典型地，施用處理后紅細胞懸液的體積對應每千克體重60至200單位的天冬酰胺酶。
本發明也涉及含天冬酰胺酶并可根據本發明方法獲得的紅細胞用于制備治療患者中急性淋巴母細胞白血病或淋巴瘤的藥劑或藥物的用途。本發明的一個具體方面包括從患者或一或多個供體獲取的一或更多單位的血液制備紅細胞濃縮物，根據本發明摻入天冬酰胺酶、并生產一批摻入天冬酰胺酶的紅細胞，用于將這些紅細胞治療患者的用途。根據一種專門方法，這種用途意圖生產含一定劑量、例如一定體積的處理后紅細胞懸液的小袋，所述一定體積的處理后紅細胞懸液包含相當于每千克體重60至200單位的天冬酰胺酶。
本發明也涉及應用本發明方法來有效、可重復、可靠和穩定地摻入肌醇磷酸，特別是肌醇六磷酸和肌醇五磷酸、或其衍生物。優選肌醇六磷酸。
根據許多可能的方法，將肌醇磷酸引入至初始袋和/或至透析筒上游和/或下游懸液的循環。優選引入至初始袋中。最好用包含肌醇磷酸的懸液測量滲透脆性。然后對懸液進行裂解、再封、洗滌、任選地添加保護溶液，再保存備用，優選保存于柔性袋中。
計量懸液中肌醇磷酸的方法是已知的，這樣可以根據治療要求的劑量調節最終袋中的懸液體積。
根據一個優選實施方案，起始濃縮液去除了白細胞，和/或經過輻照。
本發明也涉及可通過實施本發明方法獲得的含肌醇磷酸、特別是肌醇六磷酸或五磷酸的紅細胞懸液或濃縮物。懸液可制備于制藥可接受的鹽水溶液中(通常是紅細胞的標準介質，含NaCl和選自葡萄糖、右旋糖、腺嘌呤和甘露醇中的一或多種成分的溶液；例如SAG-甘露醇或ADsol)。這種溶液能夠確保對紅細胞的保護作用并且可包括保護添加劑如L-肉毒堿。也可處理懸液或濃縮物以在使用前稀釋。懸液也可處理以備使用。備用產品的最終紅細胞壓積水平優選在40％至70％。
本發明也涉及腫瘤供氧、特別是聯合放射治療的方法，包括向患者施用有效量的摻入肌醇磷酸、特別是肌醇六磷酸的紅細胞懸液，這種懸液可通過本發明方法獲得。本發明的一個特別方面包括從患者或一或多個供體獲取一或多個血液樣品，制備紅細胞濃縮物，根據本發明摻入肌醇磷酸、尤其是肌醇六磷酸、和生產一批摻入該化合物的紅細胞，然后將懸液通過靜脈內途徑施用給患者。優選地，這種方法與放射治療聯合使用，因此可以通過靜脈內途徑與全部或部分放射治療連續地施用處理后紅細胞一段足夠長時間，此外優選在該治療之前和/或之后。
根據本發明的方法可用于治療多種癌癥，特別是肺癌、前列腺癌、直腸癌、食管癌以及腦腫瘤。該方法尤其可用于對輻射不敏感的腫瘤，這類腫瘤通常有組織缺氧，尤其是惡性膠質瘤。根據本發明的具體方面，該方法可用于治療膠質母細胞瘤和ENT(耳鼻喉)癌。
本發明進一步涉及含肌醇磷酸、特別是肌醇六磷酸并可根據本發明方法獲得的這些紅細胞用于制備藥劑或藥物的用途，所述藥劑或藥物旨在用于治療患者中上述類型的癌癥，特別是與放射治療聯合使用。本發明的一個具體方面包括從患者或一或多個供體獲取一或多個血液樣品，制備紅細胞濃縮物，根據本發明摻入活性化合物、和批量生產摻入該化合物的紅細胞，用于將這些紅細胞治療患者的用途。
本發明也涉及治療鐮刀型細胞貧血或其它缺氧狀態的方法，包括向患者施用摻入肌醇磷酸、尤其是肌醇六磷酸并可以用本發明方法獲得的紅細胞懸液。本發明的一個具體方面包括從患者或一或多個供體獲取一或多個血液樣品，制備紅細胞濃縮物，根據本發明摻入肌醇磷酸、尤其是肌醇六磷酸、和生產一批摻入該化合物的紅細胞，然后將懸液通過靜脈內途徑施用給患者。
本發明進一步涉及含肌醇磷酸、特別是肌醇六磷酸并可根據本發明方法獲得的這些紅細胞制備用于治療組織缺氧患者的藥劑或藥物的用途，組織缺氧的特征是向組織、尤其是肌肉和骨骼的氧傳送很低。這種治療對鐮刀型細胞貧血的患者特別有益。本發明的一個具體方面包括從患者或一或多個供體獲取的一或多個單位的血液用于制備紅細胞濃縮物，根據本發明摻入活性化合物、和批量生產摻入該化合物的紅細胞，用于將這些紅細胞治療患者的用途。
摻入到紅細胞中的肌醇六磷酸或類似物導致血紅蛋白的氧親合力降低。這導致了更好的組織供氧，并降低了由鐮刀型紅細胞貧血引起的缺氧癥狀。P50是對應血紅蛋白達到50％氧飽和的氧壓力(PO2)。P50增加25mmHg將導致供氧提高約兩倍(供氧是100mmHg和40mmHg的PO2值之間飽和的差異)。因此，對于有2000mL紅細胞的成年人，輸注含200ml含肌醇六磷酸的紅細胞的血袋可導致增加超過10％的供氧能力為正常情況兩倍的紅細胞。這可使供氧作用增加20％以上，對于組織缺氧個體這是十分有益的。
這種方法包括輸注代表個體5％至20％、優選10％至15％紅細胞量的體積，輸血頻率最好是每個月或每兩個月一次。
本發明現在要通過參考實施方案和附圖用非限制性實施例來更詳細描述，其中
-圖1是根據本發明的裂解/再封裝置的示意圖；-圖2是所述過程的基本流程圖；-圖3顯示紅細胞的溶血過程，表示為根據以分鐘表示的孵育時間致使約50％溶血的NaCl濃度(g/L)；-圖4是類似于圖3的圖表，在此在天冬酰胺酶(200IU/ml)存在下測量溶血；-圖5是與圖3和圖4類似的圖表，在天冬酰胺酶(400IU/ml)存在下進行測量；-圖6顯示根據致使50％溶血的NaCl濃度(g/L)的包封率。
具體實施例方式
實施例1裝置首先參考圖1。第一個虛線框指示第一模塊1，其通常為平行六面體形狀，包括玻璃前面(其未示出)，該玻璃前面可打開和關上。蠕動泵P1、P2和P3以及可移除組件的接受器件(未標注)被安置在模塊底部，現在將描述該組件。泵P1和P3有恒定、預設的流速。控制泵2以使流速變化。
可移除組件包含柔性小袋2，其包含待裂解的紅細胞懸液。袋2附帶柔性管3，呈環形，其與泵1協作使小袋循環以保持紅細胞處于懸浮狀態。袋底部進一步連接柔性管4，其連接至透析筒5的“血液”隔室的入口。管4與泵2協作將懸液從袋子循環至筒中。受控活塞型注射器PS1在筒5上游連于管4，該活塞型注射器用于將活性成分引入至紅細胞循環中。筒5的“血液”隔室出口連至柔性出口管6，其開口于模塊1之外。第二個受控活塞型注射器PS2連于管6，該活塞型注射器用于將活性成分引入裂解紅細胞的循環中。盛有裂解溶液的瓶7被安置在模塊1中，并用柔性管8連接至筒5的“透析液”入口，柔性管8與泵P3協作，使裂解溶液通過筒5循環。最后從筒中流出的裂解溶液從模塊1中通過柔性排出管9排出，管9開口于位于模塊1外的瓶10中。
出口管6延伸入第二模塊11，其通常為平行六面體形并包括未示出的玻璃前面，該玻璃前面可打開和關上。接收器件裝置(未示出)作為可移除組件的一部分被安置在該模塊底部。這些包含與管6相連的柔性袋12，袋中保存已裂解懸液。受控的活塞型注射器PS3與管6相連，用以注入再封產物。
可移除組件完全用柔性透明塑料材料生產，使得該過程完全可視。
進一步以多種未示出的方式提供該裝置-用于模塊1內部冷卻并將其溫度控制在+2至+4℃的器件，其包含溫度探頭，被置于管3上以測量在該處循環的懸液的溫度，測量模塊1內部溫度T1的溫度探頭，-模塊11還帶有能加熱其內部并將此處溫度T2控制在+37至+38℃的器件；溫度探頭置于該模塊內部，-檢測(例如，超聲或比色方法)D1和D2處管中紅細胞的存在情況的裝置，-測量透析筒入口處壓力的裝置PR1，-電子設備，其首先接收來自溫度探頭、壓力探頭和檢測器件的信息，然后是關于調節裂解參數的信息；基于這些數據，該設備控制泵P1、P2和P3。圖2顯示了工藝流程圖。
該電子設備由設計為執行上述流程的計算機組成。
根據另一個特征，其記錄每個裂解步驟以及每種處理后濃縮物的參數。
實施例2封裝天冬酰胺酶在該實施例中，滲透脆性定義為導致約50％溶血的以g/L表示的NaCl濃度。
1)天冬酰胺酶對滲透脆性的影響a.制備天冬酰胺酶溶液通過隔膜用注射器將2.5ml 0.9％NaCl注入含10000IU粉狀天冬酰胺酶的瓶中。攪動該混合物直至溶解，這樣就獲得了濃度為4000IU/ml的母液。用注射器將內容物取出并將其置于5ml溶血管中。準備三種溶液并保存在+4℃0IU/ml溶液(構成0.9％NaCl對照)，3200IU/ml溶液(加625μl 0.9％NaCl至母液中)以及1600IU/ml溶液(取1ml 3200IU/ml溶液，加入1ml 0.9％NaCl溶液)。
b.洗滌紅血球-從在檸檬酸磷酸右旋糖上取出、并于+4℃下1000g離心20分鐘的全血開始，-輕輕移出血漿，并去除暗黃層(buffycoat)，-在+4℃將等體積0.9％NaCl加至紅血球濃縮物中，-于1000g離心20分鐘，棄除上清，
-重復上述兩步進行第二次和第三次洗滌，-棄除上清，用0.9％NaCl溶液將紅細胞壓積調整到80％，-用875μl體積的紅血球懸液準備管。
這用來自六個不同供體的六個血液樣品進行。
c.添加天冬酰胺酶溶液-測量所述6個樣品的初始滲透脆性，-對每個天冬酰胺酶濃度，以6管的比率添加125μl的0、1600或3200IU/ml天冬酰胺酶溶液；每管輕搖片刻。三個六管組中包含的終濃度為0，200和400IU/ml。將這些管在碎冰上保存在+4℃直至測量滲透脆性。
-檢測四個孵育時間5，15，30和60分鐘。孵育時間的終點確定為將管從碎冰上拿開的時間，-在環境溫度下測量滲透脆性。
d.在法國SODEREL MEDICAL，Haillecourt銷售的名為OSMOCELLS的裝置上測量滲透脆性。
e.結果圖3、4和5展示了無天冬酰胺酶或存在天冬酰胺酶的情況下透析前紅細胞滲透脆性的發展和分布。
這些結果證明根據存在的天冬酰胺酶濃度和根據時間，紅細胞的滲透脆性在血液樣品之間有較寬的變異。這些結果強調了盡可能接近透析階段、優選在待包封的天冬酰胺酶存在下測量待處理紅細胞樣品的滲透脆性的重要性。
2)包封和再封過程a.設備-透析筒.PRISMA M60 PPI型，由GAMBRO，Lakewood，CO，USA銷售.尺寸(cm)38×21×9.血液腔室體積84ml.中空纖維丙烯腈和甲代烯丙基磺酸鈉共聚物.有效表面積0.60m2-裝置的操作參數-P1＝20ml/分鐘
-P2＝可變-P3＝150ml/分鐘-PS3＝P2的10％-T2＝30分鐘b.產品-由“Centre de Transfusion Sanguine”(法國輸血中心)提供的壓緊紅細胞(packed red blood cells)，也就是說，SAG-甘露醇中的紅細胞懸液，-調節紅細胞壓積至70％-天冬酰胺酶溶液透析前通常是400IU每毫升的紅血球懸液。
c.結果圖6顯示在透析器中在400IU/ml天冬酰胺酶并且P2流速為22ml/分鐘時的包封率。似乎包封率根據透析前的滲透脆性而變化(5個樣品)。根據測量的滲透脆性，通過調節透析參數，特別是透析器中紅細胞懸液的流速來優化本發明方法，以確保盡管有血樣中固有的變異而盡可能保持包封率恒定。
將流速P2(透析筒中紅細胞懸液的流速)作為調節手段，可以建立所用透析筒的下列優化水平。
表1
滲透脆性大于4.7時流速P2的降低可用透析產生的現象解釋。在流速為26ml/分鐘及以上時跨膜壓力的增加導致滲透效應增加。因此，如前所指，降低流速P2是有利的。
記錄根據本發明方法處理的7個不同紅細胞樣品的血液學和摻入參數(根據表1、即依賴于每個樣品的滲透脆性調節P2)，將這些血液學參數與從健康個體獲得的值進行比較。表2給出測量的血液學參數的平均值。
表2
NA＝不適用摻入參數用J.L.Orsonneau在Annales de Biologie Clinique 2004，Vol.62，No.5中描述的方法，對經凍融裂解后的紅細胞確定天冬酰胺酶的劑量。
-天冬酰胺酶的平均血球(globular)水平，表示為天冬酰胺酶IU每109個紅細胞10±1.1。
-天冬酰胺酶的平均血球濃度，表示為IU/ml紅細胞112±11.3。
-包封率(終產品中天冬酰胺酶的血球濃度/透析前天冬酰胺酶的濃度)29.8％±2.1。
在用十四個不同樣品進行的初步實驗中，不考慮滲透脆性也不調節流速，但流速P2在18至30ml/分鐘，有可能測量平均包封率是32±12.4％，其代表非常大的變異性。相反，在以上實驗中調節流速P2可獲得更加均勻的平均包封率(29.8％±2.1)。
權利要求
1.制備包含活性成分的紅細胞的裂解/再封方法，該方法包括下列步驟(1)將血球濃縮物懸于紅細胞壓積水平等于或大于65％的等滲溶液中，并維持低溫在+1至+8℃，(2)基于來自相同血球濃縮物的紅細胞的樣品測量滲透脆性，步驟1和2可以任何順序進行，(3)在相同腔室內、在恒定維持在+1至+8℃的溫度下裂解和內化活性成分的步驟，其包括允許紅細胞壓積水平等于或高于65％的紅細胞懸液以及冷卻在+1至+8℃的低滲裂解溶液在透析筒內循環；根據先前測量的滲透脆性調節裂解參數；(4)在第二腔室中在+30至+40℃溫度下由高滲溶液進行的再封步驟。
2.根據權利要求1的方法，其中用配置成在小于15分鐘內測量紅細胞樣品滲透脆性的測量裝置測量滲透脆性，并且所得結果在短期內應用以調節裂解參數。
3.根據權利要求1或2的方法，其中對具有已知等滲性的低滲溶液通過半透膜測量紅細胞樣品的一或多個溶血參數。
4.根據權利要求3的方法，其中測量一或多個以下參數a.發生溶血的介質的摩爾滲透壓濃度，b.溶血速率，其是通過溶血％＝f(介質的摩爾滲透壓濃度)曲線線性部分的梯度而建立，c.給定摩爾滲透壓濃度下的溶血百分比，d.允許獲得50％溶血的摩爾滲透壓濃度，e.獲得給定溶血百分比所需的時間。
5.根據前述任一項權利要求的方法，其中使用帶有溫度控制的低溫模塊，低溫保持在+1至+8℃的紅細胞懸液的小袋被放于模塊中，并連接或待連接至無菌、一次性使用的可移除組件，其包含透析筒、將透析筒一側連接至小袋且另一側連接至瓶的管，所述模塊進一步包含能使紅細胞懸液和裂解溶液循環的裝置，模塊內部的溫度被穩定在+1至+8℃。
6.根據權利要求5的方法，其中當袋中懸液溫度為+1至+8℃時開始裂解步驟。
7.根據前述任一項權利要求的方法，其中在懸液在透析筒中穿過的全部時間中懸液中維持穩定的紅細胞壓積水平。
8.根據權利要求7的方法，其中使用帶有外部環形循環的小袋，其能使懸液出入小袋而循環。
9.根據前述任一項權利要求的方法，其中基于滲透脆性測量來調節通入透析筒的紅細胞懸液的流速或者來選擇裂解溶液的摩爾滲透壓濃度。
10.根據前述任一項權利要求的方法，其中活性成分存在于懸液袋中和/或在通過透析筒之前和/或之后引入至懸液循環中。
11.根據前述任一項權利要求的方法，其中血球濃縮物含有先前已經用能增加和/或均化其滲透強度的溶液處理過的紅細胞。
12.根據前述任一項權利要求的方法，其中步驟1和3中的溫度維持在+2至+6℃，優選約+4℃。
13.根據前述任一項權利要求的方法，其中活性成分選自天冬酰胺酶和肌醇六磷酸。
14.根據權利要求13的方法，來生產摻入天冬酰胺酶的紅細胞用于治療患者中急性淋巴母細胞白血病和淋巴瘤，或者來生產摻入肌醇六磷酸的紅細胞用于與放射治療聯合以治療組織缺氧性腫瘤或治療鐮刀型細胞貧血或其它缺氧狀態。
15.根據權利要求1至14中任一項的方法，其中對步驟(1)獲得的懸液樣品測量滲透脆性。
16.裂解裝置，可用于實施根據前述任一項權利要求的制備含活性成分的紅細胞的方法，該裝置包含帶有冷卻器件的模塊(1)，配置成能置于模塊(1)中并包含透析筒(5)的無菌、一次性使用的可移除組件(2至12)，所述透析筒(5)能在一側連接至裂解溶液入口而在另一側連接至紅細胞懸液入口，其特征在于，模塊(1)中帶有將溫度控制在+1至+8℃的器件和根據待處理紅細胞的滲透脆性來調節通過裂解筒的紅細胞懸液流速和/或調節裂解溶液摩爾滲透壓濃度的器件。
17.根據權利要求16的裝置，其中可移除組件包含能含有紅細胞懸液和管(4)的小袋(2)，所述管(4)將該小袋連接至透析筒(5)，并且模塊(1)包含能與所述管(4)協作并使紅細胞懸液從袋中循環至和通過筒(5)的泵(P2)，該泵(P2)任選地連接至調節流速的器件。
18.根據權利要求16或17的裝置，其中小袋帶有在其兩端連接至袋(2)的環形管(3)，并且模塊(1)包含能與管(3)協作并使袋中內容物在袋中進出而循環的泵(P1)。
19.根據前述任一項權利要求的裝置，其中注入活性成分的管連接至管(4)，管(4)將小袋(2)連接至透析筒(5)的“血液”入口，透析筒(5)通過管(8)連接至能含裂解溶液的瓶(7)，并且模塊(1)包含瓶(7)的接收器件和泵(P3)，該泵(3)能與管(8)協作使裂解溶液進和通過透析筒而循環；并且透析筒的“血液”出口連接至開口或可以開口于模塊外的管(6)。
20.根據權利要求19的裝置，其中管(6)連接至能收集從裂解以及再封溶液中排出的紅細胞懸液的第二小袋(12)，該袋安置在第二模塊(11)中，該模塊帶有能將模塊中溫度控制在+30至+40℃、優選+35至+38℃的器件。
21.根據前述任一項權利要求的裝置，其包含能根據操作者所輸入指令或者根據操作者的數據輸入針對滲透脆性來控制裂解過程和任選再封過程的電子器件。
22.柔性塑料材料的一次性使用組件，其適于實施根據前述任一項權利要求的方法和裝置，其包含帶環形管(3)的袋(2)，環形管(3)通過其兩端與袋相連，然后袋(2)連接至管(4)，管(4)連接至透析筒(5)的血液入口，其“血液”出口連接至與第二小袋(12)相連的管(6)，至少一個另外的管開口入管(4)或管(6)中，并且透析筒進一步連接至用于循環裂解溶液的兩管(8和9)；管(6)優選連接至第二小袋(12)并且第二管(12)與管(6)相連。
全文摘要
用于制備含有活性成分的紅細胞的裂解/再封方法，該方法含有下列步驟(1)將血球濃縮物懸于紅細胞壓積等于或高于65％的等滲溶液中，并維持在+1℃至+8℃，(2)基于來自相同血球濃縮物的紅細胞樣品測量滲透脆性，優選基于從步驟(1)所獲得懸液的樣品，(3)活性成分的裂解和內化步驟，在同一腔室內，溫度恒定維持在+1至+8℃，包括允許紅細胞壓積水平等于或高于65％的紅細胞懸液與在+1至+8℃冷藏的低滲裂解溶液在透析套管中循環，根據先前測量的滲透脆性調節裂解參數，和(4)在+30至+40℃溫度下在第二個腔室中通過高滲溶液進行的再封步驟。
文檔編號A61K9/50GK101031339SQ200580029814
公開日2007年9月5日 申請日期2005年8月4日 優先權日2004年8月5日
發明者揚·戈德弗蘭 申請人:愛瑞泰克藥物公司