專利名稱：一種用于裂解液分析的整體床的合成方法
技術領域：
本發明涉及一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，屬于生物分子分析技術及色譜分 析領域。
背景技術：
基因治療和DNA疫苗在癌癥、單基因遺傳病、艾滋病、心血管疾病、關節炎等重大疾病 的診斷和治療方面的應用研究正日益引起越來越廣泛的關注。目前質粒逐漸成為基因治療的 最重要的基因傳遞系統，因此應用于基因治療的藥用質粒的大規模制備成為其基礎。而藥用 質粒的大規模制備過程的關鍵之一在于如何監測質粒純度、監測質粒制備過程的性能，評價 最終產品質量以及產品的規格等，這對于過程開發、認證、產品批準非常重要。
典型的質粒大規模制備過程包括發酵、細胞收獲、細胞裂解、澄清與濃縮和純化等步驟。 其中裂解步驟可以去除全部細胞碎片，去除部分gDNA、 RNA、蛋白等雜質，所得到的裂解 液除了含有各種拓撲形態的質粒異構體、變性DNA (變性gDNA、變性質粒)之外，仍含有 人量雜質，如gDNA、高分子量RNA、低分子量RNA、蛋白、內毒素等。該過程對質粒收率 和質粒產品的質量影響很大，是目前研究者關注的焦點。在質粒制備過程流分析中因堿裂解 液中雜質含量高，其分析最為困難。
目前應用于裂解液分析的色譜法包括反相色譜、疏水相互作用色譜、體積排阻和離子交 換色譜等多種模式。離子交換色譜在裂解液分析中應用最為廣泛。應用于裂解液分析過程的 陰離子交換型色譜介質均為商業化產品，其中大多數是為蛋白質分離分析而開發，主要有多 孔微球、灌注色譜填料、非多孔色譜填料和薄殼色譜填料等，為提高傳質性能而開發的各種 新型色譜介質是其中的主體。裂解液分析是質粒制備過程流分析中重要且難于分析的部分。 因裂解是質粒制備過程的第一個步驟，而且該步驟對質粒的收率影響很大，該部分是目前質 粒制備研究的重點之一。裂解液中通常除目標質粒外，還含有高分子量RNA、低分子量RNA、 gDNA、蛋白和內毒素。將質粒和蛋白、RNA、 gDNA等雜質有效分離是色譜柱準確定量質粒 的前提。質粒與蛋白和低分子量RNA的分離比較容易，但是質粒與高分子量RNA的分離比較 困難，特別是未經純化的裂解液，因樣品中高分子量RNA含量很高，與質粒共洗脫形成寬峰， 一般的色譜柱均無法實現分離。為精確定量裂解液中質粒含量，通常采用RNase酶解將高分 子量RNA降解為寡核苷酸。目前尚未見采用色譜柱直接對含有大量RNA樣品的裂解液進行分 析的報道。
3發明人在"Zhang M L, Sun Y. Poly(glycidyl methacrylate ~divinylbenzene -triallylisocyanurate) continuous-bed protein chromatography. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHYA. 2001,912(1): 31-38"和"張敏蓮，白姝，孫彥.聚(GMA-DVB-TAIC) 型連續床的制備及其對蛋白質的色譜分離性能.離子交換與吸附，2003， 16(3) : 199 206"
中曾針對蛋白質分離分析開發了聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯一二乙烯基苯一三聚異氰尿酸三 烯丙酯)型整體床，該整體床具有良好的親水性能。但由于該整體床針對蛋白分離分析開發， 整體床中的孔徑為l 2nm，雖然在蛋白分離中可以具有良好的傳質性能，但因質粒的長度可 達幾百納米，窄的部分可達十幾納米，而裂解液中還含有大量的高分子量雜質，如高分子量 RNA和gDNA，因此該類型整體床在裂解液分析中傳質性能差，易出現色譜柱堵塞，而無法 應用于裂解液的分析。
發明內容
針對目前裂解液分析中需要對其進行預處理、傳質性能差和色譜柱易污染的問題，本發 明的目的是提供一種具有適宜修飾密度、不易被污染、具有大量質粒可以進入的孔道、傳質 速度快，背壓低，可直接用于裂解液分析的整體床的合成方法。實現該發明的關鍵點在于控 制整體床的孔結構和修飾密度，即選取適宜的聚合條件和修飾條件。
本發明的目的是通過如下技術方案實現的
一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，其特征在于該方法包括如下步驟
1) 將含有環氧端基的甲基丙烯酸酯類或含有環氧端基的丙烯酸酯類單體與交聯劑、致 孔劑和引發劑混合，得到反應混合物，其中
a. 所述交聯劑與單體的物質的量的比為0.05 0.2;
b. 所述致孔劑用量占反應混合物體積含量的40 80%;
c. 所述引發劑與單體的物質的量的比為0.005 0.03;
2) 將上述反應混合物超聲混和均勻，加入到色譜柱管中，原位聚合形成整體床，聚合 溫度控制在50 6(TC之間，反應時間為12 72小時；
3) 聚合反應結束后，利用有機溶劑沖洗整體床；
4) 利用溶于有機溶劑的胺類修飾劑對整體床進行改性，其中胺類修飾劑的體積含量為 25 75%，修飾溫度控制在50 6(TC之間，反應時間為3 9小時；
5) 修飾反應結束后，利用有機溶劑沖洗整體床。
上述技術方案中，所述交聯劑采用含有兩個雙鍵的化合物和三個雙鍵的化合物的混合 物，兩類交聯劑的物質的量的比為0.25 4;所述的致孔劑采用飽和烷烴和芳烴中的至少一種； 所述的引發劑采用偶氮類物質；所述的有機溶劑為醇類和環醚類中的任一種。
所述含有兩個雙鍵的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷和雙甲基丙烯酸乙二醇 酯中的任一種；所述含有三個雙鍵的化合物采用三聚異腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯和三甲基丙烯酸丙三醇酯中的任一種。所述偶氮類物質采用偶氮二異丁腈和偶氮二異庚腈中的任一 種。所述飽和烴采用正庚烷、正辛垸和正壬垸中的任一種；所述芳烴采用甲苯、乙苯和二甲 苯中的任一種。所述醇類采用乙醇或甲醇；所述環醚類采用四氫呋喃或二噁烷。所述胺類修 飾劑采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一種。
本發明與現有技術中裂解液分析方法相比，具有以下優點及突出性效果該種類型的整 體床具有適宜的修飾密度、不易被污染、具有大量質粒可以進入的孔道、傳質速度快、背壓 低、可以對于未經預處理的含有大量雜質的裂解液進行多個批次的分析而分析柱性能無明顯 改變，在裂解液分析中具有良好的耐污染能力，分析過程方便快捷，成本低。
具體實施例方式
本發明提供一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，其特征在于該方法包括如下歩驟:
1) 將含有環氧端基的甲基丙烯酸酯類或含有環氧端基的丙烯酸酯類單體與交聯劑、致 孔劑和引發劑混合，得到反應混合物，其中
a. 所述交聯劑與單體的物質的量的比為0.05 0.2;
b. 所述致孔劑用量占反應混合物體積含量的40 80%;
c. 所述引發劑與單體的物質的量的比為0.005 0.03;
2) 將上述反應混合物超聲混和均勻，加入到色譜柱管中，原位聚合形成整體床，聚合 溫度控制在50 6(TC之間，反應時間為12 72小時；
3) 聚合反應結束后，利用有機溶劑沖洗整體床；
4) 利用溶于有機溶劑的胺類修飾劑對整體床進行改性，其中胺類修飾劑的體積含量為 25 75%，修飾溫度控制在50 6(TC之間，反應時間為3 9小時；
5) 修飾反應結束后，利用有機溶劑沖洗整體床。 所述交聯劑采用含有兩個雙鍵的化合物和三個雙鍵的化合物的混合物，兩類交聯劑的物
質的量的比為0.25 4;所述的致孔劑采用飽和烷烴和芳烴中的至少一種；所述的引發劑采用 偶氮類物質；所述的有機溶劑為醇類和環醚類中的任一種。
所述含有兩個雙鍵的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷和雙甲基丙烯酸乙二醇 酯中的任一種；所述含有三個雙鍵的化合物采用三聚異腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯和三甲 基丙烯酸丙三醇酯中的任一種。所述偶氮類物質采用偶氮二異丁腈和偶氮二異庚腈中的任一 種。所述飽和烴采用正庚垸、正辛烷和正壬烷中的任一種；所述芳烴采用甲苯、乙苯和二甲 苯中的任一種。所述醇類采用乙醇或甲醇；所述環醚類采用四氫呋喃或二噁垸。所述胺類修 飾劑采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一種。
利用合成的整體床進行裂解液分析的過程如下采用水和緩沖液A (10mMTris-HCl， lmMEDTA，pH8.0)沖洗整體床。所采用的溶液為緩沖液A，緩沖液B(緩沖液A+2MNaCl)。 鹽梯度為0-5min 30-50%緩沖液B; 5-5.01min 50-30%緩沖液B; 5.01-15min 30%緩沖液B。將裂解液加入到整體床中，在0.2 0.6 mol/L鹽濃度下將RNA和蛋白等雜質從整體床中洗脫 下來，然后在0.7 1.0mol/L鹽濃度下將質粒組分洗脫下來，從而實現對裂解液的分析。下面通過幾個具體實施例對本發明作進一步的說明。實施例l:稱取單體甲基丙烯酸縮水&油酯、交聯劑二乙烯基苯和三聚異腈尿酸三烯丙酯(1:0.04:0.01 mol/mol/mol);致孔劑甲苯和正庚烷(致孔劑/反應混合物80 vol%，甲苯/正庚烷3: 2vol/vol);引發劑偶氮二異丁腈(引發劑/單體0.005:1 mol/mo1)，混合均勻，裝入一端密封 的50x4.6mm不銹鋼管中，將另一端密封，于50。C反應72小時。將整體床連接到泵上，乙醇 沖洗。然后利用二乙胺為修飾劑，溶劑采用乙醇，二乙胺的體積含量為25%，修飾反應控制 在5(TC，反應時間為9小時。反應結束后，采用乙醇沖洗整體床。本發明所合成的整體床中 75%以上的孔其孔徑在十微米以上，整體床的修飾密度約為1.1mmol/g整體床。 實施例2:稱取單體甲基丙烯酸環氧乙酯、交聯劑雙甲基丙烯酸乙二醇酯和三乙烯基苯(l: 0.03:0.06 mol/mol/mol);致孔劑乙苯和正辛烷(致孔齊U/反應混合物75 vol%，乙苯/正辛烷1: 1 vol/vol); 引發劑偶氮二異丁腈(引發劑/單體0.01:1 mol/mo1)，混合均勻，裝入一端密封的50x4.6mm 不銹鋼管中，將另一端密封，于55'C反應36小時。將整體床連接到泵上，四氫呋喃沖洗。 然后利用二甲胺為修飾劑，溶劑采用四氫呋喃，二甲胺的體積含量為75%，修飾反應控制在 6(TC，反應時間為3小時。反應結束后，采用四氫呋喃沖洗整體床。本發明所合成的整體床 中75%以上的孔其孔徑在十微米以上，整體床的修飾密度約為0.5mmol/g整體床。實施例3:稱取單體丙烯酸縮水甘油酯、交聯劑二乙烯基苯和三聚異腈尿酸三烯丙酯(1: 0.06:0.03 mol/mol/mo1);致孔劑二甲苯(致孔劑/反應混合物60 vol% );引發劑偶氮二異庚腈(弓I發劑/ 單體0.02:1 mol/mo1)，混合均勻，裝入一端密封的50x4.6mm不銹鋼管中，將另一端密封， 于6(TC反應12小時。將整體床連接到泵上，甲醇沖洗。然后利用乙胺為修飾劑，溶劑采用 甲醇，乙胺的體積含量為30%，修飾反應控制在55'C，反應時間為6小時。反應結束后，采 用甲醇沖洗整體床。本發明所合成的整體床中75%以上的孔其孔徑在十微米以上，整體床的 修飾密度約為0.9mmol/g整體床。實施例4:稱取單體丙烯酸環氧乙酯、交聯劑二乙烯基苯基甲垸和三甲基丙烯酸丙三醇酯(1:0.04:0.16 mol/mol/mol);致孔劑正壬垸(致孔劑/反應混合物40 vol%);引發劑偶氮二異庚腈 (引發劑/單體0.03:1 mol/mo1)，混合均勻，裝入一端密封的50x4.6mm不銹鋼管中，將另一 端密封，于6(TC反應12小時。將整體床連接到泵上，二噁烷沖洗。然后利用乙二胺為修飾 劑，溶劑采用二噁烷，乙二胺的體積含量為50%，修飾反應控制在55'C，反應時間為4小時。反應結束后，采用二噁烷沖洗整體床。本發明所合成的整體床中75%以上的孔其孔徑在十微 米以上，整體床的修飾密度約為0.7mmol/g整體床。
權利要求
1.一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，其特征在于該方法包括如下步驟1)將含有環氧端基的甲基丙烯酸酯類或含有環氧端基的丙烯酸酯類單體與交聯劑、致孔劑和引發劑混合，得到反應混合物，其中a.所述交聯劑與單體的物質的量的比為0.05～0.2；b.所述致孔劑用量占反應混合物體積含量的40～80％；c.所述引發劑與單體的物質的量的比為0.005～0.03；2)將上述反應混合物超聲混和均勻，加入到色譜柱管中，原位聚合形成整體床，聚合溫度控制在50～60℃之間，反應時間為12～72小時；3)聚合反應結束后，利用有機溶劑沖洗整體床；4)利用溶于有機溶劑的胺類修飾劑對整體床進行改性，其中胺類修飾劑的體積含量為25～75％，修飾溫度控制在50～60℃之間，反應時間為3～9小時；5)修飾反應結束后，利用有機溶劑沖洗整體床。
2. 按照權利要求1所述的一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，其特征在于所 述交聯劑采用含有兩個雙鍵的化合物和三個雙鍵的化合物的混合物，兩類交聯劑的物質的量的比為0.25 4;所述的致孔劑采用飽和烷烴和芳烴中的至少一種；所述的引發劑采用偶氮類物質；所述的有機溶劑為醇類和環醚類中的任一種。
3. 按照權利要求2所述的一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，其特征在于所 述含有兩個雙鍵的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲垸和雙甲基丙烯酸乙二醇酯中的 任一種；所述含有三個雙鍵的化合物采用三聚異腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯和三甲基丙烯 酸丙三醇酯中的任一種。
4. 按照權利要求2所述的一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，其特征在于所 述偶氮類物質采用偶氮二異丁腈和偶氮二異庚腈中的任一種。
5. 按照權利要求2所述的一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，其特征在于所 述飽和烴采用正庚烷、正辛垸和正壬垸中的任一種；所述芳烴采用甲苯、乙苯和二甲苯中的 任一種。
6. 按照權利要求2所述的一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，其特征在于所述醇類采用乙醇或甲醇；所述環醚類采用四氫呋喃或二噁烷。
7. 按照權利要求2所述的一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，其特征在于所述胺類修飾劑采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一種。
全文摘要
一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，屬于生物分子分析和色譜分析技術領域。該方法將含有環氧端基的甲基丙烯酸酯類或含有環氧端基的丙烯酸酯類單體與交聯劑、致孔劑和引發劑混合，得到反應混合物；然后將上述反應混合物超聲混和均勻，加入到色譜柱管中，原位聚合形成整體床；聚合反應結束后，利用有機溶劑沖洗整體床；利用溶于有機溶劑的胺類修飾劑對整體床進行改性；修飾反應結束后，利用有機溶劑沖洗整體床。實現該發明的關鍵點在于控制整體床的孔結構和修飾密度。采用本方法所合成的整體床在裂解液分析中可以對于未經預處理的含有大量雜質的裂解液進行分析，分析過程方便快捷，成本低。
文檔編號G01N30/00GK101625346SQ20091009037
公開日2010年1月13日 申請日期2009年8月7日 優先權日2009年8月7日
發明者張敏蓮, 青 徐, 花秀夫 申請人:清華大學