專利名稱：積雪酸在制備預防或治療腎臟纖維化的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及積雪酸在制藥中的應用，尤其涉及積雪酸在制備預防或治療腎臟纖維化的藥物中的應用。
背景技術：
積雪草是一種植物藥，積雪苷是從積雪草中提取的物質，也稱為積雪甙(Asiaticoside)，結構見式II。
式II研究發現積雪苷在治療皮膚粘膜損傷后，其具有纖維疤痕過增生作用。該物質作為相關用途的化妝品和藥品均有上市，在這些產品中積雪苷是其主要活性成份。積雪酸是積雪苷脫糖后即形成的苷元，其結構見式I所示 式I
發明內容
本發明的目的是提供積雪酸在制備預防或治療腎臟纖維化的藥物中的應用。
其中，所述的腎臟可為腎間質和/或腎小球，優選腎間質。
探討積雪酸(JXS)對單側輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎間質纖維化的保護作用。方法將大鼠隨機分為UUO組和UUO+JXS組，另設假手術(SHAM)組。用藥組(即UUO+JXS組)于術前三天灌胃給予積雪酸20mg/kg，對照組(即SHAM組)和UUO組給予等體積生理鹽水，直至術后第21天處死動物，觀察左側腎臟病理學改變，比較腎間質基質含量和腎間質纖維化程度；以α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的免疫組化觀察腎小管上皮細胞轉型情況。
本發明的積極進步效果在于本發明通過用積雪酸對大鼠腎臟纖維化的影響，證實了積雪酸具有抗腎臟纖維化的作用。因而，積雪酸可作為活性成份用于制備抗腎臟纖維化的藥物。
具體實施例方式
實施例11.材料與方法1.1實驗動物 wistar大鼠(中國科學院上海實驗動物中心)，雄性，健康清潔級，8周齡，體重180～220g，飼養環境為每籠5只，室溫22±2℃，相對濕度55±2％。
1.2藥物與試劑 積雪酸由廣西昌州天然產物開發有限公司或上海醫藥工業研究院制造，小鼠抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體購自SIGMA公司，兔抗小鼠IgG即用型二抗購自上海抗體公司，DBA顯色試劑盒購自華美公司。
1.3方法1.3.1動物模型制作 手術時大鼠以10％水合氯醛0.03ml/kg IP麻醉后右臥位固定，剪毛消毒，左側腹部切口，分離左側輸尿管，5-0號絲線結扎兩道，上一道結扎點位于左腎下極水平，在兩道結扎點間剪斷輸尿管，逐層縫合制作UUO模型。假手術組僅開腹并游離左側輸尿管，但不結扎和剪斷。
1.3.2動物分組及給藥 大鼠隨機分為三組，分別為假手術(SHAM)組、UUO組和UUO+JXS組，在UUO術前三天開始給藥JXS 36mg/kg直至UUO術后第21天。
1.3.3檢查項目 術后第21天血標本分離出血清檢測生化常規，處死動物，抽取UUO大鼠左側殘余尿定量；留取左側腎臟，腎組織分2部分，一部分作光鏡病理檢查，另一部分經皮、髓質分離后置于-70℃凍存作α-SMA免疫組化。SHAM大鼠留取左側腎臟作同樣處理。
1.3.4組織病理檢查 腎組織經4％多聚甲醛緩沖液固定，石蠟包埋后3μm切片，進行PAS和MASSON染色。光鏡下觀察PAS染色切片皮質腎間質炎細胞浸潤程度和纖維化等病理學改變，雙盲給予PAS染色下腎間質病變計分，標準為0分(間質病變占間質總量＜5％)；1分(間質病變占間質總量5％-15％)；2分(間質病變占間質總量15％-30％)；3分(間質病變占間質總量30％-60％)；4分(間質病變占間質總量＞60％或有局灶性壞死)。每張切片在放大200倍情況下取10個不重疊的視野，分別對每個視野進行打分，取平均值作為該標本的間質病變計分。對MASSON染色腎組織切片進行半定量分析，具體步驟如下采用北航醫學圖像分析管理系統，在同一條件下對每張標本選取15個不重復視野(40×)，將呈現為綠色的纖維區域(去除腎小球和大血管)視為陽性目標，以陽性面積與統計場總面積的比值作為腎小管間質的纖維化指數。采用北航醫學圖像采集和分析系統軟件對MASSON染色進行分析。
1.3.5α-SMA免疫組化 切片常規脫蠟至無水，浸入37℃含1.5％H2O2的甲醇30min消除內源性過氧化酶，胰蛋白酶消化暴露抗原位點，一抗(小鼠抗大鼠α-SMA抗體，1∶200)4℃過夜，繼而以對應即用型二抗(兔抗小鼠IgG，1∶200)37℃放置30min，最后在顯微鏡下用DAB顯色。同時采用刪除第一抗體的方法作為陰性對照。在高倍鏡下(400×)對每張切片隨機選取15個不重疊的視野，采用北航醫學圖像分析管理系統進行半定量分析，結果以陽性目標總面積/統計場總面積表示。所有數據用x±s表示，利用SPSS10.0軟件進行統計學分析，采用單因素方差分析及SNK檢驗比較各組差異。
2.結果2.1實驗大鼠基礎指標觀察 UUO大鼠左側腎盂及輸尿管擴張，內為梗阻后的殘余尿。UUO組和UUO+JXS組殘余尿量無顯著性差異，各組動物血清生化指標均為正常，組間比較無顯著性差異，見表1。
表1 UUO模型大鼠基礎指標(n＝6)
Triglyceride甘油三酯；Cholesterol膽固醇；Glucose葡萄糖；BUN血清尿素氮；Creatinine肌酐；Resudual Urine殘余尿量。
2.2大鼠左腎組織的病理學改變2.2.1PAS染色 與SHAM組大鼠相比，UUO后21天腎組織間質增寬，有較多的炎性細胞浸潤，腎小管擴張，偶見腎小管管腔內有中性粒細胞聚集，并可見腎小管上皮細胞萎縮、壞死、脫落；UUO+JXS組上述改變明顯減輕，各組腎間質病變計分結果見表2。
表2 大鼠腎組織病理、免疫組化結果(n＝6)
與SHAM組相比，ap＜0.05；與UUO組相比，bp＜0.05Damage score損傷份數；Interstitial fibrosis index間質纖維化指數；α-SMA Positive areaα-SMA陽性面積。
2.2.2 MASSON染色 SHAM組切片可見腎小球基底膜有少量綠色著染，小管間幾無間隙。UUO后21天腎組織間質增寬且廣泛著綠色，顯示基質成分增多，纖維化程度明顯。UUO+JXS組腎間質纖維化指數明顯減輕，結果見表2。
2.3左腎α-SMA免疫組化檢測 SHAM組大鼠α-SMA僅表達于腎臟血管平滑肌和血管外膜層細胞，在腎小管和間質幾乎無表達。UUO組腎皮質α-SMA染色明顯增加，主要位于內髓部，在皮質腎小管上皮細胞及增寬的的腎間質區也出現α-SMA陽性表達，提示腎小管上皮細胞向肌纖維細胞轉型，間質成纖維細胞明顯增多。UUO+JXS組皮質區α-SMA的表達顯著減少，見表2。
結論與UUO組比較，UUO+JXS組左側腎臟的病理改變及腎間質纖維化程度明顯減輕(p＜0.05)，腎小管上皮細胞α-SMA的表達明顯減少(p＜0.05)，而SHAM組對左側腎臟病理學無明顯影響。積雪酸對UUO所致的大鼠腎間質纖維化具有保護作用，其機制可能部分是通過減少腎小管上皮細胞向肌纖維細胞的轉型，從而改善腎間質纖維化。
權利要求
1.積雪酸在制備預防或治療腎臟纖維化的藥物中的應用，其中該積雪酸的化學結構如式I所示 式I。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述的腎臟為腎間質。
全文摘要
本發明公開了積雪酸在制備預防或治療腎臟纖維化的藥物中的應用。本發明通過用積雪酸對大鼠腎臟纖維化的影響，證實了積雪酸具有抗腎臟纖維化的作用。因而，積雪酸可作為活性成份用于制備抗腎臟纖維化的藥物。
文檔編號A61P13/00GK101032494SQ200610024408
公開日2007年9月12日 申請日期2006年3月6日 優先權日2006年3月6日
發明者趙帥, 秦燕, 劉全海, 徐智儒, 陳靜 申請人:上海醫藥工業研究院