專利名稱：一種用于制備抗體化乙肝疫苗的融合蛋白及其載體的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，涉及一種結構融合分子，特別是一種用于制備抗體化乙肝疫苗的融合蛋白及含有此融合蛋白編碼基因的載體。
背景技術：
乙肝是危害人類健康的一大疾病，在我國尤其嚴重。由于傳統的血源性疫苗安全性差，產量較低，因此已被基因工程疫苗所取代。由于大部分乙肝患者為幼兒時期感染病毒，處于對HBSAg的免疫耐受狀態，現存的基因工程疫苗雖然可以在大部分人中誘導出抗體，但對于已經感染乙肝病毒的患者作用不大。因為對于病毒和胞內菌而言，中和性抗體可以阻斷它們進入胞內，但不能清除已經進入細胞內的病毒或者細菌。對于此類患者，需要能誘導出較強細胞免疫應答的治療性疫苗。
乙肝表面抗原是乙肝病毒的包膜蛋白，由3種蛋白組成主蛋白(S)、中蛋白(M)和大蛋白(L)，目前市場上的乙肝疫苗主要為S蛋白疫苗，而M和L蛋白N端的preS1和preS2區含有許多重要的T、B抗原決定簇，它們在增強S蛋白的反應、克服對S蛋白的無反應中起著重要作用。
因此，研究一種包含有preS1或preS2區的疫苗，并且達到提高細胞免疫應答、低毒、易于制備的效果是目前現有技術中急需解決的問題。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種用于制備抗體化乙肝疫苗的融合蛋白，它具有第一部分和第二部分，所述的第一部分為乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S，所述的第二部分為鼠IgG1 Fc段。
進一步的，所述的融合蛋白的第一部分具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，所述的第二部分具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
進一步的，所述的融合蛋白的第一部分具SEQ ID NO3有所示的基因序列，所述的融合蛋白的所述的第二部分具有SEQ ID NO4所示的基因序列。
進一步的，所述的融合蛋白的所述的第一部分和第二部分通過設計限制性酶切位點來進行連接。
本發明的目的還在于提供所述的融合蛋白在制備乙肝疫苗的藥物中的應用。
本發明的目的還在于提供一種載體，含有上述所述的融合蛋白的編碼基因。
進一步的，所述的載體含有SEQ ID NO9所示的基因序列。
進一步的，所述的載體含有SEQ ID NO10所示的氨基酸序列。
本發明的目的還在于提供所述的載體在制備乙肝疫苗的藥物中的應用。
本發明的目的還在于提供制備所述的融合蛋白的方法，包含以下步驟1)獲得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因；2)獲得鼠IgG1 Fc段編碼基因；3)將乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，及鼠IgG1 Fc段編碼基因克隆入質粒，獲得含有目的基因的載體，通過原核或者真核細胞表達獲得表達蛋白。
本發明的目的還在于提供制備所述的載體的方法，包含以下步驟1)獲得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因；2)獲得鼠IgG1 Fc段編碼基因；3)將乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，及鼠IgG1 Fc段編碼基因克隆入質粒，獲得含有目的基因的載體。
更具體的，制備上述所述的載體的方法，包含以下步驟1)設計擴增乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因的合適酶切位點的引物，2)獲得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，3)設計擴增鼠IgG1 Fc段編碼基因的合適酶切位點的引物，4)獲得鼠IgG1 Fc段編碼基因，5)將獲得的preS2-S克隆入含有相應酶切位點的PcDNA3質粒，獲得PCS2S載體，再將IgG1 Fc克隆入含有相應酶切位點的質粒PCS2S，獲得PCMFS載體。
本發明的目的還在于提供一種抗體化的乙肝疫苗，含有上述所述的融合蛋白，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。
本發明的目的還在于提供一種抗體化的乙肝疫苗，含有有效量的上述所述的載體，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。
本發明人通過長期而廣泛的研究發現，將乙肝表面抗原與IgG的Fc段融合，可通過抗原攝取方式和遞呈方式的改變，從而可從根本上打破乙肝免疫耐受，顯著提高治療性疫苗的效果。
乙肝表面抗原是乙肝病毒的包膜蛋白，由3種蛋白組成主蛋白(S)、中蛋白(M)和大蛋白(L)，目前的乙肝疫苗主要為S蛋白疫苗，而M和L蛋白N端的preS1和preS2區含有許多重要的T、B抗原決定簇，它們在增強S蛋白的反應、克服對S蛋白的無反應中起著重要作用。另外preS2通過人多聚白蛋白介導結合于肝細胞的表面，所以含pres2的疫苗可與HBV競爭從而阻斷HBV的感染途徑。故我們設計的乙肝疫苗包含了preS2和S基因。
IgG Fc能與Fc受體結合，preS2和S基因與鼠IgG1 Fc段的融合一方面能促進融合蛋白被DC細胞的攝取，另一方面融合蛋白在胞內與Fc受體結合，促進了PreS2-S蛋白以內源性抗原的方式進行遞呈，從而有利于活化CD8+T細胞，促進了特異性的細胞免疫應答。鑒于APC細胞表達的Fc受體以FcγR為主，而IgG1與FcγR親和力較強，因此我們選擇了來自IgG1亞型的Fc段。并且，Fc段與Fc受體結合的位點位于鉸鏈區和CH2段，且抗體的鉸鏈區富含脯氨酸而易于伸展彎曲，能夠使融合蛋白的兩個部分之間的位障減到最小程度，所以我們選擇的Fc段包括鉸鏈區Hinge和CH2+CH3。
因此，在本發明中，所述的融合蛋白將乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S作為融合蛋白的N端，可作為疫苗抗原部分；鼠IgG1 Fc段作為融合蛋白的C端，可使疫苗具有抗體化特征。
本發明將獲得的乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，及獲得的鼠IgG1 Fc段編碼基因克隆入質粒，獲得含有目的基因的載體成為基因疫苗，通過原核或者真核細胞表達獲得表達蛋白成為蛋白疫苗，所述的基因疫苗的5’端為抗原表位部分，由表面抗原前S蛋白preS2和主蛋白S組成的preS2-S基因；它的3’端為抗體的Fc段基因。所述的蛋白疫苗的N端為抗原表位部分，由表面抗原前S蛋白preS2和主蛋白S組成，它的C端為抗體的Fc段。
本發明的融合蛋白可以通過多種方式制備獲得，包括但不限于a)化學合成；b)將目的基因克隆入適當的載體，表達出目的融合蛋白。所述融合蛋白的第一部分和第二部分之間可以是帶有連接序列(linker)的或直接相連接的；優選的，第一部分和第二部分之間可直接相連，直接利用抗體分子的絞鏈區富含脯氨酸而易于伸展彎曲的特性，將兩部分連接起來，在保證了各自功能基團的獨立性的同時也有助于形成穩定的空間結構。
在本發明中，用于克隆入目的基因的載體包括任何哺乳動物細胞轉化用載體，或病毒載體，尤其是各種市售的載體或病毒載體。包括但不限于PcDNA、pEGFP、pSEc、pMG18、pGL3等。
在本發明中，可用于轉化所述融合基因的載體的細胞為原核或者真核生物細胞，比如、CHO細胞等。
將特定DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉化方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔，脂質體包裝等。獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達所需的蛋白。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。
在本發明中，所述的藥物組合物中有效成分的存在形式包括但不限于以下幾類a)乙肝表面抗原前S抗原和主蛋白S以及鼠IgG1 Fc段的融合蛋白；b)含有乙肝表面抗原前S抗原和主蛋白S以及鼠IgG1 Fc段基因的載體；c)含有b)所述的載體并且可表達所述融合蛋白的細胞。在給藥時，可直接給予a)、b)、c)任一所述的有效成分，以及藥學上可接受的載體。
在本發明中，“藥學上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)即有合理的效益/風險比的物質。
在本發明中，“藥學上可接受的載體”是用于將具有活性的成分傳送給動物或人的藥學上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。所述的載體可以是液體或固體。
本發明的藥物組合物，它含有上述的有效成分，以及藥學上可接受的載體。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。
本發明的藥物組合物含有安全有效量的本發明上述的有效成分以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。
本發明所構建的抗體化乙肝疫苗，經過肌肉基因免疫小鼠的方法，證實其可以誘導很強的體液免疫應答和細胞免疫應答，具有比傳統疫苗更好的效果。
圖1顯示了抗體化乙肝疫苗融合分子的質粒模式圖。
圖2顯示了構建融合分子的PCR結果。其中第1、5泳道為DNA marker；第2泳道為preS2S+Fc融合分子；第3泳道為preS2S；第四泳道為mouse IgG1Fc。
圖3顯示了PCMFS的酶切鑒定結果。其中第1泳道為PCMFS經Hind III和NotI雙酶切結果；第2泳道為PCMFS經Hind III單酶切結果。
圖4顯示了PCMFS的測序鑒定結果。其中A、B為以T7為測序引物的正向測序，A為測序部分序列，其中，第十八至第二十個堿基所示的序列為起始密碼子atg，B為相應的峰圖；C、D為以SP6為測序引物的反向測序，C為測序部分序列，第三十六至第三十八個堿基開始的序列為終止密碼子tga的反向互補序列tca，D為相應的峰圖。
圖5顯示了以PCMFS轉染C2C12細胞，收集不同時間的轉染和未轉染上清，抽濾至硝酸纖維素膜上，以小鼠抗人HBsAg單克隆抗體、生物素化的馬抗小鼠二抗和ABC、DAB檢測，其中，1.未轉染上清24-72小時；2.PcDNA3質粒轉染上清24-72小時3.PCMFS質粒轉染上清24-72小時。
圖6顯示了PCMFS質粒轉染C2C12細胞后72小時細胞內目的基因的轉錄水平的檢測。1.PCMFS質粒轉染組；2.PcDNA3質粒轉染組；3.陽性對照。
圖7顯示了C2C12細胞中HBsAg的轉錄水平及上清和細胞裂解物中HBsAg的表達情況。
圖8顯示了顯示了抗體化乙肝疫苗在體外的表達情況，a為pcDNA3肌注局部HBsAg蛋白的檢測；b為PCMFS肌注局部HBsAg的檢測。
圖9顯示了PCMFS免疫組同PCS2S組一樣，可以誘導小鼠產生體液免疫應答。
圖10顯示了不同質粒免疫小鼠脾臟細胞的增殖情況。結果顯示在用特異性抗原HBsAg刺激時PCMFS免疫組小鼠的增殖能力比PCS2S免疫組強。ConA為非特異性的淋巴細胞激活劑，可以刺激不同組的淋巴細胞增殖，1640組為陰性對照。
圖11顯示了不同質粒免疫小鼠脾臟細胞的特異性殺傷情況。可見用特異性抗原HBsAg刺激后，PCMFS免疫組小鼠脾臟細胞對表達表面抗原的SP2/0-preS2S細胞有更強的殺傷能力。
具體實施例方式
以下是本發明的具體實施例，所述的實施例是用于描述本發明的使用和用途，而不是限制本發明。
實施例中采用的質粒、菌種、細胞、動物及試劑如下質粒、菌種、細胞、動物、質粒pcDNA3、PEHH、宿主細菌DH5α、細胞SP2/0為本實驗室保存。將編碼preS2S的質粒PCS2S轉入SP2/0細胞得到表達表面抗原的細胞SP2/0-preS2S。基因合成委托上海博亞公司。4-6周齡雌性BALB/c(H-2Kd)小鼠購自復旦大學實驗動物中心。
分子生物學試劑限制性核酸內切酶HindIII、EcoRV、Not I(TaKaRa公司)、T4DNA連接酶(MBI公司)；Taq DNA聚合酶(Promega公司)；RNaseA(Ameresco公司)；dNTP(Promega和華美生物公司)；LB培養基(英國OXOID公司)，瓊脂粉、瓊脂糖、SDS、EB、重蒸酚(上海化學試劑采購供應站)，Tris(USB公司)，瓊脂糖膠回收試劑盒(上海華舜生物制品公司)，小鼠抗人HBsAg單克隆抗體(上海科華公司)，HBsAg蛋白純品(北京肝炎所)ABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，CFSE、7-AAD(Sigma公司)。
細胞培養、轉化試劑細胞培養試劑(Gibco BRL公司)。Lipofectamin2000真核細胞轉染試劑(Invitrogen公司)。
實施例1抗體化乙肝疫苗的設計、構建和鑒定1.PreS2-S和鼠IgG1 Fc編碼基因的擴增本發明所設計的抗體化乙肝疫苗由乙肝表面抗原和鼠IgG1 Fc段構成，中間不加linker，為了保證兩個部分各自功能基團的獨立性以及形成穩定的空間結構，我們將表面抗原設計在融合分子的N端，Fc段則在融合分子的C端，類似于完整的抗體分子。
乙肝表面抗原PreS2-S編碼基因以質粒PEHH為模板，進行PCR擴增，采用的引物見表1(SEQ ID NO5和SEQ ID NO6)，在設計引物的同時引入酶切位點Hind III和EcoR V。
鼠IgG1 Fc段編碼基因從小鼠來源的雜交瘤細胞520C9中擴增，細胞培養在RPMI1640(含10％小牛血清，1000u/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素)中，用Trizol抽提細胞總RNA，以逆轉錄獲得的cDNA第一鏈為模板，PCR方法擴增Fc編碼基因，采用的引物見表1(SEQ ID NO7和SEQ ID NO8)，在設計引物的同時引入酶切位點EcoR V和Not I。
酶切鑒定結果如圖2所示。
表1引物設計 2.抗體化乙肝疫苗的構建如圖1所示，將PreS2-S以限制性酶切的方式克隆至載體PcDNA3的相應位點上，構成質粒PCS2S，再將鼠IgG1 Fc以限制性酶切的方式克隆至質粒PCS2S的相應位點上，構成質粒PCMFS。
具體地，將上述擴增得到的基因產物以膠回收試劑盒回收純化，并用Hind III和EcoR V雙酶切，同時將載體PcDNA3雙酶切，酶切后經電泳回收純化，以T4連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布于氨卞青霉素抗性平板，陽性克隆質粒進行酶切及測序鑒定。
經鑒定構建成功的質粒PCS2S和Fc PCR產物用EcoR V和Not I雙酶切，酶切后經電泳回收純化，以T4連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布于氨卞青霉素抗性平板，陽性克隆質粒經酶切及測序鑒定，鑒定構建成功的質粒包含編碼抗體化乙肝疫苗的融合基因(SEQ ID NO9)，稱之為PCMFS，其相應的蛋白質序列見SEQ ID NO10。PCMFS的酶切鑒定結果見圖3，其中第1泳道為PCMFS經Hind III和NotI雙酶切結果；第2泳道為PCMFS經Hind III單酶切結果。
PCMFS的測序鑒定結果見圖4，左側為以T7為測序引物的正向測序，右側為以SP6為測序引物的反向測序。
實施例2PCMFS的體外轉染依照Lipofectamine2000真核轉染試劑說明進行C2C12細胞培養于完全1640培養基，轉染前一天以5×105C2C12細胞加入35mm六孔板，待細胞密度為80％時進行轉染。取10μl Lipofectamine2000加至90μl不完全1640培養基中，即為溶液A；取2μl(約3-5μg)經QIAGEN試劑盒純化的質粒，即為溶液B；將溶液A加入溶液B中，輕輕混勻，室溫作用20-25分鐘促進復合物的形成。室溫孵育時，吸去培養上清，并以PBS洗滌細胞一次，逐滴將A、B復合物加入六孔板中，再加入800μl不完全1640培養基，輕輕混勻。37℃ 5％CO2培養5小時后，加入含有20％NBS的完全1640培養液，繼續培養至收集上清，置-20℃保存；在六孔板中每孔加入1mlTrizol消化細胞抽提RNA進行檢測。
以PCMFS轉染C2C12細胞，收集不同時間的轉染和未轉染上清，抽濾至硝酸纖維素膜上，以小鼠抗人HBsAg單克隆抗體、生物素化的馬抗小鼠二抗和ABC、DAB檢測，結果見圖5，其中1.未轉染上清24-72小時；2.PcDNA3質粒轉染上清24-72小時；3.PCMFS質粒轉染上清24-72小時。
PCMFS質粒轉染C2C12細胞后72小時細胞內目的基因的轉錄水平的檢測見圖6，其中1.PCMFS質粒轉染組；2.PcDNA3質粒轉染組；3.陽性對照。
C2C12細胞中HBsAg的轉錄水平及上清和細胞裂解物中HBsAg的表達見圖7，可見PCS2S和PCMFS轉染C2C12細胞都能檢測到HBsAg的表達，但在PCS2S轉染上清中HBsAg的表達量相對較高，而PCMFS轉染的細胞裂解物中HBsAg的表達量相對較高。PCMFS的表達的融合蛋白具有在細胞內積聚的特性，有利于PreS2-S蛋白以內源性抗原的方式進行遞呈，從而有活化CD8+T細胞，促進了特異性的細胞免疫應答。
實施例3抗體化乙肝疫苗經肌肉基因注射本實施例中，注射的是PCMFS質粒。
以0.75％戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠(約120-150ul/只)，取腹位，調整腿姿暴露脛骨前肌。消毒后，用帶有塑料套管的1ml注射器在肌肉的中部垂直進針，針尖插入深度由套管決定，約為2-3mm，緩慢推進，一次注射量為100ul(含100ug PCMFS質粒)，可見注射肌肉膨脹，完畢后將針頭旋轉90°，停留5秒，緩緩拔出。
實施例4基因注射后肌肉局部HBsAg蛋白的檢測取小鼠免疫部位肌肉組織做冰凍切片，37℃烤片45分鐘，置預冷的丙酮固定10分鐘，蒸餾水沖洗；在各切片上滴加0.3％H2O2-甲醇溶液，37℃濕盒中孵育30分鐘，蒸餾水沖洗，再以0.01M PBS(pH＝7.4)洗3次，每次5分鐘；在各切片上滴加正常羊血清(0.01M PBS，pH＝7.4，1∶100)，37℃濕盒中孵育20分鐘；傾去稀釋的正常血清，滴加小鼠抗人HBsAg單克隆一抗(0.01M PBS，pH＝7.4，1∶10)，37℃濕盒中孵育1小時，以0.01MPBS洗3次，每次5分鐘；在各切片上滴加生物素化的馬抗小鼠二抗(0.01MPBS，pH＝7.4，1∶1000)，37℃濕盒中孵育1小時，0.01M PBS洗3次，每次5分鐘；滴加提前半小時配好的ABC，37℃濕盒中孵育30分鐘，0.01M PBS洗3次，每次5分鐘；滴加DAB底物液，顯微鏡下控制染色時間，蒸餾水終止反應；蘇木素復染細胞核，室溫下風干，以中性樹膠封片。
結果見圖8，a為pcDNA3肌注局部HBsAg蛋白的檢測，b為PCMFS肌注局部HBsAg的檢測。可見PCMFS肌肉免疫可以在局部檢測到HBsAg的表達。
實施例5抗體化乙肝疫苗可以誘導較強的體液免疫應答小鼠共免疫三次，間隔2周，自眼眶內靜脈按期采集各組小鼠全血，分離血清，采用常規ELISA檢測免疫小鼠血清特異性抗體，以純化蛋白(HBsAg5μg/ml，100μl/孔)包被96孔酶標反應板，置濕盒中，37℃放置1小時，4℃過夜。測血清標本之前以0.01M PBST(PH＝7.4，0.05％Tween-20)洗滌三次，每次3分鐘；以含5％山羊血清和10％小牛血清的PBST封閉，37℃作用1小時，以0.01M PBST洗滌三次，每次3分鐘；小鼠血清以0.01MPBST稀釋后加入孔中，37℃作用1小時，以0.01M PBST洗滌三次，每次3分鐘；加入以0.01M PBST稀釋的HRP標記羊抗小鼠IgG，37℃作用1小時，0.01M PBST洗滌三次，每次3分鐘；OPD顯色，1M H2SO4終止反應，測OD490值。圖9顯示PCMFS免疫組同PCS2S組一樣，可以誘導小鼠產生很強的抗HBsAg的特異性抗體。
實施例6抗體化乙肝疫苗促進特異性的細胞免疫應答免疫小鼠第8周時處死取脾細胞，以5×105細胞/孔加入96孔板，同時加入非特異性抗原con A(5ug/ml)或特異性抗原HBsAg(50ug/ml)，37℃，5％CO2培養72小時，在收獲細胞前18小時每孔加入0.5uCi3H-TdR，最后以多頭細胞收集儀收集細胞于玻璃纖維濾紙上，液體閃爍計數器測量cpm值。
同樣取自8周免疫小鼠的脾細胞，以4×106細胞/孔加入6孔板中，以50ug/ml的HBsAg刺激，第二天加入50u/ml的IL-2，培養5天后作為效應細胞，而轉染了PCS2S基因的SP2/0細胞作為靶細胞，用CFSE標記效應細胞后，以10∶1、20∶1和40∶1的效靶比混合加入96孔板，37℃作用6小時后收集細胞，加入7-AAD 4℃染色30分鐘，流式細胞儀檢測靶細胞調亡情況。
不同質粒免疫小鼠脾臟細胞的增殖情況見圖10。
不同質粒免疫小鼠脾臟細胞的特異性殺傷情況見圖11，可以見到與PCS2S免疫組相比，PCMFS組脾細胞增殖能力增加，特異性殺傷能力明顯增強，提示此抗體化乙肝疫苗能夠誘導較好的細胞免疫應答，有利于打破因病毒感染而引起的免疫耐受。
序列表<110>復旦大學<120>一種用于制備抗體化乙肝疫苗的融合蛋白及其載體<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>281<212>PRT<213>PreS2-S蛋白<400>1Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg1 5 10 15Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val20 25 30Asn Pro Val Leu Thr Thr Ala Ser Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg35 40 45Ile Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu50 55 60Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile65 70 75 80Leu Thr Ile Pro Gln Cys Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe85 90 95Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr100 105 110Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg115 120 125Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu130 135 140
Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro145 150 155 160Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys165 170 175Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys180 185 190Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro195 200 205Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg210 215 220Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly225 230 235 240Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp245 250 255Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro260 265 270Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile275 280<210>2<211>227<212>PRT<213>鼠IgG1 Fc<400>2Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu1 5 10 15Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr20 25 30Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys35 40 45
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val50 55 60His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe65 70 75 80Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly85 90 95Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile100 105 110Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val115 120 125Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser130 135 140Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu145 150 155 160Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro165 170 175Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val180 185 190Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu195 200 205His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser210 215 220Pro Gly Lys225<210>3<211>843<212>DNA<213>preS2-S<400>3
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165 170 175Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys180 185 190Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro195 200 205Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg210 215 220Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly225 230 235 240Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp245 250 255Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro260 265 270Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Ile Val Pro Arg Asp Cys275 280 285Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe290 295 300Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro305 310 315 320Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val325 330 335Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr340 345 350Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu355 360 365Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys370 375 380Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser385 390 395 400Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro
405 410 415Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile420 425 430Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly435 440 445Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp450 455 460Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp465 470 475 480Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His485 490 495Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys500 505 510
權利要求
1.一種用于制備抗體化乙肝疫苗的融合蛋白，其特征在于，它具有第一部分和第二部分，所述的第一部分為乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S，所述的第二部分為鼠IgG1 Fc段。
2.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的第一部分具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，所述的第二部分具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的第一部分具SEQID NO3有所示的基因序列，所述的第二部分具有SEQ ID NO4所示的基因序列。
4.根據權利要求1、2或3所述的融合蛋白，其特征在于，所述的第一部分和第二部分通過設計限制性酶切位點來進行連接。
5.權利要求1所述的融合蛋白在制備乙肝疫苗的藥物中的應用。
6.一種載體，其特征在于，含有權利要求1所述的融合蛋白的編碼基因。
7.如權利要求6所述的一種載體，其特征在于，含有SEQ ID NO9所示的基因序列。
8.如權利要求6所述的一種載體，其特征在于，含有SEQ ID NO10所示的氨基酸序列。
9.權利要求6所述的載體在制備乙肝疫苗的藥物中的應用。
10.制備權利要求1或2或3所述的融合蛋白的方法，其特征在于，包含以下步驟1)獲得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因；2)獲得鼠IgG1 Fc段編碼基因；3)將乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，及鼠IgG1 Fc段編碼基因克隆入質粒，獲得含有目的基因的載體，通過原核或者真核細胞表達獲得表達蛋白。
11.制備權利要求6或7或8所述的載體的方法，其特征在于，包含以下步驟1)獲得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因；2)獲得鼠IgG1 Fc段編碼基因；3)將乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，及鼠IgG1 Fc段編碼基因克隆入質粒，獲得含有目的基因的載體。
12.根據權利要求11所述的制備所述的載體的方法，其特征在于，包含以下步驟1)獲得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，2)設計擴增乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因的合適酶切位點的引物，3)獲得鼠IgG1 Fc段編碼基因，4)設計擴增鼠IgG1 Fc段編碼基因的合適酶切位點的引物，5)將乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S克隆入含有相應酶切位點的PcDNA3質粒，獲得PCS2S載體，再將IgG1 Fc克隆入含有相應酶切位點的質粒PCS2S，獲得PCMFS載體。
13.一種抗體化的乙肝疫苗，其特征在于，含有有效量的權利要求1所述的融合蛋白，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。
14.一種抗體化的乙肝疫苗，其特征在于，含有有效量的權利要求6所述的載體，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。
全文摘要
本發明屬于生物工程領域，公開了一種用于制備抗體化乙肝疫苗的融合蛋白，它具有兩個功能結構域，由N端的乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S，及C端的鼠IgG1 Fc段組成。本發明還公開了含有編碼所述融合蛋白基因的載體。本發明還公開了一種抗體化的乙肝疫苗。本發明所構建的抗體化乙肝疫苗，可以誘導很強的體液免疫應答和細胞免疫應答，具有比傳統疫苗更好的效果。
文檔編號A61K38/16GK101037476SQ20061002471
公開日2007年9月19日 申請日期2006年3月15日 優先權日2006年3月15日
發明者熊思東, 王纓, 蔣正剛, 儲以微 申請人:復旦大學