專利名稱：抗癌作用的林蛙卵蛋白及其制備方法
技術領域：
本發明屬于抗癌藥物和保健品及其制備領域，特別涉及一種林蛙卵抗癌蛋白藥物及其制備方法。
背景技術：
林蛙(Rana chensinensis)是我國東北地區長白山麓藥、食兩用的珍貴蛙種。林蛙蛙卵具有很高的營養價值，可應用于制藥和保健食品，具有調節免疫、延緩衰老、壯陽、明目、調節血脂和預防婦女更年期綜合癥的作用。在民間被公認是與林蛙輸卵管即林蛙油、蛤士蟆油、田雞油并列的滋補佳品。目前，國內很多學者和企業已經對林蛙蛙卵的卵油進行了研究開發和利用，主要是采用CO2超臨界萃取技術等方法提取其中脂溶性的林蛙卵油，發現林蛙卵油中的不飽和脂肪酸種類和含量都十分豐富，其中不飽和脂肪酸含量為76.36％，飽和脂肪酸含量為23.64％，主要不飽和脂肪酸均為十六碳烯酸、油酸、亞油酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十碳四烯酸、二十碳烯酸、二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPA)。此外，中國林蛙卵油中還含有雌二醇以及維生素A、D、E等。對林蛙卵油的一些生物活性研究結果表明，林蛙卵油可以拮抗四氯化碳對肝臟的毒性，提高小鼠紅細胞中SOD的抗氧化活性，具有中樞神經抑制作用，進而起到抗驚厥和保護驚厥動物的作用。
申報林蛙研究的專利也逐年增多，以林蛙和卵為關鍵詞，檢索國內外專利，沒有查到國外關于林蛙的專利，國內31篇。其中CN1287837“林蛙卵及其應用”是保護林蛙卵在調節免疫、延緩衰老、壯陽、明目、調節血脂和預防更年期方面的作用；CN1670192“中國林蛙輸卵管分泌細胞體外培養方法”、CN1546497“林蛙卵卵磷脂分離提純方法”、CN1389552“活體林蛙的取油方法”、CN1346639“一種林蛙雌蛙成體輸卵管全質營養液的制作方法”、CN1212140“促鈣吸收作用的林蛙卵組合物及其制劑”等只是涉及保護林蛙卵卵磷脂的提取方法和林蛙油，即林蛙輸卵管的應用；此外CN1370559“抗衰老降血脂營養保健軟膠囊及其制法”等10余篇專利都是關于保護林蛙卵油的萃取技術、林蛙卵油降血脂、抗焦慮作用產品的生產技術。沒有檢索到林蛙蛙卵抗癌活性蛋白的研究和專利。
本發明從林蛙卵中提取的具有抗癌活性的蛋白提取物，經Sephadex G-100和DEAE-cellulose柱層析分離得到林蛙蛙卵抗癌活性蛋白。并將得到的產品用于體內和體外的抗癌作用研究，結果顯示林蛙卵蛋白對S180胃肉瘤、白血病K562細胞和HL60細胞有明顯的抑制生長作用，其抑制率達到50％以上；并能誘導K562腫瘤細胞發生凋亡，細胞膜破損、細胞變形或出現胞芽和縊痕，細胞皺縮變小，胞漿致密，核固縮，染色質濃集、邊聚化，胞質空泡化等，其S期DNA含量低于G1期。據此，本發明研究了林蛙卵抗癌活性蛋白的制備方法并進行了抗癌實驗效果觀察。
發明內容
本發明的目的是從林蛙蛙卵中提取具有抗癌活性的蛋白質，并進行體內和體外抗癌實驗，使林蛙卵蛋白制成具有抗癌活性的藥物或保健品。
本發明涉及的林蛙卵抗癌活性蛋白以林蛙卵為原料，其制備方法如下1.將林蛙蛙卵加入2-8倍體積的10mM pH6.5的磷酸鈉緩沖液，于4000-8000rpm條件下常溫勻漿；2.上述勻漿液在3000-8000rpm下，4-20℃離心10-60min，吸取脂肪層與沉淀之間的上清液，冷凍干燥；3.將上述凍干粉溶于蒸餾水中配成溶液；4.上述溶液經Sephadex G-100凝膠柱層析，收集活性組分；5.活性組分透析脫鹽，凍干濃縮；6.凍干粉溶于蒸餾水中配成溶液，經DEAE-cellulose柱層析，收集活性組分；7.活性組分透析脫鹽，凍干，于-20℃保存，得到本發明的林蛙卵抗癌活性蛋白。
圖1是本發明的SephadexG100的凝膠層析圖；圖2是本發明的DEAE-cellulose柱層析圖。
圖3(1)對照組K562細胞 (2)絲裂霉素 (3)林蛙蛙卵抗癌活性蛋白圖4中國林蛙蛙卵抗癌活性蛋白作用不同時間對K562細胞的抑制作用圖具體實施例下面實施例進一步說明本發明的制備方法，并不是用來限制發明的范圍。
實施例11.取鮮林蛙蛙卵100g加入10mM pH6.5的磷酸鈉緩沖液200ml，于8000rpm條件下常溫勻漿；2.勻漿液在8000rpm下，4℃離心60min，吸取脂肪層與沉淀之間的上清液，冷凍干燥；
3.將凍干粉溶于蒸餾水中配成濃度為6mg/ml的溶液；4.上述溶液經Sephadex G-100凝膠柱層析，收集活性組分；其活性組分見說明書附圖1所示活性組分。
5.活性組分透析脫鹽，凍干濃縮；6.凍干粉加入蒸餾水，配成濃度為6mg/ml的經DEAE-cellulose柱層析，收集活性組分；其活性組分見說明書附圖2所示活性組分。
7.活性組分透析脫鹽，凍干，于-20℃保存，得到本發明的林蛙卵抗癌活性蛋白。
實施例21.取鮮林蛙蛙卵100g加入10mM pH6.5的磷酸鈉緩沖液500ml，于4000rpm條件下常溫勻漿；2.勻漿液在5000rpm下，4℃離心40min，吸取脂肪層與沉淀之間的上清液，冷凍干燥；3.將凍干粉溶于蒸餾水中配成濃度為6mg/ml的溶液；4.上述溶液經Sephadex G-100凝膠柱層析，收集活性組分；其活性組分見說明書附圖1所示活性組分。
5.活性組分透析脫鹽，凍干濃縮；6.凍干粉加入蒸餾水，配成濃度為6mg/ml的經DEAE-cellulose柱層析，收集活性組分；其活性組分見說明書附圖2所示活性組分。
7.活性組分透析脫鹽，凍干，于-20℃保存，得到本發明的林蛙卵抗癌活性蛋白。
實施例31.取鮮林蛙蛙卵100g加入10mM pH6.5的磷酸鈉緩沖液800ml，于6000rpm條件下常溫勻漿；2.勻漿液在6000rpm下，常溫下離心20min，吸取脂肪層與沉淀之間的上清液，冷凍干燥；3.將凍干粉溶于蒸餾水中配成濃度為6mg/ml的溶液；4.上述溶液經Sephadex G-100凝膠柱層析，收集活性組分；其活性組分見說明書附圖1所示活性組分。
5.活性組分透析脫鹽，凍干濃縮；6.凍干粉加入蒸餾水，配成濃度為6mg/ml的經DEAE-cellulose柱層析，收集活性組分；其活性組分見說明書附圖2所示活性組分。
7.活性組分透析脫鹽，凍干，于-20℃保存，得到本發明的林蛙卵抗癌活性蛋白。
本發明的林蛙蛙卵抗癌活性蛋白具有如下特征(1)黃白色粉末；(2)pH4-10；(3)分子量10-110kD；(4)穩定性-4℃保存24個月仍然具有抗癌活性。
(5)抗癌活性對多種癌細胞具有抑制作用。
林蛙卵抗癌活性蛋白的體內和體外抗癌實驗1.體內抗癌實驗1.1材料林蛙蛙卵抗癌活性蛋白，由上述制備方法獲得；用蒸餾水配制成0.1、0.2、0.3、0.5、1、2mg/mL的溶液，用無菌的0.45μm的濾菌膜過濾，制備成無菌樣品注射液，4℃保存。
1.2動物瘤株傳代及皮下腫瘤的接種BALB-c小鼠體重20±1g，雌雄各半，清潔級，由大連醫科大學病理教研室提供。胃肉瘤細胞株S180，由大連醫科大學衛生學教研室提供。S180細胞接種前于RPMI 1640+10％FBS培養液中37℃、5％CO2條件下復蘇至狀態良好，細胞數達到105數量級左右，接入小鼠腹腔內傳代2次，每次一周。將小鼠腹水置于冰浴中，再于1000rpm離心5-8min，棄去上清液，用無菌的冷生理鹽水懸浮，計數后制成5×106個/mL的細胞懸液。小鼠腋下常規消毒，皮下注射癌細胞懸液0.2mL，使每只小鼠癌細胞接種量達到106個。小鼠接種腫瘤細胞后第三天，開始注射用藥，每只小鼠每天注射0.2mL樣品溶液，正常飼喂、自由飲水，實驗周期為15天，第16天對小鼠頸椎脫臼處死。剝出皮下肉瘤稱重。
1.3抑瘤率的計算抑瘤率％＝100(A-B)/A A荷瘤對照組的平均瘤重 B給藥組的平均瘤重1.4實驗結果表1林蛙卵蛋白對S180胃瘤的抑制作用
結果表明，林蛙卵蛋白對小鼠S180胃瘤具有明顯的抑制作用，當樣品濃度為03mg/ml時，其抑瘤率就可達到74％，而且隨著用藥濃度的增大，中國林蛙蛙卵抗癌活性蛋白對小鼠S180肉瘤的抑制作用增大。
2.體外抗癌實驗
2.1材料林蛙蛙卵抗癌活性蛋白，由上述制備方法獲得；用蒸餾水配制成0.1、0.5、1、2、3、4、5、6mg/mL的溶液，用無菌的0.45μm的濾菌膜過濾，制備成無菌樣品注射液，4℃保存。
2.2白血病K562細胞培養將K562細胞接種在含有10％小牛血清(FBS)的RPMI 1640培養液中，在培養液中分別加入100國際單位的青霉素和鏈霉素，pH6.8-7.6，置于37℃、5％CO2培養箱中培養。待細胞生長狀態良好時，進行傳代。
2.3體外藥物敏感性和細胞生長抑制實驗——MTT比色法將濃度為5×104個K562細胞/mL的細胞懸液接入96孔細胞培養板，每孔200μL。每孔加入4μL林蛙蛙卵抗癌活性蛋白濃度分別為0.0020、0.0098、0.0196、0.0392、0.0588、0.0784、0.0980、0.1176mg/mL。在24h、48h和72h，提前4h在每孔內加入20μL的MTT，繼續培養4h，將懸浮細胞于1000rpm離心10min，棄上清，加150μL的DMSO振蕩。加入DMSO后20min，待沉淀完全溶解，于490nm下用酶標儀測定OD值。
2.4凋亡的形態學觀察將K562細胞以1×105個細胞/mL的濃度，接種于24孔培養板中，每孔接種1mL細胞懸液，中國林蛙蛙卵抗癌活性蛋白濃度為6mg/mL，每孔加入20μL中國林蛙蛙卵抗癌活性蛋白液，使其終濃度達到0.1176mg/mL，選擇培養后的24h、48h和72h三個時間點觀察中國林蛙蛙卵抗癌活性蛋白對K562細胞形態的影響，并做顯微照相。將加入絲裂霉素的組作為陽性對照組，將正常K562細胞組作為陰性對照組。絲裂霉素的濃度為0.13mg/mL，其用量與中國林蛙蛙卵抗癌活性蛋白樣品一致，所用樣液均經0.45μm濾膜除菌。
2.5流式細胞檢測分析林蛙蛙卵抗癌活性蛋白對K562細胞周期的影響2.6于JEM-200EX型(JEOL日本電子株式會社)透射電鏡下觀察K562細胞形態2.7實驗結果2.7.1不同濃度中國林蛙蛙卵抗癌活性蛋白對K562細胞的生長抑制作用表2不同濃度中國林蛙蛙卵抗癌活性蛋白對K562細胞的生長抑制作用
不同濃度中國林蛙蛙卵抗癌活性蛋白作用于K562細胞，對細胞生長的抑制作用不同，隨著作用濃度的增大，作用時間的延長，抑制效果增強。
2.7.2中國林蛙蛙卵抗癌活性蛋白誘導K562細胞凋亡電鏡下觀察，未加樣品組的細胞形態完整。加入中國林蛙蛙卵抗癌活性蛋白后，細胞呈現凋亡改變，包括細胞皺縮變小，胞漿致密，核固縮，染色質濃集、邊聚，形成不同形狀、不同大小的塊狀，胞質空泡化等。
2.7.3林蛙蛙卵抗癌活性蛋白對K562細胞周期的影響中國林蛙蛙卵抗癌活性蛋白作用于K562細胞，24、48、72h后，分別分析細胞周期的分布情況。對照組未見凋亡現象出現，使用林蛙蛙卵抗癌活性蛋白樣品組G0/G1期細胞減少，產生典型凋亡峰，出現了亞G0/G1期，通常認為此期細胞為凋亡細胞，其凋亡程度與時間關系如圖4所示。從24h開始，S期細胞明顯減少，說明細胞周期被阻滯在G1期到S期的關鍵點上。
通過體內外抗癌實驗證明本發明的林蛙蛙卵蛋白具有抑制多種癌細胞生長的作用，并可以誘導癌細胞凋亡。其制備工藝簡單，產品穩定性好。
權利要求
1.一種以林蛙卵為原料制備的具有抗癌作用的林蛙卵蛋白，其特征在于林蛙卵蛋白可以作為抗癌藥物和保健食品。
2.一種權利要求1所述的具有抗癌作用的林蛙卵蛋白的制備方法，其特征是(1)將林蛙蛙卵加入2-8倍體積的10mM pH6.5的磷酸鈉緩沖液，于4000-8000rpm條件下常溫勻漿；(2)上述勻漿液在3000-8000rpm下，4-20℃離心10-60min，吸取脂肪層與沉淀之間的上清液，冷凍干燥；(3)將上述凍干粉溶于蒸餾水中配成溶液；(4)上述溶液經Sephadex G-100凝膠柱層析，收集活性組分；(5)活性組分透析脫鹽，凍干濃縮；(6)凍干粉溶于蒸餾水中配成溶液，經DEAE-cellulose柱層析，收集活性組分；(7)活性組分透析脫鹽，凍干，于-20℃保存，得到本發明的林蛙卵抗癌活性蛋白。
3.如權利要求2所述方法制備的具有抗癌作用的林蛙卵蛋白，其具有如下特征(1)黃白色粉末；(2)pH4-10；(3)分子量10-110kD；(4)穩定性-4℃保存24個月仍然具有抗癌活性。(5)抗癌活性對多種癌細胞具有抑制作用。
4.如權利要求1所述的林蛙卵蛋白，可以在體內外抑制多種癌細胞的生長，并誘導癌細胞凋亡，具有較強的抑癌作用。
全文摘要
本發明公開了具有抗癌作用的林蛙卵蛋白及其制備方法。它可以用于抗癌藥物和保健品及其制備領域。以林蛙蛙卵為原料，用磷酸緩沖液提取，離心。經SephadexG100和DEAE－cellulose柱層析，得到具有抗癌活性的林蛙卵蛋白。體內外抗癌實驗表明，林蛙卵蛋白可以明顯抑制癌細胞的生長，并能誘導多種癌細胞的凋亡。本發明為林蛙卵在抗癌藥物和保健食品中的應用創造了條件。
文檔編號A61P35/00GK101089018SQ20061004688
公開日2007年12月19日 申請日期2006年6月12日 優先權日2006年6月12日
發明者尚德靜, 李慶偉 申請人:遼寧師范大學