專利名稱：抗腫瘤多靶點復合抗原及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗原及其編碼基因與應用，特別是涉及一種多靶點復合抗原及其編碼基因與其在制備預防和/或治療性腫瘤疫苗及藥物中的應用。
背景技術：
惡性腫瘤是威脅人類健康的最重要殺手之一。腫瘤的發生、發展和轉移與腫瘤的血管形成密切相關，對根治性切除術的術后患者來說，無微血管侵襲的患者5年復發率為11％，而存在微血管侵襲的患者5年復發率高達50％。由于腫瘤區血管具有相同的特點，因此抗血管形成治療適用于多種實體腫瘤。以血管為靶點、抑制血管形成，從而抑制腫瘤增殖和轉移已成為一條新的腫瘤治療途徑。
研究表明，血管的形成不僅僅取決于血管內皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)及其受體(vascular endothelial growth factor receptors，VEGF-R)，同時也受到細胞外基質(extracellular matrix，ECM)蛋白受體—整合素(integrin)的影響[Kerbel RS.A cancer therapy resistant to resistance[J].Nature，1997，390(6658)335-336.Ellis LM..Angiogenesis and its role incolorectal tumor and metastasis formation[J].Semin Oncol，2004，31(6)3-9.]。其中，VEGF-E、VEGF-R2和αVβ3與腫瘤血管形成的關系最為密切，可以作為抑制病理性血管形成的直接靶標。
VEGF是一種內皮細胞特異性的絲裂源，在體內誘導血管生成，是作用最強的血管形成因子之一。現已發現VEGF家族包括VEGF-A、B、C、D、E和胎盤生長因子(placentagrowth factor，PIGF)，其中VEGF-E僅在病理性血管中高表達[Veikkola T，AlitaloK.VEGFs，receptors and angiogenesis[J].CancerBiology，1999，9(3)211-220.]。有實驗證實，應用抗VEGF的單克隆抗體可封閉已分泌的VEGF，阻斷血管形成過程的信號轉導，從而抑制腫瘤的生長和轉移[Pidgeon GP，Barr MP，Harmey JH，et al.Vascular endothelial growth factor(VEGF)upregulates BCL-2and inhibitsapoptosis in human and murine mammary adenocarcinoma cells[J].Br J Cancer，2001，85(2)273-278.Lichtenbeld HC，Ferarra N，Jain RK，et al.Effectof local anti-VEGF antibody treatment on tumor microvessel permeability[J].Microvasc Res，1999，57(3)357-362.]。抗VEGF-E單克隆抗體現在正處于III期臨床。VEGF-E是從羊口瘡病毒感染組分離出來的，是一種分泌型二聚體糖蛋白，既可以分泌到細胞外，也可以結合到細胞表面或細胞外基質，具有最佳的生物利用度和生物潛能。每個單體含有8個特征性的半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸通過二硫鍵形成3個環狀結構loop-1、-2和-3，構成其主要的功能區域。
EGF受體家族目前已發現5種，其中VEGF-R1(Flt-1)、VEGF-R2(KDR/Flk-1)和VEGF-R3(Flt-4)屬于酪氨酸蛋白激酶受體(receptortyrosine kinases，RTKs)超家族，另外兩種為Npn(neuropillin)-1和-2，它們在內皮細胞分化和血管形成中發揮關鍵性作用。VEGF-R2在胚胎血管內皮細胞中高表達，而在成熟血管中表達下降，說明它在促進血管發生及再生中起作用。VEGF-R2的胞外區域包含七個免疫球蛋白樣區域、一個酪氨酸激酶區域以及一個跨膜區域，其中第二和第三個免疫球蛋白樣區域組成高親和性的配體結合區。
近年來，對血管形成機理的研究已經越來越完善。研究發現，腫瘤血管的形成不僅取決于內皮生長因子及其受體，也受到細胞外基質(extracellular matrix，ECM)蛋白受體—整合素αVβ3的影響[Stromblad S，Becker JC，Yebra M，et al.Suppression of p53 activity and p21WAF1/CIP1expression by vascular cellintegrin alphaVbeta3 during angiogenesis[J].J Clin Invest，1996，98(2)426-433.]。腫瘤組織中新生的血管內皮細胞表達高水平的αVβ3，而成人正常血管內皮細胞中無表達或某些組織極低水平表達。它可以在內皮細胞表面引發MMP-2降解基質的活性，并且抑制內皮細胞的p53及其所誘導的p21蛋白的活性，從而表現出抗凋亡效應。大量實驗表明，動物體內應用整合素αVβ3拮抗劑，可導致參與生成血管的內皮細胞的凋亡；抗αVβ3抗體或αVβ3的拮抗劑能破壞鵪鶉胚胎、鼠視網膜、兔角膜的新生血管生成；腫瘤模型中應用αVβ3的拮抗劑不僅阻止了腫瘤相關的血管生成，而且可以引起腫瘤的退縮。αVβ3是由αV鏈和β3鏈非共價結合構成的一個異二聚體的跨膜糖蛋白，是一個能與ECM廣泛結合的受體，凡是具有RGD序列(Arg-Gly-Asp)的ECM蛋白均能與其結合。
發明內容
本發明的目的是提供一種對腫瘤具有抑制作用的多靶點復合抗原。
本發明所提供的多靶點復合抗原，命名為ERV，具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。
序列表中的SEQ ID №1由404個氨基酸殘基組成，自氨基(N)端第1-96位為以口瘡病毒VEGF-E為靶點的抗原序列，其中，自氨基端第23-30位為Loop1的氨基酸殘基序列，自氨基端第46-51位為Loop2的氨基酸殘基序列，自氨基端第68-73位為Loop3的氨基酸殘基序列；自氨基端第97-238位為以非洲爪蟾αVβ3為靶點的抗原序列；自氨基端第239-404位為以VEGF-R2為靶點的抗原序列，其中，自氨基端第243-293位為來源于鵪鶉的VEGF-R2第二個免疫球蛋白樣區域的氨基酸殘基序列，自氨基端第339-400位為來源于小鼠的VEGF-R2第三個免疫球蛋白樣區域的氨基酸殘基序列，自氨基端第294-338位為來源于人的連接區的氨基酸序列。
編碼上述多靶點復合抗原ERV的基因也屬于本發明的保護范圍，可具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
序列表中的SEQ ID№2由1212個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1212位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質。其中，自5’端第1-288位堿基編碼以口瘡病毒VEGF-E為靶點的抗原序列，自5’端第289-714位堿基編碼以非洲爪蟾αV β3為靶點的抗原序列，自5’端第715-1212位堿基編碼以VEGF-R2為靶點的抗原序列。
含有本發明多靶點復合抗原ERV基因的表達載體、轉基因細胞系和宿主菌均屬于本發明的保護范圍。
擴增所述抗原基因中任一片段的引物對也在本發明的保護范圍之內。
與上述多靶點復合抗原ERV特異結合的抗體也屬于本發明的保護范圍，所述抗體包括單克隆抗體及多克隆抗體，均可按照常規方法制備。
本發明的另一個目的是提供一種表達上述多靶點復合抗原ERV的方法。
本發明所提供的表達上述多靶點復合抗原ERV的方法，是將含有上述多靶點復合抗原ERV基因的重組表達載體導入宿主細胞，表達得到多靶點復合抗原ERV。
用于構建所述重組表達載體的出發載體可為在大腸桿菌中表達外源基因的表達載體，如pGEX-4T-2、pET-3a、pET-30a、pET-28a、pET-28b或pET-28c，優選為pGEX-4T-2。
以pGEX-4T-2為出發載體，構建的含有所述血管內皮生長因子VEGF-E抗原基因的重組表達載體為pGEX-ERV。
上述重組表達載體均可按照常規方法構建。
所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或枯草桿菌等，優選為大腸桿菌。
所述大腸桿菌可為E.coliBL21(DE3)、E.coli JM109、E.coliHB101或E.coliTop10等。
可采用構建工程菌所用的出發菌株的常規培養條件對工程菌進行培養，當所述工程菌為重組大腸桿菌時，需加入IPTG誘導劑，所加入IPTG的濃度為0.8-1.2mmol/L，優選為1mmol/L，誘導溫度為35-39℃，優選為37℃，誘導時間為2-4小時，優選為3小時。
本發明的多靶點復合抗原ERV可用于制備預防和/或治療性腫瘤疫苗，編碼多靶點復合抗原ERV的基因可用于制備預防和/或治療性腫瘤DNA疫苗。
所述預防和/或治療性腫瘤DNA疫苗中的多靶點復合抗原ERV基因可存在于真核表達載體中。
用于構建攜帶有多靶點復合抗原ERV基因的真核表達載體的出發載體可為任意一種可在哺乳動物中表達外源基因的表達載體，優選為pCI-GPI，其物理圖譜見圖18。
以pCI-GPI為出發載體，構建的攜帶有多靶點復合抗原ERV基因的重組表達載體為pCI-ERV。
需要的時候，以血管內皮生長因子VEGF-E抗原制備的疫苗中還可以融入顆粒白細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、TGF-β4等一種或多種細胞因子的基因或蛋白質作為分子免疫佐劑。
本發明提供了多靶點復合抗原ERV及其編碼基因。以分別含有本發明多靶點復合抗原ERV基因的真核表達質粒作為免疫原免疫小鼠，結果與PBS和空載體的對照組相比，抗原組小鼠血清中均產生了較高水平的抗體，抗原組小鼠脾細胞中分泌IFN-γ和IL-4的T淋巴細胞數量明顯增加，CD4+/CD8+的比值也明顯升高，且本發明的多靶點復合抗原ERV較單個靶點抗原更能激發小鼠的體液免疫反應；免疫小鼠接受皮下移植瘤攻擊后，與PBS和空載體對照組相比，抗原組小鼠的成瘤時間延長、腫瘤生長緩慢且瘤體積縮小、抑瘤率明顯提高，且本發明的多靶點復合抗原ERV較單個靶點抗原的抑瘤效果更加顯著，抑瘤率可達95％。上述實驗結果表明本發明的多靶點復合抗原ERV及其編碼基因具有顯著的抑瘤效果，且具有表達量高，易純化，生產周期短，生產規模大，成本低的優點，可制備成預防和/或治療性腫瘤藥物及疫苗。本發明在醫學和生物制藥領域具有較大的實際意義和廣闊的應用前景。
下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
圖1為用中心模板法分五步PCR擴增VEGF-E靶點基因的模式2為PCR擴增的VEGF-E靶點基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖3為用中心模板法分五步PCR擴增αVβ3靶點基因的模式4為PCR擴增的αVβ3靶點基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖5為用中心模板法分五步PCR擴增αVβ3靶點基因的模式6為PCR擴增的αVβ3靶點基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖7為PCR擴增的多靶點復合抗原ERV基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖8為穩定轉染細胞mRNA的RT-PCR鑒定結果圖9為穩定轉染細胞的免疫熒光檢測結果圖10為穩定轉染細胞的Western Blotting鑒定結果圖11為免疫小鼠的IFN-γ和IL-4的ELISPOT檢測結果圖12為免疫小鼠中CD4+和CD8+T細胞數比例的流式細胞儀測定結果圖13為免疫小鼠中CD4+和CD8+T細胞數比例的柱狀14為皮下移植瘤攻擊后50天各組免疫小鼠的瘤體積測量結果圖15為皮下移植瘤攻擊后50天各組免疫小鼠的瘤重測量結果圖16為以B組為對照組的各組免疫小鼠的抑腫瘤率統計結果圖17為皮下移植瘤攻擊后50天各組免疫小鼠的存活情況、在體瘤體積和體外瘤體積圖18為載體pCI-GPI的物理圖譜具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。所有引物合成及測序工作均由北京三博生物有限公司完成。
實施例1、多靶點復合抗原的設計及其編碼基因的克隆一、多靶點復合抗原的設計通過大范圍文獻檢索(國內與國外)及序列比較，獲得了一系列VEGF-E、VEGF-R2及αVβ3的功能性區域及這些區域在不同物種序列中的同源性差異，為制備高效的腫瘤治療性疫苗提供了侯選序列。最終選取口瘡病毒VEGF-E的核心區包含Loop-1、Loop-2和Loop-3的由96個氨基酸殘基組成的多肽作為VEGF-E的靶點，即序列表中SEQ ID №1的自氨基(N)端第1-96位氨基酸殘基，其中，自氨基端第23-30位為Loop1的氨基酸殘基序列，自氨基端第46-51位為Loop2的氨基酸殘基序列，自氨基端第68-73位為Loop3的氨基酸殘基序列；選取非洲爪蟾αVβ3全長中的功能性片段包括自氨基端第118-131，126-129，217-231，211-221，109-118，99-118，209-220位，共涉及142個氨基酸殘基組成的多肽作為αVβ3的靶點，即序列表中SEQ ID №1的自氨基端第97-238位氨基酸殘基；選取包含VEGF-R2胞外區第二和第三個免疫球蛋白樣區域由166個氨基酸殘基組成的多肽作為VEGF-R2的靶點，即序列表中SEQ ID №1的自氨基端第239-404位氨基酸殘基，其中，自氨基端第243-293位為來源于鵪鶉的VEGF-R2第二個免疫球蛋白樣區域的氨基酸殘基序列，自氨基端第339-400位為來源于小鼠的VEGF-R2第三個免疫球蛋白樣區域的氨基酸殘基序列，自氨基端第294-338位為來源于人的連接區的氨基酸序列；最后將上述VEGF-E、VEGF-R2和αVβ3的功能性區域順次連接起來，得到異源性多靶點復合抗原，命名為ERV。
二、多靶點復合抗原ERV基因的克隆根據步驟一設計的多靶點復合抗原ERV的氨基酸序列推導出編碼該序列的核苷酸序列，即序列表中的SEQ ID №2，由1212個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1212位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質。其中，自5’端第1-288位堿基編碼口瘡病毒VEGF-E靶點序列，自5’端第289-714位堿基編碼非洲爪蟾αVβ3靶點序列，自5’端第715-1212位堿基編碼VEGF-R2靶點序列。用下述方法合成多靶點復合抗原ERV基因1、口瘡病毒VEGF-E靶點基因的克隆根據口瘡病毒VEGF-E靶點基因序列，即序列表中SEQ ID №2的自5’端第1-288位核甘酸序列設計PCR擴增引物，并在引物F5、R5兩端分別添加限制性內切酶XhoI和EcoRV識別位點，引物序列如下F1 5’-AACTGTTAAACGATGCGGCGGTTGCTGTAATGACGACGGTCAAA-3’R1 5’-TTGTATTTCTTGTTTCAACCGCTGTACATATTTGACCGTCATCG-3’；F2 5’-ACTAACCTACAATATAATCCCCGGTGCGTAACTGTTAAACGATG-3’R2 5’-AGACACGCCGGTTACTGAAACTGTTACAGTTGTATTTCTTGTTT-3’；F3 5’-TTTATTTGGGAGAAGAATATCCAGAAAGCACTAACCTACAATAT-3’R3 5’-GATACACCACTATTAGTACCAGACGAACTAGACACGCCGGTTAC-3’；F4 5’-AAGTGGTTGTAAACCTAGAGATACTGTAGTATATTTGGGAGAAG-3’R4 5’-CTGTAACACTTGTTCTTTGAAGGTTAGTAGATACACCACTATTA-3’；F5 5’-GCCTCGAGTGGATGCGTACACTAGACAAAAGTGGTTGTAAACC-3’(帶下劃線堿基為限制性內切酶XhoI識別位點)R5 5’-GCGATATCACAATCGCACTTTGTGTGTTCTGTAACACTTGTTC-3’(帶下劃線堿基為限制性內切酶EcoRRV識別位點)。
采用中心模板法分五步PCR擴增目的基因，合成模式圖見圖1(F上游引物，R下游引物)，具體方法如下第一步擴增體系為10×PCR緩沖液5μl，MgCl2(2.5mM)5μl，dNTPs混合物(2.5mM)4μl，合成引物(20μM)R1、F1各1μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)1μl，加去離子水至50μl。PCR反應條件為先94℃預變性5min；然后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共5個循環；最后72℃繼續延伸10min。
隨后四步擴增均以上一步PCR產物稀釋50倍后作為模板進行。擴增體系同上，只是第二步PCR擴增選用引物R2和F2，第三步選用引物R3和F3，第四步選用引物R4和F4，第五步分別選用R5-1、F5-1和R5-2、F5-2，最后一輪PCR體系放大至100μl以備PCR產物的純化。PCR反應條件為先94℃預變性5min；然后94℃變性30s，55℃退火30s、72℃延伸30s，共30個循環；最后72℃繼續延伸10min。五次PCR擴增后，對PCR擴增產物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖2所示(泳道M.DNA相對分子質量標準DL-2000；泳道1.PCR終產物(288bp)；泳道2-5.分步PCR產物)，結果經PCR擴增獲得了長度約為288bp的基因片段(圖2中箭頭所指片段)，與預期結果相符。用北京博大泰克生物基因技術有限責任公司的“PCR片斷快速膠回收試劑盒”并參照試劑盒說明書回收并純化該目的片段，將其克隆到pMD18-T載體(TaKaRa公司)中，對含有回收片斷的重組載體進行測序，結果擴增片斷具有序列表中SEQ ID№2自5’端第1-288位核甘酸序列，擴增序列正確。
2、非洲爪蟾αVβ3靶點基因的克隆根據非洲爪蟾αVβ3靶點基因序列，即序列表中SEQ ID №2的自5’端第289-714位核甘酸序列設計PCR擴增引物，并在引物F51、R51兩端分別添加限制性內切酶XhoI和EcoRV識別位點，引物序列如下前段F11 5’-ATGATTTAATTAAGATCCAAACCCTGGGCACTAGTTTGTCAGAGA-3’前段R11 5’-ATCCGCAGGTTACTAGTTAGCCGGCGCATCCTCTCTGACAAACTA-3’；前段F21 5’-ACCTTATGGACCTTTCCTATTCCATGAAGGATGATTTAATTAAGA-3’前段R21 5’-ATCGGCTTGTCAACGAATGCACCAAATCCAATCCGCAGGTTACTA-3’；前段F31 5’-AAGTAGAAGACTATCCTGTGGACATATACTACCTTATGGACCTTT-3’前段R31 5’-TCAGGAGGTGACATGAACATGTACGGTGACATCGGCTTGTCAACG-3’；前段F41 5’-GTCTTCAACCTACAGGTGAGGCAAGTAGAAGACTATC-3’前段R41 5’-ATAGCATGGGTTCTTGATGACTTCAGGAGGTGACATG-3’；后段F11 5’-GCACGTCTTGACTTTGACAGAGGAAGTCTTGCTGTTTAACGAGGAGGT-3’后段R11 5’-GAGAATCCCGGTTTCGGGAGACCTTCTGTTTCTGGACCTCCTCGTTAA-3’；后段F21 5’-TCAATACCGAGTGCATGCCGACATTCGGATATAAGCACGTCTTGACTT-3’后段R21 5 ’-GCTGCCTGTAGCACCGCATCAAATCCACCCTCTGGAGAATCCCGGTTT-3’；后段F31 5’-CCTGAAGTCATCAAGAATCCATGCTATGAATTCAATACCGAGTGC-3’后段R31 5’-ATTTCTCCAGCCAATCTTCTCGTCGCATACTGCTGCCTGTAGCAC-3’；F51 5’-GCCTCGAGGTCTTCAACCTACAGGTGAGGCAAG-3’(帶下劃線堿基為限制性內切酶Xho I識別位點)R51 5’-GCGATATCATTTCTCCAGCCAATCTTCTCGTCG-3’(帶下劃線堿基為限制性內切酶EcoR V識別位點)。
采用中心模板法分五步PCR擴增目的基因，合成模式圖見圖3(F上游引物，R下游引物)，將全基因分成前、后兩段，兩片段均用四步PCR合成法獲得目的基因，然后利用PCR方法將前后兩端拼接起來，具體方法如下第一步擴增體系為10×PCR緩沖液5μl，MgCl2(2.5mM)5μl，dNTPs(2.5mM)4μl，引物R1、F1(20μM)各1μl，TaqDNA聚合酶(5U/μl)1μl，加去離子水至50μl。PCR反應條件為先94℃預變性5min；然后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共5個循環；最后72℃繼續延伸10min。
第二步、第三步和第四步擴增均以上一步PCR產物稀釋50倍后作模板進行。擴增體系同上，只是引物第二步PCR擴增選用引物和F2，第三步選用引物R3和F3，第四步選用引物R4和F4。PCR反應條件為94℃1min，55℃1min，72℃1min，共30個循環。四次PCR擴增后所得的兩段目的基因，分別命名為前段和后段。
最后一步PCR擴增體系為10×PCR緩沖液5μl，MgCl2(2.5mM)5μl，dNTPs(2.5mM)4μl，合成引物(20μM)F5和R5各1μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)1μl，稀釋50倍后的前段1μl，稀釋50倍后的后段1μl，加去離子水至50μl。PCR反應條件同步驟二至四。五次PCR擴增后，對PCR擴增產物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖4所示(泳道M.DNA相對分子質量標準DL-2000；泳道1-4.前段分步PCR產物；泳道5.αVβ3的PCR終產物(426bp)；泳道6-8.后段分步PCR產物)，結果經PCR擴增獲得了長度約為426bp的基因片段(圖4中箭頭所指片段)，與預期結果相符。用北京博大泰克生物基因技術有限責任公司的“PCR片斷快速膠回收試劑盒”并參照試劑盒說明書回收并純化該目的片段，將其克隆到pMD18-T載體中，對含有回收片斷的重組載體進行測序，結果擴增片斷具有序列表中SEQ ID№2的5’端第289-714位核苷酸序列，擴增序列正確。
3、VEGF-R2靶點基因的克隆根據VEGF-R2靶點基因的核甘酸序列設計PCR擴增引物，并在引物F52、R52兩端分別添加限制性內切酶XhoI和EcoRV識別位點，引物序列如下前段F12 5’-ATTTCGTGGGATAATAAAAAAGGCTTCACTATACCCAGTCATCTAA-3’前段R12 5’-GCTTCACAGAAGACCATGCCTGCGTAGTTGATTAGATGACTGGGTA-3’；前段F22 5’-AGAAAAGGTGTTCGTTCCTGACGGTAAATCCATTTCGTGGGATAAT-3’前段R22 5’-AATAGACTGGTAACTTTCATCATTAATTTTTGCTTCACAGAAGACC-3’；前段F32 5’-ATCTCAATGTATCTCTACATGCGAAATATCCAGAAAAGGTGTTCGT-3’前段R32 5’-TCCTATACCCTACAACGACAACTATGTACATAATAGACTGGTAACT-3’；前段F42 5’-GTGGTGATTCCATGCCTTGGAACTGTGTCAAATCTCAATGTATCTC-3’前段R42 5’-CCATGAGACGGACTCAGAACCACATCATAAATCCTATACCCTACAA-3’；后段F12 5’-GGCTTGATTTCACCTGGCACTCTCCACCTTCAAAGTCTCATCATAA-3’后段R12 5’-AAAGGGTTTCACATCCCGGTTTACAATCTTCTTATGATGAGACTTT-3’；后段F22 5’-AATTGTACAGCGAGAACAGAGCTCAATGTGGGGCTTGATTTCACCT-3’后段R22 5’-TGCTCAAAAACATCTTCGCCACAGTCCCAGGAAAGGGTTTCACATC-3’；后段F32 5’-TGAACTATCTGTTGGAGAAAAGCTTGTCTTAAATTGTACAGCGAGA-3’后段R32 5’-TCACTCTTGGTCACACTTTCTATTGTCAAGGTGCTCAAAAACATCT-3’；后段F42 5’-AGGGATGTTTTCTGAGTCCGTCTCATGGAATTGAACTATCTGTTGG-3’后段R42 5’-CTGGATGCTAGCACAGGTGTATTCCCCTTGGTCACTCTTGGTCACA-3’；
F52 5’-GCCTCGAGGTGGTGATTCCATGCCTTGGAACTG-3’(帶下劃線堿基為限制性內切酶XhoI識別位點)R52 5’-GCGATATCACTGGATGCTGCACAGGTGTATTCC-3’(帶下劃線堿基為限制性內切酶EcoRV識別位點)。
采用中心模板法分五步PCR擴增目的基因，合成模式圖見圖5，將全基因分成前、后兩段，兩片段均用四步PCR合成法獲得目的基因，然后利用PCR方法將前后兩端拼接起來，具體方法如下第一步擴增體系為10×PCR緩沖液5μl，MgCl2(2.5mM)5μl，dNTPs(2.5mM)4μl，上、下游引物(20μM)各1μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)1μl，加去離子水至50μl。PCR反應條件為先94℃預變性5min；然后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共5個循環；最后72℃繼續延伸10min。
第二步、第三步和第四步擴增均以上一步PCR產物稀釋50倍后作模板進行。擴增體系同上，只是引物第二步PCR擴增選用引物和F2，第三步選用引物R3和F3，第四步選用引物R4和F4。PCR反應條件為94℃1min，55℃1min，72℃1min，共30個循環。四次PCR擴增后所得的兩段目的基因，分別命名為前段和后段。
最后一步PCR擴增體系為10×PCR緩沖液5μl，MgCl2(2.5mM)5μl，dNTPs(2.5mM)4μl，合成引物(20μM)F5和R5各1μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)1μl，稀釋50倍后的前段1μl，稀釋50倍后的后段1μl，加去離子水至50μl。PCR反應條件同步驟二至四。五次PCR擴增后，對PCR擴增產物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖6所示(泳道M.DNA相對分子質量標準DL-2000；泳道1-4.前段分步PCR產物；泳道5和6.PCR終產物(498bp)；泳道7-10.后段分步PCR產物)，結果經PCR擴增獲得了長度約為498bp的基因片段(圖6中箭頭所指片段)，與預期結果相符。用北京博大泰克生物基因技術有限責任公司的“PCR片斷快速膠回收試劑盒”并參照試劑盒說明書回收并純化該目的片段，將其克隆到pMD18-T載體中，對含有回收片斷的重組載體進行測序，結果擴增片斷具有序列表中SEQ ID №2的自5’端第715-1212位核苷酸序列，擴增序列正確。
3、多靶點復合抗原ERV基因的克隆利用PCR技術，分五步將上述VEGF-E、VEGF-R2和αVβ3靶點基因連接起來合成ERV融合基因，根據ERV基因的核甘酸序列設計PCR擴增引物，并在引物F13、R33兩端分別添加限制性內切酶XhoI和EcoRV識別位點，引物序列如下F13 5’-GCCTCGAGTGGATGCGTACACTAGACAA-3’(帶下劃線堿基為限制性內切酶XhoI識別位點)R13 5’-CTGTAGGTTGAAGACACAATCACACTTTGT-3’；F23 5’-ACAAAGTGTGATTGTGTCTTCAACCTACAG-3’
R23 5’-ATGGAATCACCACCAAGACGTGCTTATA-3’；F33 5’-TATAAGCACGTCTTGGTGGTGATTCCAT-3’R33 5’-GCGATATCACTGGATGCTGCACAGGTGTATTCC-3’(帶下劃線堿基為限制性內切酶EcoRV識別位點)。
前三步是將VEGF-E、VEGF-R2和αVβ3靶點基因分別加上連接序列，以備連接。PCR擴增體系為10×PCR緩沖液5μl，MgCl2(2.5mM)5μl，dNTPs(2.5mM)4μl，引物(20μM)R13、F13(或R23/F23或R33/F33)各1μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)1μl，VEGF-E靶點基因(或VEGF-R2靶點基因或αVβ3靶點基因)1μl，加去離子水至50μl。PCR反應條件為先94℃預變性5min；然后94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共5個循環；最后72℃繼續延伸10min。
第四步是將VEGF-E和αVβ3靶點基因連接起來，以添加有連接序列的VEGF-E和αVβ3靶點基因的PCR產物稀釋50倍后同時作為模板，在引物R23和F13的引導下進行PCR擴增，PCR擴增體系和反應條件與前三步相同。
第五步是連接形成ERV融合基因，以添加有連接序列的VEGF-R2靶點基因和第四步PCR產物稀釋50倍后同時作為模板，在引物R33和F13的引導下進行PCR擴增，PCR擴增體系和反應條件與前三步相同。五次PCR擴增后，對PCR擴增產物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖7所示(泳道M.DNA相對分子質量標準DL-2000；泳道1.ERV融合基因；泳道2.添加有連接序列的αVβ3靶點基因；泳道3.添加有連接序列的VEGF-E靶點基因；泳道4.添加有連接序列的VEGF-R2靶點基因)，結果經PCR擴增獲得了長度約為1212bp的目的基因片段(見泳道1)，與預期結果相符。用北京博大泰克生物基因技術有限責任公司的“PCR片斷快速膠回收試劑盒”并參照試劑盒說明書回收并純化該目的片段，將其克隆到pMD18-T載體中，對含有回收片斷的重組載體進行測序，結果擴增片斷具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，擴增序列正確。
實施例2、多靶點復合抗原ERV基因真核表達載體的構建及其鑒定一、多靶點復合抗原ERV基因真核表達載體的構建將實施例1擴增的多靶點復合抗原ERV基因用限制性內切酶XhoI和EcoRV進行雙酶切后，與經相同酶雙酶切的載體pCI-GPI[在Promega公司的真核表達質粒pCI-neo+基礎上構建而成。主要是在pCI-neo+原多克隆位點Nhe I和Xba I酶切位點之間插入通用序列構建而成。通用序列的基因順序為5’-NheI-信號肽-XhoI-EcoRV-EcoRI-IgG Fc-GPI-XbaI-3’，外源免疫分子基因可以在NheI-EcoRI之間選擇合適的酶切位點插入。pCI-GPI除含有人IgG Fc段(GenBank號Z17370)和糖基化磷脂酰肌醇GPI(GenBank號XM676434)編碼序列外，還含有pCI載體的主要骨架結構，如CMV早期啟動子、嵌合內含子、Neo篩選標記、SV40增強子和氨芐抗性基因Ampr+等，物理圖譜見圖18]在16℃下連接12-24小時，連接體系為10×T4DNA連接緩沖液1μl，T4DNA連接酶(12u/μl)1μl，ERV基因PCR純化產物4μl，pCI-GPI載體1μl，加滅菌雙蒸水至10μl。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，將轉化細胞涂布于含100mg/mL氨芐青霉素的LB抗性平板上進行篩選。然后挑取在抗性平板上長出的單菌落進行菌落PCR鑒定將單菌落接種于3mL含100mg/mL氨芐青霉素(Amp+)的LB液體培養基中擴大培養3h。培養結束后，取1μl菌液用100μl水稀釋，煮沸10min，12000rpm離心3min，取上清做模板，在引物R33和F13的引導下進行PCR擴增，25μlPCR反應體系為上清5μl，引物F5和R5各1μl，10×PCR緩沖液2.5μl，MgCl22.5μl，dNTPs 0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加滅菌雙蒸水至25μl。PCR反應條件先94℃預變性5分鐘；然后94℃30s，60℃30s，72℃2分鐘，共30個循環；最后72℃延伸10分鐘。反應結束后，對PCR擴增產物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，經PCR擴增可獲得長度約為1212bp的DNA片段的為陽性重組子。提取經PCR鑒定出的陽性重組子的質粒，用測序方法作進一步鑒定，測序結果表明目的基因的序列及在載體中的位置均正確，得到了ERV基因的真核表達載體，命名為pCI-ERV。同時用相同方法將實施例1擴增的VEGF-E、αVβ3和VEGF-R2靶點基因片段也分別連接入載體pCI-GPI中，得到各自的真核表達載體，分別命名為pCI-VEGFE、pCI-αVβ3和pCI-VEGFR2。
二、真核表達質粒的鑒定1、瞬時轉染RenCa細胞將步驟一獲得的分別攜帶有真核表達載體pCI-ERV、pCI-VEGFE、pCI-αVβ3和pCI-VEGFR2的陽性克隆菌接種于LB液體培養基中，在37℃下培養12-24小時，用QIAGEN公司的質粒小量提取試劑盒并參照產品說明書提取質粒，然后用QIAGEN公司的轉染試劑SuperFectTransfection Reagent并參照產品說明書將pCI-ERV、pCI-VEGFE、pCI-αVβ3和pCI-VEGFR2質粒轉染腎癌細胞系RenCa，以pCI-neo(Promega公司)為對照。
2、穩定轉染細胞的篩選將轉染細胞培養約48小時至細胞密度達到50-70％融合時，棄培養液，換用含有G-418(400μg/mL)的RPMI 1640培養基(Gibco公司)進行抗性細胞篩選培養，同時用未轉染的RenCa細胞作對照。當對照細胞幾乎全部死亡時，G-418濃度可降至200μg/mL以維持篩選作用。兩周后，可見有抗性克隆形成，待其逐漸增大后，用0.25％(質量百分濃度)的胰酶將細胞消化下來，用有限稀釋法挑取單克隆并進行擴大培養。
3、穩定轉染細胞的鑒定
1)穩定轉染細胞mRNA的RT-PCR鑒定用0.25％的胰酶將擴大培養的單克隆細胞消化制成單細胞懸液，收集于玻璃離心管中，1000rpm離心5min，棄上清；PBS洗三次后完全吸棄上清；重懸細胞并計數，使細胞的終密度為1×106/mL；取1mL細胞懸液加1mL Trizol混勻，提取細胞總RNA，然后用引物R33和F13對轉染有pCI-ERV質粒的細胞進行RT-PCR鑒定，用引物F5和R5對轉染有pCI-VEGFE質粒的細胞進行RT-PCR鑒定，用引物F51和R51對轉染有pCI-αVβ3質粒的細胞進行RT-PCR鑒定，用引物F52和R52對轉染有pCI-VEGFR2質粒的細胞進行RT-PCR鑒定，鑒定結果如圖8所示(泳道M.DNA相對分子質量標準DL-2000；泳道1.pCI-VEGFE；泳道2.pCI-VEGFR2；泳道3.pCI-αVβ3；泳道4.pCI-ERV)，pCI-VEGFE質粒經擴增均獲得了長度約為288bp的片段，pCI-αVβ3質粒經擴增均獲得了長度約為426bp的片段，pCI-VEGFR2質粒經擴增均獲得了長度約為498bp的片段，pCI-ERV質粒經擴增均獲得了長度約為1212bp的片段，表明VEGF-E、αVβ3和VEGF-R2靶點基因和ERV基因分別在轉染有pCI-VEGFE、pCI-αVβ3、pCI-VEGFR2和pCI-ERV質粒的RenCa細胞中已在mRNA水平上表達。
2)穩定轉染細胞的免疫熒光檢測將步驟1)已鑒定的穩定轉染細胞(以pCI-neo+空載體轉染的RenCa細胞和未轉染的RenCa細胞分別作為陰性對照和空白對照)用0.25％的胰酶消化制備成單細胞懸液；PBS洗3次后，封閉劑(3％BSA)室溫封閉20-30分鐘；去除封閉劑，加入熒光素標記的鼠抗人IgG(購自北京中杉金橋技術有限公司)，4℃避光孵育12-24小時；PBS洗3次，調整細胞濃度至5×105/mL，細胞懸液滴到載玻片上，封片劑(購自北京中杉金橋技術有限公司)封片。檢測結果如圖9所示(1.pCI-VEGFE轉染細胞；2.pCI-VEGFR2轉染細胞；3.pCI-αVβ3轉染細胞；4.pCI-ERV轉染細胞；5.pCI-neo+轉染細胞；6.RenCa細胞)，表明VEGF-E、αVβ3和VEGF-R2靶點基因和ERV基因分別在各自的轉染細胞中獲得表達。
3)穩定轉染細胞的Western Blotting鑒定將步驟2)鑒定的穩定轉染細胞(以pCI-neo+轉染細胞和RenCa細胞為對照)用0.25％胰酶消化，收集細胞，PBS洗滌兩次；用含1％Triton X-100的TBS(50mMTris-Cl，pH7.6，150mM NaCl)裂解細胞30min；4℃、12000rpm離心10min收集上清；對待測樣品進行15％SDS-PAGE電泳分離后，用半干轉移儀將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉移至硝酸纖維素膜(電壓15V，轉移1小時)；用含5％脫脂奶粉的TBST(TBS+0.05％Tween 20)室溫封閉1小時；加入HRP標記的鼠抗人IgG單克隆抗體(購自北京中杉金橋技術有限公司，按1∶500比例稀釋)4℃孵育12-24小時；TBST洗滌后，加入二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(購自北京中杉金橋技術有限公司，按1∶2000比例稀釋)，室溫孵育2小時；TBST洗滌后，用ECL進行曝光顯色。檢測結果如圖10所示(泳道1.pCI-VEGFE轉染細胞；泳道2.pCI-VEGFR2轉染細胞；泳道3.pCI-αV β3轉染細胞；泳道4.pCI-ERV轉染細胞；泳道5.pCI-neo+；泳道6.RenCa細胞)，進一步證明表明VEGF-E、αVβ3和VEGF-R2靶點基因和ERV基因分別在各自的轉染細胞中獲得表達。
實施例3、多靶點復合抗原ERV基因的原核表達一、多靶點復合抗原ERV基因原核表達載體的構建將純化的pCI-ERV和pGEX-4T-2(Pharmacia公司)分別用限制性內切酶Sal I和Not I進行雙酶切，對酶切產物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用北京博大泰克生物基因技術有限責任公司的“PCR片斷快速膠回收試劑盒”并參照試劑盒說明書回收并純化線形化的pGEX-4T-2及1212bp的pCI-ERV的酶切片段，然后將純化的目的片段和線性化pGEX-4T-2載體16℃連接12-24小時，連接體系為10×連接酶緩沖液1μl，T4DNA連接酶1μl，目的基因4μl，pGEX-4T-2載體1μl，用雙蒸水補充反應體系至10μl。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，將轉化細胞涂布于含100mg/mL氨芐青霉素的LB抗性平板上進行篩選，然后挑取在抗性平板上長出的單菌落并在引物R33和F13的引導下進行菌落PCR鑒定，經PCR擴增可獲得長度約為1212bp的DNA片段的為陽性重組子。提取經PCR鑒定出的陽性重組子的質粒，用測序方法作進一步鑒定，測序結果表明目的基因的序列及在載體中的位置均正確，得到了多靶點復合抗原ERV基因的原核表達載體，命名為pGEX-ERV。
二、工程菌的獲得及包涵體的大量制備將pGEX-ERV轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，用與步驟一相同的方法篩選出陽性重組菌株，然后按1∶100的比例將陽性重組菌接種至含100mg/mL氨芐青霉素的1000mL LB液體培養基中在37℃下進行大量培養，培養至對數生長期時加入化學誘導劑IPTG至終濃度為1mmol/L，在37℃下繼續培養12-24小時。培養結束后，4℃、6000rpm離心15min收集菌體，用100mL TE緩沖液(20mmol/L，pH8.0)重懸菌體沉淀，加入溶菌酶(1mg/mL)于室溫磁力攪拌10min；冰浴中超聲波(30s/開，20s/停，15個循環)破碎菌體；4℃、12000rpm離心20min分別收集包涵體沉淀和上清。將包涵體沉淀用1mol/L的NaCl(TE配制)洗滌1次，4℃、12000rpm離心20min以去除包涵體中的雜蛋白，棄上清后再用TE緩沖液洗滌2次，4℃、12000rpm離心20min收集沉淀，用下述步驟進行純化。
三、目的蛋白的純化用8mol/L的脲溶解包涵體，20℃、12000rpm離心10min后添加巰基乙醇至1％(體積百分濃度)；將Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱(購自Pharmacia公司)用6mol/L脲的TE緩沖液平衡后上樣；用6mol/L脲的TE緩沖液洗脫出穿過峰后，用不同濃度(濃度為0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.5M和1M)的NaCl(6mol/L脲的TE緩沖液配制)洗脫，收集相關洗脫峰；每個峰取樣進行SDS-PAGE鑒定，根據電泳結果，將目的蛋白組分再進行S-Sepharose Fast Flow陽離子交換柱和SephardexG-50柱(購自Pharmacia公司)進行純化，最后對經純化的目的蛋白進行SDS-PAGE檢測，結果獲得了經純化的目的蛋白，即多靶點復合抗原ERV。
實施例4、多靶點復合抗原ERV的抑瘤活性檢測一、動物的分組與免疫6周齡Balb/c小鼠分為7組，每組9只。A組為空白對照組；B組為PBS對照組；C組為pCI-neo+空載體組；D-4組為pCI-VEGFR2組；E-2組為pCI-αVβ3組；F-2組為pCI-VEGFE組；G組為pCI-ERV組((pCI-ERV)-R、(pCI-ERV)-V、(pCI-ERV)-E為平行的三組)。
將五種質粒DNA(pCI-neo、pCI-VEGFR2(實施例2構建)、pCI-αVβ3(實施例2構建)、pCI-VEGFE(實施例2構建)、pCI-ERV(實施例2構建))分別與轉染試劑LipofectAMINE按1∶1(m∶v)的比例混合，輕輕振蕩后室溫放置15分鐘，得到LipofectAMINE-質粒DNA復合物，作為免疫用DNA。免疫采用股四頭肌肌肉多點注射，100μg/只首先注射100μl 0.25％布比卡因預處理接種部位，72h后在相同部位初次免疫，分別于第3周和6周各加強免疫1次。
二、血清抗體效價的ELISA檢測每組小鼠于每次免疫后2周經尾靜脈取血，室溫放置3h后3000rpm離心10min，取上層血清用ELISA法檢測抗體滴度，以驗證抗原的體液免疫反應，同時設立免疫前鼠血清的陰性對照和PBS空白對照，ELISA檢測方法如下將實施例3制備的蛋白用包被液稀釋至終濃度為5μg/mL，包被ELISA板，4℃靜置12-24小時；PBST洗滌甩棄ELISA板孔中的包被液，PBST洗滌1次；用2％酪蛋白液室溫封閉4h，棄去封閉液，拍干ELISA板；將免疫鼠血清用PBS倍比稀釋后加入各孔，100ul/孔，37℃靜置30min；用PBST洗滌后加入HRP標記的羊抗鼠IgG(購自北京中杉金橋技術有限公司)，37℃反應20min；PBST洗滌后，用TMB顯色10min，2M硫酸終止反應；最后用SPECTRAIII酶聯儀檢測450nm的OD值。結果判定待測樣品的OD值與陰性對照的OD值之比大于或等于2.1(P/N≥2.1)為陽性，顯示陽性結果的最大抗體稀釋度為免疫小鼠血清的抗體效價。免疫小鼠血清中的抗體效價檢測結果如表1所示，表1免疫小鼠血清中的抗體效價
注※與PBS、pCI-neo+和同種抗原對照組相比，該組小鼠均產生特異性抗體(P＜0.05)※※兩次加強免疫可明顯增強免疫小鼠血清的抗體效價(P＜0.05)與PBS和空載體對照組相比，抗原組(D-4、E-2、F-2、G組)小鼠血清中均產生了較高水平的抗體，兩次加強免疫可明顯增強免疫小鼠血清的抗體效價，此外，本發明的多靶點復合抗原ERV較單靶點抗原更能激發小鼠的體液免疫反應。
三、免疫小鼠的IFN-γ和IL-4的ELISPOT檢測1、免疫小鼠脾淋巴細胞的分離每組免疫小鼠各取三只，無菌分離脾淋巴細胞，方法為斷頸處死小鼠，75％乙醇中滅菌5min，隨即放入超凈臺內成右側臥位；無菌取出脾臟，放于平皿(內裝預冷的8mL無血清RPMI1640培養液)中，盡量剔除脂肪和結締組織，于200目不銹鋼網上用研磨棒輕輕擠壓脾組織；將脾細胞懸液8mL緩慢沿管壁緩慢加入裝有4mL Ficoll淋巴細胞分離液(購自Pharmacia公司)的透明離心管中，2000rpm水平離心20min；小心吸取白膜層，用10mL預冷的培養基洗2次(1000rpm、10min)，將細胞重懸于含20％胎牛血清的RPMI1640培養基中，調整細胞濃度至1×107/mL。
2、免疫小鼠的IFN-γ和IL-4的ELISPOT檢測對步驟1分離的免疫小鼠的脾淋巴細胞用Murine IFN γ和IL-4ELISPOT試劑盒并參照試劑盒說明書進行IFN-γ和IL-4的ELISPOT檢測，檢測結果見表2和圖11所示，表2免疫小鼠IFN-γ和IL-4的ELISPOT檢測
注※與B、C對照組比較，ELISPOT檢測該組小鼠斑點數增多P＜0.05，※※P＜0.01與PBS、空載體對照組相比，抗原組(D-4、E-2、F-2、G組)小鼠脾細胞中分泌IFN-γ和IL-4的T淋巴細胞數量與對照組比均明顯增加，且本發明的多靶點復合抗原ERV較單靶點抗原更能激發小鼠的體液免疫反應。
四、免疫小鼠脾淋巴細胞的T細胞亞群測定取小鼠脾細胞1×106/mL-2×106/mL，PBS洗兩次；分別加入PE標記的抗CD4+mAb和FITC標記的抗CD8+mAb(購自北京晶美生物有限公司)各20ul，混勻后4℃避光反應30min；PBS洗兩次后，加入0.5mL熒光保存液(0.15mol/L PBS，20g/L葡萄糖，10g/L甲醛及1g/L NaN3)重懸細胞，用流式細胞儀分析T細胞亞群，免疫小鼠CD4+和CD8+T細胞數比例的流式細胞儀測定結果如表3和圖12、圖13所示。
表3流式細胞儀測定的免疫小鼠CD4+和CD8+T細胞數的比例
注※與B、C對照組比較，該組小鼠CD4+/CD8+的比值顯著增高P＜0.05，※※P＜0.01與PBS和空載體對照組相比，抗原組(D-4、E-2、F-2、G組)小鼠脾細胞中CD4+/CD8+的比值明顯升高，且本發明的多靶點復合抗原ERV較單靶點抗原更能激發小鼠的體液免疫反應。
五、檢測免疫小鼠對皮下移植瘤攻擊的保護作用末次免疫后一周對各組余下6只免疫小鼠進行皮下移植瘤攻擊。收獲對數生長期的RenCa細胞，制備單細胞懸液，用生理鹽水洗兩次，調整細胞濃度至1×107/mL，于小鼠背部右側皮下接種100μl細胞懸液即1×106/只。皮下移植瘤攻擊后，觀察小鼠移植瘤的生長情況。待腫瘤結節形成后(可捫及，長徑約2-3mm)，記錄每組小鼠的成瘤時間，同時觀察小鼠的存活狀況。于腫瘤細胞攻擊后50天處死小鼠，拍照；用游標卡尺測量腫瘤的垂直長徑(a)和垂直短徑(b)，依照公式計算移植瘤體積；稱取瘤重，依照公式計算腫瘤的抑制率。
各組免疫小鼠皮下移植瘤的平均成瘤時間見表4，皮下移植瘤攻擊后50天各組免疫小鼠的存活情況、在體瘤體積和體外瘤體積見圖17從左到右依次是小鼠存活情況、在體顯示腫瘤體積、離體顯示腫瘤體積)，其中存活率統計結果見表5，瘤體積測量結果見表6和圖14，瘤重測量結果見圖15，各組免疫小鼠的抑腫瘤率統計結果見表7，其中以B組為對照組的各組免疫小鼠的抑腫瘤率統計結果的柱狀圖見圖16，表4各組免疫小鼠皮下移植瘤的平均成瘤時間
注※與B、C對照組比較該組小鼠成瘤潛伏期延長(P＜0.05)表5皮下移植瘤攻擊后50天各組免疫小鼠的存活情況
注※與B、C對照組比較該組小鼠存活率明顯增加(P＜0.05)表6皮下移植瘤攻擊后50天各組免疫小鼠的瘤體積
注※與B、C對照組比較該組小鼠腫瘤體積明顯縮小(P＜0.001)
表7各組免疫小鼠對腫瘤的抑制作用
注※與對照組相比，該組小鼠對腫瘤的抑制作用非常顯著(P＜0.01)；※※P＜0.001免疫小鼠接受皮下移植瘤攻擊后，與PBS和空載體對照組相比，抗原組(D-4、E-2、F-2、G組)小鼠的成瘤時間延長、腫瘤生長緩慢且瘤體積縮小、抑瘤率明顯提高，且本發明的多靶點復合抗原ERV較單靶點抗原的抑瘤效果更加顯著。
序列表<160>2<210>1<211>404<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Trp Met Arg Thr Leu Asp Lys Ser Gly Cys Lys Pro Arg Asp Thr Val1 5 10 15Val Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Pro Glu Ser Thr Asn Leu Gln Tyr Asn20 25 30Pro Arg Cys Val Thr Val Lys Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Asp35 40 45Gly Gln Ile Cys Thr Ala Val Glu Thr Arg Asn Thr Thr Val Thr Val50 55 60Ser Val Thr Gly Val Ser Ser Ser Ser Gly Thr Asn Ser Gly Val Ser65 70 75 80Thr Asn Leu Gln Arg Ile Ser Val Thr Glu His Thr Lys Cys Asp Cys85 90 95Val Phe Asn Leu Gln Val Arg Gln Val Glu Asp Tyr Pro Val Asp Ile100 105 110Tyr Tyr Leu Met Asp Leu Ser Tyr Ser Met Lys Asp Asp Leu Ile Lys115 120 125Ile Gln Thr Leu Gly Thr Ser Leu Ser Glu Arg Met Arg Arg Leu Thr130 135 140Ser Asn Leu Arg Ile Gly Phe Gly Ala Phe Val Asp Lys Pro Met Ser145 150 155 160
Pro Tyr Met Phe Met Ser Pro Pro G1u Val Ile Lys Asn Pro Cys Tyr165 170 175Glu Phe Asn Thr Glu Cys Met Pro Thr Phe Gly Tyr Lys His Val Leu180 185 190Thr Leu Thr Glu Glu Val Leu Arg Phe Asn Glu Glu Val Gln Lys Gln195 200 205Lys Val Ser Arg Asn Arg Asp Ser Pro Glu Gly Gly Phe Asp Ala Val210 215 220Leu Gln Ala Ala Val Cys Asp Glu Lys Ile Gly Trp Arg Asn Val Val225 230 235 240Ile Pro Cvs Leu Gly Thr Val Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu His Ala245 250 255Lys Tyr Pro Glu Lys Val Phe Val Pro Asp Gly Lys Ser Ile Ser Trp260 265 270Asp Asn Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser His Leu Ile Asn Tyr Ala275 280 285Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser290 295 300Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val305 310 315 320Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val325 330 335Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Leu Asp Phe Thr340 345 350Trp His Ser Pro Pro Ser Lys Ser His His Lys Lys Ile Val Asn Arg355 360 365Asp Val Lys Pro Phe Pro Gly Thr Val Ala Lys Met Phe Leu Ser Thr370 375 380Leu Thr Ile Glu Ser Val Thr Lys Ser Asp Gln Gly Glu Tyr Thr Cys385 390 395 400Ala Ala Ser Ser<210>2
<211>1212<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2tggatgcgta cactagacaa aagtggttgt aaacctagag atactgttgt ttatttggga 60gaagaatatc cagaaagcac taacctacaa tataatcccc ggtgcgtaac tgttaaacga 120tgcggcggtt gctgtaacga tgacggtcaa atatgtacag cggttgaaac aagaaataca 180actgtaacag tttcagtaac cggcgtgtct agttcgtctg gtactaatag tggtgtatct 240actaaccttc aaagaacaag tgttacagaa cacacaaagt gcgattgtgt cttcaaccta 300caggtgaggc aagtagaaga ctatcctgtg gatatctact accttatgga cctttcctat 360tccatgaagg atgatttaat caagatccaa accctgggca ctagtttatc agaaaggatg 420cgccggctaa ctagtaacct gcggattgga tttggtgcat ttgttgacaa gcctatgtca 480ccgtacatgt ttatgtcacc tcctgaagtc atcaaaaacc cctgctatga atttaacacc 540gagtgcatgc ccacttttgg atataaacac gtcttgactt tgacagagga agtcttgaga 600tttaacgagg aggtccagaa acagaaggtc tcccgaaacc gggattctcc agagggtgga 660tttgatgcgg tgctacaggc agcagtatgc gacgagaaga ttggctggag aaatgtggtg 720attccatgcc ttggaactgt gtcaaatctc aatgtatctc tacatgcgaa atatccagaa 780aaggtgttcg ttcctgacgg taaatccatt tcgtgggata ataaaaaagg cttcactata 840cccagtcatc taatcaacta cgcaggcatg gtcttctgtg aagcaaaaat taatgatgaa 900agttaccagt ctattatgta catagttgtc gttgtagggt ataggattta tgatgtggtt 960ctgagtccgt ctcatggaat tgaactatct gttggagaaa agcttgtctt aaattgtaca 1020gcgagaacag agctcaatgt ggggcttgat ttcacctggc actctccacc ttcaaagtct 1080catcataaga agattgtaaa ccgggatgtg aaaccctttc ctgggactgt ggcgaagatg 1140tttttgagca ccttgacaat agaaagtgtg accaagagtg accaagggga atacacctgt 1200gcagcatcca gt 121權利要求
1.多靶點復合抗原，具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。
2.編碼權利要求1所述多靶點復合抗原的基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
4.含有權利要求2或3所述的基因的表達載體、轉基因細胞系和宿主菌。
5.一種表達多靶點復合抗原的方法，是將含有權利要求2或3所述多靶點復合抗原基因的重組表達載體導入宿主細胞，表達得到多靶點復合抗原。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于用于構建所述重組表達載體的出發載體為pGEX-4T-2、pET-3a、pET-30a、pET-28a、pET-28b或pET-28c；以pGEX-4T-2為出發載體，構建的含有所述多靶點復合抗原基因的重組表達載體為pGEX-ERV；所述宿主為E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli HB101或E.coli Top10。
7.與權利要求1所述多靶點復合抗原特異結合的抗體。
8.權利要求1所述的多靶點復合抗原在制備預防和/或治療性腫瘤疫苗及藥物中的應用。
9.權利要求2或3所述的多靶點復合抗原基因在制備預防和/或治療性腫瘤DNA疫苗及藥物中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于所述DNA疫苗中的多靶點復合抗原基因存在于真核表達載體中；所述攜帶有多靶點復合抗原基因的真核表達載體為pCI-ERV。
全文摘要
本發明公開了一種抗腫瘤多靶點復合抗原及其編碼基因與應用。其目的是提供一種多靶點復合抗原及其編碼基因與其在制備預防和/或治療性腫瘤疫苗中的應用。該抗原具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。其編碼基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。本發明的多靶點復合抗原及其編碼基因具有顯著的抑瘤效果，且具有表達量高，易純化，生產周期短，生產規模大，成本低的優點，可制備成預防和/或治療性腫瘤藥物及疫苗。本發明在醫學和生物制藥領域具有較大的實際意義和廣闊的應用前景。
文檔編號A61K38/16GK1903881SQ200610089099
公開日2007年1月31日 申請日期2006年8月2日 優先權日2006年8月2日
發明者于繼云, 劉穎, 閻瑾琦, 陳興, 宋曉國, 賈銳, 劉國棟, 王浩 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所