腦損傷治療的靶點和藥物的制作方法

專利名稱：腦損傷治療的靶點和藥物的制作方法
技術領域：
本申請涉及腦損傷治療的靶點和藥物。具體而言，本申請涉及治療腦損傷的TRPC6 靶點，以及通過該靶點治療腦損傷的方法和藥物。
背景技術：
神經退行性疾病是大腦和脊髓的細胞神經元喪失的疾病狀態。大腦和脊髓由神經 元組成，神經元有不同的功能，如控制運動，處理感覺信息，并作出決策。大腦和脊髓的細胞 一般是不會再生的，所以過度的損害可能是毀滅性的，不可逆轉的。神經退行性疾病是由神 經元或其髓鞘的喪失所致，隨著時間的推移而惡化，導致功能障礙。神經退行性疾病按表型 分為兩組一類影響運動，如小腦性共濟失調；一類影響記憶以及相關的癡呆癥。神經退行 性疾病通常包括阿爾茨海默氏病、肌肉萎縮性側索硬化癥、共濟失調毛細血管擴張癥、牛 海綿狀腦病、克雅二氏病、亨廷頓氏病、小腦萎縮癥、多發性硬化癥、帕金森氏病、原發性側 索硬化、和脊髓性肌萎縮癥。因此，如何保護神經元免受各種傷害而喪失對于預防和治療神 經退行性疾病是非常重要的。腦缺血，俗稱中風，是一種由于瞬間腦部血液供應不足而引起腦細胞死亡或者損 傷的病理過程。腦缺血可以分為局灶性腦缺血和全腦缺血，前者是由于腦中部分血管栓 塞或者破裂造成的這部分血管相應的供血區域發生了缺血，多見于腦梗塞或腦溢血等情況 中；而后者多見于溺水或者心肌梗死等情況下的整個腦部血液供應不足。在局灶性腦缺血中，由栓塞血管直接供血的區域，其血流量可以降低到15%以下 甚至更低，這部分組織將發生不可逆的病變和細胞死亡，稱為中心梗塞區；而其間接供血的 區域，由于還有其他側支循環供血，所以血流量下降幅度小于中心區，一般降低到60-80% 以下，這部分組織多發生非功能性的損傷或延遲性細胞死亡，如果及時恢復血流供應或及 時治療，是可以挽救該區域的細胞死亡及組織損傷的；這樣的區域一般稱為半影區。由于半 影區細胞死亡的延遲性及可逆性，科學研究多集中在這個領域，以減少半影區細胞死亡和 最終腦梗塞面積為目的。二十世紀八十年代后期，局灶性腦缺血的動物模型的建立為缺血 性神經元死亡機制的研究提供了良好的平臺。腦缺血過程中，神經元是最敏感且耐受性最低的一類細胞。怎樣保護神經元不受 損傷、不死亡就成了腦缺血研究領域中的一個重要問題。近幾十年來，關于缺血性神經元死 亡機制的研究數不勝數，主要概述為以下幾個方面谷氨酸興奮毒作用，細胞凋亡，炎癥反 應以及離子濃度失衡引起的細胞損傷等。針對以上這些神經元死亡機制，研究人員開發了 很多藥物，以干擾這些破壞型通路的啟動或者進行。然而，在腦缺血的臨床治療、應用方面， 這些策略的效果卻不盡如人意。經典型瞬時受體電勢通道(TransientReceptor Potential channel，簡稱 TRPC 通道)是一類近年來發現的通道蛋白家族，從1995年首次發現至今，人們已經發現TRPC通 道在神經系統、免疫系統、血液循環系統、腎臟、肺臟、脾臟、卵巢和平滑肌等多個系統和組 織器官中均有表達〔“TRPC6與腎臟疾病”，國際病理科學與臨床雜志，2008年10月，第觀卷，第 5 期〕。TRPC 的家族成員(亞基)包括=TRPCU TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、 TRPC7。根據其序列相似性，又可以把 TRPCl, TRPC2, TRPC4、TRPC5 和 TRPC3、TRPC6、TRPC7 分別歸為一組。功能型的TRPC通道分別由這些亞基組成同四聚體或異四聚體，它是一類可 以通透鈣離子的非選擇性陽離子通道。許多細胞的細胞膜上都有TRPC通道的分布，包括神 經元上。近年來的研究表明，TRPC通道參與了很多重要的生理或病理過程，比如神經軸突 生長導向，神經元突觸的發育，肌肉細胞增殖，腎臟疾病，以及小腦顆粒細胞的存活等。TRPC 通道的激活有兩條途徑，其一是膜上G蛋白耦聯受體的激活引起的下游PLC(磷脂酶C)的 激活所介導的；其二是膜上酪氨酸激酶受體所引起的PLC的激活介導的。可見，PLC的活化 是TRPC通道開放所必需的。PLC活化后水解膜上的PIP2 (磷脂酰肌醇4，5- 二磷酸)產生 IP3(肌醇三磷酸)和DAG(二酰甘油)，前者引起內鈣釋放從而激活膜上的某些TRPC通道； 后者則可以直接作用于膜上的某些TRPC通道進而開放通道。目前可用于臨床治療缺血性腦中風(局灶性腦缺血)的藥物僅一種tPA(組織血 纖維蛋白溶酶原活化劑)，該藥物也僅能用于一小部分病例，并且伴有腦出血的風險。因此， 急需新的藥物和理解新的發病機制，發現新的靶點和開發新的藥物。

發明內容
本申請人發現，TRPC6的蛋白水平在缺血后的皮層半影區神經元中特異地下調，這 一過程是由NMDA受體激活引發的鈣蛋白酶(calpain)的蛋白水解作用介導的。阻止TRPC6 的下調，或者上調TRPC6的蛋白水平對于缺血損傷有保護神經元的作用。這些結果提示，在 局部腦缺血過程中，TRPC6對于神經元存活起到關鍵作用；鈣蛋白酶介導的TRPC6的下調促 進了神經元的死亡，加重了缺血造成的腦損傷。因此，本申請涉及一種分離的多肽，選自(i)SEQ ID NO 1 或其包含 SLKAAP 的片段；或(ii)在(i)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有抑制 鈣蛋白酶降解TRPC6的活性的由(i)衍生的多肽。在一個實施例中，所述多肽選自(a)GGSLKAAPGA ；或(b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有抑制 鈣蛋白酶降解TRPC6的活性的由(a)衍生的多肽。在一個實施例中，所述(b)項多肽選自在該(a)項多肽的SLKAAP的左右兩側獨 立延伸0、1、或2個(a)所示的對應位置上的氨基酸殘基的多肽；和在SEQID NO 1的基礎 上，在其中的GGSLKAAPGA的左右兩側獨立延伸0、1、2、3、4、5或6個氨基酸殘基所得到的多肽。在一個實施例中，所述多肽選自(1) RRGGSLKAAPGAGTRR ；或(2)在(1)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有抑制 鈣蛋白酶降解TRPC6的活性的由(1)衍生的多肽。本申請的多肽包括RRGGSLKAAPGAGTRR或其包含SLKAAP的片段。在一個實施例中，所述包含SLKAAP的片段為GGSLKAAPGA。
本申請提供一種分離的多肽，所述多肽含有穿膜因子和本申請所述的多肽。在本申請中，穿膜因子可選自RKKRRQRRR、GffTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKI L, RQIKIffFQNRRMKffKK, RRRRRRR、RRRRRRRRR、RRRRRRRRRRR、GRKKRRQRRRC。在一個實施例中，穿 膜因子為GRKKRRQRRRC。在一個實施例中，本申請的多肽如SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 10所示。本申請提供一種藥物組合物，所述組合物含有本申請的多肽以及藥學上可接受的 載體或賦形劑。本申請的藥物組合物中，本申請的多肽可以是RRGGSLKAAPGAGTRR或其包含 SLKAAP的片段，該多肽可連接于穿膜因子。在一個實施方式中，本申請的藥物組合物含有SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :9和/或 SEQ ID NO :10。本申請還提供含有NMDA受體拈抗劑、TRPC6表達載體和/或TRPC6表達增強劑的 藥物組合物。本申請提供本申請的多肽在制備提高對象TRPC6表達量用的藥物中的用途。所述 多肽包括與或未與穿膜因子連接的多肽。穿膜因子(穿膜肽)是一類能攜帶大分子物質進 入細胞的短肽。本申請包括TRPC6表達載體、鈣蛋白酶的抑制劑、TRPC6增強劑或NMDA受體拈抗 劑在制備保護神經元用的藥物中的用途。在一個實施方式中，所述增強劑選自0AG、或其類似物。本申請包括TRPC6表達載體、鈣蛋白酶的抑制劑、TRPC6增強劑或NMDA受體拈抗 劑在制備治療或預防神經退行性疾病中的用途。在本申請中，神經退行性疾病通常包括阿爾茨海默氏病、肌肉萎縮性側索硬化 癥、共濟失調毛細血管擴張癥、牛海綿狀腦病、克雅二氏病、亨廷頓氏病、小腦萎縮癥、多發 性硬化癥、帕金森氏病、原發性側索硬化、和脊髓性肌萎縮癥。本申請包括TRPC6表達載體、鈣蛋白酶的抑制劑、TRPC6增強劑或NMDA受體拈抗 劑在制備治療或預防缺血引起的損傷用的藥物中的用途。本申請中，損傷包括缺血引起的腦損傷。本申請中，鈣蛋白酶的抑制劑包括與或未與穿膜因子連接的本申請多肽。在具體 實施方式中，所述多肽為RRGGSLKAAPGAGTRR或其包含SLKAAP的片段，或者如SEQ ID NO 4 和9所示。本申請提供一種篩選治療或預防缺血引起的損傷用的藥物的方法，所述方法包 括(1)將待測物質加入含有TRPC6的體系中；(2)向步驟(1)所述的體系中加入鈣蛋白酶，和(3)測定所述待測物質是否能抑制鈣蛋白酶降解TRPC6，其中，將能夠抑制鈣蛋白酶降解TRPC6的物質作為治療或預防缺血引起的損傷用 的候選藥物。本申請還提供一種篩選TRPC6表達增強劑的方法，該方法包括
(1)將待測物質加入表達TRPC6的體系中；和(2)測定該體系中TRPC6的表達量，其中，與未加入待測物質的實驗相比，能使 TRPC6的表達量提高的待測物質確定為TRPC6表達增強劑。另一方面，本申請包括用于維持神經細胞的TRPC6水平以預防或者治療缺血性腦 損傷或腦神經退行性病變的物質。所述物質可選自鈣蛋白酶抑制劑，或TRPC6表達增強劑，或NMDA受體拈抗劑。所述鈣蛋白酶的抑制劑可選自鈣蛋白酶特異性的小干擾RNA，或calpeptin，或包 含SLKAAP序列的多肽。所述多肽的序列可選自SEQ ID NO=I或其片段。本申請中，所述多肽可與跨膜因子相連接。在一些實施方式中，所述多肽的序列如SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 9或SEQ IDNO 10所示。本申請中，所述鈣蛋白酶特異性的小干擾RNA可選自SEQ ID NO 5或SEQ IDNO 6。本申請中，TRPC6表達增強劑可選自TRPC6表達載體、OAG或者OAG的類似物。本申請中，NMDA受體拈抗劑可選自金剛烷胺、地佐環平、SEQ ID NO :7或SEQID NO:8。本申請也包括前述物質的用途，所述用途包括預防或者治療缺血性腦損傷或腦神 經退行性病變。本申請也包括前述物質的用途，所述用途包括制備預防或者治療缺血性腦損傷或 神經退行性病變的藥物或者藥物組合。


圖1顯示TRPC6抗體的特異性。(a)顯示使用抗TRPC6的抗體進行的轉染了 GFP或 WT-TRPC6構建物的HEK293細胞中TRPC6的蛋白免疫印跡。(b)顯示使用抗myc表位的抗 體進行的轉染了 GFP或TRPC6-myc構建物的HEK293細胞中TRPC6的蛋白免疫印跡。(c)顯 示與或不與抗原性肽共培育情況下，使用抗TRPC6的抗體進行的大鼠腦裂解物中的TRPC6 的蛋白免疫印跡。(d)顯示用抗TRPC6的抗體和抗NeuN的抗體在或不在抗原性肽存在下 雙染色的大鼠腦切片的代表性圖。刻度為50μπι。(e)顯示轉染了 TRPC1-HA、TRPC3-Myc、 TRPC4、TRPC5-Flag或TRPC6構建物的HEK293細胞的提取物的免疫印跡分析。TRPC6的抗 體能特異性地識別過表達的TRPC6蛋白，但不能識別過表達的TRPC1、3、4和5蛋白。圖2顯示腦缺血后神經元中的TRPC6特異性下調。(a)顯示使用所示抗體，對照側 (C)或缺血側(I)皮層(aiam假手術組左側皮層(L)或右側皮層(R))提取物的免疫印跡。 微管蛋白(Tubulin)作為蛋白上樣量的對照。(a)的半圖顯示歸一化TRPC6蛋白水平的定 量分析(每個時間點，η = 5-8只大鼠，與Sham相比，Y < 0. 05廣ρ < 0. 01。(b)顯示腦缺 血后，所示時間點TRPC6、3和4蛋白水平的定量分析。在每個時間點，η = 3_5只大鼠，與 Sham相比，*ρ < 0. 05，**ρ < 0. 01。(c)顯示缺血復灌24小時后(R24) TRPC和GluRl的免 疫印跡。右圖顯示蛋白水平定量分析，η = 5只大鼠，與對照側相比，、< 0.01。(d)顯示 采用qRT-PCR測定的TRPC6mRNA水平，η = 3-5只大鼠。(e)顯示缺血復灌M小時(R24)后，用所示抗體雙染色得到的所示皮層的代表圖。刻度為50μπι。右圖顯示定量分析(η = 5只大鼠)；與對照側皮層中的熒光強度相比，**ρ < 0. 01。圖3顯示腦缺血后膠質細胞中TRPC6未下調。圖中顯示，缺血復灌M小時(R24) 后，用抗TRPC6和GFAP的抗體雙染色所得的對照側和缺血側皮層的代表圖。右圖是從所示 區域得到的放大圖。斜向上的兩個箭頭顯示GFAP陽性膠質細胞；水平的兩個箭頭顯示鄰近 的神經元。該圖表明，缺血后神經元中的TRPC6蛋白特異性下調，而膠質細胞中的TRPC6蛋 白水平沒有變化。圖4顯示TRPC6的下調先于缺血性神經元死亡。(a)顯示用TRPC6抗體和TUNEL 標記雙染色，缺血復灌M小時(R24)或48小時(R48)后所示皮層的代表圖。Hoechst標 記細胞核。刻度為50 μ m。(b)顯示在指定時間缺血側皮層或假手術(Sham)中TRPC6蛋 白的定量水平和TUNEL標記的陽性細胞數量；每種情況下，η = 3只大鼠。與Siam相比廣ρ < 0. 05，**ρ < 0· 01。圖5顯示在模擬缺血實驗中神經元中TRPC6的下調。(a)顯示OGD后用所示抗體 進行的培養的皮層神經元提取物的免疫印跡。條帶下的數值為歸一化的蛋白水平(n = 3)。 (b)顯示OGD后在指定時間點神經元中TRPC1、3和6的實時RT-PCR定量mRNA水平。圖6顯示培養的皮層神經元被OAG刺激后產生的電流(IOAG)。(a)培養的皮層神 經元的全細胞記錄(第一條軌跡)和轉染了 TRPC6 RNAi的皮層神經元的記錄(第二條軌 跡)。右圖為電流密度的定量分析結果(每組10個細胞)。右圖插圖顯示分別轉染對照質 粒、隨機RNAi序列TRPC6RNAi的皮層神經元中TRPC6的蛋白水平。0AG(1_油酰基-2-油酰 基-sn-甘油)100 μ M ；SKF96365,10 μ M ；NMDG =N-甲基-D-葡糖胺的無Ca2+溶液。單星號 表示相對對照組而言P < 0. 05。(b)用斜升電壓鉗記錄的代表性電流軌跡，電流軌跡下面 的圖表示這種記錄給電壓的方式，如圖應用了四次從-100V +80V的斜升電壓。100 μ M的 OAG是在第一個斜升電壓之后給藥的。(c)未轉染的皮層神經元(對照組)及轉染了 TRPC6 RNAi的神經元，OAG刺激電流的I-V曲線。圖7顯示OAG刺激對培養的皮層神經元的胞內鈣信號的影響。(a) AR/R描述的由 F340/F380定義的胞內鈣升高及其標準化的基線。圖中直線代表給藥時間。SS即HPSS緩沖 液作為對照，零鈣胞外液的成分為SS+2mM EGTA0 OAG 100 μ M，SKFlO μ Μ。右圖為曲線下面 積定量分析，每組15-25個細胞的數據。雙星號表示相對于SS組或OAG組ρ < 0. 01。(b) 顯性抑制型TRPC6對OAG引起的胞內鈣升高的影響。用100 μ M OAG刺激轉染了對照質粒 或顯性抑制型TRPC6質粒的皮層神經元，檢測其鈣升高。圖中直線代表OAG給藥時間。右 圖為每組曲線下面積定量分析，每組20個細胞的數據。雙星號表示相對對照組ρ < 0.01。圖8顯示氧糖剝奪特異地抑制神經元中OAG刺激的電流。左圖為相應刺激的電流 密度定量分析結果，右圖為在對照或氧糖剝奪的處理下OAG刺激的反轉電位統計結果。單 星號表示相對對照組而言ρ < 0. 05。圖9顯示下調TRPC6會加劇氧糖剝奪導致的神經元死亡。轉染了相應質粒的培養 皮層神經元，經氧糖剝奪處理后復灌M小時，定量統計細胞死亡。(3次試驗)。單星號表 示相對GFP組或對照RNAi組而言ρ < 0. 05，雙星號表示ρ < 0. 01。圖10顯示藥理學方法影響TRPC6對缺血損傷的作用。(a)PI染色顯示的對照 組，OAG(IOOyM)處理組及SKF96365 (10 μ M)處理組，對氧糖剝奪處理引起的細胞死亡的影響。統計數據代表三次獨立的實驗，單星號表示相對對照組而言P <0.05，雙星號表 示ρ <0.01。(b，c)大鼠腦缺血復灌對小時后，腦片的TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑) 染色區域(照片)，及量化的腦梗塞體積(柱狀圖)(b)RM或假手術對照(veh，DMSO 5μΜ/5μ1)或OAG 100πιΜ/5μ 1，每組8-11只大鼠的數據。雙星號表示ρ <0.01。(c)RM 或假手術對照(veh, DMSO 5 μ Μ/5 μ 1)或SKF9636520mM/5 μ 1，每組8-11只大鼠的數據。 雙星號表示P < 0. 01。圖11顯示過表達TRPC6特異地保護氧糖剝奪處理的神經元。(a)轉染了野生型 TRPC6的培養皮層神經元的代表圖及轉染效率的定量分析。用TRPC6的抗體對轉染GFP或 野生型TRPC6的神經元裂解物進行免疫雜交印記的結果。(b) TRPC6而非TRPC3對氧糖剝奪 處理的神經元有保護作用。用氧糖剝奪處理轉染了相應質粒的神經元之后，用PI (碘化丙 啶)染色顯示神經元死亡。插圖為過表達TRPC3的免疫雜交印記圖。統計分析的數據由三 次不同的實驗得來。雙星號表示相對于GFP ρ < 0. 01。圖12顯示環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(CREB)是TRPC6的下游信號分子。(a) 用圖示相應的抗體對轉染GFP或野生型TRPC6的神經元進行免疫雜交印記分析。(b)氧糖 剝奪處理轉染了相應質粒的神經元后，PI染色統計的細胞死亡情況的結果。其中KCREB為 顯性抑制型CREB，每組統計是三次獨立的實驗數據，雙星號表示相對于GFP ρ < 0. 01。圖13顯示TRPC6被鈣離子依賴的蛋白酶降解。(a)將大鼠腦裂解物與鈣離子及如 圖相應的抑制劑共孵育后，用相應抗體做免疫雜交印記。Calp印tin :20μΜ ；亮抑蛋白酶 100 μ M ；PMSF :100 μ M ；EGTA :5mM。右圖為三次獨立實驗的TRPC6蛋白水平的統計結果。雙 星號表示相對于對照P <0.01。(b)左圖為大鼠腦裂解物與ImM鈣離子37攝氏度下共孵育 的TRPC6蛋白降解的時間曲線，右圖為30分鐘內大鼠腦裂解物與相應濃度鈣離子37攝氏 度下共孵育的TRPC6蛋白降解的劑量曲線。(c)將大鼠腦裂解物與鈣離子及如圖相應的抑 制劑或對照組共孵育后，用TRPC6或α -spectrin抗體做免疫雜交印記的結果。Calp印tin 20 μ M ；亮抑蛋白酶100μΜ ;MDL28170(鈣蛋白酶抑制劑 3) 60 μ M ； cpm-VAD-CHO :20μΜ ； Lactacystin(蛋白酶體抑制劑)10μΜ ；和 EGTA :5mM。圖14顯示TRPC6蛋白的K16及A17氨基酸之間被鈣蛋白酶切割。(a)在HEK293 細胞中過表達N-f lag-second loop-HA-C-myc蛋白(如示意圖所示)后將細胞裂解物與相 應濃度的μ-鈣蛋白酶共孵育，用相應的標簽抗體進行免疫雜交印記分析。(b)純化后的 NUS標簽的TRPC6前203個氨基酸的產物用鈣蛋白酶消化后，跑SDS-PAGE膠分離后的考馬 斯亮藍染色圖。箭頭所示為鈣蛋白酶切割下來的22kD小片段，右圖顯示為用Edman N端測 序法，對此片段測序得到的鈣蛋白酶在TRPC6上的切割位點。其下為依據此位點合成的帶 有TAT穿膜序列，且包含此位點的肽段TAT-C6序列，再下為大鼠腦裂解物在30分鐘內與 ImM鈣離子及相應濃度的TAT-C6共孵育后，用相應抗體做免疫雜交印記分析。圖15顯示NMDA受體介導細胞缺血模型中鈣蛋白酶對TRPC6的降解。(a)左圖 在對照(Veh. )，calpeptin(20yM)或MDL28170 (MDL，60 μ Μ)共孵育下，進行氧糖剝奪處理 的皮層神經元裂解物，用TRPC6抗體對其進行免疫雜交印記分析。中圖三次獨立實驗的 TRPC6蛋白水平統計。單星號表示相對對照組而言ρ < 0. 05，雙星號表示ρ < 0. 01。右圖 以上三種處理的氧糖剝奪導致細胞死亡統計，三次獨立實驗，雙星號表示P < 0. 01。(b)對 轉染了對照無義siRNA及轉染兩種鈣蛋白酶的RNAi (CAPNi_l，CAPN i_2)進行鈣蛋白酶蛋白的免疫印記分析。下方圖為三次實驗的鈣蛋白酶蛋白水平統計圖。雙星號表示P <0.01。 右圖兩段鈣蛋白酶的RNAi都可以阻斷氧糖剝奪導致的TRPC6蛋白降解，下圖為TRPC6蛋 白水平統計，三次獨立實驗，雙星號表示P <0.01。(c)在共孵育對照或IOuM地佐環平后 對培養的皮層神經元進行氧糖剝奪處理。細胞裂解物用TRPC6抗體進行免疫雜交印記分 析。(d)對轉染了對照無義siRNA及轉染兩種NMDA受體NRl亞基的RNAi (NRli_l,NRli_2) 進行NRl蛋白的免疫印記分析。下方圖為三次實驗的NRl蛋白水平統計圖。雙星號表示ρ
<0. 01。右圖兩段NRl的RNAi都可以阻斷氧糖剝奪導致的TRPC6蛋白降解，下圖為TRPC6 蛋白水平統計，三次獨立實驗，雙星號表示？ < 0.01。(e)免疫雜交印記實驗顯示，鈣蛋白 酶的抑制劑calp印tin及NMDA受體的抑制劑金剛烷胺都可以阻斷缺血導致的TRPC6蛋白 降解，下圖為TRPC6蛋白水平統計，三次獨立實驗，雙星號表示ρ < 0. 01。圖16顯示TRPC6轉基因小鼠中TRPC6蛋白水平在前腦中特異地上調。(a)用圖示 相應的抗體對轉基因小鼠(tg)或野生型小鼠(wt)的皮層提取物進行免疫雜交印記分析。 下方圖為相應小鼠的基因型鑒定，右圖為TRPC6蛋白水平定量分析。每種基因型三只小鼠， 雙星號表示相對于野生型ρ < 0. Ol0 (b)分別用TRPC6，3，4，5，NR2A, GluR2/3及PSD95的 抗體對來自3個獨立的轉基因建成系的轉基因小鼠(tg)或同窩的野生型小鼠(wt)的皮層 提取物進行免疫雜交印記分析。右圖為相應蛋白水平定量分析。每種基因型三只小鼠，單星 號表示相對于野生型P < 0. 05。(c)用TRPC6抗體對轉基因小鼠(tg)或野生型小鼠(wt) 的腦冰凍切片進行免疫組織化學分析。下方圖為不同腦區。CTX皮層，HIP海馬，CBM小腦。 比例尺為200微米。圖17顯示提高TRPC6蛋白水平可降低小鼠腦缺血損傷。左圖對相應基因型小鼠 進行局灶腦缺血后的TTC染色腦片照片及腦梗塞體積統計(柱狀圖)，每種基因型14只小 鼠，雙星號表示相對于野生型P <0.01。右圖腦缺血后轉基因及野生型小鼠的生存率。每 種基因型14只小鼠。圖18顯示轉基因及野生型小鼠的腦血管情況代表組化圖。轉基因及野生型小鼠 腦的冠狀切片，用血管內皮細胞特異的蛋白CD31的抗體做組化，Hoechst染細胞核。比例 尺為50微米。右圖為缺血后轉基因及野生型小鼠的腦血流量分析。雙星號表示相對于缺 血0分鐘時ρ < 0. 01。圖19顯示TRPC6蛋白量與缺血造成的細胞死亡負相關。左圖用TRPC6抗體及 TUNEL染色對缺血側皮層半影區進行的免疫組化雙標代表圖。Hoechst染細胞核。比例尺 50微米。右圖TRPC6的免疫熒光強度及TUNEL標記的陽性細胞數的統計結果，每組三只小 鼠的數據，雙星號表示相對于野生Sp < 0.01。圖20顯示，(a)用TRPC6的抗體對缺血或假手術的小鼠皮層提取物進行免疫 雜交印記實驗，右圖為統計結果，每組6只小鼠，雙星號表示相對于假手術(轉基因型)ρ
<0. 01。(b，c)缺血或假手術后的野生型或轉基因型小鼠的皮層提取物，分別用P-CREB， CREB, P-CaMKII α，CaMKII α及NOSl的抗體進行免疫雜交印記分析。右圖為p-CREB/ CREB，p-CaMKII α/CaMKII α的蛋白水平比值，及NOSl的相對蛋白水平。單星號表示ρ
<0. 05，雙星號表示相對于相應組ρ <0.01。圖21顯示抑制鈣蛋白酶對TRPC6的降解可降低大鼠腦缺血損傷。對側腦室注射 對照肽或TAT-C6的大鼠進行局灶腦缺血或假手術，左圖用TRPC6及spectrin抗體對其腦組織提取物進行免疫雜交印記實驗，下方圖為TRPC6蛋白水平統計分析，每組三只大鼠，單 星號表示相對于對照ρ < 0. 05。右圖TTC染色腦片照片及腦梗塞體積(柱狀圖)。缺血 前大鼠側腦室注射對照(Veh.)，對照TAT-肽(TAT-ctrl)或TAT-C6肽(TAT-C6)。單星號 表示相對于對照ρ < 0. 05。圖22顯示TTC染色腦片及損傷體積(柱狀圖)。側腦室注射對照TAT-肽 (TAT-empty)或 TAT-C6-2 肽(TAT-C6-2)。單星號表示相對于對照 ρ < 0. 05。圖23顯示TTC染色腦片照片及損傷體積(柱狀圖)。側腦室注射對照TAT-肽 (TAT-empty)或 TAT-C6-3 肽(TAT-C6-3)。單星號表示相對于對照 ρ < 0. 05。圖M顯示腹腔注射TAT-C6改善老年性癡呆模型老鼠的學習和記憶能力。附圖中，“control”和“Ctrl”指對照，“Tubulin”指微管蛋白，“Noinh. (No Ca2+)，， 指“無抑制劑(無Ca2+)，，，“ No inh. ”指“無抑制劑”，“Veh. ”指“載體”(例如蒸餾水)。 “TAT-empty” 指的是 TAT，“nai+ve，，指“未經實驗的”，"scrambIeRNAi"為“對照無義 RNAi ”。
具體實施例方式如本說明書中和權利要求中使用的，單數形式“一”、“一個”、“該”包括復數參考， 除非內容明顯說明。因此，“一多肽”的應用包括兩個或多個多肽的混合物等。文中使用了下列氨基酸縮寫丙氨酸=Ala(A)精氨酸Arg(R)
天冬酰胺=Asn(N)天冬氨酉I =Asp (D)
半胱氨5脧=Cys(C)谷氨酰胺=Glr^Q)
谷氨酸=Glu(E)甘氨酸:Gln(Q)
組氨酸=His(H)異亮氨酸IMI)
亮氨酸:Leu(L)賴氨酸= Lys(K)
甲硫氨5脧:Met(M)苯丙氨酸 The (F)
脯氨酸:Pro (P)絲氨酸= Ser(S)
蘇氨酸:Thr(T)色氨酸:Trp (W)
酪氨酸= Tyr(Y)纈氨酸:Val(V)
術語“多肽”和“蛋白質’指氨基酸殘基的聚合物，并不限于產物的最小長度
此，肽、寡肽、二聚物、多聚物等都包括在該定義中。全長的蛋白質及其片段包括在該定義 中。該術語還包括多肽的表達后修飾，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。另外，為了本申請的 目的，“多肽”指包括天然序列的修飾，例如缺失、添加和取代(通常性質保守)，只要蛋白質 維持所需活性。這些修飾可以通過定點誘變設計，或可以是偶然的，例如通過產生蛋白質的 宿主突變，或由于PCR擴增引起的錯誤。術語“類似物”指具有天然多肽序列和結構，以及相對于天然分子的一個或多個氨 基酸添加、取代(通常性質保守)和/或缺失的化合物，只要修飾不破壞衍生該類似物的原 始多肽的活性。制備多肽類似物和突變蛋白的方法是本領域已知的，如下進一步所述。特別優選的類似物包括性質上保守的取代，即這些取代發生在與它們的側鏈有 關的一類氨基酸中。具體而言，氨基酸一般被分成四類(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸； (2)堿性——賴氨酸、精氨酸、組氨酸；C3)非極性——丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)無電荷的極性——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、 半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。有時將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸歸為芳族氨基酸。例 如，有理由預測單獨用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用絲氨酸 取代蘇氨酸，或者用結構上相關的氨基酸取代類似的保守的氨基酸，這樣的取代將不會對 生物活性有重要影響。例如，感興趣的多肽可包括多達約2-6個保守的或不保守的氨基酸 取代，甚至多達約5-10個保守的或不保守的氨基酸取代，或2-10之間任何整數，只要該分 子的所需功能仍維持完整。本領域的熟練技術人員可結合本領域熟知的Hopp/Woods和 Kyte-Doolittle曲線圖，容易地測定感興趣的分子中可耐受改變的區域。可用“相同性”或“同源性”來限定本申請的多肽或核苷酸序列。“相同性”或“同源 性”指兩條多核苷酸或多肽序列上準確的核苷酸對核苷酸或者氨基酸對氨基酸對應。通過 排列兩個分子的序列直接比較它們的序列信息，計算兩條排列的序列間匹配的準確數量， 將其除以最短序列的長度，然后乘以100，從而可得到相同性百分數。在同源性和相同性分析中可輔助使用易于獲得的計算機程序，如ALIGH、Dayh0fT、 Μ. 0. (Atlas of Protein Sequence and Structure^ M. 0. Dayhoff 編 輯，5Suppl.，3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC)，它適用于 Smith 和 Waterman 分析肽用的局部同源性算法(Advances in App 1. Math.，2 =482-489,1981)。 可從 Wisconsin Sequence Analysis Package (第 8 版，從 Genetics Computer Group, Madison, WI獲得)獲得測定核苷酸序列同源性的程序，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程 序，這些程序也依賴于Smith和Waterman算法。使用制造者建議的和上述Wisconsin Sequence Analysis Package所述的默認參數可容易地使用這些程序。例如，可使用Smith 和Warerman的同源性算法的默認計分表和6個核苷酸位置的間隔罰分(gap penalty)測 定的核苷酸序列與參比序列的同源性百分數。本申請建立同源性百分數的另一方法是使用版權屬于愛丁堡大學、由John F. Collins 禾口 Shane S. Sturrok 開發、由 IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA)發行 的MPSRCH程序包。Smith-Waterman算法可在這套程序包中使用，其中，在計分表中使用默 認參數(例如，間隔開放罰分=12，間隔延伸罰分=1，間隔=6)。從這批數據產生的“匹 配”值反映出“序列同源性”。計算序列間的相同性百分數或相似性百分數的其它合適的 程序在本領域中一般都是已知的，例如，另一種排列程序是BLAST，使用默認參數。例如，可 使用下述默認參數的BLASTN和BLASTP 基因編碼=標準；過濾=無；鏈=兩；截留=60 ； 期望值=10 ；矩陣=BL0SUM62 ；描述=50個序列；排序=HIGH SCORE ；數據庫=無冗余， GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS 翻譯 +Swiss 蛋白 +Spupdate+PIR。在 http://www. ncbi. nim. gov/cgi-bin/BLAST網址上可查到這些程序的詳細描述。或者，在同源區域之間形成穩定的雙鏈的條件下進行多核苷酸雜交，接著用單鏈 特異性核酸酶消化，然后測定消化的片段的大小，從而測出同源性。在如(對具體的體系所 定義的)嚴格條件下進行的Southern雜交試驗中，可鑒別基本同源的DNA序列。確定適當 的雜交條件在本領域熟練技術人員所掌握的知識之內。例如，參見Sambrook等，同上；DNA Cloning,同上；Nucleic Acid Hybridization,同上。本申請優選與本申請多肽具有90%以上、95%以上、96%以上、98%以上或者 99%以上序列相同性、并保留本文所述治療或預防活性或者保留抑制鈣蛋白酶降解TRPC6的活性的多肽。可采用各種方法制備本申請的多肽。例如，可采用常規的化學合成法或者重組表 達法制備。本申請分離的多肽序列以MSQSPRFVTRRGGSLKAAPGAGTRRNESQD(SEQID NO :1，見圖 14b)為基礎，包括此序列及其含有SLKAAP的片段。術語“含有SLKAAP的片段”是指在SEQ ID NO 1的氨基酸序列的左右兩側獨立截短任意數量的氨基酸、但仍保留SLKAAP序列所得 的序列。所述片段仍保留抑制鈣蛋白酶降解TRPC6的活性。所述任意數量對于左側而言指 1-13間的整數，而對于右側而言指1-11之間的整數，其中，最短的片段可為SLKAAP。本申 請也包括上述多肽及其片段的保守性取代產物，尤其是上述多肽或片段中的一個或幾個氨 基酸殘基被性質上相同的氨基酸殘基所取代(見前文所述)，同時保守取代所得的氨基酸 序列仍保留了抑制鈣蛋白酶降解TRPC6的活性。本申請分離的多肽可選自(a)GGSLKAAPGA ；或(b)在(a)中的氨基酸序列經過取 代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有抑制鈣蛋白酶降解TRPC6的活性的由(a)衍生的多肽。上述(b)項的多肽包括但不限于在上述(a)的SLKAAP的左右兩側獨立地延伸0、1 或2個(a)所示的對應位置上的氨基酸殘基的多肽，和在SEQ ID NO 1的基礎上，在其中的 GGSLKAAPGA的左右兩側獨立延伸0、1、2、3、4、5或6個氨基酸殘基所得到的多肽。例如，當 在SLKAAP的左右兩側各延伸一個氨基酸殘基時，所述序列為GSLKAAPG ；當在SLKAAPGAGTR 的左右兩側各延伸兩個氨基酸殘基時，所述序列為GGSLKAAPGAGTRRN ；當SLKAAPGAGTR的左 側延伸6個氨基酸殘基、右側延伸4個氨基酸時，所述序列為VTRRGGSLKAAPGAGTRRNES ；以 此類推。本申請也包括這些氨基酸序列的保守取代產物，尤其是上述多肽中的一個或幾個 氨基酸殘基被性質上相同的氨基酸殘基所取代(見前文所述)，同時保守取代所得的氨基 酸序列仍保留了抑制鈣蛋白酶降解TRPC6的活性。本申請還提供一種分離的多肽，選自(c)RRGGSLKAAPGAGTRR ；或(d)在(c)中的 氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有抑制鈣蛋白酶降解TRPC6的活 性的由(c)衍生的多肽。上述(d)項的多肽包括但不限于在上述(c)項序列兩側獨立減少0、1、2、3或4個 氨基酸殘基所得的多肽；和在SEQ ID NO 1的基礎上，在其中的RRGGSLKAAPGAGTRR的左右 兩側獨立延伸0、1、2、3、4、5或6個氨基酸殘基所得到的多肽。例如，當僅在(c)項序列左 側延伸一個氨基酸殘基時，所述序列為TRRGGSLKAAPGAGTRR ；當在(c)項序列兩側各延伸2 個氨基酸殘基時，所述序列為VTRRGGSLKAAPGAGTRRNE ；依次類推。本申請也包括這些氨基 酸序列的保守取代產物，尤其是上述多肽中的一個或幾個氨基酸殘基被性質上相同的氨基 酸殘基所取代(見前文所述)，同時保守取代所得的氨基酸序列仍保留了抑制鈣蛋白酶降 解TRPC6的活性。在一個實施方式中，本申請包括分離的CRRGGSLKAAPGAGTRR。如前所述， C和T均屬性質上相近似的氨基酸，其替換不會影響到所得多肽抑制鈣蛋白酶降解TRPC6的 活性。在一個具體實施方式
中，本申請提供一種分離的多肽，所述多肽選自 RRGGSLKAAPGAGTRR及其含SLKAAP的片段。在一個具體實施例中，所述含SLKAAP的片段為 GGSLKAAPGA。
本申請也提供一種肽序列，該序列包含SLKAAP，并具有抑制鈣蛋白酶降解TRPC6 的活性。在一個實施例中，該肽序列的氨基酸殘基數量為6-30個，例如，可以為6-25個、 6-20個、6-16個、6-10個等。在一實施例中，包含SLKAAP的序列為SEQ ID N0:1或其片段。 在另一實施例中，包含SLKAAP的序列為RRGGSLKAAPGAGTRR或其片段。在另一實施例中，包 含SLKAAP的序列為GGSLKAAPGA或其片段。前述附圖14b 所示 TRPC6 為 MSQSPRFVTRRGGSLK ^APO^ GTRRNESQD,前述可在 SLKAAP、(a)項序列、(c)項序列和(e)項序列兩側獨立延伸或減少的氨基酸殘基及其所處 位置與此TRPC6序列一一相對應。所述一一對應意指，例如，當延伸氨基酸殘基時，所延伸 的氨基酸殘基為從基礎序列(即SLKAAP、(a)項序列、(c)項序列和(e)項序列)兩側的最 后一個氨基酸殘基起分別外推至指定數量的氨基酸殘基，如當延伸2個氨基酸殘基時，則 從基礎序列兩側的最后一個氨基酸殘基起算按順序外推2個氨基酸殘基，所延伸的氨基酸 殘基與圖14b的TRPC6中對應的氨基酸位置的氨基酸殘基相同。當減少氨基酸殘基時，是 指從基礎序列的兩側的第一個氨基酸開始減少指定數量的氨基酸殘基。在一具體實施方式
中，本申請優選下述氨基酸序列SLKAAP、SLKAAPGAGTR、 GSLKAAPGAGTR、GGSLKAAPGAGTR、RGGSLKAAPGAGTR、RRGGSLKAAPGAGTR、RRGGSLKAAPGAGTRR、 TRRGGSLKAAPGAGTR、VTRRGGSLKAAPGAGTR、SLKAAPGAGTRR、SLKAAPGAGTRRN、SLKAAPGAGTRRNE、 GSLKAAPGAGTRR、 GGSLKAAPGAGTRR、 RGGSLKAAPGAGTRR、 TRRGGSLKAAPGAGTRR、 CRRGGSLKAAPGAGTRR、VCRRGGSLKAAPGAGTRR、FVCRRGGSLKAAPGAGTRRN、GGSLKAAPGA 等。本申請的分離的多肽可與穿膜因子連接，以便于穿過細胞膜。穿膜因子 指長度小于約30個氨基酸、能穿過細胞膜并能將其所攜帶的各種物質帶入細胞 中的多肽。本領域已知的各種穿膜因子可用于本申請，包括但不限于RKKRRQRRR、 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL、RQIKIffFQNRRMKffKK, RRRRRRR、RRRRRRRRR、RRRRRRRRRRR、 GRKKRRQRRRC等。本申請分離的多肽可直接與穿膜因子連接。可采用本領域各種已知的方 法制備與穿膜因子連接的本申請多肽，例如，采用常規的化學合成法來制備。本申請提供一種藥物組合物，所述組合物含有本申請的分離多肽以及藥學上可接 受的運載體或賦形劑。在一個實施方式中，所述多肽連接于穿膜因子。本申請還提供一種藥物組合物，該組合物含有TRPC6表達增強劑和藥學上可接受 的運載體或賦形劑。TRPC6表達增強劑指能提高TRPC6的表達量的物質。表達增強劑包括 TRPC6表達載體、OAG或其類似物。本申請還提供一種藥物組合物，該組合物含有NMDA受體的抑制劑和藥學上可接 受的運載體或賦形劑。本申請中，NMDA受體拈抗劑可選自地佐環平(MK801，Sigma公司)、 金剛烷胺(memantine)等。本申請還提供一種藥物組合物，該組合物含有TRPC6表達載體。在一個實施例中， 所述表達載體是CaMKII α啟動子驅使的表達載體。可采用各種常規的技術手段給予對象 所述表達載體，例如，轉染技術等。本申請還提供一種藥物組合物，該組合物含有鈣蛋白酶的抑制劑和藥學上可接受 的運載體或賦形劑。所述抑制劑為本申請的多肽、calp印tin、亮抑蛋白酶、或MDL28170或 其任意組合。所述多肽可連接于穿膜因子。本申請藥物組合物中還含有溶于或分散于藥學上可接受的運載體或賦形劑中的短語“藥學上可接受的”是指當用于動物時，例如人，不會產生副作 用、過敏或其它不良反應的分子實體和組合物。通過本文所公開的內容，本領域技術人員將 會知道含有至少一種多肽、在某些實施方式中還含有一種或多種其它活性成分的藥物組合 物的制備，例如見《雷明頓藥物科學》第18版，Mack PrintingCompany, 1990(納入本文參考 文獻)。另外，對動物(如人)給藥，可以理解的是制品應符合無菌、無致熱原，總體安全和 純度標準。本文使用的“藥學上可接受的運載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質、包衣劑、 表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(如抗菌劑，抗真菌劑)、等滲劑、吸收延緩劑、鹽類、防腐劑、 藥物、藥物穩定劑、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、增甜劑、調味劑、染料等物質和它們的 組合，這是本領域普通技術人員知道的(見例如，《雷明頓藥物科學》第18版，Mack Printing Company, 1990，1289-1329頁，納入本文參考文獻)。除了與活性成分不相容的常規運載體 外，認為均可用于治療或藥物組合物中。給予患病動物本申請組合物的實際劑量由物理和生理因素，如體重、疾病嚴重性、 待治療疾病的類型、原有和共同的治療措施、受試者的特發病和給藥途徑所決定。負責給藥 的醫生將決定組合物中活性成分的濃度和受試者個體的合適劑量。某些實施方式中，藥物組合物可含有，例如至少約0.001重量％的活性成分。在其 它實施方式中，藥物組合物可含有例如0. 01-99. 9重量％、0. 01-50重量％、0. 01-10重量％ 等的本申請多肽。在一個具體實施方式
中，給予的藥物組合物中多肽的濃度可為0. 01-5mM， 例如0. 01-3mM、0. 05-lmM。給藥的方式是常規的，可由臨床醫師根據患者的具體情況來確 定。例如，可直接注射入側腦室或蛛網膜下腔。或者，也可以腹腔注射給藥。本申請藥物組合物可含有各種抗氧化劑以防止一種或多種組分的氧化。此外可 用防腐劑來預防微生物的作用，如各種抗菌和抗真菌劑，包括但不僅限于對羥基苯丙酸酯 (如甲基對羥基苯丙酸酯、丙基對羥基苯丙酸酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其組合。治療性多肽可配制成游離堿、中性或鹽形式的組合物。藥學上可接受的鹽包括酸 加成鹽，如與蛋白質組分的游離氨基形成的鹽，或與無機酸，如鹽酸或磷酸，或有機酸如乙 酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可衍生自無機堿，如氫氧化鈉、 鉀、銨、鈣或鐵；或有機堿如異丙胺、三甲基胺、組胺或普魯卡因。在該組合物是液體形式的實施方式中，運載體可以是溶劑或分散介質，包括但不 限于水、多元醇(如甘油、丙烯二醇、液態聚乙二醇等)、脂質(如甘油三酯、植物油、脂質 體)和它們的組合。例如，可通過采用包衣如卵磷酯；通過用運載體如液體多元醇或脂分散 維持所需顆粒大小；用表面活性劑如羥丙基纖維素；或這些方法的組合來維持適當的流動 性。許多情況下，優選包含等滲劑如糖、氯化鈉或其組合。可采用本領域常規的方法配置本申請的藥物組合物。該組合物在制備和貯存條件下必須穩定，防止微生物如細菌和真菌的污染。需知 應將內毒素的污染控制到最低，處在安全水平內，例如低于0. 5ng/mg蛋白質。本申請包括本申請藥物組合物在制備提高對象的TRPC6表達量用的藥物中的用 途。本申請也包括鈣蛋白酶的抑制劑在制備提高對象的TRPC6表達量用的藥物中的 用途。
本申請中，鈣蛋白酶的抑制劑包括本申請的多肽、鈣蛋白酶特異性的小干擾RNA、 calp印tin、亮抑蛋白酶(Ieup印tin)、或MDL28170或其任意組合。所述多肽可連接于穿膜 因子。鈣蛋白酶特異性的小干擾RNA可選自SEQ ID NO :5或SEQ IDNO :6，或其組合。本申請也包括TRPC6增強劑在制備提高對象的TRPC6表達量用的藥物中的用途。 增強劑包括0AG、其類似物或其任意組合。本申請包括NMDA受體拈抗劑在制備提高對象的 TRPC6表達量用的藥物中的用途。NMDA受體拈抗劑包括金剛烷胺(memantine)、地佐環平、 SEQ ID NO :7、或SEQ ID N0:8等。本申請包括TRPC6表達載體在制備提高對象的TRPC6表 達量用的藥物中的用途。本申請當然也包括TRPC6表達載體本身。在一個具體實施方式
中，所述表達載體 是CaMKII α啟動子驅使的表達載體。本申請涉及本申請多肽在制備治療或預防缺血引起的損傷用的藥物中的用途。所 述多肽可與穿膜因子相連。所述損傷包括腦缺血造成的腦損傷。本申請多肽也可用于制備治療或預防鈣蛋白酶和TRPC6介導的各種疾病用的藥 物，通過抑制鈣蛋白酶降解TRPC6而實現治療或預防目的。所述疾病包括缺血造成的損傷 以及各種神經退行性疾病。本申請多肽可用于制備保護神經元免受傷害的藥物。所述傷害可由各種原因引 起，包括由缺血引起的傷害等。本申請多肽可用于制備治療或預防各種神經退行性疾病用的藥物。本文中，神經退行性疾病包括阿爾茨海默氏病、肌肉萎縮性側索硬化癥、共濟失調 毛細血管擴張癥、牛海綿狀腦病、克雅二氏病、亨廷頓氏病、小腦萎縮癥、多發性硬化癥、帕 金森氏病、原發性側索硬化、和脊髓性肌萎縮癥。因此，本申請還包括治療或預防缺血引起的損傷的方法，該方法包括提高有此需 要的對象的TRPC6的表達。本申請還包括治療或預防神經退行性疾病的方法，該方法包括提高有此需要的對 象的TRPC6的表達。本申請還包括保護神經元免受傷害的方法，所述方法包括提高有此需要的對象的 TRPC6的表達。提高對象中TRPC6表達的方法包括(1)給予對象鈣蛋白酶的抑制劑以抑制該酶 對TRPC6表達的降解；(2)提供NMDA受體拈抗劑；(3)提供TRPC6表達載體；和/或⑷提 供TRPC6表達增強劑。給予對象鈣蛋白酶的抑制劑包括給予對象本申請的多肽、鈣蛋白酶特異性的小干 擾RNA、calp印tin、亮抑蛋白酶、或MDL28170或其任意組合。所述多肽可連接于穿膜因子。 增強劑包括0AG、其類似物或其任意組合。NMDA受體拈抗劑包括金剛烷胺和地佐環平等。本申請也包括一種提高患病對象中TRPC6表達的方法。本申請還包括治療或預防鈣蛋白酶和TRPC6介導的各種疾病的方法，所述方法包 括向有此需要的對象給予本申請的多肽，通過抑制鈣蛋白酶降解TRPC6而實現所述治療或 預防目的。本文中，對象包括各種哺乳動物，尤其是人。本申請提供一種篩選治療或預防缺血引起的損傷用的藥物的方法，所述方法包括(1)將待測物質加入含有TRPC6或表達TRPC6的體系中；(2)向步驟(1)所述的體系中加入鈣蛋白酶；(3)測定所述待測物質是否能抑制鈣蛋白酶降解TRPC6，其中，將能夠抑制鈣蛋白酶降解TRPC6的物質作為治療或預防缺血引起的損傷用 的候選藥物。所述方法還包括，測試該候選藥物是否影響到鈣蛋白酶除降解TRPC6之外的其它 活性，其中，沒有影響到鈣蛋白酶的其它活性的候選藥物是優選的藥物。所述方法還包括，進一步將測得的優選的藥物進行體內實驗。本申請還涉及一種篩選TRPC6表達增強劑的方法，該方法包括(1)將待測物質加入表達TRPC6的體系中；和(2)測定該體系中TRPC6的表達量，其中，與未加入待測物質的實驗相比，能使 TRPC6的表達量提高的待測物質確定為TRPC6表達增強劑。所述的表達TRPC6的體系例如可以是細胞(或細胞培養物)體系，所述的細胞可 以是內源性表達TRPC6的細胞；或可以是重組表達TRPC6的細胞。所述的表達TRPC6的體 系還可以是(但不限于)亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系(如動物 模型)等。所述含有TRPC6的體系可以是例如含有TRPC6的溶液體系。本文所用的術語“治療有效量”指治療劑治療、緩解或預防目標疾病或狀況的量， 或是表現出可檢測的治療或預防效果的量。本領域技術人員能夠采用常規的方法評估一治 療是否達到所需的治療目的。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發 明而不用于限制本發明的范圍。本發明的實施除非另外說明，將使用本領域技術人員已知 的化學、生物化學、重組DNA技術和免疫學的常規方法。這些技術在文獻中有完整的解釋。 參見，如《基礎病毒學》(Fundamental Virology)，第二版，第I和II卷(B. N. Fields和 D.M. Knipe 編)；《實驗免疫學手冊》(Handbook of Experimental Immunology)，第 I-IV 卷 (D. Μ. Weir 禾口 C. C. Blackwell 編，Blackwell ScientificPublications) ；Τ. Ε. Creighton, 〈〈蛋白質結構禾口 分子特性〉〉(Proteins Structures andMolecular properties) (W. H. Freeman and Company, 1993) ；A. L Lehninger，《生物化學》(Biochemistry) (Worth Publishers, Inc.最新版)；Sambrook 等，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning :a Laboratory Manual)，第二版，1989 ；《酶學方法》(Methods in Engymology) (S. Colowick禾口 N. Kaplan編，Academic Press, Inc. ) 0除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。對 于未指明來源的試劑，使用的是通常從市場上購得的常規試劑。
具體實施例1.實驗材料和方法1.1腦缺血動物模型大鼠(雄性SD大鼠，體重250480克)或小鼠(雄性C57BL6品系小鼠，體重 25-30克)用10%的水合氯醛麻醉，然后切開頸部皮膚，分離出頸總動脈(CCA)和頸外動脈 (ECA)，在ECA兩端結扎然后剪小口，將栓線由此插入，扎好栓線和血管以后再放開靠近CCA端的結扎線，將栓線推入CCA并且往上推入ICA直至有輕微阻感即可。實驗中，大鼠缺血2 小時，小鼠缺血3小時以后，將栓線退出，恢復灌流(復灌)。在復灌不同時間后，將老鼠腦 取出，間隔2mm (大鼠)或間隔Imm (小鼠)切片，然后將腦切片在2 % 2，3，5-三苯基四唑氯 化物(TTC，在0.9%生理鹽水中)中染色以確定梗塞區域的大小。側腦室注射藥物的時候，利用stoelting公司的立體定位儀固定大鼠，根據腦圖 譜定位，將藥物(5ul)用微量注射泵(microsyringe pump, Stoelting Co.)按 0. 5 μ 1/min 的速度注入側腦室，注射完畢留針lOmin，然后再縫合。1.2蛋白免疫印跡和免疫組織化學細胞或組織在裂解液(以mM 計，IOTris-Cl，pH 7. 4，150NaCl, 5EDTA, 1 % Triton-XlOO, 1原釩酸鈉，50NaF，IPMSF, 1抑酶肽，1亮抑酶肽和5DTT)中進行勻漿裂解，將 勻漿液在13000rpm，4度，離心15分鐘，分離后取上清液。用分光光度計測定樣品蛋白濃 度并調整至相同濃度。加入上樣緩沖液，混勻后在95度加熱5 8分鐘，使蛋白變性后， 經過蛋白質SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉至硝酸纖維素膜，用5%的脫脂牛奶在室溫封 閉1個小時，用抗體稀釋液(5% BSA+0. 05% NaN3+PBS)稀釋一抗到合適濃度(1 200 1 2000)，用稀釋過的一抗雜交過夜，PBS洗3次后(3*10分鐘)，用抗體稀釋液稀釋HRP 連接的羊抗兔(鼠)二抗，室溫孵育2小時。PBS洗3次后(3*10分鐘)，ECL曝光顯影。 Western-blot的條帶灰度經過膠片掃描后用軟件ImageQuant(Amersham)統計分析。免疫組化實驗中，麻醉動物后，先用37攝氏度的PBS通過心臟灌流，然后用4攝氏 度的4%PFA(多聚甲醛)灌流固定，最后取出腦組織；組織塊用OCT(冰凍切片包埋劑，是一 種聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)包埋，然后冰凍切片，切片厚度一般為12-16μπι; 冰凍切片用5%的普通羊血清室溫封閉1小時，隨即加入用5%普通羊血清稀釋好的一抗，4 攝氏度過夜，第二天PBS洗3次后，加入對應的熒光二抗在暗處孵育1小時，PBS洗3次后， 用封片劑固定后到熒光顯微鏡下觀察。1. 3神經元的培養，質粒轉染和氧糖剝奪(OGD)實驗懷孕SD大鼠(Ε17)，取胚胎小鼠的皮層，胰酶消化后，按4Χ IO6個細胞電轉質粒 4yg,用電轉儀 the rat neuron Nucleofector Kit (Amaxa，Koeln，德國)Mf DNA 質粒或 RNA 質粒導入細胞。在氧糖剝奪實驗中，先將細胞外液替換為無葡萄糖的Earle' s平衡鹽溶液 (見1. 7實驗所用抗體和藥品)，然后放入一個密閉的OGD室(Formakientific，Marietta， OH,USA)中，沖入氮氣(5% CO2和95% N2) 10分子，然后將該室放入37°C培養箱中孵育池； 0⑶處理結束，換回原來的細胞外液再放入正常的培養箱中孵育即可。細胞死亡采用碘化丙 錠(PI)染色的方法來計算。1. 4電生理和鈣成像實驗利用計算機控制的700A 擴增儀(Axopatch 700A, Molecular Devices, Foster City, CA)，在培養的皮層神經元上采用全細胞膜片鉗的方法來記錄電信號。電極內液成分 如下(以 mM 計)=CsCl 140，CaCl2O. 3，EGTA 10, MgCl2I, HEPES 10, pH 7.2。正常細胞外液 包含(以 mM 計)=NaCl 140，KCl 5，MgCl2I, CaCl2I, D-葡萄糖 10，和 HEPES10，pH 7.4。記 錄過程中，鉗制電壓為-70mV。鈣成像實驗的方法主要是參考am等1996的文章[3ηι，X.等，trp，a novelmammalian gene famiIy essential for agonist-activated capacitativeCa2+entry. Cell, 1996. 85(5) :p. 661-71.]。簡言之，皮層神經元和鈣離子染料 Fura-2AM (溶解在0.0125%的聚醚酸中，并用DMSO稀釋)共孵育30min，整個反應在HEPES 緩沖鹽水(HPSS (以 mM 計)120NaCl，5. 3KC1，0. 8MgS04,1. 8CaCl2,11. 1 葡萄糖禾口 20HEPES, pH7. 4)中進行，孵育完畢用HPSS洗2-3次，然后再用HPSS孵育半小時。然后用尼康 eclipsddOOO-e顯微鏡來檢測胞內鈣離子濃度[Ca2+] i (F;340/F380比)的變化情況。1.5體外鈣蛋白酶切實驗成年大鼠腦組織用HEPES 緩沖液(以 mM 計:20HEPES, ρΗ7· 4，5KC1,1. 5MgCl2，1 二 硫蘇糖醇，1EGTA)來勻漿，其提取物與ImM Ca2+在37攝氏度反應；或者在ImM Ca2+，37攝 氏度條件下與純化的μ-鈣蛋白酶(Biovision，Palo Alto, CA, USAS)孵育。為了確定 鈣蛋白酶在TRPC6上的切割位點，在HEK293細胞中轉染flag-loop-HA-TRPC6-myc質粒 (pcDNA3. lTRPC6-myc質粒，在之前插入flag，中間TRPC6第二個loop區插入HA，插入標簽 ffl 白勺Stratagene ^w] ^QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit)
HEPES緩沖液提取細胞裂解液，再加入U-鈣蛋白酶切消化。純化蛋白NUS-CeiJ3用Ni柱 (Qiagen，Hilden，德國)提取，然后加入U-鈣蛋白酶切消化，酶切下來的片段用來做質譜分 析和Edman測序。1. 6TRPC6轉基因小鼠的構建和培養利用CaMKII α的啟動子來驅動小鼠TRPC6基因在小鼠大腦(特別是前腦)神經 元上的表達。在質粒p279(Joe Z Tsian等，Neuron, March 4,2004)上含有大約8. 5kb的 來源于小鼠基因組的CaMKII α的啟動子區域，在其后接上小鼠TRPC6的cDNA片斷，并且后 面加上polyA尾巴。將該質粒進行線性化，然后顯微注射到C57BL6J和FBN品系小鼠雜交 的受精卵中，最后將注射好的受精卵植入代孕的母鼠體內。轉基因小鼠的基因型是通過聚 合酶鏈式反應(PCR)的方法來鑒定的。PCR檢測所用的引物分別是p279F, GTTCTCCGTTTGCACTCAGG(SEQ ID NO 2)；trpc6-flag R, CGGGATCCCTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCTCTGCGG (SEQID NO 3)最終得到3個親代小鼠(FO)。使FO的小鼠與C57BL6J品系的小鼠進行交配產生 子代，實驗中所用的小鼠都是子3代(F3)以上的小鼠。1. 7實驗所用抗體和藥品實驗中所用商業化抗體分別來自以下公司Alomone Labs 的兔抗 TRPC 1、3、4、5、6 抗體；Millipore的兔抗TRPC6抗體、小鼠抗NeuN、抗GFAP、抗血影蛋白、抗NR2A和抗 CD31抗體；Upstate 的兔抗 GluRl、GluR2/3、GREB 和磷酸-GREB Serl33 抗體，小鼠抗 myc 和 抗PSD95抗體；Sigma的小鼠抗CaMKII α、抗α -微管蛋白抗體，和抗TRPC6抗體；Santa Cruz的羊抗capain 1抗體、小鼠抗磷酸-CaMKII α Thr286抗體和抗NOSl 抗體。除非特別說明，其他藥品及試劑均來自Sigma公司。由吉爾生化(上海)有限公司直接合成本申請的TAT-C6肽(見圖14b)。1.8數據統計
用于數據分析的軟件主要有=Clampfit 9. 0 (Axon公司，美國)、Origin 7. 0(0riginlabcorporation，美國)和 Excel 2003 (Microsoft)。實驗數據以平均值 士 標 準誤(mean士s. e.m)表示。用t檢驗(student’ s t_test，包含配對與非配對檢驗)比較 兩組數據之間的差異性；用方差分析(ANOVA)比較多組數據之間的差異性。ρ表示顯著性 值，η表示實驗例數。當P <0.05即認為有顯著性差異。此外，生存曲線的分析采用的是 nonparametric Kaplan-Meier 方法。2.實驗結果2. 1腦缺血后神經元中的TRPC6蛋白特異的下調大鼠局灶腦缺血模型采用的是中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCA0)白勺 Tj 法[Longa, Ε. Ζ.等，Reversible middle cerebral artery occlusion withoutcraniectomy in rats. Stroke, 1989. 20 (1) :p. 84-91],缺血 2 小時然后 復灌不同時間；缺血損傷情況用TTC染色的方法來檢測。首先，在缺血大鼠腦中篩查了與 生存相關的分子的蛋白表達變化情況。將缺血大鼠腦中缺血側的半影區和相對應的正常側 腦區的組織提取蛋白，再用免疫蛋白印跡的方法來檢測其中蛋白的變化情況。利用特異的 TRPC抗體(圖1)(見1. 7實驗所用抗體和藥品)，發現TRPC6蛋白表達量在缺血后復灌的 0、6、12和M小時分別降低為對照側蛋白量的74158140%和32% (每個時間點，η = 5-8只老鼠，*ρ < 0. 05，**ρ < 0. 01，圖加)，而TRPC3和TRPC4蛋白在這些時間點上卻沒有 顯著變化(圖2b)。盡管TRPC6蛋白量在復灌后M小時有顯著的降低，但是TRPC1、C3、C4、 C5和GluRl等蛋白的表達量卻沒有明顯降低(圖2c)。此外，實時酶鏈式聚合反應也顯示， 在缺血復灌后TRPC6在mRNA水平上未有顯著變化(圖2d)，這就提示，其蛋白量的顯著下調 是發生在翻譯后水平的。綜上可以推斷TRPC6蛋白在缺血后的半影區發生了特異的下調。接著，用免疫組織化學的方法研究TRPC6蛋白的下調是否發生在神經元中。實驗 顯示，復灌后M小時在缺血側的NeuN陽性細胞(神經元)中TRPC6的免疫陽性顯著降低 (圖2e)，然而在GFAP陽性細胞(膠質細胞)中，TRPC6的免疫陽性卻沒有明顯變化(圖3)。 這提示缺血后神經元中的TRPC6蛋白發生了特異的下調。2. 2TRPC6蛋白的下調先于神經元的死亡為了研究TRPC6蛋白的下調是否是神經元死亡的一個被動結果，將缺血大鼠的腦 切片同時用TRPC6蛋白的抗體(見1. 7實驗所用抗體和藥品)和檢測細胞死亡的試劑盒 (TUNEL Kit)來做染色標記。實驗結果顯示，缺血復灌M小時后，半影區的TRPC6蛋白已有 明顯下調，但是TUNEL檢測的陽性細胞卻要在復灌48小時后才會明顯增多(圖如)。進一 步的統計分析表明，缺血后的復灌期間，TRPC6蛋白量和TUNEL陽性細胞數之間有很好的負 相關性。如圖4b顯示，缺血后復灌0小時開始，TRPC6蛋白就明顯降低，并且在12、24、48小 時其蛋白表達量顯著的逐漸降低。而TUNEL標記的陽性細胞在復灌后M小時才開始出現 并在48小時顯著增加。這就提示，TRPC6蛋白的下調是先于神經元死亡的，并且TRPC6蛋 白下調可能在其后的缺血性神經元死亡中扮演一個重要角色。2. 3在細胞模擬缺血實驗中TRPC6蛋白發生功能性的下調為了更好地研究TRPC6蛋白的下調，利用廣泛使用的細胞模擬缺血實驗，即 在培養的神經元細胞上進行氧糖剝奪實驗(Oxygen-Glucose D印rivation，簡稱0GD) [Goldberg, Μ.P.禾口 D. W. Choi, Combined oxygen and glucose deprivation in corticalcellculture calcium-dependent and calcium-independent mechanisms of neuronal iniury. JNeurosci，1993. 13(8) :p. 3510-24] 結果發現，在 OGD 處理的培養神經元中， TRPC6蛋白量特異地下調，而TRPC3蛋白量卻沒有顯著變化(圖fe)。通過定量RT-PCR的 方法分析得出TRPC6在mRNA水平上并未有變化(圖恥)，這就與前面在動物中的實驗結果 相符，表明在模擬缺血刺激的條件下，神經元中的TRPC6蛋白也會發生特異性的下調。為了研究TRPC6蛋白的下調是否影響膜上TRPC6通道的功能，進行電生理實 驗。利用全細胞膜片鉗的記錄方式，在培養的神經元中0AG(DAG(二酰基甘油)的類似 物，是TRPC6、TRPC3通道的增強劑)可以引起一個緩慢而微小的內向電流(IOAG)。用 SKF96365 (廣泛的TRPCs通道的抑制劑，Sigma公司購得)或者用OCa2+外液加NMDG (替代 Na+)都可以完全抑制這一電流。進一步，在神經元中轉染針對TRPC6蛋白的特異的RNAi質 粒(RNAi_C6，見^10U J*等的文獻，旨在敲減TRPC6蛋白的表達量)可以抑制OAG引起的這 一電流(圖6a、b)。同樣，在鈣成像實驗中，發現用OAG刺激可以在培養的皮層神經元中引起 一個緩慢而微小的胞內鈣離子濃度([Ca2+]i)的升高。這一 [Ca2+]i的升高可以被SKF96365 所抑制；如果在OCa2+外液中，OAG則不能引起胞內鈣升高；此外，如果神經元中過表達突變 型的TRPC6 (DN-TRPC6，其通道孔區有三個突變，從而可以抑制TRPC6通道的開放[Hofmarm， Τ. , et al. , Subunit composition of mammalian transient receptor potential channels in livingcells. Proc Natl Acad Sci U S A,2002. 99(11) :p. 7461-6])，則OAG 引起的[Ca2+]i升高也會被明顯抑制(圖7)。并且，根據電流和電壓的關系所顯示的該通道 的雙向整流性質(圖6c)，提示I·電流主要是由TRPC6通道蛋白所介導的。在OGD處理的 神經元中，發現I·明顯被抑制(圖8)，作為對照，與已有報道一致的是，由酸離子通道所介 導的電流IpH6. 0 明顯增力口 [Xiong，Z. G. ，et al. ,Neuroprotection in ischemia blocking calcium-permeable acid-sensing ion channels. Cell, 2004. 118(6) :p. 687—98]。這就提 示，在模擬缺血的實驗條件下神經元中的TRPC6通道蛋白特異下調，從而導致膜上TRPC6通 道功能的特異性的下調。在神經元中過表達以下質粒GFP (對照蛋白)，TRPC6(功能性通道蛋白)， DN-TRPC6 (突變的沒有功能的通道)，RNAi_C6 (敲減TRPC6蛋白的表達)〔SiouJ*，Du WL*, Zhou KC, Tai YL, Yao HL, Jia YC, Ding YQ, Wang YZ. Critical role ofTRPC6 channels in the formation of excitatory synapses. Nat Neurosci. 2008Jul ； 11(7) :741-3〕，并 且對神經元做OGD處理。結果發現，過表達TRPC6蛋白可以降低OGD引起的細胞死亡數，而 過表達DN-TRPC6或者過表達RNAi_C6質粒敲減內源的TRPC6蛋白量都會明顯增加OGD引 起的細胞死亡。這就說明，在模擬的缺血條件下，增加TRPC6蛋白表達量對神經元有保護作 用，而降低TRPC6蛋白量則加重細胞損傷(圖9)。與此相應，我們用OAG預處理細胞后再做 OGD刺激，細胞死亡率明顯降低；但是如果用SKF96365預處理細胞后再給OGD刺激，則細胞 死亡率明顯增加(圖10a)。同樣，在MCAO大鼠(Sprague_Dawley，250180g，上海斯萊克實 驗動物有限公司)中，如果預先側腦室注入0AG，那么缺血引起的梗塞面積明顯減小；相反， 如果預先注入SKF96365，則加重缺血損傷(圖10b，c)。以上實驗結果表明，在模擬缺血刺 激的情況下，上調TRPC6有很好的神經元保護作用，而下調TRPC6則加重神經元的損傷。此外，在培養的神經元中過表達TRPC3蛋白，發現其對于0⑶引起的細胞死亡并沒 有保護作用(圖11)。進一步的實驗提示，TRPC6蛋白的特異性保護作用是有賴于CREB蛋白的激活，因為，其一，過表達TRPC6蛋白量可以增加p-CREB的表達量，即激活形式的CREB 增多(圖12a)；其二，如果將KCREB(顯性抑制型環磷酸腺苷反應元件結合蛋白，不能與DNA 結合，無功能)與TRPC6共表達的話，則完全抑制了 TRPC6蛋白的保護作用(圖12b)。2.4TRPC6蛋白被鈣蛋白酶降解缺血復灌中，TRPC6蛋白的快速下調提示，這可能是由一種蛋白酶介導的快速降解 過程。接下來的實驗篩查是參與TRPC6蛋白的下調的蛋白酶。在大鼠腦組織提取液中，加入鈣離子可以誘導TRPC6蛋白特異的下調，而TRPC3 蛋白卻沒有這種鈣離子引起的下調，并且預加EGTA可以阻斷這種蛋白降解(圖13a)。時 程分析表明，加入鈣離子5分鐘后這一蛋白降解就非常明顯了，并且發現當鈣離子濃度從 100 μ M開始就有這一降解現象(圖13b)。已知這樣的鈣離子濃度正好可以激活μ型鈣 蛋白酶，這也是主要分布在神經元中的一類型鈣蛋白酶[Goll，D.E.，et al.，Thecalpain system. Physiol Rev, 2003. 83(3) :p. 731-801]。這些結果提示，TRPC6 蛋白被一種鈣離子 激活的蛋白酶水解。為了進一步驗證是哪一種蛋白酶參與此過程，使用以下抑制劑PMSF， 絲氨酸蛋白酶抑制劑，cpm-VAD-CHO, caspase蛋白酶抑制劑，以及lactacystin，蛋白降解 體抑制劑(見1. 7實驗所用抗體和藥品)，然而，這些抑制劑都不能阻斷這一體外系統中鈣 離子引起的TRPC6蛋白的降解。相反，鈣蛋白酶的抑制劑，包括calp印tin，亮抑蛋白酶和 MDL28170(見1. 7實驗所用抗體和藥品)，它們都很好的阻斷了鈣離子引起的TRPC6蛋白的 降解(圖13a，c)。這些結果表明，TRPC6蛋白的降解是由于鈣蛋白酶的蛋白水解作用。此 外，通過免疫蛋白印跡的方法檢測了 spectrin蛋白的降解情況(可以作為鈣蛋白酶激活與 否的一個標志[Siman,R. ,M. Baudry,and G. Lynch,Brain fodrin :substrate for calpain I,an endogenouscalcium-activated protease. Proc Natl Acad Sci U S A,1984. 81(11) p. 3572-6])，證實了在這一體外系統中鈣蛋白酶確實是激活的。接下來驗證TRPC6蛋白是否是由鈣蛋白酶直接降解的。首先在HEK293細胞系 中表達了 N-flag-second loop-HA-C-myc (pcDNA3. lTRPC6_myc 質粒，在之前插入 flag, 中間TRPC6第二個loop區插入HA，插入標簽用的是Mratagene公司的QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit)標記的TRPC6質粒(圖14，示意小圖)，M小時以后，收 取細胞蛋白并做鈣蛋白酶體外消化實驗。在免疫蛋白印記實驗中用HA抗體檢測發現，代表 全長的TRPC6蛋白的條帶隨著鈣蛋白酶濃度的增加而降低(Fig 3. 4. ),并且在原來主帶 下面出現兩條條帶。用flag抗體檢測發現，隨著鈣蛋白酶濃度的增加全長TRPC6蛋白的條 帶很快的消失了，而用myc抗體檢測的全長條帶消失明顯晚于flag抗體所識別的條帶，并 且隨著鈣蛋白酶濃度的增加，全長的條帶下面緊靠著出現一條條帶，到最后的全部條帶消 失。這就提示，TRPC6蛋白的N端比C端更容易被鈣蛋白酶降解。因此推測N端是開始降 解的地方，隨著N端的降解，TRPC6蛋白發生了順序的降解，直至C端片段也完全降解。接下來，在原核細胞E. Coli中表達了 TRPC6蛋白的N端氨基酸序列(把TRPC6 的N端序列從M1到D203亞克隆后接到載體NUS_tag (pET-43. Ia載體，Novagen,德國)， 即NUSJ^1J3),分離純化這段蛋白后，加入鈣蛋白酶消化。結果顯示，鈣蛋白酶濃度依賴 性地切割這段蛋白，并且發現了一條被切割下來的片段，把這一片段收集并進行質譜分析 和N端測序，顯示該片段確實來源于TRPC6，測序結果也證實了鈣蛋白酶在TRPC6上的切 割位點是在AAPGA序列的N端(圖14b)。根據這一位點構建了一段多肽，其序列就是包含了這一切割位點的一段TRPC6的氨基酸序列，并帶有TAT序列(為了使其很好的穿過細 胞膜[Vives, E. , P. Brodin,禾P B. Lebleu, Atruncated HIV-ITat protein basic domain rapidly translocates through the ρlasmamembrane and accumulates in the cell nucleus. J BiolChem, 1997. 272(25) :p. 16010-7]) 將該多肽命名為 TAT-C6，其序列為 GRKKRRQRRRCRRGGSLKAAPGAGTRR(SEQ ID NO :4)。接下來的要用這一段多肽去特異的阻斷 鈣蛋白酶對TRPC6的蛋白水解作用而不影響鈣蛋白酶的其他功能。實驗發現，這段TAT_C6 肽段可以有效的抑制Ca離子引起的大鼠腦溶解物(rat brainlysates)中TRPC6蛋白的降 解，而并不影響鈣蛋白酶的標志性底物spectrin的降解(圖14b，右圖)。這就提示，這段 肽對于抑制鈣蛋白酶降解TRPC6的過程是非常特異并且有效的。2. 5在缺血情況下NMDA受體參與TRPC6蛋白的降解根據已有文獻報道，在缺血過程中，鈣蛋白酶的激活很可能是由于NMDA受體的過 度開放造成的。為了研究NMDA受體是否參與了缺血條件下鈣蛋白酶介導的TRPC6蛋白水解過程， 首先在培養的神經元中預加入鈣蛋白酶的兩種抑制劑calp印tin和MDL28170(見1.7實 驗所用抗體和藥品)，再將細胞做OGD處理二4小時后檢測其中蛋白變化情況和細胞死亡 率。實驗結果顯示，OGD引起的TRPC6蛋白的降解可以被預加鈣蛋白酶的抑制劑所阻斷。并 且，這兩個鈣蛋白酶的抑制劑都可以有效的降低OGD引起的細胞死亡(圖15a)。預先在培養的皮層神經元中轉染特異的針對鈣蛋白酶的兩段 siRNA(CAPN i_l 5' -GCUUCUUGUUGGCCCUCAUTT-3‘ (SEQ ID NO 5) ；CAPN i_2, 5，-GAAUCAUUAGCAAACACAATT-3，(SEQ ID NO :6)，上海吉瑪公司合成)以敲減鈣蛋白酶的表 達量，再做OGD刺激然后統計TRPC6蛋白的降解情況。結果發現，這兩段siRNA都能很好的 阻斷OGD引起的TRPC6蛋白降解(圖15b)。這些結果都表明，細胞缺血條件下TRPC6蛋白的下調確實由于鈣蛋白酶的水解作用。此外還發現地佐環平(MK801，Sigma公司購得，NMDA受體的阻斷劑)能有效的阻 斷TRPC6蛋白的降解(圖15c)，提示NMDA受體可能參與這一過程。進一步的，預先用轉染 siRNA(RANi 由上海吉瑪公司合成，NR li_l :5，-GGCAGUUCACGAACUCCUATT-3，(SEQ ID N0: 7) ；NR li_2:5，-GACUAAAGAUA⑶GACAAUTT-3，(SEQ ID NO :8))的方法去降低 NMDA 受體一 個必需亞基NRl的蛋白表達量，結果，OGD引起的TRPC6蛋白降解被有效的抑制(圖15d)。 這提示，NMDA受體也確實參與了 TRPC6蛋白的降解過程。此外，在大鼠的缺血模型中，如果 預先側腦室注入NMDA受體的阻斷劑(memantine)或鈣蛋白酶的抑制劑(calp印tin)，都可 以有效的抑制缺血引起的TRPC6蛋白的降解(圖15e)。無論在缺血的動物模型中或細胞模 型中，都證實了 NMDA受體和鈣蛋白酶都參與了 TRPC6蛋白的降解過程。2. 6增加TRPC6蛋白表達量可以有效的降低缺血小鼠腦損傷為了進一步證明TRPC6蛋白量與腦缺血保護的關系，構建了 TRPC6轉基因小鼠。利 用CaMKII α啟動子驅使的表達載體，可以將外源的TRPC6蛋白比較特異的表達在前腦神經 元中，這其中包括皮層和海馬神經元，而不包括小腦神經元。首先鑒定了在轉基因小鼠大腦皮層蛋白中，TRPC6蛋白的表達水平較之于野生型 小鼠有明顯的增加而其他蛋白水平未有改變(圖16a，b)。其次，用免疫組化實驗觀察到在轉基因小鼠中TRPC6蛋白在皮層和海馬中都有較高表達，而小腦中沒有(圖16c)。這都說明 了轉基因小鼠中的TRPC6蛋白特異的在前腦神經元中有較高表達。接下來，用轉基因小鼠 (Tg)和其同窩的非轉基因小鼠(WT)做了缺血實驗(這里采用的是雙盲實驗的方式，即做手 術的人員并不知道小鼠的分組，而統計缺血損傷的人員也不知道小鼠的分組情況)。結果發 現TRPC6轉基因小鼠的腦梗塞面積明顯小于非轉基因的野生型小鼠，并且轉基因小鼠的存 活率也高于野生型小鼠(圖17)。這就進一步的證實，增加TRPC6蛋白表達量對于缺血小 鼠的腦損失有明顯的降低作用，并且可以提高腦缺血后的存活率。同時，也用免疫組化的方 法，通過標記⑶31蛋白(一種血管內皮細胞的marker，常用于顯示血管的結構及密度)，來 檢查轉基因小鼠和野生型小鼠腦中的血管結構及密度，結果表明沒有顯著性差異(圖18)。 另一方面，用激光多普勒血流儀來檢測缺血前后轉基因小鼠和野生型小鼠腦中的血流量變 化情況，結果顯示也沒有明顯差異(圖18，右圖)。所以，我們認為，轉基因小鼠對于缺血損 傷的耐受性可能是由于保持了一定的TRPC6蛋白量，而并非其他原因。為了進一步證實TRPC6轉基因小鼠在腦缺血中的耐受性是由于其神經元中TRPC6 蛋白量較高，我們將缺血后的小鼠腦片做免疫組化染色標記TRPC6蛋白的同時用TUNEL試 劑盒來檢測細胞死亡情況。結果顯示，在轉基因小鼠中，TRPC6蛋白表達量高的細胞對應的 TUNEL陽性數目較少，而在野生型小鼠中TRPC6蛋白表達量低的細胞對應的TUNEL陽性數目 顯著多于前者(圖19)。這就提示，細胞中維持一定的TRPC6蛋白量可以有效的增加其對缺 血損傷的耐受性。如圖20a所示，在假手術組中，轉基因小鼠腦中的TRPC6蛋白量明顯高于野生型小 鼠；缺血后，盡管轉基因小鼠和野生型小鼠腦中的TRPC6蛋白量都有明顯降低，但是轉基因 小鼠腦中的TRPC6蛋白量仍然高于野生型小鼠。這就提示缺血保護作用可能是依賴于維持 一定的TRPC6蛋白量。2. 7TRPC6的缺血保護作用可能是依賴于CREB蛋白的激活在TRPC6轉基因小鼠的皮層蛋白中，檢測缺血前后p-CREB以及CREB的蛋白水 平，結果顯示，假手術組中，轉基因小鼠腦中的P-CREB/CREB水平明顯的高于野生型小鼠， 并且在缺血后，轉基因小鼠皮層中的p-CREB/CREB水平也仍高于對照小鼠(圖20b)。作為 對照，還同時檢測了其他受Ca2+調控的下游蛋白，比如，p-CaMKII α /CaMKII α和NOSl的 蛋白量變化情況，結果表明在轉基因小鼠和野生型小鼠中，這兩個蛋白的表達量在缺血前 后都沒有明顯的差異(圖20c)。這就提示，轉基因小鼠的缺血損傷小并且存活率長很可 能是由于其腦中TRPC6蛋白水平較高，進而下游激活形式的CREB，即p_CREB蛋白水平較 高，作為一個促進細胞存活的蛋白，CREB的持續激活對于保護大腦免受缺血損傷有重要作 用[Kitagawa, K. , CREB andcAMP response element-mediated gene expression in the ischemic brain. Febs J,2007. 274(13) :p. 3210—7]。2. 8抑制鈣蛋白酶降解TRPC6可以有效的降低大鼠腦缺血損傷前面的實驗表明，TAT_C6這段肽可以有效抑制Ca2+引起的腦溶解物中TRPC6蛋白 的降解而不影響鈣蛋白酶對于其他底物的降解過程。所以，檢測TAT_C6肽是否可以抑制 腦缺血引起的腦中TRPC6蛋白的降低，進而維持內源性TRPC6蛋白量而保護腦免受缺血損 傷。實驗結果顯示，缺血前側腦室注入TAT C6肽可以有效的減少缺血引起的TRPC6蛋白的 降解而不影響spectrin的降解(圖21)，即不影響鈣蛋白酶的其他功能，只是特異性的抑制鈣蛋白酶降解TRPC6這一過程。此外，將大鼠分為三組，分別給予Veh.(蒸餾水)、TAT_ ctrl (GRKKRRQRRRC_PPYGYYPSFRGNENRL由吉爾生化(上海)有限公司直接合成)和TAT_C6 肽(缺血前側腦室注入)，然后缺血2小時復灌M小時以后評估其缺血損傷情況，發現只 有第三組，即TAT_C6肽處理組的大鼠其腦損傷最小，相比前兩組有明顯的差異(圖21，右 圖)。綜上，利用針對性的肽段(TAT_C6)抑制鈣蛋白酶降解TRPC6蛋白，這一策略可以有效 的保護缺血性腦損傷。3.其它多肽也能抑制鈣蛋白酶降解TRPC6在之前的實驗中我們已證明RRGGSLKAAPGAGTRR可以阻止鈣蛋白酶切割TRPC6，并 且在側腦室注射此肽段可以保護缺血腦損傷。為了進一步證明鈣蛋白酶對TRPC6的切割位 點是這一保護作用中的關鍵，我們合成了包含有此位點的更短肽段TAT-C6-2 (grkkrrqrrrc GGSLKAAPGA(SEQ ID NO :9)，grkkrrqrrrc為TAT序列(穿膜因子)，KA為切點兩側的氨基 酸)。側腦室注射(每只大鼠側腦室注射ImM肽Χ5μ 1)后對損傷面積的分析表明，缺血前 注射此短肽段對缺血損傷仍有顯著的保護作用Γρ < 0. 05)(見圖22)。為了進一步證明鈣蛋白酶對TRPC6的切割位點是這一保護作用中的關鍵因素，我 們合成了包含有此位點的更短肽段 TAT-C6-3 (TAT-C6-3 :grkkrrqrrrcSLKAAP (SEQID NO 10) ,grkkrrqrrrc為TAT序列(穿膜因子)，KA為切點兩側的氨基酸)。每只大鼠側腦室注 射ImM肽Χ5μ 1，側腦室注射后對損傷面積的分析表明，缺血前注射此短肽段對缺血損傷 仍有仍有顯著的保護作用Γρ < 0. 05)(見圖23)。此外，在體外系統中(cell-free)，將鈣蛋白酶與純化的TRPC6蛋白在37°C并且有 鈣離子存在的條件下孵育，同時加入不同濃度的多肽。然后用免疫印跡的方法檢測某多肽 是否能濃度依賴性的抑制鈣蛋白酶降解TRPC6蛋白。采用上述方法檢測如下多肽SLKAAPGAGTR、RGGSLKAAPGAGTR、 TRRGGSLKAAPGAGTRR、VCRRGGSLKAAPGAGTRR、FVCRRGGSLKAAPGAGTRRN,預期這些多肽能夠抑 制特異性地競爭性結合到鈣蛋白酶解離TRPC6的位點，從而抑制鈣蛋白酶降解TRPC6。4.腹腔注射TAT-C6改善老年性癡呆模型老鼠的學習和記憶能力選取年齡在11個月左右的野生型(WT)和APP/PS1老年性癡呆模型小鼠(APP/ PSl)，按照20mg/kg的劑量分別進行腹腔注射TAT-C6肽和對應量的生理鹽水，分成四個組 (每組的η = 5) =WT注射TAT-C6肽組(WT+肽)，WT注射生理鹽水組(WT)，APP/PS1注射 TAT-C6肽組(APP/PS1+肽)，APP/PS1注射生理鹽水組(APP/PS1)。每周注射兩次，一共持 續三個月，然后進行水迷宮實驗檢測老鼠的學習和記憶能力。結果顯示(圖，相比WT組，APP/PS1組在訓練階段需要花更多時間才能找到隱 藏的平臺(圖Mb)，在測試階段則更少次地穿越了平臺位置(圖24d)，提示APP/PS1鼠在 14個月時表現出明顯的學習記憶能力下降。而與APP/PS1相比，APP/PS1+肽組在訓練階段 只需花更少時間即可找到隱藏的平臺，在測試階段則更多次地穿越了平臺位置Γρ<0. 05 ； **ρ < 0. 01 ；***ρ < 0. 001)。這說明TAT-C6肽能夠顯著改善APP/PS1鼠的學習和記憶能力。以上以具體實施方式
的形式描述了本發明。但是，這些具體實施例僅僅是闡述性 而言，而非是對本發明范圍的限制。本領域技術人員在不偏離本申請說明書的精神的情況 下可對本發明作出各種變動和更改。本申請的保護范圍由權利要求書來限定。
權利要求
1.用于維持神經細胞的TRPC6水平以預防或者治療缺血性腦損傷或腦神經退行性病 變的物質。
2.如權利要求1所述的物質，其特征在于，所述物質是鈣蛋白酶的抑制劑，或TRPC6表 達增強劑，或NMDA受體拮抗劑。
3.如權利要求2所述的物質，其特征在于，所述鈣蛋白酶的抑制劑是鈣蛋白酶特異性 的小干擾RNA，或calp印tin，或包含SLKAAP序列的多肽。
4.如權利要求3所述的物質，其特征在于，所述多肽的序列如SEQID NO :1所示，或其 片段。
5.如權利要求2或3所述的物質，其特征在于，所述多肽與跨膜因子相連接。
6.如權利要求5所述的物質，其特征在于，所述多肽的序列如SEQID NO 4, SEQ ID NO 9 或 SEQ ID NO 10 所示。
7.如權利要求3所述的物質，其特征在于，所述鈣蛋白酶特異性的小干擾RNA的序列如 SEQ ID NO :5 或 SEQ ID NO 6 所示。
8.如權利要求2所述的物質，其特征在于，所述TRPC6表達增強劑是TRPC6表達載體， OAG或者OAG的類似物。
9.如權利要求2所述的物質，其特征在于，所述NMDA受體拮抗劑是金剛烷胺、地佐環 平，或如 SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO 8 所示。
10.如權利要求1-9所述的物質的用途，其特征在于，所述用途包括制備預防或者治療 缺血性腦損傷或神經退行性病變的藥物或者藥物組合。
全文摘要
本申請涉及腦損傷治療的靶點和藥物。具體而言，本申請涉及用于維持神經細胞的TRPC6水平以預防或者治療缺血性腦損傷或腦神經退行性病變的物質，及其在制備預防或者治療缺血性腦損傷或神經退行性病變的藥物或者藥物組合中的用途。本發明也涉及一種篩選可用于治療或預防由缺血引起的損傷用的物質的方法。
文檔編號A61P9/10GK102100913SQ201010588868
公開日2011年6月22日 申請日期2010年12月15日 優先權日2009年12月16日
發明者杜婉璐, 王以政, 黃雋波 申請人:中國科學院上海生命科學研究院