專利名稱：一種從香茅油中提取抗癌提取物的方法及其組成和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗癌提取物的制備方法及其組成和用途，尤其是從香茅油中提取抗癌提取物的方法及其組成和用途。
背景技術：
香茅草是中藥大詞典收載的中藥品種，香茅草的品種不一樣，其所含有的精油成分也不一樣。我國的香茅屬植物主要有九個品種，按其含精油成分分為六個類型，I香茅油類型，II楓茅油類型，III臭草油類型，IV玫瑰香草或姜草油類型，V野香茅油類型，VI青香茅油類型。類型I香茅油類型，以香草醛和香葉醇為主成分；類型II楓茅油，以檸檬醛為主要成分；類型III臭草油，以辣味薄荷酮為主要成分；類型IV玫瑰香草或姜草油，以香葉醇和乙酸香葉醇為主成分；類型V野香茅油，以甲基丁香酚為主成分；類型VI青香茅油類型，主成分為葛縷酮及薄荷酮。
香茅油類型有西雙版納亞香茅油，云南大理香茅油等。不同地區的香茅油所含的有效成分和含量是不同的，作為中藥的療效也就不同。由于提取的方法不同，提取物的成分也就不同，作為藥物的療效也就不同。
香茅油提取物的主要成分是欖香烯，請參見中國專利ZL98106848.0，欖香烯用于制備抗癌藥物。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是，提供一種從香茅油中提取抗癌提取物的方法及其組成和用途，提取物的有效成分是β-欖香烯、β-波旁烯、古巴烯，抗癌效果好，資源豐富，工藝簡單，可進行工業化生產。
為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是一種從香茅油中提取抗癌提取物的方法，包括以下步驟a.以含香草醛和香葉醇為主要成分的西雙版納亞香茅油為原料，用填料式真空蒸餾裝置蒸餾，真空度為13-14mmHg，放掉65℃-80℃/13-14mmHg的餾分，分離掉大部分香草醛，然后將余餾物繼續蒸餾，真空度為7-8mmHg，放掉92℃-102℃/7-8mmHg的餾分，分離掉大部分子香葉醇，然后將余餾物繼續蒸餾，真空度為7-8mmHg，收集103℃-107℃/7-8mmHg的餾分，得到西雙版納亞香茅油次要成分；b.采用填料式真空精餾法或分子蒸餾法對西雙版納亞香茅油次要成分進行分離，得到含有β-欖香烯、β-波旁烯、古巴烯的抗癌提取物。
所述步驟b中填料式真空精餾法的條件如下真空度為1-3mmHg；收集82℃-84℃/3mmHg的餾分；填料為網狀填料。
所述網狀填料為狄克松填料或Q網環填料。
所述步驟b中分子蒸餾法的步驟為a.蒸餾溫度30-45℃，蒸餾壓力70-90Pa，刮膜速度300-320轉/分，冷凝面溫度20-25℃，系統保溫20-25℃，物料流速15-30毫升/小時，僅收集餾余物；b.將餾余物繼續進行分子蒸餾，蒸餾溫度為40-60℃，蒸餾壓力20-70Pa，刮膜速度300-320轉/分，冷凝溫度20-25℃，物料流速15-30毫升/小時，分別收集餾出物與餾余物，將餾余物繼續進行分子蒸餾，蒸餾溫度30-70℃，蒸餾壓力10-50Pa，刮膜速度300-320轉/分，冷凝面溫度20-25℃，系統溫度20-25℃，物料流速15-30毫升/小時，收集餾出物，放掉餾余物，將得到的二次餾出物混合；c.將二次混合的餾出物繼續重復步驟b進行分子蒸餾，蒸餾溫度30-70℃，蒸餾壓力10-30Pa，其他條件不變，直到使通過毛細管氣相色譜儀檢測得到的β-欖香烯、波旁烯、古巴烯的含量滿足抗癌提取物的要求。
一種如上所述方法從香茅油中提取的抗癌提取物，其特征在于，提取物包括以重量百分比計β-欖香烯85％-95％β-波旁烯3％-10％古巴烯1％-5％。
所述的從香茅油中提取的抗癌提取物的用途，其用來制備用于腫瘤治療的靜脈注射乳。
所述靜脈注射乳包括納米脂質體、前體脂質體、長循環納米脂質體、納米微乳、脂質納米球、脂肪乳或靜脈乳。
本發明的有益效果是中國專利ZL98106848.0的香茅油提取物的主要成分是β-欖香烯，不含有波旁烯，我們申請的專利以西雙版納亞香茅油提取的抗癌提取物，主要成分是β-欖香烯，還含有波旁烯，藥理試驗證實波旁烯的抑癌活性比欖香烯高，又增加了對胃癌的癌譜，欖香烯對胃癌的療效不明顯，含有波旁烯的抗癌提取物有高效的抑癌性。生產成本比提取欖香烯降低20％，資源豐富，原料易得，生產工藝容易控制，開發成抗癌新藥，有更廣闊的市場。
圖1是以西雙版納香茅草精油的次要成分為原料提取的提取物的毛細管氣相色譜圖。
圖2是西雙版納香茅草精油的次要成分的毛細管氣相色譜圖。
圖中15峰為古巴烯；16峰為β-波旁烯；17峰為β-欖香烯。
具體實施例方式
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細說明我們從以香草醛和香葉醇為主要成分的西雙版納亞香茅油中分離出抑癌功效成分。經用氣質聯用儀檢測β-欖香烯為主要成分，還含有波旁烯、古巴烯。其構成比例為β-欖香烯占85％-95％，β-波旁烯占3％-10％，古巴烯占1％-5％。如圖1所示，在毛細管氣相色譜圖上顯示的從左至右峰序為古巴烯、β-波旁烯和β-欖香烯，構成了西雙版納亞香茅油次要成分提取物作為原料藥的指紋譜。提取物主要成分以重量百分比計為β-欖香烯85％-95％，β-波旁烯3％-10％，古巴烯1％-5％。
色譜條件，色譜柱DB-5，30mm×0.25mm，柱溫60---240℃，3℃/min-300℃，10℃/min，載氣N2，30cm/S，檢測器MS，氣化室溫度250℃。
或色譜條件，色譜柱DB-1，30m毛細柱，柱溫80--200℃，載氣N230ml/S，檢測器FID，氣化室溫度250℃。
固定液為聚二甲基硅氧烷(DB-1)或聚(5％苯基)，二甲基硅氧烷(DB-5)。
實施例1從西雙版納亞香茅油中提取抗癌提取物外購西雙版納亞香茅油以香草醛和香葉醇為主成分，用填料式真空蒸餾裝置蒸餾，真空度為13-14mmHg，放掉65℃-80℃/13-14mmHg的餾分，分離掉大部分香草醛，然后將余餾物繼續蒸餾，真空度為7-8mmHg，放掉92℃-102℃/7-8mmHg的餾分，分離掉大部分子香葉醇，然后將余餾物繼續蒸餾，真空度為7-8mmHg，收集103℃-107℃/7-8mmHg的餾分得到西雙版納亞香茅油次要成分，其毛細管氣相色譜圖見圖2。
A；分子蒸餾法以制得的西雙版納亞香茅油次要成分為原料，經廣州漢維機電公司MD-S80型分子蒸餾儀進行分餾，其工藝條件蒸餾溫度30-45℃，蒸餾壓力70-90Pa，刮膜速度300-320轉/分，冷凝面溫度20-25℃，系統保溫20-25℃，物料流速15-30毫升/小時，僅收集餾余物。將餾余物進行分子蒸餾，蒸餾溫度為40-60℃，蒸餾壓力20-70Pa，刮膜速度300-320轉/分，冷凝溫度20-25℃，物料流速15-30毫升/小時。分別收集餾出物與餾余物，將餾余物繼續進行分子蒸餾。蒸餾溫度30-70℃，蒸餾壓力10-30Pa，蒸餾壓力10-50Pa，刮膜速度300-320轉/分，冷凝面溫度20-25℃，系統溫度20-25℃，物料流速15-30毫升/小時，收集餾出物，放掉餾余物，將得到的二次餾出物混合，繼續蒸餾，蒸餾溫度30-70℃，蒸餾壓力10-30Pa，毛細管氣相色譜儀檢測提取物中β-欖香烯含量90-95％，波旁烯含量3-7％，古巴烯含量1-3％。
當然，可以通過提高溫度和加大真空度，繼續通過分子蒸餾法，直到經毛細管氣相色譜儀檢測，得到所需的含量為止。
B填料式真空蒸餾法填料式真空蒸餾裝置由裝上述西雙版納亞香茅油次要成分的釜、填料精餾塔、回流器、真空泵構成，由上海化工研究院新型填料技術開發中心設計制造，填料為狄克松填料或Q網環填料。以西雙版納亞香茅油次要成分為原料，真空度為150Pa-500Pa或1-3mmHg，收集82℃-84℃/3mmHg的餾分。毛細管氣相色譜分析提取物中β-欖香烯含量85-92％，波旁烯含量5-10％，古巴烯含量1-3％。用毛細管氣相色譜制定供檢測用指紋圖譜。
實施例2提取物的脂質體的制備將達到質量要求的提取物與精制大豆磷脂、膽固醇以重量比1∶3.2∶1.5混合，添加適量乙醚，使溶解，置入旋轉蒸發儀上脫除乙醚成膜，然后置入寧波新芝科學儀器廠出產的超聲波細胞粉碎機(功率300W)超聲，經粒度檢驗合格，調節PH，使PH值為4.5-6.5，經0.8μM微孔濾膜過濾裝瓶，經檢驗脂質體粒徑小于200nm，100℃蒸汽流滅菌，提取物的最終濃度為0.5％-0.75％。
包封率的檢測，用分子篩法檢測(利用SephadexG25層析系統，可將提取物納米脂質體制劑分成兩個部份，即提取物納米脂質體部份和抗癌提取物部份，經氣相色譜檢測兩個部份中含有的提取物含量)，包封率應超過80％。包封率計算公式＝提取物納米脂質體部份含提取物量÷(提取物納米脂質體部份含提取物量+游離的提取物量)。
顯微鏡、電鏡檢測，證實是脂質體。
實施例3提取物脂質體藥效學試驗對皮下接種的人體腫瘤異種移植模型QGY肝癌、MKN-45胃癌的療效，以80mg/Kg，40mg/Kg，20mg/Kg劑量，每天靜脈給藥1次，連續給藥10天的治療方案，高劑量組抑制腫瘤分別為40％-43％、37％-39％。
對顱內原位接種小鼠腦瘤G422模型的療效，高劑量延長生命率為60％-67％。
對皮下接種小鼠腦瘤G422模型的療效，高劑量組抑瘤率33％。
對免疫功能的影響對荷Lewis肺癌的小鼠NK細胞對照組比活性提高21％-23％。
對荷Lewis肺癌的小鼠淋巴細胞增殖活性影響、刺激指標提高了1.5-1.55。
實施例4提取物前體脂質體的制備將達到質量要求的提取物原料藥與大豆磷脂、膽固醇以重量比1∶3.2∶1.5混合，添加適量乙醚，使溶解，置入旋轉蒸發儀上脫除乙醚成膜，然后置入寧波新芝科學儀器廠出產的超聲波細胞粉碎機(功率300W)超聲，經粒度檢驗合格，調節PH，使PH值為4.5-6.5，經0.8μM微孔濾膜過濾裝瓶，經檢驗脂質體粒徑小于200nm，加入乳糖或低分子右旋糖苷，100℃蒸汽流滅菌，提取物的最終濃度為0.5％-0.75％。
包封率的檢測，用分子篩法檢測(利用SephadexG25層析系統，可將提取物前體脂質體制劑分成兩個部份，即提取物前體脂質體部份和提取物部份，經氣相色譜檢測兩個部份中含有的提取物含量。)，包封率應超過80％。包封率計算公式＝提取物前體脂質體部份含提取物量÷(提取物前體脂質體部份含提取物量+游離的提取物量)。
顯微鏡、電鏡檢測，證實是前體脂質體。
實施例5提取物長循環納米脂質體的制備將達到質量要求的提取物與大豆磷脂、膽固醇、聚乙二醇磷脂酰乙醇以重量比1∶2.6∶0.6∶1.4混合，添加適量乙醚，使溶解，置入旋轉蒸發儀上脫除乙醚成膜，然后置入寧波新芝科學儀器廠出產的超聲波細胞粉碎機(組合機功率300W)超聲，經粒度檢驗合格，調節PH，使PH值為4.5-6.5，經0.8μM微孔濾膜過濾裝瓶，經檢驗脂質體粒徑小于200nm，100℃蒸汽流滅菌，提取物的最終濃度為0.5％-0.75％。
包封率的檢測，用分子篩法檢測(利用SephadexG25層析系統，可將提取物納米脂質體制劑分成兩個部份，即提取物納米脂質體部份和提取物流份，經氣相色譜檢測兩個部份中含有的提取物含量。)，包封率應超過80％。包封率計算公式＝提取物長循環納米脂質體部份含提取物量÷(提取物長循環納米脂質體部份含提取物量+游離的提取物量)。顯微鏡、電鏡檢測，證實是長循環脂質體。
實施例6提取物納米微乳(帶負電荷及帶正電荷)的制備制備方法1帶負電荷的納米微乳的制備將達到質量要求的提取物與大豆磷脂、膽固醇比1∶3.2∶1.5混合，添加適量乙醚，使溶解，置入旋轉蒸發儀上脫除乙醚成膜，然后置入寧波新芝科學儀器廠出產的超聲波細胞粉碎機(組合機功率300W)超聲，經粒度檢驗合格，粒度為200nm，調節PH，使PH值為4.5-6.5，經0.8μM微孔濾膜過濾裝瓶，經檢驗脂質體粒徑小于150nm，100℃蒸汽流滅菌，提取物的最終濃度為0.5％-0.75％。
顯微鏡、電鏡檢測，證實是納米微乳。
制備方法2提取物帶正電荷的納米微乳的制備將達到質量要求的提取物與大豆磷脂、膽固醇、以重量比1∶3.2∶1.5混合，加入適量十八胺，添加適量乙醚，使溶解，置入旋轉蒸發儀上脫除乙醚成膜，然后置入寧波新芝科學儀器廠出產的超聲波細胞粉碎機(組合機功率300W)超聲，經粒度檢驗合格，粒度為100nm，調節PH，使PH值為7-8.5，經0.8μM微孔濾膜過濾裝瓶，經檢驗脂質體粒徑小于150nm，100℃蒸汽流滅菌提取物的最終濃度為0.5％-0.75％。
顯微鏡、電鏡檢測，證實是帶正電荷的納米微乳。
實施例7提取物脂質納米球的制備取經質量檢驗符合標準的提取物與大豆磷脂加入大豆油中，升溫控制成油相，將該油相加入到含甘油的水溶液中。其具體重量比為西茅分-1占總重量的0.1％-0.5％，大豆磷脂1.2％-2.0％，大豆油10％，甘油2.25％，注射用水加至100ml，然后高速攪拌，調節PH為4.5-6.5，再經APV2000型(丹麥產)型高壓均質機處理，使其脂質球的粒徑小于200nm，，經0.8mμM微孔濾膜過濾裝瓶，100℃-120℃滅菌，提取物的最終濃度為0.1％-0.5％。
根據需要加入適量膽固醇、亞油酸等。
實施例8提取物靜脈注射乳的制備經質量檢驗合格的原料藥與大豆磷脂、膽固醇以重量比1∶3.2∶1.5混合，用APV2000型(丹麥產)型高壓均質機乳化，使粒度小于1mM，經粒度檢驗合格，調節PH為4.5-6.5，經1.2μM微孔濾膜過濾裝瓶，100℃-120℃滅菌，提取物的最終濃度為0.5％-0.75％。
實施例9提取物脂肪乳的制備取經質量檢驗符合標準的提取物與大豆磷脂加入大豆油中，升溫控制成油相，將該油相加入到含甘油的水溶液中。其具體重量比為提取物占總重量的0.1％-0.5％，大豆磷脂1.2％-2.0％，大豆油10％，甘油2.25％，注射用水加至100ml，然后高速攪拌，調節PH為4.5-6.5，再經APV型(丹麥產)型高壓均質機處理，使其脂質球的粒徑小于1μM，經1.2μM微孔濾膜過濾裝瓶，100℃-120℃滅菌，提取物的最終濃度為0.1％-0.5％。根據需要加入膽固醇、亞油酸的最終濃度為0.1％。
實施例10β-波旁烯的制備將分子蒸餾過一次的香茅油次要成分的餾出物繼續進行分子蒸餾。蒸餾溫度30-70℃，蒸餾壓力10-50Pa，刮膜速度300-320轉/分，冷凝溫度20-25℃，物料流速7-10毫升/小時，收集餾余物，將該富含波旁烯的餾余物用硝酸銀處理過的硅膠柱層析單離，洗脫劑為石油醚，β-欖香烯分子有三個雙鍵，β-波旁烯分子僅有一個雙鍵，β-欖香烯分子與銀離子絡和作用大于波旁烯分子，結合β-欖香烯及β-波旁烯雙鍵的位置的空間差異，利用銀離子促進β-欖香烯與波旁烯分離，餾余物100克，硅膠500克，硝酸銀10克，用石油醚的洗脫流速為40ml/分，將富集波旁烯的石油醚溶液經旋轉蒸發儀濃縮，除去石油醚得到波旁烯的樣品。
實施例11β-波旁烯靜脈乳的制備經質量檢驗合格的β-波旁烯與大豆磷脂、膽固醇以重量比1∶3.2∶1.5混合，用APV2000型(丹麥產)型高壓均質機乳化，使粒度小于1μM，經粒度檢驗合格，調節PH為4.5-6.5，經1.2μM微孔濾膜過濾裝瓶，100℃滅菌，β-波旁烯的最終濃度為0.5％-0.75％。
實施例12β-波旁烯靜脈乳藥效學試驗對皮下接種的人體腫瘤異種移植模型QGY肝癌、MKN-45胃癌的療效，以80mg/Kg，40mg/Kg，20mg/Kg劑量，每天靜脈給藥1次，連續給藥10天的治療方案，高劑量組抑制腫瘤分別為41％-44％、38％-40％。
對顱內原位接種小鼠腦瘤G422模型的療效，高劑量延長生命率為61％-68％。
對皮下接種小鼠腦瘤G422模型的療效，高劑量組抑瘤率34％。
對免疫功能的影響對荷Lewis肺癌的小鼠NK細胞對照組比活性提高22％-24％。
對荷Lewis肺癌的小鼠淋巴細胞增殖活性影響、刺激指標提高了1.5-1.56。
所以提取物添加相關藥用輔料制備成的靜脈注射乳包括納米脂質體，前體脂質體，長循環納米脂質體，納米微乳，脂質納米球，脂肪乳，靜脈乳。經QGY肝癌、MKN-45胃癌、小鼠腦瘤G422模型藥理學實驗有效。對免疫功能影響試驗，荷Lewis肺癌的小鼠NK細胞與對照組比較提高21％--23％。淋巴細胞增值活性影響、刺激指標提高了1.4-1.55。
綜上所述，本發明的內容并不局限在上述的實施例中，相同領域內的有識之士可以在本發明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發明的范圍之內。
權利要求
1.一種從香茅油中提取抗癌提取物的方法，其特征在于，包括以下步驟a.以含香草醛和香葉醇為主要成分的西雙版納亞香茅油為原料，用填料式真空蒸餾裝置蒸餾，真空度為13-14mmHg，放掉65℃-80℃/13-14mmHg的餾分，分離掉大部分香草醛，然后將余餾物繼續蒸餾，真空度為7-8mmHg，放掉92℃-102℃/7-8mmHg的餾分，分離掉大部分子香葉醇，然后將余餾物繼續蒸餾，真空度為7-8mmHg，收集103℃-107℃/7-8mmHg的餾分，得到西雙版納亞香茅油次要成分；b.采用填料式真空精餾法或分子蒸餾法對西雙版納亞香茅油次要成分進行分離，得到含有β-欖香烯、β-波旁烯、古巴烯的抗癌提取物。
2.根據權利要求1所述的從香茅油中提取抗癌提取物的方法，其特征在于，所述步驟b中填料式真空精餾法的條件如下真空度為1-3mmHg；收集82℃-84℃/3mmHg的餾分；填料為網狀填料。
3.根據權利要求2所述的從香茅油中提取抗癌提取物的方法，其特征在于，所述網狀填料為狄克松填料或Q網環填料。
4.根據權利要求1所述的從香茅油中提取抗癌提取物的方法，其特征在于，所述步驟b中分子蒸餾法的步驟為a.蒸餾溫度30-45℃，蒸餾壓力70-90Pa，刮膜速度300-320轉/分，冷凝面溫度20-25℃，系統保溫20-25℃，物料流速15-30毫升/小時，僅收集餾余物；b.將餾余物繼續進行分子蒸餾，蒸餾溫度為40-60℃，蒸餾壓力20-70Pa，刮膜速度300-320轉/分，冷凝溫度20-25℃，物料流速15-30毫升/小時，分別收集餾出物與餾余物，將餾余物繼續進行分子蒸餾，蒸餾溫度30-70℃，蒸餾壓力10-50Pa，刮膜速度300-320轉/分，冷凝面溫度20-25℃，系統溫度20-25℃，物料流速15-30毫升/小時，收集餾出物，放掉餾余物，將得到的二次餾出物混合；c.將二次混合的餾出物繼續重復步驟b進行分子蒸餾，蒸餾溫度30-70℃，蒸餾壓力10-30Pa，其他條件不變，直到使通過毛細管氣相色譜儀檢測得到的β-欖香烯、波旁烯、古巴烯的含量滿足抗癌提取物的要求。
5.一種如權利要求1所述方法從香茅油中提取的抗癌提取物，其特征在于，提取物包括以重量百分比計β-欖香烯85％-95％β-波旁烯3％-10％古巴烯1％-5％。
6.由權利要求5所述的從香茅油中提取的抗癌提取物的用途，其用來制備用于腫瘤治療的靜脈注射乳。
7.根據權利要求6所述的從香茅油中提取的抗癌提取物的用途，其特征在于，所述靜脈注射乳包括納米脂質體、前體脂質體、長循環納米脂質體、納米微乳、脂質納米球、脂肪乳或靜脈乳。
全文摘要
本發明公開了一種從香茅油中提取抗癌提取物的方法及其組成和用途，以西雙版納亞香茅油次要成分為原料，經填料式真空精餾裝置或分子蒸餾儀分離出提取物，其中β－欖香烯為主要成分，還含有β－波旁烯和古巴烯等倍半萜烯。β－欖香烯已經被證實為抑癌功效成分，將香茅油次要成分中含有的波旁烯單離出來再經藥效學試驗證實其為抑癌功效成分，抗癌效果好，資源豐富，工藝簡單，可進行工業化生產。
文檔編號A61P35/00GK1970054SQ200610129740
公開日2007年5月30日 申請日期2006年11月29日 優先權日2006年11月29日
發明者李德山, 王喜文 申請人:王喜文, 李德山