專利名稱：一種含有植物乳桿菌的組合物及其在增強腸道免疫屏障中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及的植物乳桿菌LP-Onlly，其16S RNA基因序列于GeneBank(NCBI)備案，其登錄號為AY590777。
本發明涉及的植物乳桿菌LP-Onlly組合物和腸內營養成分的組合，可以獨立組合包裝或混合包裝。涉及的植物乳桿菌LP-Onlly的載體可以為該菌株發酵的培養基，尤其是基于豆芽、谷芽等，適當的培養基還可以含有水溶性膳食纖維、低聚糖等。根據本發明的植物乳桿菌LP-Onlly載體如為口服液，主要含植物乳桿菌活菌和代謝產物，其活菌數量達1.0×106～2.0×108CFU/ml；如為顆粒、片劑或膠囊等固體劑型，則其活菌數量達1.0×108～2.0×1010CFU/g。涉及的腸內營養可為常規的腸內營養成分，特別地也可含有具有一定藥理學作用的特殊營養素，如谷氨酰胺、精氨酸、ω-3脂肪酸、牛磺酸、抗氧化劑、蛋白寡肽等。
本發明涉及的植物乳桿菌LP-Onlly組合物和腸內營養成分的組合，可以以任何適當的方式給藥，優選口服給藥或直腸給藥，如口服產品可以是口服液、顆粒、片劑或膠囊，也可以制成灌腸劑劑型，還可以通過導管經胃插入腸道或直接插入腸道給藥。
下面結合實施例和圖進一步說明本發明。
實施例1動物實驗 1.大鼠重癥急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis，SAP)模型的建立 本發明采用雄性SD大鼠，體重250～300g(復旦大學醫學院動物中心提供)，禁食不禁水12h，20g/L鹽酸氯胺酮(100mg/kg體重)腹腔內注射麻醉后，將大鼠固定于仰臥位，頸部和腹部去毛，1g/L新潔而滅酊消毒，鋪無菌巾。正中切口打開腹腔，于十二指腸內側找到片狀分布的胰腺及膽管，將4.5號針頭經系膜對側腸壁逆行插入膽管，結扎膽管末端和針頭，無創血管夾夾閉肝門處膽管，均勻緩慢推注50g/L牛磺膽酸鈉(1ml/kg)，推注時間約5min，10min后松開血管夾和結扎線，8字縫合腸壁處穿刺點。
在距盲腸約40cm小腸處荷包埋入另一硅膠管，外徑為12mm，并將其沿腹壁皮下潛行至頸背部肩胛間引出，經該管給予腸內營養液及植物乳桿菌LP-Onlly。旁正中切口剪開頸部皮膚，鈍性分離出頸外靜脈，經頸外靜脈置入外徑為12mm的硅膠管，皮下隧道潛行至頸背部引出，經該管給予腸外營養液。頸外靜脈插管及空腸造瘺管穿過螺旋式彈簧圈與360°旋轉式輸液裝置相連接。腸外營養液及腸內營養液以微量輸液泵24h均勻輸入。
2.植物乳桿菌LP-Onlly發酵液、腸外營養(PN液)、腸內營養(EN液)組成 本發明中采用的植物乳桿菌LP-Onlly發酵液，是以植物乳桿菌LP-Onlly為出發菌株發酵豆芽生產的“昂立一號口服液”，產品中含有活性植物乳桿菌LP-Onlly，活菌數量達1.0×106～2.0×108CFU/ml，該產品由上海交大昂立股份有限公司售出。
PN液為常規腸外營養成份，由葡萄糖、氨基酸、脂肪乳劑、維生素、礦物質等組成。
EN液由荷蘭紐迪希亞Nutricia(Zoetermeer)公司生產的百普素經溫水稀釋而成，百普素由麥芽糖糊精、葡萄糖糖漿、乳清蛋白水解物、植物油、中鏈甘油三酯、維生素、礦物質素等組成。
3.動物實驗分組 將造模成功的實驗動物隨機分為三組，前24h均給予生理鹽水2ml/h(1)腸外營養組(PN組)，第2～6天給予PN支持，微量輸液泵保持輸液速度約33ml/h，平均每只大鼠輸液數量約80ml/天；(2)腸外營養+腸內營養組(PN+EN組)，第2～6天給予PN+EN支持，其中80％的熱氮量由PN提供，平均每只大鼠輸液量約64ml/天；20％由EN提供，百普素用溫水按1g∶4ml稀釋成16ml，再用生理鹽水將后者以1∶2(體積比)稀釋至24ml，1ml/h經空腸造瘺管滴入，每日EN供能200.6kj/kg(48kcal/kg)。(3)腸外營養+腸內營養+植物乳桿菌LP-Onlly發酵液組(PN+EN+LP-Onlly組)，第2～6天給予PN+EN支持，PN液+EN液支持量同PN+EN組，同時經空腸造瘺管分三次滴入植物乳桿菌LP-Onlly發酵液共10ml/d。上述三組大鼠于造模成功后觀察大鼠一般情況、反應靈敏度、活動度及死亡情況；所有上述實驗組大鼠均于第7天處死并取樣檢測或觀察。
正常對照組同樣予以頸外靜脈插管，禁食不禁水24h處死，取樣檢測或觀察。
4.觀察指標 (1)菌群易位率 取腔靜脈血1ml，腸系膜淋巴組織、肝臟中葉、肺臟右葉組織勻漿后分別倒入心腦浸出液管中35℃增菌培養，18-24h后置于伊紅美蘭平板35℃培養，18-24h后計數鑒定。菌群易位率＝培養陽性的樣本數/檢測的總樣本數×100％。
(2)末端回腸粘膜免疫組化和Peyer’s結MAdCAM-1、CD4、CD8、IgA分析 所有組織標本用10％中性緩沖福爾馬林固定；采用石蠟包埋，5μm厚連續切片，經脫臘、水化及0.01mol/L(PH6.0)檸檬酸鹽緩沖液抗原修復后滴加抗體。使用HPIAS1000高清晰度彩色圖文病理報告分析系統，光密度法測定每視野相應細胞CD4、CD8、MAdCAM-1、IgA密度，并計算陽性顯色面積占測量窗內的百分比。
5.結果分析 (1)各實驗組一般情況及死亡情況 實驗組大鼠造模24h后均出現不同程度萎靡不振，對外界刺激反應度下降，其中以PN組最為明顯。
PN+EN+LP-Onlly組死亡率明顯低于PN組(P＜0.05)，PN+EN組與PN組相比差異無統計學意義(P＞0.05)，但總體優于PN組(5238％VS 7561％)；PN+EN組與PN+EN+LP-Onlly組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。
表1各組死亡率％ 與PN組相比△P＝0.0641 △△P＝0.0455 以上結果提示，植物乳桿菌LP-Onlly與腸內營養組合，有助于提高重癥急性胰腺炎大鼠的存活率。
(2)菌群易位率 PN+EN組、PN+EN+LP-Onlly組低于PN組，其中PN+EN+LP-Onlly組最低，PN+EN組與PN+EN+LP-Onlly組相比差異無統計學意義(P＝0.6256)。
表2.各組臟器菌群易位率％ 與PN組相比，△P＝0.0003，△△P＝0.0001 以上結果提示，植物乳桿菌LP-Onlly與腸內營養組合，有助于降低重癥急性胰腺炎大鼠臟器菌群易位率。
(3)末端回腸粘膜免疫組化 如
圖1～4和表3所示，模型實驗組末端回腸粘膜CD4、CD8、MAdCAM-1、IgA表達均低于正常對照組(P＜0.05)，表明重癥急性胰腺炎大鼠腸道免疫屏障功能損害，造模成功。但PN組與PN+EN組、PN+EN+LP-Onlly組相比，前者明顯低于后兩組，且有顯著性差異(P＜0.05)；而后兩組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)，但總體上添加植物乳桿菌LP-Onlly組數值高于PN+EN組。表明重癥急性胰腺炎大鼠給予腸外營養+腸內營養和腸外營養+腸內營養+植物乳桿菌LP-Onlly較單純腸外營養組有助于改善腸道免疫屏障功能；該結果提示，植物乳桿菌LP-Onlly有助于提高回腸粘膜免疫功能。
表3.各組末端回腸粘膜免疫組化(％，
) △與其余組相比P＜0.05，*與其余組相比P＜0.05 (4)Peyer Patches免疫組化 如圖5～8和表4所示，模型實驗組Peyer Patches中CD4、CD8、MAdCAM-1、IgA表達均低于正常對照組(P＜0.05)，表明重癥急性胰腺炎大鼠腸道免疫屏障功能損害，造模成功。但PN組與PN+EN組、PN+EN+LP-Onlly組相比，在CD4和IgA表達中，前者明顯低于后兩組，且有顯著性差異(P＜0.05)；而后兩組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)，但總體上添加植物乳桿菌LP-Onlly組數值高于PN+EN組；而在CD8、MAdCAM-1表達中，PN組低于PN+EN組，且有顯著性差異(P＜0.05)，添加植物乳桿菌LP-Onlly組顯著低于PN+EN組(P＜0.05)。表明重癥急性胰腺炎大鼠給予腸內營養較單純腸外營養有助于改善腸道免疫屏障功能，而植物乳桿菌LP-Onlly則有助于提高Peyer Patches中CD8和粘附分子MAdCAM-1的表達，該結果提示植物乳桿菌LP-Onlly可提高腸淋巴細胞歸巢，增強腸道免疫屏障功能。
表4.各組Peyer Patches免疫組化(％，
) △與PN組相比P＜0.05，#與PN+EN組相比P＜0.05，*與其余組相比P＜0.05 6.結論 上述結果表明，本發明植物乳桿菌LP-Onlly有助于提高Peyer Patches中CD8和粘附分子MAdCAM-1的表達，提示植物乳桿菌LP-Onlly可提高腸淋巴細胞歸巢，增強腸道免疫屏障功能。植物乳桿菌LP-Onlly與腸內營養成分組合將提高末端回腸粘膜和Peyer Patches中CD4、CD8、MAdCAM-1和IgA的表達，增強腸道免疫屏障功能。
實施例2植物乳桿菌LP-Onlly與腸內營養組合對重癥胰腺炎患者自然病程的影響 1.重癥急性胰腺炎患者篩選 選擇30例符合急性重癥胰腺炎診斷標準的患者。30例患者中男性17例，女性13例；年齡20-87歲(平均59.9±16.4歲)；發病至入院平均時間25.6±15.6小時；30例患者發病均有腹痛癥狀，發熱(T＞38℃)，WBC升高(＞109/L)，血/尿淀粉酶升高(血淀粉酶＞110U/L；尿淀粉酶＞641U/L)；血淀粉酶最高6500U/L，平均1236±1373U/L；尿淀粉酶最高20000U/L，平均5636±6439U/L。入院時18例伴有黃疸(總膽紅素＞18μmol/L)；13例伴有肝功能異常(ALT＞65U/L或AST＞37U/L)；6例伴有腎功能異常(BUN＞6.4mmol/L或Cr＞115μmol/L)。30例均采取保守治療。凡需外科手術干預者，病情過重者(APACHE II評分＞25分)，有嚴重代謝性疾病者(糖尿病，高脂血癥等)，不在本研究之列。
2.植物乳桿菌LP-Onlly發酵液、腸外營養(PN液)、腸內營養(EN液)組成 本發明中采用的植物乳桿菌LP-Onlly發酵液，是以植物乳桿菌LP-Onlly為出發菌株發酵豆芽生產的“昂立一號口服液”，產品中含有活性植物乳桿菌LP-Onlly，活菌數量達1.0×106～2.0×108CFU/ml，該產品由上海交大昂立股份有限公司生產。
PN液為常規腸外營養成份，由葡萄糖、氨基酸、脂肪乳劑、維生素、礦物質等組成。
EN液采用荷蘭紐迪希亞Nutricia(Zoetermeer)公司的百普素(Nutricia，126g/袋，可沖成500ml營養液)為主要能源。
3.實驗分組及治療方法 30例重癥急性胰腺炎隨機分為三組，即常規治療組(常規組)、腸外營養治療組(PN組)和植物乳桿菌LP-Onlly聯合腸外和腸內營養治療組(LP-Onlly組)。
(1)常規治療組 采用傳統禁食，胃腸減壓，常規液體治療，全量補液，約3000ml/天，以10％GS、5％GS為主，部分5％GNS，平衡液等，補液中按葡萄糖∶胰島素比約6g∶1g加入胰島素。電解質需要量NaCl 4.5g/天，KCl 3g/天。靜脈使用頭孢呋辛鈉(6g/天)、滅滴靈(200ml/天)等抗生素。對低蛋白血癥者使用人體白蛋白糾正，靜脈補充10-20g/天。入院初期生長抑素(施他寧或善寧，6mg/24h維持)抑制消化腺分泌。一般至患者腹部體征緩解，無腹脹，嘔吐等，可停止胃腸減壓。血常規，血/尿淀粉酶正常3天以上，可考慮逐步開放飲食。
(2)腸外營養組(PN組) PN經中心靜脈輸注，實施時間1周。以50％葡萄糖和20％脂肪乳劑(Intralipid，SSPC)提供能量，供熱量25-30kcal/kg/天，糖脂供能比1-2∶1；以8.5％樂凡命(Novamin，SSPC)供氮，供氮量為0.12-0.15g/kg/天。同時加入維生素(水樂維他，SSPC)、微量元素(安達美，SSPC)和K+、Na+等電解質；按葡萄糖∶胰島素的比例為4-5g∶1g加入胰島素，所有營養液混入三升袋中，營養液輸入時間不少于12-14h(PN配方見表4)。同樣使用頭孢呋辛鈉、滅滴靈等抗生素，善寧、施他寧等生長抑素，使用方法同常規組，不使用血漿或人體白蛋白等制劑。
(3)植物乳桿菌LP-Onlly聯合腸外和腸內營養組(LP-Onlly組) 實施時間1周。能量供應同PN組。EN開始后第1-2天予百普素126g/天，3天后予百普素252g/天，輸注速度120ml/h。能量不足部分由PN補充，PN部分由10％GS和20％脂肪乳劑(Intralipid，SSPC)供能，8.5％樂凡命(Novamin，SSPC)供氮，經外周靜脈途徑輸注，輸注單瓶脂肪乳劑和樂凡命時，控制輸液速度約120ml/h。實施EN同時合并使用植物乳桿菌LP-Onlly(使用量50ml/天，經空腸營養管注入)。滅滴靈等抗厭氧菌藥物不予使用，頭孢呋辛鈉等仍正常使用同常規組，不使用血漿或人體白蛋白等制劑。
4.觀察指標 (1)血/尿淀粉酶，血常規，肝腎功能 靜脈采血，碘比色法測血/尿淀粉酶；全自動血細胞分析儀測定血常規和肝腎功能。
(2)血漿內毒素 內毒素試劑盒(美國Accociates of Cape Cod公司LAL試劑盒)測治療前后血漿內毒素變化。
(3)并發癥 患者出院后對病史資料進行整理統計，包括并發癥、住院時間、住院費用。并發癥包括胰腺局部并發癥(胰腺壞死，胰腺膿腫，胰腺假性囊腫)、全身并發癥(敗血癥，臟器功能衰竭)、PN并發癥(導管感染，代謝并發癥)、EN并發癥(導管阻塞，嘔吐，腹瀉)。
5.結果分析 (1)血/尿淀粉酶、血常規、肝腎功能 三組間上述指標均無統計學差異(P＞0.05)(詳見表5和表6)。隨時間變化，各指標變化趨勢一致。總體上血/尿淀粉酶，WBC等均呈下降趨勢并逐漸恢復正常。
表5.血/尿淀粉酶 表6.WBC，肝腎功能 (2)血漿內毒素 治療前三組血漿內毒素平均值無統計學差異。常規組第二周內毒素水平較第一周升高(p＜0.05)；PN組變化不明顯(p＞0.05)；LP-Onlly組則有顯著降低(p＜0.05)。比較治療后的內毒素水平，LP-Onlly組顯著低于常規治療組(p＜0.01)，與PN組比較無統計學差異(表7)。該結果提示，植物乳桿菌LP-Onlly聯合腸外和腸內營養有助于降低重癥急性胰腺炎患者的內毒素水平，增強腸屏障功能。
表7.治療前后血漿內毒素變化(Pg/ml) 注*與第1周比較p＜0.05，#與第1周比較p＜0.05 △與常規組比較p＜0.01 (3)并發癥 常規治療組1例患者入院1周后出現腎功能衰竭，并發呼吸功能衰竭。入院第13天家屬放棄治療后死亡。其余29例患者均治愈出院。統計病程中并發癥情況見表8)。可見PN組和LP-Onlly組在嚴重并發癥方面(胰腺局部并發癥、敗血癥、器官功能衰竭)少于常規組。該結果提示，植物乳桿菌LP-Onlly聯合腸外和腸內營養有助于緩解重癥急性胰腺炎患者的病發癥，減輕病情。
表8.并發癥情況 (4)住院天數和住院費用 統計學分析表明，總費用常規治療組顯著高于PN組和LP-Onlly組(p＜0.01)，PN組和LP-Onlly組之間無統計學差異(P＞0.05)。住院天數LP-Onlly組20.9天低于常規組34.8天和PN組24.2天。該結果提示植物乳桿菌LP-Onlly聯合腸內營養有助于重癥急性胰腺炎患者減少并發癥、降低治療費用、以及縮短住院時間。
表8.住院天數(天)與費用(元) 注**與常規組比較(p＜0.01) 6.結論 本發明植物乳桿菌LP-Onlly聯合腸內營養有助于減少腸道內毒素的吸收、增強腸道屏障功能，減少并發癥發生率，降低住院費用，縮短住院天數。
權利要求
1.一種含有植物乳桿菌的組合物，其特征在于，所述組合物包括植物乳桿菌LP-Onlly和腸內營養液；
其中植物乳桿菌LP-Onlly，CGMCC NO.1258，其16S RNA基因序列于Gene Bank(NCBI)備案，其登錄號為AY590777；
所述腸內營養液為常規的腸內營養成分或具有藥理學作用的營養液。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物中還含有常規的腸外營養成分。
3.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述具有藥理學作用的營養液是谷氨酰胺、精氨酸、ω-3脂肪酸、牛磺酸、抗氧化劑、蛋白寡肽、麥芽糖糊精、葡萄糖糖漿、乳清蛋白水解物、植物油、中鏈甘油三酯、維生素、礦物質或者微量元素。
4.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述植物乳桿菌LP-Onlly的載體可以為該菌株發酵的培養基。
5.根據權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述培養基是基于豆芽、谷芽。
6.根據權利要求5所述的組合物，其特征在于，所述培養基還含有水溶性膳食纖維、低聚糖。
7.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述植物乳桿菌LP-Onlly的載體為口服液，活菌數量達1.0×106～2.0×108CFU/ml。
8.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述植物乳桿菌LP-Onlly的載體為固體劑型，活菌數量達1.0×108～2.0×1010CFU/g。
9.根據權利要求1～8所述的任一組合物，其特征在于，所述組合物為獨立組合包裝或混合包裝。
10.權利要求1所述的組合物應用于增強腸道免疫屏障、預防和/或治療腸道炎癥及感染性疾病。
全文摘要
本發明涉及一種含有乳桿菌屬、植物乳桿菌種、植物乳桿菌株LP－Onlly的組合物及其在增強腸道免疫屏障中的應用。本發明的組合物通過干預腸淋巴細胞歸巢、腸道分泌性IgA和腸道淋巴細胞數量、降低內毒素水平，改善腸道免疫屏障，增強腸道屏障功能，防止饑餓、營養不良、長期全腸外營養、感染、應激、損傷、免疫紊亂等疾病所引起的腸道免疫屏障破壞，預防和/或治療腸道炎癥、感染性疾病和免疫紊亂疾病的發生。
文檔編號A61K38/00GK1985854SQ20061014773
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月22日 優先權日2006年12月22日
發明者蘭先德, 范小兵, 杭曉敏, 張和春, 楊國, 潘玉輝 申請人:上海交大昂立股份有限公司