專利名稱：一種含有植物乳桿菌的組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種含有植物乳桿菌的組合物，所使用的植物乳桿菌LP-Onlly，CGMCC NO.1258，其16S rRNA基因GeneBank(NCBI)序列登錄號為AY590777。組合物中含有植物乳桿菌LP-Onlly活菌和/或死菌體及其代謝產物，還含有一種或多種中草藥提取物，如甘草、蒲公英、黨參、白芍、黃芪等。該組合物作為食品或藥品，適于長期食用，主要用于預防和/或輔助治療由幽門螺桿菌感染引起的消化性潰瘍、慢性胃炎等疾病。
背景技術：
幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori，HP)是一種螺旋狀，革蘭氏染色陰性，微需氧性細菌，能在人胃低pH值環境下生長繁殖。它與消化性潰瘍、慢性活動性胃炎、萎縮性胃炎相關，并與胃癌及MALT淋巴瘤發生的危險性增加有關。我國于1985年首次分離出HP之后，對HP進行了大量的基礎和臨床研究，證實了HP感染是消化性潰瘍發病的主要原因。消化性潰瘍常見于十二指腸潰瘍和胃潰瘍，絕大多數患者伴有HP感染，94％的十二指腸潰瘍和84％的胃潰瘍胃竇粘膜活檢檢出HP感染。
鑒于HP是消化性潰瘍的主要致病因素，大多數胃腸病專家主張應用抗菌療法。目前的治療方案主要是應用制酸劑及胃粘膜保護劑，同時給予抗HP的抗生素藥物。這些方案包括含鉍劑三聯、含質子泵抑制劑(PPI)三聯、含雷尼替丁膠體鉍(RBC)三聯療法等。鉍劑三聯療法為膠態次枸櫞酸鉍(CBS)加甲硝唑及四環素或阿莫西林。PPI三聯療法為PPI加上阿莫西林和甲硝唑。RBC三聯療法為RBC再加阿莫西林或甲硝唑。目前的三聯療法治療方案雖然可使HP的根除率提高到80％以上，但副作用的發生率約超過30％，有惡心、嘔吐、腹瀉、頭痛、胃納差、真菌感染，甚至發生偽膜性腸炎等，在很大程度上影響了治療的效果。其次，治療過程中HP對抗菌藥物可產生耐藥性，極大地影響了抗菌療效。
目前，基于中草藥的清熱化濕、養胃健脾、理氣和中、消炎止痛等機理，我國已開發了多種中藥制劑以預防和輔助治療幽門螺桿菌感染，如ZL1171952，“抗幽門螺桿菌中藥制劑”，主要采用黃連、黃芩、黃柏的抗菌消炎作用，而這類中藥制劑一般而言服用劑量大，且由于中藥原料可能存在的毒副作用，不宜長期服用。因此，要進一步提高療效、減少耐藥菌株、降低復發率，應尋找和設計可長期食用的組合物以預防及輔助治療由幽門螺桿菌感染所致的消化性潰瘍、慢性胃炎等疾病。
發明內容
本發明的目的是提供一種含有植物乳桿菌活菌和/或死菌體及其代謝產物的組合物。該組合物實質為植物乳桿菌LP-Onlly菌體及其代謝產物和藥食兩用植物原料的組合物，可通過常規食品輔料制成液體、散劑、片劑或膠囊。該組合物可食用或作藥用，主要用于預防和/或輔助治療由幽門螺桿菌感染引起的消化性潰瘍、慢性胃炎等疾病。
實現上述發明目的的解決方案是一種含有植物乳桿菌的組合物，其中植物乳桿菌LP-Onlly，CGMCCNO.1258，其16S rRNA基因序列為AY590777及與一種或多種藥食兩用原料的組合物具有預防和/或輔助治療幽門螺桿菌感染作用，這些原料包括甘草、蒲公英、黨參、白芍及黃芪提取物。
上述的組合物中，植物乳桿菌LP-Onlly用量范圍為0.05～10％，植物提取物的合適的用量范圍為4.5～20％，其余為常規食品輔料。
一種含有植物乳桿菌的組合物，其中植物乳桿菌LP-Onlly，CGMCCNO.1258，其16S rRNA基因序列為AY590777及與一種或多種藥食兩用原料的組合物具有預防和/或輔助治療由幽門螺桿菌感染引起的消化性潰瘍、慢性胃炎等疾病，這些原料包括甘草、蒲公英、黨參、白芍及黃芪提取物。
上述的組合物中，植物乳桿菌LP-Onlly用量范圍為0.05～10％，植物提取物的合適的用量范圍為4.5～20％，其余為常規食品輔料。
本發明的組合物包括植物乳桿菌LP-Onlly活菌和/或死菌體及其代謝產物，還包括下列一種或多種藥食兩用植物提取物，如甘草、蒲公英、黨參、白芍、黃芪等，與常規食品輔料按一定比例組合，制成液體、散劑、片劑或膠囊等產品。其中植物乳桿菌LP-Onlly活菌和/或死菌體及其代謝產物、藥食兩用植物提取物為組合物的有效成分。根據組合物應用目的，如預防、保健或治療等，確定有效成分用量，植物乳桿菌LP-Onlly活菌和/或死菌體及其代謝產物合適的用量范圍為0.05～10％，植物提取物的合適的用量范圍為4.5～20％，其余為常規食品輔料。
具體實施例方式
本發明的植物乳桿菌LP-Onlly直接自健康嬰兒糞便中分離獲得，其形態為桿狀，革蘭氏染色陽性，不形成芽孢，產生乳酸，兼性厭氧。它能利用L-阿拉伯糖、山梨醇、蜜二糖、D-松二糖、D-阿糖醇、葡萄糖酸鈉、α-甲基-D-甘露糖甙，不能利用山梨糖、鼠李糖、D-塔格糖、α-甲基-D-葡萄糖甙。
其發酵過程于MRS液體培養基中37℃培養72h。
該植物乳桿菌LP-Onlly已于2004年12月6日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址中國北京市海淀區中關村一條13號，中國科學院微生物研究所)保藏，并收到保藏登記號CGMCC NO 1258。
本發明涉及的植物乳桿菌，其16S rRNA基因序列于GeneBank(NCBI)備案，其登錄號為AY590777。
下面結合實施例進一步說明本發明實施例1菌株鏡檢無菌條件下用接種環挑植物乳桿菌LP-Onlly，涂于載玻片上，制片并革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體形態。
實施例2MRS平板純化分離無菌條件下用接種環挑植物乳桿菌LP-Onlly，在MRS平板上劃線，平板置于培養箱中37℃培養72h，挑選單菌落進行鏡檢，達到菌株純種分離。
實施例3菌株發酵用接種環將植物乳桿菌LP-Onlly從斜面上挑取二環至裝有50ml MRS液體培養基中，37℃培養24h，再以5％接種量接入50ml MRS液體培養基中，37℃培養72h，即得植物乳桿菌LP-Onlly發酵液。
實施例4體外抑制HP作用采用平板孔阱擴散法進行抑菌活性檢測。實驗以生理鹽水作為對照，用植物乳桿菌LP-Onlly發酵原液、5倍濃縮液、含0.05％植物乳桿菌LP-Onlly和4.5％甘草提取物組合物及含10％植物乳桿菌LP-Onlly和20％甘草提取物組合物進行體外抑制HP實驗。結果如表1所示。
表1樣品對HP的抑制作用
表1結果表明，植物乳桿菌LP-Onlly發酵原液、5倍濃縮液、含5％LP-Onlly和5％甘草提取物組合物及含10％植物乳桿菌LP-Onlly和20％甘草提取物組合物均對HP有明顯的抑制作用，其抑菌圈直徑分別為9、15、15及17mm。
實施例5體外抑制HP粘附胃上皮細胞作用人胃癌細胞株MKN-28按常規傳代培養于含10％小牛血清的DMEM培養液中，細胞接種于含蓋玻片的六孔板，待在蓋玻片上形成單層細胞后，進行粘附實驗。六孔板中培養的細胞以DMEM洗滌2次后，每孔中加入0.8ml含2％小牛血清的DMEM和0.2ml的HP菌懸液，再分別加入植物乳桿菌LP-Onlly5倍濃縮液、含0.05％植物乳桿菌LP-Onlly和4.5％甘草提取物組合物及含10％植物乳桿菌LP-Onlly和20％甘草提取物組合物各1ml，在對照孔中加入1.8ml含2％小牛血清的DMEM和0.2ml的HP菌懸液，混勻，37℃、5％CO2孵箱中培養3h。然后用無菌生理鹽水沖洗3次，甲醇固定15min，瑞氏染色法染色，干燥后用中性樹脂固定，油鏡下觀察，記數50個MKN-28細胞粘附的HP數目，取平均值。HP粘附抑制率＝[1-(樣品孔的細胞粘附HP數目)/(對照孔的細胞粘附HP數目)]×100％。(表2)表2樣品平均HP粘附抑制百分率
表2結果表明，植物乳桿菌LP-Onlly發酵原液、5倍濃縮液、含5％LP-Onlly和5％甘草提取物組合物及含10％植物乳桿菌LP-Onlly和20％甘草提取物組合物均對HP粘附胃上皮細胞具有明顯的抑制作用。
實施例6HP感染BALB/c小鼠模型實驗HP臨床分離株經純培養后，用無菌布氏肉湯制備菌液，濃度為109CFU/ml，實驗選用6周齡雄性BALB/c小鼠，小鼠胃內直接注射109CFU/ml HP菌液0.2ml/只，造成HP感染小鼠模型。將造模后的小鼠隨機分為樣品組和對照組，其中對照組(10只)小鼠灌喂蒸餾水，樣品組每次灌喂樣品0.2ml，每日2次，喂養八周后，用乙醚麻醉頸動脈取血處死小鼠，無菌取胃，沿胃大彎剪開，去除內容物，將胃組織置于HP選擇培養基上，粘膜面向下反復涂抹后分區劃線，培養基置厭氧罐中微需氧培養3～4d。根據菌落特點、革蘭氏染色、尿素酶試驗等鑒定HP。結果如表3所示。
表3樣品對HP感染小鼠模型的療效觀察
表3結果表明，HP感染鼠經灌喂植物乳桿菌LP-Onlly組合物后，HP感染率明顯下降，HP陽性檢出率從100％降到50％。這表明，植物乳桿菌LP-Onlly組合物具有預防和/或輔助治療幽門螺桿菌感染作用。
實施例7抗HP感染臨床實驗參與本發明臨床實驗的人群共40例，其中男性14例，女性26例，年齡12～94歲，平均年齡47.37歲，均為胃病專科門診患者，經碳十三尿素呼氣試驗確診為胃炎、消化性潰瘍或十二指腸球部潰瘍。受試人群每日服用組合物(含10％植物乳桿菌LP-Onlly和20％甘草提取物)100ml，每日三次，每服用5d后做碳十三尿素呼氣試驗復查一次。以檢查結果來判定療效，結果低于3.5者為轉陰；比服用前有一定幅度降低但直至滿15d尚未轉陰者視為有效；服用滿20d未見降低者視為無效。(表4)表4抗HP感染臨床實驗結果
表4結果表明，用含植物乳桿菌LP-Onlly的組合物來治療胃炎、消化性潰瘍或十二指腸球部潰瘍，總有效率達到70％。其中有效例數9例，治療前C13尿素呼氣試驗檢測平均值為33.94，治療15d后降低至17.68，平均每天降低數值為1.03；而在19例轉陰者中發現，服用含植物乳桿菌LP-Onlly的組合物5d后轉陰者為7例，治療前碳十三尿素呼氣試驗檢測平均值為15.97，治療5d后降低至14.94，平均每天降低數值為2.99；10d轉陰者7例，治療前平均數值為36.34，治療10d后降低至35.66，平均每天降低數值為3.57；15d轉陰者5例，治療前平均數值為29.15，治療15d后降低至26.31，平均每天降低數值為1.75。臨床實驗還發現本發明組合物在40例人群中未見發生任何不良反應。這表明，含植物乳桿菌LP-Onlly和20％甘草提取物的組合物可用來預防和/或輔助治療由幽門螺桿菌感染引起的消化性潰瘍、慢性胃炎等疾病。
權利要求
1.一種含有植物乳桿菌的組合物，其中植物乳桿菌LP-Onlly，CGMCCNO.1258，其16S rRNA基因序列為AY590777及與一種或多種藥食兩用原料的組合物具有預防和/或輔助治療幽門螺桿菌感染作用，這些原料包括甘草、蒲公英、黨參、白芍及黃芪提取物。
2.如權利要求1中所述的組合物中，植物乳桿菌LP-Onlly用量范圍為0.05～10％，植物提取物的合適的用量范圍為4.5～20％，其余為常規食品輔料。
3.一種含有植物乳桿菌的組合物，其中植物乳桿菌LP-Onlly，CGMCCNO.1258，其16S rRNA基因序列為AY590777及與一種或多種藥食兩用原料的組合物具有預防和/或輔助治療由幽門螺桿菌感染引起的消化性潰瘍、慢性胃炎等疾病，這些原料包括甘草、蒲公英、黨參、白芍及黃芪提取物。
4.如權利要求3中所述的組合物中，植物乳桿菌LP-Onlly用量范圍為0.05～10％，植物提取物的合適的用量范圍為4.5～20％，其余為常規食品輔料。
全文摘要
本發明涉及一種含有植物乳桿菌的組合物，所使用的植物乳桿菌LP－Onlly，CGMCC NO.1258，其16S rRNA基因GeneBank(NCBI)序列登錄號為AY590777。組合物中含有植物乳桿菌LP－Onlly活菌和/或死菌體及其代謝產物，還含有一種或多種中草藥提取物，如甘草、蒲公英、黨參、白芍、黃芪等。該組合物作為食品或藥品，適于長期食用，具有預防和/或輔助治療幽門螺桿菌感染作用，主要用于預防和/或輔助治療由幽門螺桿菌感染引起的消化性潰瘍、慢性胃炎等疾病。
文檔編號A61P31/00GK1660300SQ20041009331
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月21日 優先權日2004年12月21日
發明者范小兵, 杭曉敏, 沙大年, 張和春, 王勁松, 楊國, 周叢 申請人:上海交大昂立股份有限公司