專利名稱：含川芎嗪的糖皮質激素皮膚副作用明顯減少的外用藥劑的制作方法
技術領域：
糖皮質激素類外用藥劑是臨床治療皮膚病的常用藥物，但這些外用藥均有較大的副作用。本發明涉及一組療效高副作用少的含糖皮質激素與川芎嗪組成的外用藥劑。
背景技術：
20世紀50年代以來，糖皮質激素局部外用治療某些皮膚病取得了良好的效果。但自70年代以后，由于不適當地外用及濫用，局部副作用尤其是致皮膚萎縮逐漸增多。這給糖皮質激素的臨床外用帶來了困難。不適當使用糖皮質激素可導致一系列皮膚及系統性副作用。皮膚表現可有皮膚萎縮、萎縮紋、毛細血管擴張、色素沉著等。系統性副作用可有肌肉萎縮、骨質疏松、無菌性關節壞死、誘發精神癥狀、青光眼、白內障等。
川芎嗪是由中藥傘形科植物川芎(Ligusticum Chuanxiong)的根莖提取的有效成分，化學結構為四甲基吡嗪(Tetramethylpyrazine)。川芎辛香行散，溫通血脈，上行頭顛，下走血海，功能活血行氣，祛風止痛，被前人譽為血中之氣藥。現代研究表明，川芎嗪有解痙、降低血管阻力和強烈抑制血小板聚集的作用，對已聚集的血小板有解聚作用，能明顯降低全血粘度；還能增加冠脈流量、改善心肌供氧、降低心肌耗氧的作用，治療缺血性腦血管及冠心病效果良好，還可以治療偏頭痛和重癥肺心病。我國在20世紀70年代初，由北京制藥工業研究所從川芎提取物中分離出單體川芎嗪，現在已由人工合成。
本課題組發現川芎嗪可有效防治環磷酰胺所誘致的大鼠骨質疏松。在尋找能增加糖皮質激素的療效，減少其不良反應的藥物組合物的研究中，，我們發現川芎嗪與糖皮質激素組成外用制劑局部外用于皮膚，既有協同抗炎效應，又不會導致皮膚萎縮，為我們開發糖皮質激素組成外用制劑提供了很好的選擇。
發明內容
本發明發現在糖皮質激素外用制劑加入川芎嗪，與糖皮質激素組成復方后能增強糖皮質激素的抗炎作用，減輕其不良反應，可用于防治各種糖皮質激素外用制劑適應癥。糖皮質激素外用制劑是臨床上治療皮膚病的重要藥物，已知可用于防治皮膚疾病的糖皮質激素類藥物有醋酸潑尼松，醋酸潑尼松龍，醋酸氫化可的松，醋酸可的松，甲潑尼松，曲安西龍，地塞米松，倍他米松，氟氫可的松，氯潑尼醇，地夫可特，氟米龍，曲安奈德，布丁奈德，莫米松，氯倍他索，氟氫松，丁氯倍他松，倍氯米松，氯氟輕松，阿氯米松，鹵米松，甲羥松，去羥米松，氟氫縮松，二氟可龍；這些藥物不少也已經配成外用的藥膏如軟膏劑、乳膏劑；霜劑；膜劑，凝膠劑。但糖皮質激素外用制劑長期大劑量使用可造成一系列嚴重的不良反應，如果在這些制劑中加入川芎嗪，可以減輕糖皮質激素的不良反應。
具體實施例方式本發明方案是設計了下述研究處方進行實驗1.復方川芎嗪曲安縮松涂劑取70ml無水乙醇先把實驗用量的曲安縮松溶解，充分溶解后，加入川芎嗪，充分溶解后，再加入30ml蒸餾水，即可。實驗用量的曲安縮松是指每100毫升的溶液中含曲安縮松0.05～0.5克，川芎嗪用量為，每100毫升的溶液中含0.1～2克。
2.復方川芎嗪地塞米松乳劑取醋酸地塞米松0.25克，川芎嗪10克，乳膏基質(硬脂酸100克，液狀石臘160克，白凡士林50克，單硬脂酸甘油酯50克，三乙醇胺2克，十二烷基硫酸鈉2克，甘油125克，10％羥苯乙酯溶液10毫升)蒸餾水470毫升，按乳膏的生產工藝制備成1000克乳劑，供研究及臨床應用。本復方醋酸地塞米松可在0.1～0.25克，川芎嗪5～20克之間調整。
根據研究或臨床應用需要，上述涂劑中的曲安縮松，乳劑中的地塞米松，可采用醋酸氫化可的松，醋酸可的松，甲潑尼松，曲安縮松，氟氫可的松，莫米松，氯倍他索，氟氫松，倍氯米松，氯氟輕松來替代。
實施例一為了觀察外用曲安縮松誘發皮膚萎縮的小鼠皮膚組織病理學特征、皮膚相關的生化指標以及免疫器官的變化；同時，觀察復方川芎嗪曲安縮松涂劑對對糖皮質激素皮膚不良反應的防治作用，我們開展了下述實驗1.實驗方法1.1材料1.1.1實驗動物及飼養條件初始體重20士2g的三月齡清潔級昆明種小鼠30只，雌雄各半(廣東醫學院實驗動物中心提供)。飼養條件飼養室內溫度保持24℃～28℃，濕度在50％～60％。分籠普通喂養。每籠10只，自由攝食攝水，專室飼養，專人負責，實驗前及每周稱體重一次。動物飼養3周。
1.1.2主要儀器SHH.W21.600三用電熱恒溫水浴箱 天津市華北實驗儀器有限公司華凌電冰箱 BCD-205WE廣東752型紫外分光光度計 上海第三分析儀器廠內切式組織勻漿機浙西機械廠55p-72超速離心機日本HITACHTAE-240型電子分析天平Mettle-Toledo儀器(上海)有限公司半自動圖像數字化分析儀包括光鏡和熒光顯微鏡Nikon日本計算機 Macintosh IICi，美國蘋果公司產品數字化板報 SummaSketch II plusKSS Image Analysis(version2.0) KSS Scientific consultants，UT USAKSS Stereologe(version2.0) KSS Scientific consultants，UT USALEICA MPS30熒光-光學顯微鏡及顯微照相機 德國LEICA公司1.1.3主要試劑考馬司亮蘭G250 南京建成生物科技公司羥脯氨酸試劑盒 南京建成生物科技公司SOD試劑盒 南京建成生物科技公司MDA試劑盒 南京建成生物科技公司1.1.4研究藥物及配制方法(1)各組所涂用的藥物1組空白對照組，取70ml無水乙醇，加蒸餾水至100ml即可；2組曲安縮松模型組，用70ml無水乙醇把0.2g曲安縮松溶解，加入30ml蒸餾水，配制濃度為0.2g/100ml溶液；3組復方川芎嗪曲安縮松涂劑。
(3)脫毛劑硫化鈉購自廣州化學試劑廠。配制方法稱取硫化鈉25g，加水50ml，加溫溶解，然后加入聚乙烯10m，充分混合即可。
(4)三氯化鐵廣東省臺山市化工廠。配制方法三氯化鐵29g，蒸餾水加至100ml。
(5)堿性品紅上海化學試劑公司。
(6)間苯二酚上海山浦化工有限公司。
(7)Weigert溶液配制方法堿性品紅2g，間苯二酚4g，三氯化鐵25ml，濃鹽酸4ml，蒸餾水200ml。
(8)蘇木素上海化學試劑公司。
(9)Weigert鐵蘇木素液配制方法A液蘇木素1g；無水酒精100ml。
B液30％三氯化鐵4ml，蒸餾水100ml，純鹽酸1ml。
A、B兩液需分瓶盛放，臨用前A液B液等量混合。
(10)Van Gieson染液配制方法A液1％酸性品紅水溶液。
B液苦味酸飽和水溶液(約1.22％)。
A、B兩液需分瓶盛放，臨用前取A液1份B液9份混合后使用。
(11)1％鹽酸酒精液配制方法70％酒精99ml，純鹽酸1ml，充分混合即可。
2.2方法2.2.1實驗設計分組根據實驗所需，分為空白對照組、曲安縮松模型組、復方川芎嗪曲安縮松涂劑組。每組10只小鼠。
2.2.2動物背部脫毛及涂藥實驗前，用脫毛劑在背部尾上1cm處始，向頭頸方向沿背部正中線兩側對稱脫毛面積約4cm2，成一矩形，并用清水沖洗小鼠背部，避免脫毛劑的殘留。各組以對應的藥物外涂于背部，每次涂0.01ml/cm2，每天兩次，共三周，實驗前及實驗開始后每周稱重一次。
2.2.3取材所有小鼠用藥三周后，眼球取血處死。取背部正中皮膚，取一1cm×1cm大小皮膚迅速放入10％中性甲醛液中固定，擬作組織切片進行組織病理形態學觀察及定量分析；另取余背部皮膚迅速冰凍保存，擬作皮膚組織勻漿測皮膚羥脯氨酸、SOD及MDA含量。取小鼠胸腺、脾，稱濕重，觀察其變化。
2.2.4皮膚生化指標的檢測(1)10％皮膚組織勻漿的制備①取脫毛后的皮膚組織塊0.5g左右，經冷生理鹽水漂洗，除去皮下脂肪和其它結締組織，濾紙拭干，稱重，放入10ml的小燒杯中。
②用量筒取該組織塊重量9倍的預冷的生理鹽水，取2/3倒入裝有組織塊的燒杯中，用眼科小剪盡快剪碎組織塊，然后倒入勻漿管中將剩余的1/3生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的組織塊，一起倒入勻漿管，用內切式組織勻漿機攪拌制成10％組織勻漿(勻漿時間10次/秒，間歇3秒，連續7～10次，在冰水中進行)。
③取少量組織勻漿直接涂片，在顯微鏡下觀察細胞的破碎情況，若破碎不全，則反復凍溶三次，使其完全破碎，使胞內容物完全游離在液相中。
(2)皮膚組織羥脯氨酸、SOD及MDA含量測定參照南京建成生物工程公司試劑盒說明方法測定。羥脯氨酸，以微克/毫克蛋白(μg/mgprot)為單位；SOD，每毫克組織蛋白在1ml反應液中SOD抑制率達50％時所對應的SOD量為一個SOD活力單位(U)，以活力單位/毫克蛋白(U/mgprot)表示；MDA，以納摩爾/毫克蛋白(nmol/mgprot)為單位。皮膚組織蛋白含量的測定，按照考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒說明書進行。
2.2.5組織切片染色及鏡下觀測內容(1)彈力纖維染色采用Weigert間苯二酚-堿性品紅染色法操作方法①石蠟切片，脫蠟至水，蒸餾水洗。
②0.25％高錳酸鉀氧化10分鐘。
③0.5％草酸漂白為止。
④蒸餾水洗后95％酒精洗一次。
⑤直接浸入Weigert溶液20～60分鐘。
⑥0.5％鹽酸酒精分化，觀察背景無色彈力纖維清楚為好。
⑦水洗，快洗后進二甲苯透明，中性樹膠封固。
(結果彈力纖維呈黑藍色。)(2)膠原纖維染色采用Van Gieson染色法操作方法①組織固定10％福爾馬林液，常規脫水包埋。
②切片脫蠟至蒸餾水。
③用Weigert鐵蘇木素液染10～20分鐘。
④流水稍沖洗。
⑤1％鹽酸酒精迅速分化。
⑥流水沖洗后蒸餾水沖洗。
⑦用VanGieson液染3～5分鐘。
⑧傾去染液，直接用95％酒精分化和脫水。
⑨無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。
(結果膠原纖維呈紅色，肌纖維、胞質及紅細胞呈黃色，細胞核呈藍褐色。)(3)表皮細胞染色采用HE染色法染色。操作方法略。
(4)鏡下觀察皮膚表皮，真皮膠原纖維、彈力纖維變化情況主要觀察皮膚表皮厚度，細胞層數，基底層細胞排列分布及形態；觀察真皮層膠原纖維、彈力纖維的形態及數量。
(5)表皮厚度，彈力纖維面積的測量采用LEICA MPS30熒光-光學顯微鏡下攝影，應用相應計算機以KSS Image Analysis圖像分析軟件，在每組隨機選擇4-6個高倍鏡視野，測量皮膚表皮厚度及真皮彈力纖維面積平均值。
2.3統計學分析運用SAS軟件進行單因素分析，先采用SAS中的UNIVARIATE過程檢驗方差齊性，若方差相等采用方差分析，組間比較再采用SNK-q檢驗；若方差不齊則采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，再用Nemenyi檢驗比較兩組間差別。
3.實驗結果(1)各組表皮形態學觀察及計算機圖像定量分析實驗結果可見曲安縮松模型組小鼠表皮厚度明顯變薄，細胞層數減少，基底細胞排列散亂，細胞大小不一。正常對照組小鼠表皮厚度較厚，由3～5層細胞組成，可見明顯的角質層，棘細胞散在分布，基底細胞呈立方形，排列整齊。與曲安縮松模型組相比，復方川芎嗪曲安縮松涂劑組小鼠表皮厚度及細胞層數均增加，細胞大小一致，基底細胞呈立方形，排列緊湊，可見角質層。
各用藥組小鼠表皮厚度計算機圖像定量分析見表3.1表3.1小鼠表皮厚度計算機圖像分析系統定量分析結果
注(1)與曲安縮松模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05；(2)變化比例1與正常對照組比較，變化比例2與曲安縮松模型組比較。
從表3.1可見，曲安縮松模型組小鼠表皮厚度較正常對照組減少了39.5％，差異有統計學意義(P＜0.05)。復方川芎嗪曲安縮松涂劑組表皮厚度比曲安縮松模型組增加了36.2％差異有統計學意義(P＜0.05)。
(2)各組真皮彈力纖維形態學觀察及計算機圖像定量分析實驗結果可見曲安縮松模型組小鼠彈力纖維變短、減少，散在性分布。正常對照組小鼠彈力纖維細長，有輕微彎曲度，分布廣泛，排列相對有序。與曲安縮松模型組相比，復方川芎嗪曲安縮松組小鼠彈力纖維增多，部分彈力纖維細長，部分彈力纖維斷裂，呈散在性分布。各用藥組小鼠真皮彈力纖維面積計算機圖像定量分析見表3.2表3.2小鼠皮膚彈力纖維面積計算機圖像分析系統定量分析結果
注(1)與曲安縮松模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05；(2)變化比例1與正常對照組比較，變化比例2與曲安縮松模型組比較。
從表3.2可見，曲安縮松模型組小鼠彈力纖維面積較正常對照組減少了26.8％，差異有統計學的意義(P＜0.05)。復方川芎嗪曲安縮松組彈力纖維面積比曲安縮松模型組增加了40.1％差異有統計學意義(P＜0.05)。
(3)各組真皮膠原纖維形態學觀察實驗結果可見曲安縮松模型組真皮膠原層厚度變薄，膠原束斷裂甚至破碎，排列疏松且紊。正常對照組膠原纖維豐富，排列緊密，呈束狀排列，走向與皮面平行，呈波紋狀。與曲安縮松模型組相比，復方川芎嗪曲安縮松涂劑組小鼠膠原纖維增厚，膠原束排列規整、致密。
(4)各用藥組皮膚生化指標的檢測①各用藥組小鼠羥脯氨酸含量的檢測見表3.3表3.3大鼠皮膚組織羥脯氨酸含量檢測結果
注(1)與曲安縮松模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05；(2)變化比例1與正常對照組比較，變化比例2與曲安縮松模型組比較。
從表3.3可見，曲安縮松模型組羥脯氨酸含量較正常對照組降低了31.1％，差異有統計學的意義(P＜0.05)。復方川芎嗪曲安縮松涂劑組羥脯氨酸含量比曲安縮松模型組增加了56.4％，差異有統計學意義(P＜0.05)。
②各用藥組小鼠SOD活力的檢測見表3.4表3.4小鼠皮膚組織中SOD活力
注(1)與曲安縮松模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05；(2)變化比例1與正常對照組比較，變化比例2與曲安縮松模型組比較。
從表3.4可見，曲安縮松模型組SOD活力較正常對照組降低了30.3％，差異有統計學的意義(P＜0.05)。復方川芎嗪曲安縮松涂劑組SOD活力比曲安縮松模型組增加了52.5％，差異有統計學意義(P＜0.05)。
③各組小鼠MDA含量的檢測見表3.5
表3.5小鼠皮膚組織中MDA含量
注(1)與曲安縮松模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05；(2)變化比例1與正常對照組比較，變化比例2與曲安縮松模型組比較。
由表3.5可見，曲安縮松模型組MDA含量較正常對照組增加了36.9％，差異有統計學的意義(P＜0.05)。復方川芎嗪曲安縮松涂劑組MDA含量比曲安縮松模型組減少了32.7％，差異有統計學意義(P＜0.05)。
以上結果表明，復方川芎嗪曲安縮松組小鼠表皮層厚度增厚，彈力纖維均較激素組明顯增加，組織形態趨向正常空白對照組；皮膚SOD活性增強、皮膚羥脯氨酸含量增加，皮膚MDA含量下降均較曲安縮松組提高，差異有統計學意義，說明了川芎嗪可以預防曲安縮松所致的皮膚不良反應。
外用糖皮質激素致皮膚萎縮皮膚病理表現皮為膚嚴重萎縮，僅有2層(正常為3-4層)上皮細胞和一層薄的肌膜，脂肪細胞缺乏。川芎為一種活血化瘀的中藥，含多種成分，主要有揮發油、生物堿、酚性物質、以及內脂素、維生素A、葉酸、甾醇等。川芎嗪為川芎所含生物堿的一種。川芎嗪(Tetramethylpyrazine，TMP)是中藥川芎的一種生物堿。抗組織纖維化是川芍嗪藥理作用的一個重要方面，它具有抑制成纖維細胞增生，抑制成纖維細胞I、III型前膠原mRNA表達的作用。以往的研究中發現川芎嗪可抑制瘢痕中過度增殖的成纖維細胞從而發揮抗纖維化作用。也發現川芎嗪有抑制瘢痕成纖維細胞增殖及膠原的合成的作用。同時川芎嗪還具有鈣通道阻滯作用，而鈣通道阻滯劑對增生性疲痕有一定療效。本實驗發現川芎嗪具有拮抗外用曲安縮松致小鼠皮膚萎縮的作用這可能與川芎嗪對不同狀態下成纖維細胞細胞的不同作用有關，但具體的機制尚有待研究。
另一項研究證明，川芎也具有川芎嗪同樣的作用，用中藥川芎配制的含曲安縮松的外用制劑，也有增強療效，降低不良反應的作用。
研究還證明，用醋酸潑尼松，醋酸潑尼松龍，醋酸氫化可的松，醋酸可的松，甲潑尼松，曲安西龍，地塞米松，倍他米松，氟氫可的松，氯潑尼醇，地夫可特，氟米龍，曲安奈德，布丁奈德，莫米松，氯倍他索，氟氫松，丁氯倍他松，倍氯米松，氯氟輕松，阿氯米松，鹵米松，甲羥松，去羥米松，氟氫縮松，二氟可龍制備外用制劑時，可以加黃芪，黃芪多糖或黃芪總甙，以達到增加療效，減輕不良反應的作用。
權利要求
1.一種療效高副作用少的含糖皮質激素的外用藥劑，其特征是該外用藥劑同時含有曲安縮松和川芎嗪。
2.如權利要求1所述的一種療效高副作用少的含糖皮質激素的外用藥劑，其特征是該外用藥劑中川芎嗪可以由川芎替代。
3.如權利要求1所述的一種療效高副作用少的含糖皮質激素的外用藥劑，其特征是該外用藥劑中曲安縮松可以用其他可供外用的糖皮質激素，如醋酸潑尼松，醋酸潑尼松龍，醋酸氫化可的松，醋酸可的松，甲潑尼松，曲安西龍，地塞米松，倍他米松，氟氫可的松，氯潑尼醇，地夫可特，氟米龍，曲安奈德，布丁奈德，莫米松，氯倍他索，氟氫松，丁氯倍他松，倍氯米松，氯氟輕松，阿氯米松，鹵米松，甲羥松，去羥米松，氟氫縮松，二氟可龍替代。
4.如權利要求1所述的一種療效高副作用少的含糖皮質激素的外用藥劑，該藥物組合物可制成供皮膚外用的涂劑或霜劑。
全文摘要
本發明公開了由糖皮質激素與川芎嗪組成的療效高副作用少的糖皮質激素類供外用的藥物組合物。糖皮質激素是防治皮膚病的重要藥物，但糖皮質激素長期大劑量使用可造成一系列嚴重皮膚的不良反應，本發明發現川芎嗪與糖皮質激素組成復方后能增強糖皮質激素的抗炎作用，減輕其不良反應，可用于防治各種相關的皮膚疾病。
文檔編號A61K31/56GK101045060SQ20061015651
公開日2007年10月3日 申請日期2006年12月11日 優先權日2006年12月11日
發明者吳鐵, 崔燎, 陳志東, 高志祥, 高敏堅, 許宗嚴 申請人:廣東醫學院