專利名稱：：由植物物種制備葡糖胺的制作方法由植物物種制備葡糖胺本發明涉及制備葡糖胺含量等于或大于植物干物質的0.5%(wt)的粗制植物材料的方法。
背景技術：
：葡糖胺的用途在專利以及科學文獻中廣泛描述了純葡糖胺在關節病治療中的應用，其中所述純葡糖胺通常與來自各種天然來源的其他化合物或提取物組合。純葡糖胺作為葡糖胺鹽酸鹽或葡糖胺>5克酸鹽加入，并來自有殼的水生動物水解。例如，WO2000/0074696描述了"herbalcompositionscomprisingglucosamineandTrypterygiumwilfordii，Ligustrumlucidumand/orErycibeschmidtii，fortreatinginflammationordegenerationofjointtissues,e.g.arthritis(用于治療關節組織的炎癥或退化的草本組合物，所述草本組合物包含葡糖胺和雷公藤、女貞和/或丁公藤的草本組合物)，，，其中將純葡糖胺與植物制品混合。其他專利涉及作為飲食補充劑的植物糖類組合物(EP1172041或EP923382),其中葡糖胺源自殼多糖，即也來自有殼的水生動物水解。過去十年間已經深入研究了葡糖胺作為抗骨關節炎藥的應用。葡糖胺被懷疑是針對關節病，例如骨關節炎的唯一活性化合物(僅僅到最近，才發現癥狀療法，例如非類固醇抗炎藥是有效的)。還已經表明葡糖胺通過抑制MMP(基質金屬蛋白酶)，例如MMPl、MMP3和MMP13的生成來防止軟骨退化。有趣地，葡糖胺也與皮膚的老化過程有關，其主要以所述皮膚彈性的連續喪失和滋潤度的喪失為特征。皮膚老化體現為主結構改變和組成變化。最明顯地，老化的皮膚與年輕皮膚相比具有較少膠原和葡糖胺基聚糖。皮膚產生的葡糖胺基聚糖分子包括透明質酸(聚d-葡糖醛酸-d-乙酰基-d-葡糖胺)、琉酸軟骨素和硫酸皮膚素。皮膚細胞隨剝落產生更大量的透明質酸。透明質酸具有大的水合能力。抑制MMP-1關系到多聚糖/膠原降解的抑制，并因此關系到皮膚老化MMP-1可以由紫外線豫導并被認為是皮膚老化的標志。在US2002/119107中，該發明基于MMP-1的選擇性抑制，其要求保護用于保護人類皮膚避免膠原降解的局部組合物。US2004/037卯1要求保護抑制皮膚老化效應的負面跡象的方案，其包括抑制金屬蛋白酶表達的來自迷迭香植物的提取物。已經表明葡糖胺顯著改善了皮膚的干燥和剝落。葡糖胺提高皮膚的含濕量并改善光滑度。這些發現表明，葡糖胺的長期才聶取有效改善皮膚的含濕量和光滑度。已經表明，含有葡糖胺的口服補充劑在攝取該補充劑的女性組中造成可見皺紋數(34%)和細紋數(34%)的降低。含有葡糖胺、礦物質和各種抗氧化劑化合物的口服補充劑的使用可以改善可見鈹紋和細紋的外觀。US6413525描述了對皮膚充分去角質的方法。特別地，該發明涉及含有N-乙酰基葡糖胺形式的氨基糖的局部施用組合物在去角質后暴露出年輕皮膚細胞后，它們產生更大量的透明質酸，其是由交替重復的D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺分子的鏈構成的葡糖胺基聚糖。已知N-乙酰基-D-葡糖胺是活細胞透明質酸生成中的速率限制性因素。葡糖胺的局部施用有助于透明質酸的持續生成。例如在JP59013708(軟化和滋潤皮膚)或美國專利No.5866142(用于皮膚去角質的組合物)中也公開了含有N-乙酰基-D-葡糖胺的其他局部施用《且合物。葡糖胺的來源葡糖胺——2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖，是果糖的天然形成衍生物并且是糖蛋白和蛋白多糖(許多真核蛋白的重要成分)的基本組分。這是粘多糖和殼多糖的基本組分。葡糖胺基聚糖(粘多糖)摻入結締組織、皮膚、腱、韌帶和軟骨中的大絡合物。葡糖胺的工業來源工業葡糖胺是由來自有殼的水生動物的殼多糖(源自N-乙酰基-D-葡糖胺的復合糖)的酸性水解獲得的純化合物。例如，美國專利6486307描述了殼多糖酸性水解的改進方法通過將殼多糖研磨至極細尺寸并用濃鹽酸將其煮解來由殼多糖制備葡糖胺鹽酸鹽的方法。葡糖胺也可以由有殼的水生動物的酶促水解制成。例如，美國專利5998173描述了利用酶的全體殼多糖酶家族，水解甲殼類貝殼的殼多糖以由殼多糖直接制備N-乙酰基-D-葡糖胺的新方法。也已經提交了保護微生物發酵法的專利，其中培育的微生物生物合成葡糖胺。例如，US6372457描述了使用遺傳修飾的微生物通過發酵制備葡糖胺的方法和材料。所有這些方法都涉及與有殼的水生動物提取物竟爭的純的提取的葡糖胺的制備。在WO2005/053710中，已經發現，葡糖胺可以由數種粗制植物材料遵循特殊干燥方法形成，因此獲得每千克干重150至1000毫克的葡糖胺含量。發明概述在第一方面中，本發明描迷了通過在收獲植物材料后和在加熱過程之前或之中加入葡糖胺前體來從植物中獲得葡糖胺，從而獲得葡糖胺含量高于干物質0.5%(5克/千克干重)的植物原材料的新方法。本發明因此能夠在植物材料中實現比現有技術之前描述的(例如WO2005/053710反映的)高得多的葡糖胺含量。因此達到文獻中所述的葡糖胺活性劑量需要更少的粗制植物材料或植物提取物。因此，該方法在工業規模下更合用。可以在獲取新鮮或預先干燥的植物材料或在衍生的植物提取物后,在植物材料或衍生的植物提取物的加熱過程中，或在由植物材料制備含水提取物的過程中，加入上述前體。發明詳述在本說明書中，詞語"加熱"(和f汴生詞"加熱過的")必須理解為在70-110。C加熱超過10小時，優選少于l周的加熱法。這種加熱法可以描迷為干燥法。該加熱法也可以包括在相同溫度和時間條件下發生的液體浸漬，以代替千燥法。在本說明書中，"游離葡糖胺"必須理解為是非聚合葡糖胺。在本說明書中，"大量葡糖胺"必須理解為葡糖胺的量高于葡糖胺痕量，大于相應新鮮(未干燥)材料中的量并高于文獻或專利中所述的任何含量。其應該理解為葡糖胺以高于5克/千克植物原材料干物質，優選高于20克/每千克植物原材料干物質，最優選高于40克/千克植物原材料干物質的量存在。在本說明書中，"植物"和"植物材料，，被認為是同義詞。"植物"、"植物材料"或"植物提取物"必須理解為是能夠根據本發明的加熱方法生成葡糖胺的任何植物材料，和任何類型的植物提取物，其由能夠根據本發明的加熱方法生成葡糖胺的所述植物材料，通過本領域技術人員已知的任何提取程序獲得。例如，包含一定量的葡糖胺的植物可以是經過本發明的方法的干燥或復水植物材料。包含一定量的葡糖胺的植物提取物可以是從經過本發明的方法的所述植物提取的水溶液。對于本發明的第一個目的，根據本發明加工植物或植物提取物以含有大量的天然游離葡糖胺。在優選實施方案中，植物或植物提取物來自植物的任何部分，例如葉子、塊莖、果實、種子、根、谷粒(grain)或細胞培養物。在植物原材料的受控加熱過程后，植物或植物提取物可以根據植物或新鮮植物的來源，是葉子、根和/或果實的干燥的凍干提取物或富含葡糖胺的餾分形式。根據其通過本發明的方法生成游離葡糖胺的能力選擇植物或植物提取物；特別地，其可以選自含有蔗糖、果糖或菊粉的植物物種，例如菊苣屬(Cichorium)、胡蘿卜屬(Daucus)、向曰葵屬(Helianthus)、甜菜屬(Beta)。在最優選的實施方案中，植物材料或植物提取物可以例如來自菊苣(菊苣(Cichoriumintybus)根、胡蘿卜(胡蘿卜(Daucuscarota)、菊芋(Helianthustuberosum)塊莖、甜菜(甜菜(BetaVulgais)根。在一個實施方案中，新鮮植物材料或植物材料可以首先完全或部分干燥，然后復水，在這兩個步驟后可以根據該新發明加工以獲得具有高葡糖胺含量的植物材料。在優選實施方案中，使用新鮮植物材料。如WO2005/053710中所公開，所述干燥方法是在植物中獲得大量葡糖胺的一種方式使用WO2005/053710中所述的干燥方法，可以獲得每千克菊苣根干物質大約500毫克，每千克胡蘿卜根干物質100毫克，或每千克菊芋塊莖或甜菜根干物質50毫克的含量。根據植物物種和植物器官，使用液體浸漬或干燥方法在低于110°C,優選70至110°C，最優選70至91'C或更低溫度下加熱新鮮或干燥或復水的植物原材料超過IO小時，優選少于l周，優選10至120小時，例如12至50小時。如果溫度和/或加熱時間太低和/或太短，葡糖胺的生成不有效或非常低，這產生經濟上不可行的方法。相反，如果溫度和/或加熱時間太高和/或太長，會生成葡糖胺，但隨后逐漸降解。因此，選擇溫度和時間以獲得經過加熱方法的每千克相應植物材料干物質至少5克葡糖胺的葡糖胺含量。最優選的例子包括在烘箱中以85X:干燥48至72小時。根據本發明，使用相同方法，但差別在于植物材料或植物提取物首先與葡糖胺前體接觸。結果在于，葡糖胺的所得量比WO2005/053710中高得多。實際上，根據本發明，植物的葡糖胺含量高于10克/千克菊苣^1干物質，高于15克/千克胡蘿卜根或甜菜根干物質。根據本發明使用的葡糖胺的前體是使糖-氮化合物縮合能夠發生的化合物，所述糖-氮化合物縮合是形成葡糖胺所需的。它們優選由銨鹽組成。這類銨鹽的例子是硝酸銨、硫酸銨、乙酸銨、二氬磷酸銨或谷氨酰胺等。葡糖胺的優選前體是硫酸銨和硝酸銨，它們已經在本發明的方法中表現出令人驚訝的好結果。在優選實施方案中，在加熱過程前不久在新鮮收獲的材料上加入前體。本領域技術人員會知道如何選定植物材料或植物提取物上的葡糖胺前體的量，但是在最優選實施方案中，疏酸銨的最終量為植物原材料新鮮重量的1至8%,優選4%。在最優選實施方案中，在植物材料或植物提取物中加入作為通過噴涂或通過浸泡施加的溶液的葡糖胺前體。例如，在5至30分鐘噴涂200毫升水溶液(4M)或在相同溶液中浸泡數分鐘至數小時。這些例子不視為以任何方式限制本發明。也就是說，本領域技術人員會認識到該例子中的許多變動以覆蓋寬范圍的加工和混合物，從而針對各種應用合理調整本發明的化合物的天然產量。對于導致葡糖胺生成的最終方法，在WO2005/053710中描述了在不加入前體的情況下制備植物材料的合適方法收獲植物材料，切割并根據植物物種和植物器官在烘箱中或在工業干燥器中在低于IIO'C，優選80至105°C，最優選9rC或更低的溫度下干燥超過10小時，并優選少于l周，優選10至120小時，例如12至50小時盡管不希望受制于理論，我們相信，優選將植物材料例如切成薄片或方塊，優選具有5毫米的最大寬度。本發明人確實相信，這對于本發明是重要的以實現最佳熱力學交換。收獲之后，在加熱過程之前或之中，葡糖胺前體的加入能夠明顯提高上述反應，從沒有前體時的數百毫克葡糖胺/千克干重到至少5克葡糖胺/千克相應植物材料干物質。本發明的方法直接產生游離形式的葡糖胺。不希望受制于理論，相信通過所述方法制成的至少一半的葡糖胺祐L認為是游離形式的，甚至生成的幾乎所有葡糖胺都是游離形式。實際上，根據本發明的方法，相信至少50%,至少70%,甚至至少90%的葡糖胺被認為以游離形式生成。這是本發明與用于制備葡糖胺的已知技術相比的另一優點，在已知技術中，水解步驟是強制性的以從絡合物分子，例如殼多糖、糖蛋白或蛋白多糖中釋放出游離葡糖胺。在加熱處理之前用硫酸銨預提取原材料產生更富含葡糖胺的提取物(實施例8)。可以首先從植物材料中單獨或與其他化合物，例如菊粉或低聚果糖(FOS)結合提取葡糖胺。實施例下列實施例是落在本發明范圍內的一些產品及其制備方法的舉例說明。它們不被視為以任何方式限制本發明。可以對本發明進行修改和變動。也就是說，本領域技術人員會認識到這些實施例中的許多變化以覆蓋寬范圍的配方、成分、加工和混合物以針對各種應用合理調節本發明化合物的天然產量。實施例1:新鮮糖甜菜干燥在收獲之后，將200克(新鮮重量)甜菜(甜菜(5e似vw/gflr&))根切成lxixi厘米的方塊。在方塊的所有表面上噴涂25毫升硫酸銨(NBU)2S04溶液，4M(Prolabo目錄號21332.293)，然后將方塊在烘箱中以91匸千燥56小時。分析葡糖胺的提取用20毫升水在室溫下提取2克研磨和專門干燥的甜菜根1分鐘。將該溶液在過濾器Schleicher&Schultz(n。597)上過濾，或離心。使用陽離子交換柱(OasiscartridgeWATERS,MCX型，目錄號186000776)進行溶液的提純步驟。將捕獲在基質上的堿性化合物用MeOH/NH4OH2%(v/v)洗脫。在過濾之后，使用等分試樣直接注射在LC系統(DIONEX)上。分離使用離子交換PA1柱(4*250毫米)以及DIONEXDX500裝置，用HPAE/PED系統進行分析。程序洗脫(％)<table><row><column>時間(分鐘)</column><column>H20</column><column>0.1MNaOH</column><column>0.25NaOH</column><column>評述</column></row><row><column>0</column><column>85</column><column>15</column><column>0</column><column>平衡</column></row><row><column>60</column><column>85</column><column>15</column><column>0</column></row><row><column>60.1</column><column>0</column><column>0</column><column>100</column><column>洗滌</column></row><row><column>70</column><column>0</column><column>0</column><column>100</column></row><row><column>70.1</column><column>85</column><column>15</column><column>0</column><column>平衡</column></row><row><column>90</column><column>85</column><column>15</column><column>0</column></row><table>流速l毫升/分鐘。注射體積20微升。標準來自Sigma的葡糖胺(目錄號G4875)在這些條件下，葡糖胺具有大約11分鐘的保持時間并容易檢測以在適當加工的甜菜提取物中進一步量化。在本實施例中通過該方法定量16克/千克干重的濃度，而非無前體時的小于300毫克/千克，和無加熱過程時的小于l毫克/千克。葡糖胺存在的確認為了確認甜萊植物提取物中葡糖胺的存在，已經評測了三種不同的量化技術。薄層色鐠法(TLC)在HPTLC(高效薄層色鐠法)硅膠板(Merck，目錄號1.05642)上用乙酸乙酯/MeOH/水(50/50/10;V/V/V)作為洗脫劑，分析純葡糖胺和植物提取物。在洗脫后，用含有酮1%茚三酮的乙酸溶液噴涂該板，并在120℃加熱10分鐘。對于參照物和提取物，在相同速率系數(Rf)下，顯示出一個粉色/藍色的點。℃化學降解在茚三酮的存在下，用葡糖胺進行氧化脫氨作用，這導致釋放出容易通過常規糖LC分析檢出的阿拉伯糖。明確證實對照和菊苣提取物中阿拉伯糖的存在。℃葡糖胺的衍化(derivatization)℃如Zhongming等人所述"Determinationofnutraceuticals，glucosaminehydrochlorideinrawmaterials,dosageformandplasmausingpre-columnderivationwithUVHPLC.InJ.ofPharmaceut.andBiomed.Analysis,1999(20)，807-814"，對純化合物和植物提取物使用反相色譜法，其使用用異硫氰酸苯酯和紫外線檢測U-254納米)的預置柱衍化。在菊苣提取物中檢測衍化的葡糖胺以及純化合物的相應峰。質譜分析通過電噴霧質謙法以正電離模式分析植物提取物以證實葡糖胺的存在。質鐠儀是飛行時間儀器(來自Micromass的具有Z-噴霧界面的LCT)。標準葡糖胺在m/z180.0887下產生離子。在受分析的植物提取物中找到這種離子片段。實施例2:新鮮胡蘿卜(胡蘿卜(Daucuscarota))根將200克(新鮮重量)胡蘿卜根切成lxlxl厘米方塊，然后噴涂實施例1中的硫酸銨溶液。然后將方塊在烘箱中以9rC干燥37小時。如實施例1中那樣進行提取和分析，從而產生15克/千克干重的葡糖胺濃度，而非無前體時小于190毫克/千克干重和無加熱過程時小于1毫克/千克。實施例3:新鮮菊苣(菊苣(CicAoWwwi/wO^附))根將200克(新鮮重量)菊苣根切成0.5x0.5x0.5厘米方塊。將方塊在硫酸銨溶液(4M)中浸泡30分鐘，或噴涂硫酸銨溶液，或將方塊在85C下與硫酸銨溶液混合8小時。然后將方塊在烘箱中以91'C干燥40小時。如實施例1中那樣進行提取和分析，從而產生43克/千克干重的葡糖胺濃度，而非無前體時小于900毫克/千克干重和無加熱過程時或在商業干燥菊苣根中小于10毫克/千克。實施例4:干燥菊苣根將新鮮菊苣根切成方塊(lxlxl厘米)，使用現有程序(在流化床干燥器中，入口空氣115。C，2小時)干燥，然后儲存在室溫下。當需要葡糖胺生成時，將干燥的方塊在硫酸鈉溶液(4M)中浸泡l小時，將方塊復水并引入前體。然后將方塊在烘箱中以85。C下干燥43小時。如實施例1中那樣進行提取和分析，從而產生11克/千克干重的葡糖胺濃度，而非無前體時小于190毫克/千克干重和無加熱過程時小于1毫克/千克。因此可以將本發明用于在千燥形式下經過長期儲存的植物材料。實施例5:干燥粉末菊苣根將1.5克干燥粉末在Erlenmeyer燒瓶中用100毫升硫酸銨(3M)懸浮，劇烈振蕩并在80'C溫育30分鐘。然后將該溶液在烘箱中以85'C干燥50小時。如實施例1中那樣進行提取和分析，從而產生110克/千克干重的葡糖胺濃度。這是因此可以將本發明用于在干燥形式下經過長期儲存的植物材料的另一例子。實施例6:完整干燥菊苣根將新鮮收獲的10個完整菊苣根在環境溫度下儲存三天。然后將整個根浸泡在石克酸銨溶液(4M)中24小時。然后將該根切成0.5x0.5x0.5厘米的方塊，然后如實施例3中那樣加工(干燥)，從而產生44克/千克干重的葡糖胺濃度。實施例7:在液體介質中處理的新鮮菊苣根方塊將100克新鮮菊苣根切成方塊(0.5x0.5x0.5厘米)，用200毫升硫酸銨(4M)懸浮在開放或用纖維素塞子塞住的Erlenmeyer燒瓶中并劇烈振蕩。然后將溶液在烘箱中以85℃加熱60小時。如實施例1中那樣進行提取和分析，從而產生30克/千克新鮮重量的葡糖胺濃度。因此還可以在濕加熱條件下應用本發明。實施例8:富含葡糖胺的提取物將100克新鮮菊苣才艮切成方塊(0.5x0.5x0.5厘米)，用200毫升硫酸銨(4M)懸浮在Erlenmeyer燒瓶中并劇烈振蕩。然后過濾溶液并將所得洗脫物在烘箱中以85℃干燥60小時。如實施例1中那樣進行提取和分析，從而產生100克/千克干重的葡糖胺濃度。權利要求1.由植物產生葡糖胺的方法，其中將新鮮植物材料、復水的干燥植物材料或植物提取物在70至110℃之間的溫度加熱超過10小時，其特征在于向所述植物材料、復水植物材料或植物提取物加入葡糖胺前體。2.根據權利要求1的方法，其中葡糖胺前體是使糖-氮化合物縮合能夠發生的化合物，所糖-氮化合物縮合是形成葡糖胺所需的，并且優選是銨鹽。3.根據權利要求1或2的方法，其中在加熱步驟之前加入葡糖胺前體。4.根據權利要求1至3中任一項的方法，其中加入葡糖胺前體，或在加熱步驟中也加入葡糖胺前體。5.根據權利要求1至4中任一項的方法，其中植物物種屬于菊苣屬、胡蘿卜屬、向日葵屬或甜菜屬。6.根據權利要求1至5中任一項的方法，其中植物是菊苣(Cichoriumintybus)、古月蘿卜(Daucuscarota)、菊宇(Helianthustuberosum)和/或甜菜(Betavulgaris)。7.根據權利要求1至5中任一項的方法，其中植物或植物提取物包含至少5克葡糖胺/千克植物材料干重，優選高于20克/千克干物質，并且最優選高于40克/千克干物質。8.植物或植物提取物，其包含至少5克葡糖胺/千克植物材料(干重)，更優選至少15克/千克植物材料(干重)。9.根據權利要求8的植物或植物提取物，其中至少部分葡糖胺是游離形式，優選至少一半葡糖胺是游離形式。10.根據權利要求8或權利要求9的植物或植物提取物，其中植物屬于菊苣屬、胡蘿卜屬、向日葵屬或甜菜屬。全文摘要本發明涉及由植物產生葡糖胺的方法，其中新鮮植物材料、復水的干燥植物材料或植物提取物在70至110℃加熱超過10小時，其特征在于在所述植物材料、復水植物材料或植物提取物中加入葡糖胺前體。文檔編號A61K31/7008GK101175502SQ200680016575公開日2008年5月7日申請日期2006年5月12日優先權日2005年5月13日發明者D·庫爾圖瓦,E·古盧瓦,S·米肖申請人:雀巢技術公司