為治療疼痛對EPAC、磷脂酶Cε和磷脂酶D的抑制的制作方法

專利名稱：為治療疼痛對EPAC、磷脂酶Cε和磷脂酶D的抑制的制作方法
技術領域：
本發明涉及在抑制cAMP-活化的鳥噤呤交換因子Epac、磷脂酶C-s(PLCe) 和/或磷脂酶D(PLD)的基礎上減輕疼痛的方法，和相關的藥物組合物^r歸選方 法。
發明的
背景技術：
的胞內信號通路以及參與的機械感受4本不完整。然而， 一種信號成分，即PKC 的s異構體已證實在由炎癥(Khasar等，1999b; Numazaki等，2002; Sweitzer 等，2004)、周圍神經病如糖尿病(Joseph和Levine, 2003a)、慢性酒精中毒(Dina 等，2000)和癌癥化療(Dina等，2001; Joseph和Levine， 2003b)以及急性痛轉 為慢性痛(Aley等，2000; Parada等，2003a; Parada等，2003b)引起的傷害感 受體敏化中很重要。但是，引起PKCs激活的信號通路仍然不清楚。
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最新證據顯示信號從cAMP傳導至PKC，這表明通過腺苷酸環化酶 (AC)/cAMP的信號傳導并不涉及PKA，而是在PKA的上游出現分支而激活 PKC(Gold等，1998; Parada等，2005)。但對于在傷害性感受或其它功能性背 景下從cAMP至PKC的信號機制還沒有被建立。
在非神經元細胞系中，已經顯示cAMP不僅能激活PKA,還能激活烏嘌 呤交換因子，即Epac(de Rooij等，1998; Kawasaki等，1998)。 Epac進而能 激活新鑒定的磷脂酶，即PLCs(Schmidt等，2001)，且通過磷脂酶產生的甘油 二酯(DAG)，可因此潛在地激活新型PKCs，如PKCs(Parelch等，2000)。雖 然，Epac對MAP-激酶的作用正處于深入研究中(Enserink等，2002; Keiper 等，2004)，但還并不知道Epac會介導PKCs的活化。
利用腎上腺素誘導的PKCs-介導的痛覺過敏模型(Khasar等，1999b;Parada 等，2003b)，目前的研究證明cAMP在PKCs上游，且Epac通過磷脂酶介導 cAMP-PKC相互作用，導致PKCs的移位和激活以及炎性痛的產生。
發明概述
在一實施方式中，本發明提供了一種減輕疼痛的方法。該方法包括給有 需要的患者施用有效量的抑制劑，該抑制劑是Epac抑制劑、磷脂酶C-s(PLCs) 抑制劑和/或磷脂酶D(PLD)抑制劑。在具體實施方式
中，施用該抑制劑會使患 者的痛覺過敏減輕，優選不會顯著影響傷害感受。
在某些實施方式中，所述患者患有炎性痛，可以是急性或慢性的。該炎 性痛可能是由于如曬傷、關節炎、結腸炎、心肌炎、皮炎、肌炎、神經炎、 粘膜炎、尿道炎、膀胱炎、胃炎、肺炎和/或膠原血管病引起。
或者或另外，患者可能患有神經性痛，可以是急性或慢性的。該神經性 痛可能是由于比如灼痛、糖尿病、膠原血管病、三叉神經痛、脊髓損傷、
腦干損傷、丘腦疼痛綜合癥、I型復雜區域疼痛綜合癥/反射性交感神經營養不
良癥、Fabry's綜合癥、小纖維神經病、癌癥、癌癥化療、慢性酒精中毒、中 風、膿肝、脫髓鞘疾病、病毒性感染、抗病毒治療、艾滋病和/或艾滋病治療 引起的。可以按照本發明的方法來治療的神經性痛包括選自外傷、手術、截 肢、毒素和化療中的試劑而引起的疼痛。
本發明的方法還可用于治療患有全身疼痛癥如纖維肌痛、過敏性腸綜合 癥和顳下頜關節紊亂癥的患者。
用于減輕疼痛的Epac抑制劑，可以但非必須直接對Epac起作用。在具 體實施方式中，所述方法包括給患者施用Epac抑制劑，并額外施用以不同于 Epac抑制劑的機理起作用的止痛劑。
用于減輕疼痛的PLCs抑制劑，可以但非必須直接對PLCs起作用。在具 體實施方式中，所述方法包括給患者施用PLCs抑制劑，并額外施用以不同于 PLCs抑制劑的機理起作用的止痛劑。
用于減輕疼痛的PLD抑制劑，可以但非必須直接對PLD起作用。在優選 的實施方式中，該PLD抑制劑是選擇性的PLD抑制劑。在具體實施方式
中， 所述方法包括給患者施用PLD抑制劑，并額外施用以不同于PLD抑制劑的機 理起作用的止痛劑。
用于本發明方法中的任何抑制劑也可以與下述制劑共同給藥蛋白激酶 A(PKA)抑制劑、cAMP抑制劑、非甾體類抗炎藥、前列腺素合成抑制劑、局 部麻醉劑、抗驚厥藥、抗抑郁劑、阿片受體激動劑和/或鎮靜藥。
本發明的另一方面是藥物組合物。該藥物組合物可包括(a)Epac抑制劑， PLCs抑制劑和/或PLD抑制劑；和(b)以不同于所述抑制劑的機理起作用的止 痛劑。在另一實施方式中，該藥物組合物包括(a)Epac抑制劑、PLCs抑制劑 和/或PLD抑制劑；和(b)—種或多種下述制劑蛋白激酶A(PKA)抑制劑、cAMP
抑制劑、非甾體類抗炎藥、前列腺素合成抑制劑、局部麻醉劑、抗驚厥藥、 抗抑郁劑、阿片受體激動劑和鎮靜藥。
本發明還提供了預篩選和篩選能減輕患者疼痛的試劑的方法。以多肽結
合為基礎的預篩選方法包括(a)將待測試劑與下述多肽的一種結合Epac、 PLCs和PLD; (b)確定該待測試劑是否特異性結合所述多肽；和(c)如果該待 測試劑特異性結合所述多肽，則選定該待待測試劑作為潛在的止痛劑。以多 核苷酸結合為基礎的預篩選方法包括(a)將待測試劑與編碼下述多肽的一種 的多核苷酸接觸Epac、 PLCs和PLD; (b)確定該待測試劑是否特異性結合所 述多核苷酸；和(c)如果該待測試劑特異性結合所述多核苷酸，則選定該待測 試劑作為潛在的止痛劑。這兩種預篩選方法都還可以額外地包括，分別將特 異性結合所述多肽或所述多核苷酸的任何待測試劑記錄在候選止痛劑數據庫 中。在優選的實施方式中，所述預篩選方法在^^外進行。
本發明的篩選方法包括(a)將待測試劑與下述多肽的一種接觸Epac、 PLCs和PLD; (b)確定該待測試劑是否抑制所述多肽；和(c)如果該待測試劑 抑制所述多肽，則選定該待測試劑作為潛在的止痛劑。該篩選方法還可以包 括，將抑制所述多肽的任何待測試劑記錄在候選止痛劑數據庫中。在具體實 施方式中，該篩選方法在體外進行。在該篩選方法的一種變體中，(a)將待測 試劑與在不存在該待測試劑的條件下表達所述多肽的細胞接觸，或與該細胞 的一部分接觸；(b)對于該待測試劑是否抑制該多肽的確定包括確定該多肽或 編碼該多肽的多核普酸的水平；和(c)如果該多肽，或編碼該多肽的多核苷酸 的水平降低，則選定該待測試劑為潛在的止痛劑。在該篩選方法的另一種變 體中，(a)將待測試劑與在不存在該待測試劑的條件下表達所述多肽的細胞接 觸，或與該細胞的一部分接觸；(b)對于該待測試劑是否抑制該多肽的確定包 括確定該多肽的活性水平；和(c)如果多肽的活性水平降低，則選定該待測試
劑為潛在的止痛劑。
在具體實施方式
中，本發明的篩選方法可以包括將選定的待測試劑與藥 學上可接受的栽體組合和/或在動物模型中，測定所選定的待測試劑減輕疼痛 的能力。
本發明的體內篩選方法包括(a)選擇下述抑制劑的一種作為待測試劑 Epac抑制劑、PLCs抑制劑和PLD抑制劑；和(b)在動物模型中，測定所選定 的待測試劑減輕疼痛的能力。
本發明的另一方面是試劑盒，其包括(a)在藥學上可接受載體中的下述 抑制劑的一種Epac抑制劑、PLCs抑制劑和PLD抑制劑；和(b)進行本發明 方法來減輕患者疼痛的^兌明書。
附圖筒要說明


圖1:在培養的DRG-神經元中，(32-腎上腺素能受^f本((32-AR)激動劑誘導 的PKCs移位。A)典型的未處理的DRG-神經元(左)與異丙基腎上腺素(l [iM， 30秒)處理的DRG-神經元(右)的共聚焦圖象。將處理后的培養物固定，用親 和純化的PKCs-特異性抗血清SN 134(1: 1000)進行培養，并用FITC-偶合的 驢抗兔IgG血清(l: 200)來進行檢測。小圖顯示放大的白框標識的區域。在用 異丙基腎上腺素處理后，可以看到部分PKCs會移位至細胞膜。白色刻度條等 于20 pm。 B)30秒后呈現對指定濃度異丙基腎上腺素產生應答的至細胞膜的 PKCs移位的神經元的百分比。C)在指定時間點呈現用異丙基腎上腺素(l ^M) 刺激的PKCs移位的神經元的百分比。實心柱狀圖表示用1 異丙基腎上腺 素處理的培養物。點狀柱狀圖表示的培養物在用1 pM異丙基腎上腺素刺激之 前，先用卩2-AR特異性抑制劑ICI 118,551(50 (xM)預處理15分鐘。**表示 pO.Ol。
圖2: G-蛋白as、腺苷酸環化酶、和Epac但非PKA參與PKCs移位。 A)在用1 pM異丙基腎上腺素刺激30秒之前，先用指定濃度(1X、 IOX、 100 X 、 1000 X CMIQ-IC50(0.03-30 ^M))的PKA-特異性抑制劑4-氰基-3-甲基異喹 啉(CMIQ)預處理DRG培養物15分鐘(Lu等，1996)。沒用CMIQ或異丙基腎 上腺素進行處理的培養物作為陰性對照。B)在大鼠爪皮內注射PKA抑制劑 CMIQ(2.5 pg/2.5 W)并不會改變機械性縮爪閾值。通過注射其催化亞基 (PKAcs， 25單位/2.5 pl)激活PKA會引起強烈的機械性痛覺過敏。在注射 PKAcs之前15分鐘預注射CMIQ會完全封閉PKA誘導的體內痛覺過壽文。C) 用G-蛋白as的活化劑(霍亂毒素(l嗎/mi)、佛司可林(forskolin， 5 pM)和 Epac(CPTOMe 10 ^M)刺激培養物指定長的時間。未刺激細胞作用陰性對照， 異丙基腎上腺素(l pM， 30秒)處理的細胞作為陽性對照。*表示P<0.05， ** 表示pO.Ol。
圖3: p2-AR-誘導的Epac-介導的PKCs移位需要PI-PLC和PLD活性。 A)在用異丙基腎上腺素刺激后(Iso， 1 ^M, 30秒)，呈現至細胞膜的PKCs移 位的神經元的百分比。培養物用如下指定的抑制劑預處理15分鐘PC-PLC 抑制劑，D-609(30 pM); PI-PLC抑制劑，U73122(10 jxM); U73122的無活性 同系物，U73343(10 一)； PLD抑制劑，1-丁醇(50 mM); 1-丁醇的無活性同 系物，2-丁醇(50mM); PKC激酶抑制劑，雙巧1咮馬來酰亞胺I(BIM, 100 nM)。 所用濃度約為報道的IC50值的10倍。B)在用Epac特異性活化劑CPTOMe(lO ^M， 90秒)刺激后，呈現至細胞膜的PKCs移位的神經元的百分比。使用與 A)中相同的抑制劑。w表示pO.Ol。
圖4:在體內Epac通過PI-PLC、 PLD和PKCs來介導腎上腺素-誘導性痛 覺過敏。A)注射腎上腺素(2.5 pl中的0.1嗎)和CTPOMe(2.5 pl中的6.3嗎)會 產生相似量級的痛覺過敏，但鹽水載體注射就無效。在用CPTOMe刺激之前30分鐘，預注射特異性PKCs抑制性肽sVl-2(2.5 pl中1 pg)可以完全封閉 CPTOMe-誘導性敏化，這說明Epac在體內同樣通過激活PKCs誘導機械性痛 覺過敏。B)腎上腺素-誘導性(實體柱狀圖)和CPTOMe-誘導性(點狀柱狀圖)機 械性痛覺過敏可以通過在腎上腺素/CPTOMe刺激前30分鐘預注射PI-PLC抑 制劑U73122(2.5 ^， 1嗎4il)但非其無活性對照，U73343(2.5 pl， 1 pg4il)而完 全封閉。同樣，體外數據類似，注射PLD抑制劑，1-丁醇(2.5 pl， 10.9 M)而 非其無活性對照，2-丁醇，能完全抑制注射腎上腺素/CPTOMe的敏化作用。 這些抑制劑對于鹽水對照注射沒有任何作用或者作用很小(開放柱狀圖)。因 此，這兩種磷脂酶是體內介導PrAR-刺激的/Epac/PKCs-介導的機械性痛覺過 每丈所必需的。w表示pO.Ol。
圖5: PKCe移位和IB4雙染色。雙染色細胞的表面熒光圖象用于檢測 PKCs(圖A和C， 1: 1000稀釋)和IB4(圖B和D， 1: 100稀釋)。當上排的細 胞將PKCs移位至細胞膜(A)上時，也顯示出清楚的IB4表位的質膜染色(C)。 相反，(C)中的細胞就沒有發生PKCs移位，而且IB4表位也非陽性(D)。小圖 顯示了放大的白框標識的區域。白色線條等于20 pm。
圖6: p2-AR激動劑通過Epac、 PI-PLC和PLD將信號傳至PKCs，而產 生機械痛覺過敏。圖示性的(32-AR激動劑-誘導性機械痛覺過敏的擬定第二信 使信號級聯包括G-蛋白as,其導致在第一傳入傷害感受體的外周末端的AC 和Epac的活化。PKA并不參與(32-AR-誘導性/PKCs-介導的敏化。Epac導致 PI-PLC和PLD激活，這兩者的活性都是體外PKCs移位和體內Epac/PKCs-介導的痛覺過敏發生所必需的。如前面所顯示的，PKCs活化會導致TTX-R 鈉電流增大(Khasar等，1999b)，其在痛覺過敏中起重要作用。在示意圖右側 標明了以其各自活性水平來使用的活化劑/抑制劑。
發明的詳細說明
本發明涉及發現Epac、 PLCs和PLD是疼痛，尤其是炎性和神經性疼痛 的介質。因此，本發明提供了在抑制Epac、 PLCs和/或PLD的基礎上減輕疼 痛的方法和相關的藥物組合物。另外，該方法提供了在篩選結合和/或抑制 Epac、PLCs或PLD多肽或多核芬酸的試劑的基礎上篩選出減輕患者疼痛的新 型試劑的方法。
定義
除非特別指出，權利要求和說明書中的術語定義如下。 下述術語包括Genebank中已鑒定為下述名稱的多肽，以及與Genebank 中下述名稱的已鑒定多肽有至少約70%同一性的多肽cAMP-活化的Rapl鳥 嘌呤交換因子的家族中的任何多肽(包括Epacl和Epac2)，磷脂酶C-s(PLCs)(包 括剪切變體PLCsla和PLCslb)，和磷脂酶D(包括PLD1和PLD2)。在另一個 具^f本實施方式中，這些術語包括Genebank中已鑒定為上述名稱且具有至少約 80、 90、 95、 96、 97、 98或99%同一性的多肽。
多肽的"調節劑，，是多肽的作用或功能的抑制劑或增強劑。 多肽(如PLD)的"非選擇性"調節劑是在調控特定多肽的典型濃度下調控 多肽同一家族其它成員(如其它磷脂酶)的制劑。
多肽的"選擇性，，調節劑在一濃度下顯著調控特定多肽，在該濃度下多肽同 一家族的其它成員不會顯著受調控。這樣，調節劑對于如PLD和PLC來說是 有選擇性的。
當調節劑通過直接與多肽相互作用來發揮其作用時，該調節劑"直接作用 于"該多肽。
當調節劑通過與不是該多肽的其它分子相互作用來發揮其作用，而該相
互作用導致了對該多肽的作用或功能的調節時，該調節劑"間接作用于"該多肽。
多肽的"抑制劑，，或"拮抗劑"是指與不存在(或存在少量)該制劑的觀察相
比，采用任何機理削弱多肽的任一作用或功能的制劑。多肽抑制劑可以影響 (l)多肽的表達、mRNA穩定性、蛋白運輸、修飾(如磷酸化)、或降解，或(2) 多肽的一種或多種正常作用或功能。多肽抑制劑可以是非逸擇性或選擇性的。 優選的抑制劑(拮抗劑)一般是直接作用于耙蛋白且對耙蛋白有選擇性的小分子。
"增強劑"或"活化劑"是指與不存在(或存在少量)該制劑的觀察相比，采用 任何機理增強任一多肽的作用或功能的制劑。多肽增強劑可以影響(l)多肽 的表達、mRNA穩定性、蛋白運輸、修飾(如磷酸化)、或降解，或(2)多肽的 一種或多種正常作用或功能。多肽增強劑可以是非選擇性或選擇性的。優選 的增強劑(活化劑)一般是直接作用于靶蛋白且對耙蛋白有選擇性的小分子。
術語"多肽"和"蛋白質"在此可互換使用，其指氨基酸，除非特別限定，包 括與天然存在的氨基酸以相似方式行使功能的非典型氨基酸，的聚合體。
術語"氨基酸"或"氨基酸殘基"除非另外特別說明，包括天然存在的L-氨 基酸或殘基。在此處應用通常所用的一個或三個字母的氨基酸縮寫 (Lehninger, A丄.(1975)Biochemistry,第2版，pp.71-92， Worth Publishers, N.Y.)。術語"氨基酸，，和"氨基酸殘基，，包括D-氨基酸以及化學修飾的氨基酸如 氨基酸類似物，天然存在的不常組成蛋白質的氨基酸，以及具有氨基酸特性 的化學合成的化合物(統稱為"非典型"氨基酸)。例如，和天然Phe或Pro—樣 對所述肽化合物具有相同的構象限制的苯丙氨酸或脯氨酸的類似物或模擬 物，也包括在"氨基酸，，的定義內。
代表性的非典型氨基酸包括，如在國際公開號WO 90/01940中描述的氨基酸，以及可代替Glu和Asp的2-氨基己二酸(Aad);可代替Glu和Asp的2-氨基庚二酸(Apm);可代替Met、Leu和其它脂肪族氨基酸的2-氨基丁酸(Abu); 可代替Met、 Leu和其它脂肪族氨基酸的2-氨基庚酸(Ahe);可代替Gly的2-氨基異丁酸(Aib);可代替Val、 Leu和Ile的環己基丙氨酸(Cha);可代替Arg 和Lys的高精氨酸(Har);可代替Lys、 Arg和His的2,3-二氨基丙酸(Dpr);可 代替Gly 、 Pro和Ala的N-乙基甘氨酸(EtGly));可代替Asn和Gin的N-乙基 天冬酰胺酸(EtAsn);可代替Lys的羥基賴氨酸(Hyl);可代替Lys的別羥基賴 氨酸(Ahyl);可代替Pro、 Ser和Thr的3-(和4-)羥基脯氨酸(3Hyp， 4Hyp);可 代替Ile、 Leu和Val的另'J-異亮氨酸(Aile);可代替Ala的脒基苯丙氨酸 (amidinophenylalanine);可代替Gly 、 Pro和Ala的N-甲基甘氨酸(MeGly ，肌 氨酸)；可代替Ile的N-甲基異亮氨酸(Melle);可代替Met和其它脂肪族氨基 酸的正纈氨酸(Nva);可代替Met和其它脂肪族氨基酸的正亮氨酸(Nle);可代 替Lys、 Arg和His的鳥氨酸(Orn);可代替Thr、 Asn和Gin的瓜氨酸(Cit)和 甲疏氨酸亞砜(MSO);可代替Phe的N-甲基苯丙氨酸(MePhe)、三甲基苯丙氨 酸、卣代(F、 Cl、 Br和I)苯丙氨酸和三氟苯丙氨酸。
就兩個或多個氨基酸或核芬酸序列而言使用的術語"同 一的"或"百分比同 一性"是指在應用下述一種序列比較算法測量或用眼觀察中，在比較或比對最 大對應性時，兩個或多個序列或亞序列相同，或具有特定百分比的相同氨基 酸殘基或相同核苦酸。
為了進行序列比較，典型地把一個序列作為參考序列，而用待測序列與 它比較。當^f吏用序列比較算法時，把待測和參考序列輸入到電腦中，如果需 要，隨后指定亞序列坐標，并設定序列算法程序參數。然后，根據設定的程 序參數，用序列比較算法計算出待測序列相對于參考序列的百分比序列同一 性。利用下列方法可以對比較的序列進行優化比對，例如，利用Smith和 Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482( 1981)中的局部同源性算法，利用Needlman 和Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443(1970)中的同源性對比算法，利用Pearson和 Lipman(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444中的相似性搜索方法，用計 算機執行這些算法(Wisconsin Genetics軟件包中的GAP、 BESTFIT、 FASTA 和TFASTA， Genetics Computer Group， 575 Science Dr. ， Madison, WI)，或者 利用目測檢查(一般性的描述參見上述Ausubel等)。
有用算法的一個實例是PILEUP。 PILEUP用遞進、逐對比對法從一組相 關序列中產生多序列對比來表明相互關系以及百分比序列同 一性。它也可以 繪制成一種樹或樹形圖，顯示用于創建該算法的簇關系。PILEUP使用的是 Feng和Doolittle(1987)J. Mol. Evol. 35:351-360中的遞進對比方法的簡化形式。 所使用的這種方法與Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5: 151-153中描述的方 法類似。這種程序能夠對比多達300個序列，其中每個序列的最大長度可達 5000個核苷酸或氨基酸。多個序列對比方法從兩個最相似的序列的逐對對比 開始，產生一個由兩對比序列組成的簇。然后，把這個簇與下一個最相關的 序列或對比序列簇進行對比。利用兩個單個序列逐對對比的簡單延伸，就可 以對兩簇序列進4亍對比。通過一系列遞進、逐對對比實現最終序列對比。通 過指定特定序列以及序列比較區域的氨基酸或核苷酸坐標以及指定程序參 數，可以運行該程序。例如，可以用一個參考序列與其它待測序列進行比較， 用下列參數來測定百分比序列同一性關系默認間隙權重(3.00),默認間隙長 度權重C0.10)和加權的末端間隙。
適合于測定序列同 一性百分比和序列相似性的算法的另 一實例是BLAST 算法，該算法描述見Altschul等(1990)J. Mol. Biol. 215: 403-410。用于進行 BLAST分析的軟件可以從國家生物技術信息中心(http : 〃www.Ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。這種算法包括首先通過查出查詢序列中長度W 的短序列單元來鑒定高分值序列對(HSP)，這些序列單元在與數據庫序列中的 等長序列單元對比時應符合或滿足正值的閾分值T。 T是相鄰序列單元分值閾 (Altschul等，見上)。把這些起始相鄰序列單元樣作為種序列，來啟動發現含 有它們的較長HSP的搜索。只要積累的比對分值能夠不斷增大，就可以將序 列單元樣沿每個序列向兩個方向擴展。對于核普酸序列來說，累記得分用M(匹 配殘基對的獎賞得分；總是>0)和N(錯配殘基罰分；總是<0)來進行計算。 對于氨基酸序列來說，使用記分矩陣來計算累計得分。當發生下列情況時這 些序列單元樣各方向上的擴展會終止積累的比對分值從所能實現的最大分 值降低數量X后；由于一個或多個負分值的殘基對比的積累，所述積累分值 達到0或0以下；或者其中一個序列的末端已經到達。BLAST算法參數W、 T和X決定比對的壽i感度和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)把字長 (W)ll，期望值(E)IO, M=5， N=-4,和雙鏈比較作為默認值。對于氨基酸序 列來說，BLASTP程序把字長(W)3,期望值(E)IO,和BLOSUM62分值矩陣 作為默認值(參見Henikoff和Henikoff(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915)。
除計算序列同一性的百分比外，BLAST算法還進行了兩序列之間相似性 的統計學分析(參見，如Karlin和Altschul(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA ， 90: 5873-5787)。 BLAST算法提供的一個相似性測量值為最小加和概率(smallest sum probability)(P(N))，這個值指示兩個核脊酸或氨基酸序列之間偶然發生配 對的概率。例如，如果當待測核酸與參考核酸比較時最小加和概率的值小于 約O.l，就認為該核酸與參考序列相似，更優選最小加和概率的值小于約0.01， 最優選小于0.001。
術語"特異性結合"在此定義為結合伴倡與另 一結合伴侶(如，兩個多肽，
一個多肽和核酸分子，或兩個核酸分子)在特定位點的優先結合。術語"特異地 結合，，指對于靶分子/序列的結合優先性(即親和性)至少為非特異性靶分子(即
缺少特異性識別位點的隨機產生的分子)的2倍，更優選至少為5倍，最優選 至少為10倍或20倍。
如在此應用的，"抗體，，指由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片
段編碼的一個或多個多肽組成的蛋白質。被鑒定的免疫球蛋白基因包括k、 x、
a、 y、 A、 s和p恒定區基因，以及無數免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分為k 或x。重鏈分為y、 (i、 a、 A或s,它們隨后分別定義免疫球蛋白種類IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。
已知典型的免疫球蛋白(抗體)結構單元包括四聚體。每一個四聚體由兩組 相同的多肽鏈對組成，每一對具有一個"輕，，鏈(約25 kD)和一個"重，，鏈(約50-70 kD)。每個鏈的N末端是一個主要用于抗原識別的大約100-110或更多氨基酸 的可變區。術語"可變輕鏈(VL)，，和"可變重鏈(VH)"就是分別指這些輕鏈和重鏈。
抗體作為完整的免疫球蛋白或作為由各種肽酶消化產生的已被充分表征 的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶消化抗體鉸鏈區下方的二硫鍵從而產生 Fab的二聚體F(ab)，2, Fab自身是一個通過二硫鍵連接到VH-CH1的輕鏈。 F(ab)，2在溫和條件下可以被還原以破壞鉸鏈區內的二疏鍵，從而將F(ab)'2 二 聚體轉化成Fab，單體。Fab，單體主要是帶有部分鉸鏈區的Fab(對于其它抗體 片段的具體說明，參見Fundamental Immunology ， W. E. Paul ，編，Raven Press ， N.Y.(1993))。盡管是從一個完整抗體消化方面來定義各種抗體片段的，但技術 人員應該認識到這些Fab，片段也可以在體外通過化學或重組DNA方法來重新 合成。因此，本文所用術語抗體也包括通過修飾完整的抗體或利用重組DNA 方法重新合成產生的抗體片段。優選的抗體包括單鏈抗體(以單多肽鏈存在的抗體)，更優選單鏈Fv抗體(sFv或scFv),其中可變重鏈和可變輕鏈連接在一 起(直接或通過肽接頭)形成連續的多肽。單鏈Fv抗體是共價鍵連接的VH-VL 異源二聚體，其可以表達自包括VH-和VL-編碼序列的核酸，這些核酸直接 或通過編碼肽的接頭連接。Huston等(1988)Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883。雖然VH和VL相互連接形成一個單多肽鏈，但VH和VL結構域 以非共價鍵結合。本領域技術人員熟知scFv抗體和許多其它結構，它們可以 將自然聚集但化學分離的抗體V區域的F輕多肽鏈和重多肽鏈轉化成能夠折 疊成三維結構的分子，這些結構與抗原結合位點的結構基本上類似。(參見如
美國專利號5,091,513、 5,132,405和4,956,778)。
術語"多核苷酸"是指脫氧核糖核普酸或核糖核普酸的聚合體，除非特別限
術i吾"多核苷酸"是指任何形式的DNA或RNA，包括如，基因組DNA;互補 DNA(cDNA),其為mRNA的DNA形式，通常通過信使RNA(mRNA)的逆轉 錄或擴增獲得；由合成或擴增產生的DNA分子；和mRNA。術語"多核苷酸" 包括雙鏈核酸分子以及單鏈分子。在雙鏈多核芬酸中，多核普酸鏈不需要共 同可延伸(即雙鏈多核普酸不需要沿著雙鏈的全長都是雙鏈)。
本文所用術i吾"互補"是指在兩個核普酸間精確配對能力。即如果一個核酸 分子的指定位置的核普可以通過氫鍵與另一個核酸分子的核苷結合，則認為 這兩個核酸分子在此位點相互互補。術語"基本上互補"是指序列彼此間足夠互 補而在嚴格的雜交條件下可以實現特異性雜交。
短語"嚴格的雜交條件，，通常是指在限定的離子強度和pH下，對于特定序 列溫度比融熔溫度(Tm)低約5°C。可以實現大多數序列的特異性雜交的代表性 嚴格條件是溫度至少為約60t，鹽濃度為約0.2mo1, pH7.0。
"特異性雜交"是指在限定的嚴格條件下核酸分子與靶核苷酸序列結合，而基本上不與雜交混合物中的其它核芬酸序列結合。本領域技術人員知道放寬 雜交條件會使得序列錯配被接受。
短語"有效量，，和"足以……的量，，是指產生期望的生物活性的生物活性劑 的量。
當用于指施用Epac和/或PLD抑制劑和其它止痛劑時，術語"共給藥"是 指所述抑制劑的給藥能在患者體內讓這些抑制劑的生理學活性至少在時間先 后順序上有部分的重疊。因此，可以同時和/或順序施用Epac和/或PLD抑制 劑和另一種止痛劑，在順序給藥時，在施用第二種制劑前，甚至還可以有些 延遲(如幾分鐘或甚至幾小時或幾天)，只要當服用第二種給藥制劑或第二種給 藥制劑在該患者體內起作用時，第一種給藥制劑仍對生物體保持某些生理作 用。
本文所用術語"減輕疼痛"是指使患者感覺的疼痛水平相對于不進行干預 的患者感覺的疼痛水平降低。當所述患者是人時，患者感覺的疼痛水平可以
可以通過測量患者對疼痛的物理反應來進行測定，如壓力相關因子的釋放或 外周神經系統或CNS中的疼痛轉換神經的活性。還可以通過測量無疼痛存在 的報告人或要終止正具疼痛癥狀的患者所需要的已知止痛劑的量來進行測 定。疼痛減輕還可以通過閾值的增加來進行測量，在該閾值患者在給定刺激 下感受到疼痛。在某些實施方式中，疼痛減輕是通過降低"痛覺過敏，，來實現的， "痛覺過敏"是對傷害性刺激的增高敏感性，而且發生這種抑制并不會損害傷害 感受性，即患者對"傷害性刺激"的正常^i:感性。
對于疼痛減輕來說，"有需要的患者"是指料想近期會經歷疼痛的動物或 人，優選人。所述動物或人可能正處于疼痛狀態下，而且很可能將繼續引發 疼痛。或者，所述動物或人已經、正在或將遭受通常具有疼痛后果的過程或事件。慢性疼痛癥諸如糖尿病神經性痛覺過敏和膠原血管病是第一種類型的 實例；牙科行為，特別是伴有炎癥或神經損傷、和毒素接觸(包括接觸化療制 劑)的行為是后 一 種類型的實例。
"炎性痛"是指由炎癥引起的疼痛。炎性痛經常會表現為對機械刺激提高的 敏感性(機械性痛覺過敏或敏感)。
"神經性痛，，是指由神經損傷所致病癥或事件而引起的疼痛。"神經病，，是指 一種導致神經損害的疾病。"灼痛，，是指神經受損后的慢性疼痛狀態。"痛覺超
敏(Allodynia)，，是指個人對常規非痛性刺激諸如溫柔接觸感到疼痛的狀態。
如本文所用，術語"全身性疼痛癥，，是指一些先天性疼痛綜合癥(如纖維肌 痛、過敏性腸綜合癥、和顳下頜關節紊亂癥)，目前其致病機理還未知，特征 是擴散的或全身性疼痛，且確診排除了炎癥或神經病是其直接的疼痛病因。
"止痛劑，，是指一種導致疼痛減輕的分子或分子組合。當止痛劑的作用機理 并不涉及直接(通過靜電或化學相互作用)與Epac、 PLCs或PLD或任何 Epac/PLCe/PLD通道內的胞內分子相互作用，和減弱Epac、 PLCs或PLD或 任何Epac/PLCs/PLD通道內的胞內分子的作用或功能時，止痛劑會采用非抑 制Epac、 PLCs或PLD的作用機理。
"鎮靜藥"是指一類用于治療精神病癥的鎮靜藥物，其調節中柩神經系統中 的神經遞質活性并通過調節乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、五鞋色腔或y 氨基丁酸(GABA)傳導來起作用。
"急性"和"慢性"疼痛之間的區別在于時間急性疼痛是在引發所述疼痛的 事件發生(如炎癥或神經損傷)后，很快(如通常在約48小時內，更典型地是約 24小時內，最典型地是約12小時內)就經歷。相反，在經歷慢性疼痛和引發 所述疼痛的事故發生之間有很明顯的時間延遲。這個時間延遲通常是所述事 件后至少約48小時，更典型地是所述事件后至少約96小時，最典型地是所述事件后至少約1周。
"待測試劑"是任何能在本發明的預篩選或篩選分析中被篩選的試劑。所述 待測試劑可以是任何適合的組合物，包括小分子、肽或多肽。
減輕疼痛的方法
A. —般描述
本發明提供了 一種減輕疼痛的方法。該方法包括給有需要的患者施用有 效量的Epac、磷脂酶C-s(PLCs)和/或磷脂酶D(PLD)的抑制劑。
本發明的患者可以是任何能表達Epac、磷脂酶C-s(PLCs)和/或PLD且具 有可檢測的疼痛反應的個體。適合的患者實例包括研究動物，比如小鼠、大 鼠、豚鼠、兔、貓、狗、以及猴和其它靈長類和人。在一特別有用的實施方 式中，所述患者遭受痛覺過敏，施用了本發明的抑制劑減輕了痛覺過敏，優 選不會影響傷害感受。在該例中，用所述抑制劑治療的患者將會使過度的疼 痛減輕，比如由無傷害性刺激引起的疼痛，但同時還能正常地感覺對傷害性 刺激的疼痛。
在一實施方式中，所述患者患有炎性痛，其可以是急性的或慢性的。可 通過抑制Epac、PLCe和/或PLD的治療得到緩解的炎性痛實例包括由于曬傷、 關節炎、結腸炎、心肌炎、皮炎、肌炎、神經炎、粘膜炎、尿道炎、膀胱炎、 胃炎、肺炎和膠原血管病引起的疼痛。
在另一實施方式中，所述患者患有神經性痛，其也可以是急性的或慢性 的。可通過抑制Epac、 PLCs和/或PLD的治療得到緩解的神經性痛實例包括 由于病癥如灼痛、糖尿病、膠原血管病、三叉神經痛、脊髓損傷、腦干損傷、 丘腦疼痛綜合癥、I型復雜區域疼痛綜合癥/反射性交感神經營養不良癥、 Fabry's綜合癥、小纖維神經病、癌癥、癌癥化療、慢性酒精中毒、中風、膿
腫、脫髓鞘疾病、病毒性感染、抗病毒治療、艾滋病和艾滋病治療引起的疼 痛。由于如外傷、手術、截肢、毒素和/或化療引起的炎性痛也可以用本發明 的抑制劑來進行治療。
在特定具體實施方式
中，所述患者患有全身性疼痛癥，比如纖維肌痛、 過敏性腸綜合癥和/或顳下頜關節紊亂癥。
本發明的方法包括將Epac， PLCs，和/或PLD抑制到足以降低患者疼痛 體驗的程度。在不同實施方式中，Epac、 PLCs和/或PLD被抑制至少約10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90和95%，這可以通過任何適合的Epac、 PLCs 和/或PLD抑制測量法(如本文所描述的任何分析法)來測定。
1.對Epac的抑制
患者能耐受的任何類型的Epac抑制劑都可在本發明的方法中使用。因此， 所述抑制劑可以是多肽(比如抗Epac抗體)、多核苦酸(比如，編碼抑制性多肽 的抑制性RNA或多核普酸)或小分子。在具體實施方式
中，當該抑制劑是多 核苷酸編碼的抑制性多肽時，將所述多核苦酸導入患者細胞內，在該細胞內 此編碼多肽能以足以抑制Epac的量表達。
Epac抑制可通過任何可用方式獲得，如(l)抑制Epac的表達、mRNA穩 定性、蛋白運輸、或修飾；(2)刺激Epac降解；或(3)抑制Epac的 一種或多種 正常功能，比如鳥嘌呤交換。在優選實施方式中，Epac抑制劑直接對Epac起 作用。
在 一 實施方式中，Epac抑制是通過降低任意靶組織中的Epac多肽水平來 獲得的，在所述靶組織中Epac/PLCe/PLD通道有活性。該通道在如中樞神經 系統神經元中，尤其是背根神經節神經元中，更尤其是同工凝集素B4-陽性 (IB4(+))傷害感受體中是有活性的。可以使用如反義或RNA干擾(RNAi)技術來使Epac水平降低。
在其它具體實施方式
中，Epac抑制劑可以是通過如下所述的本發明篩選 方法鑒定的肽或小分子。
2.對PLCs的抑制
可以按照本發明的方法，利用患者能耐受的任何類型的PLCs抑制劑來對 PLCs進行抑制。因此，所述抑制劑可以是多肽(比如抗PLCs抗體)、多核苷 酸(比如編碼抑制性多肽的抑制性RNA或多核普酸)或小分子。在具體實施方 式中，當該抑制劑是多核脊酸編碼的抑制性多肽時，將所述多核苷酸導入患 者細胞內，在該細胞內此編碼多肽能以足以抑制PLD的量表達。
PLCs抑制可通過任何可用方式獲得，如(l)抑制PLCs的表達、mRNA穩 定性、蛋白運輸、或修飾；(2)刺激PLCs降解；或(3)抑制PLCs的一種或多種 正常功能，比如磷脂(主要是磷脂酰肌醇)水解生成三磷酸肌醇以及甘油二酯 (DAG)。在優選實施方式中，PLCs抑制劑直接對PLCs起作用。
在一實施方式中，PLCs抑制是通過降低任意耙組織中的PLCs水平而獲 得的，在所述靶組織中Epac/PLCs/PLD通道是有活性的，比如在中樞神經系 統神經元中，尤其是背根神經節神經元中，更尤其是同工凝集素B4-陽性 (IB4(+))傷害感受體中是有活性的。可以使用如反義或RNA干擾(RNAi)技術 來使PLCe水平降低。
在優選的實施方式中，PLCs抑制劑可以是如肽或小分子。對一些PLC肽 或小分子抑制劑已有描述，包括PI-PLC抑制劑U-73122(可從Sigma購得)、 ET-180CH3(Siese， A.等，Scand J Immunol. 1999年2月，49(2): 139-48)和新 霉素。適合具體應用的PLCs抑制劑的選擇是在本領域技術人員水平之內的。
PLCs抑制劑對PLCs可以是非選擇性的或選擇性的。優選的實施方式使用選擇性PLCe抑制劑。 3.對PLD的抑制
可以按照本發明的方法，利用患者能耐受的任何類型的PLD抑制劑來對 PLD進行抑制。因此，所述抑制劑可以是多肽(比如抗PLD抗體)、多核脊酸(比 如編碼抑制性多肽的抑制性RNA或多核苷酸)或小分子。在具體實施方式
中， 當該抑制劑是多核苷酸編碼的抑制性多肽時，將所述多核普酸導入患者細胞 內，在該細胞內此編碼多肽能以足以抑制PLD的量表達。
PLD抑制可通過任何可用方式獲得，如(l)抑制PLD的表達、mRNA穩定 性、蛋白運輸、或修飾；(2)刺激PLD降解；或(3)抑制PLD的一種或多種正 常功能，比如磷脂(主要是卵磷脂)水解生成磷脂酸，磷脂酸轉換成甘油二酯 (DAG)。在優選的實施方式中，PLD抑制劑直接對PLD起作用。
在一實施方式中，PLD抑制是通過降低任意耙組織中的PLD水平而獲得 的，在所述靶組織中Epac/PLCs/PLD通道是有活性的，比如在中樞神經系統 神經元中，尤其是背根神經節神經元中，更尤其是同工凝集素B4-陽性(IB4(+》 傷害感受體中有活性。可以使用如反義或RNA干擾(RNAi)技術來使PLD水 平降低。
在優選實施方式中，PLD抑制劑可以是比如肽或小分子。對一些小分子 PLD抑制劑都已有描述，包括乙二胺四乙酸三鉀鹽脫水物(Sigma)、乙二醇-二(2-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(Sigma)、 C(2)-神經酰胺(Nishimaru， K.,等， J. Pharmacol. Sci.(2003)92: 196-202)和l-丁醇(Jackson， T.C.,等，J. Pharm. Exp. Therapeutics Fast Forward(2004)DO1: 10.1124/jpet.l03.063081)。適合具體應用 的PLD抑制劑的選擇是在本領域技術人員水平之內的。
PLD抑制劑對PLD可以是非選擇性的或選擇性的。優選的具J本實施方式
使用選擇性PLD抑制劑。
4.抑制Epac， PLCs,和/或PLD的方法
能抑制任意感興趣基因或蛋白的各種技術都是可用的。它們都可在本發 明的方法中使用，包括下面描述的5種示例性技術。 a.反義法
可以利用反義分子來降低Epac、 PLCs和/或PLD基因表達或完全阻斷其 表達。"反義序列或反義多核芬酸，，是與Epac、 PLCs和/或PLD編碼mRNA序 列或其子序列互補的多核苷酸。反義分子與Epac、 PLCs和/或PLDmRNA的 結合會干擾該編碼多肽的正常翻譯。
因此，在具體實施方式
中，本發明提供了用于抑制Epac、 PLCs和/或PLD 的反義分子。適合的反義分子包括能與Epac、 PLCs和/或PLDmRNA雜交的 寡核苷酸和寡核苷酸類似物。所述寡核普酸和寡核普酸類似物能夠抑制RNA 的功能，抑制其翻譯成蛋白，移位至細胞質，或抑制對整個生物功能來說所 必需的任何其它活性。mRNA無法實現其全部或部分正常功能會部分或完全 抑制Epac、 PLCs和/或PLD多肽的表達。
可用于本發明的反義方法中的寡核普酸包括通過天然磷酸二酯鍵連接從 天然存在的堿基和/或環呋喃糖基形成的寡核香酸。術語"寡核普酸"包括與寡 核苷酸功能類似但具有非天然存在部分的實體。因此，寡核苷酸可以包括變 化的糖部分或糖內鍵。這其中的實例是^e克代磷酸酯和本領域所熟知的其它含 疏物。按照某些優選的實施方式，寡核普酸中的至少一個磷酸二酯鍵已經被 一結構取代，該結構的作用是能夠提高組合物滲入到活性會受到調控的RNA 所在的細胞區域內的能力。優選地，所述取代包括疏代磷酸酯鍵、甲基磷酸 酯鍵、或短鏈烷基或環烷基結構。按照其它優選實施方式，用基本同時是非
離子性和非手性的結構，或用手性和對映異構特異性的結構取代磷酸二酯鍵。 本領域的常規技術人員應該能夠選出適合用于本發明操作的其它鍵。
在代表性的實施方式中，核苷酸間磷酸二酯鍵被肽鍵取代。這樣的肽多 核苷酸顯示了提高的穩定性，更容易滲入細胞，而且顯示對其耙標的親和性
增強。制備肽多核普酸的方法是本領域技術人員所熟知的(參見如美國專利號 6,015,887、 6，015,710、 5,986,053、 5,977,296、 5,902,786、 5,864,010、 5,786,461、 5,773,571、 5,766,855、 5,736,336、 5,719,262和5,714,331)。
可用于本發明反義法中的寡核苷酸還包括一種或多種修飾的堿基形式。 因此，可以使用除了常在自然界中出現的噤呤和嘧啶之外的噤呤和嗜啶。類 似地，只要堅持本發明的基本原則，還可以對核芬酸亞單位的呋喃糖部分進 行修飾。這種修飾實例是2'-0-烷基-和2'-囟素-耳又代的核普酸。可用于本發明 的糖部分2'位上的某些特定修飾實例是OH、 SH、 SCH3、 F、 OCH3、 OCN、 0(CH2)[n]NH2或0(CH2)[n]CH3，其中n是從1至約10，以及其它具有相似性 質的取代基。
所有這些類似物均可在本發明的反義法中使用，只要該類似物具有能有 效地與Epac、 PLCs和/或PLD mRNA雜交并且抑制此RNA功能的功能。
本發明的反義寡核普酸優選包括約3至約50個亞基(即非修飾性多核苷酸 中的;威基)。優選，所述寡核普酸和類似物包括約8至約25個亞基，而且更優 選含有約12至約20個亞基。本發明所用的寡核普酸可利用熟知的固相合成 技術來便利且常規地制備而成。有一些賣方銷售此種合成設備(如Applied Biosy stems)。
可以根據常規慣例，合成、配制本發明的反義寡核芬酸，并施用給細胞、 組織或生物體。下面將討論關于給藥和劑量的常規考慮。對于含有Epac、 PLCs 和/或PLD多核苷酸抑制劑的組合物，下面討論了含至少一種能促進多核苷酸
進入細胞內的成分的配方。本領域的技術人員將^艮容易理解，這樣的討i侖也
同樣適用于RNAi中使用的反義寡核普酸，催化性RNA和DNA,和雙鏈RNA。 類似地，本領域的技術人員可以理解，如下面所述的多核苷酸抑制劑一樣， 反義寡核苷酸一般也能被導入到宿主細胞中。
b.催化性RNA和DNA d)核酶
在另 一方法中，可利用核酶來抑制Epac、 PLCs和/或PLD表達。如本文 所用，"核酶"包括具有用于特異性識別的反義序列和RNA-酶切活性的RNA 分子。所述催化鏈優選以高于化學計量濃度切割靶(Epac、 PLCs和/或 PLD)RNA中的特異性位點。本發明的核酶典型地由RNA組成，但該核酶也 可以由含嵌合多核苷酸序列(如DNA/RNA序列)的多核苷酸分子和/或多核苷 酸類似物(如辟^代磷酸酯)組成。
因此，本發明的一方面包括具有抑制Epac、 PLCs和/或PLD表達能力的 核酶。所述核酶可以是比如"錘頭(hammerhead)"型(如Forster和Symons (1987) Cell 48: 211-220; Haseloff和Gerlach (1988) Nature 328: 596-600; Walbot和 Bruening (1988) Nature 334: 196; Haseloff和Gerlach (1988) Nature 334: 585 所述)；Rossi等，(1991) Pharmac. Ther. 50: 245-254)或"發夾，，型(參見如，美 國專利5,254,678和Hampel等，歐洲專利申請號0 360 257， 1990年3月26 曰公開；Hampel等，(1990) Nucl. Acids Res. 18: 299-304)，并且具有特異性 靶定和切割Epac、 PLCs和/或PLD多核苷酸的能力。
發夾核酶所需序列是由NNNBN*GUCNNNNNN序列組成的任意RNA序 列(其中N承G是切割位點，B是G、 C或U， N是G、 U、 C或A)(SEQ ID NO: 1)。適合發夾核酶的Epac 、 PLCs和/或PLD識別或耙序列可以4艮容易地從Epac 、
PLCe和/或PLD序列確定。
錘頭核酶切割位點所需序列是由NUX組成的任意RNA序列(其中N是 G、 U、 C或A， X代表C、 U或A)。因此，發夾前導序列中的同一靶標GUC， 可用于錘頭核酶。錘頭核酶或發夾核酶的其它核苷酸是根據耙序列兩側的核 普酸和錘頭共有序列確定的(參見Ruffner等，(1990) Biochemistry 29: 10695-10702)。
Cech等(美國專利4,987,071)已經公開了某些具有核糖核酸內切酶活性的 合成核酶的制備和應用。這些核酶是以四膜蟲核糖體RNA自剪4姿反應為基礎， 需要8個堿基對的靶位點。據報道，核糖核酸內切酶活性的最適宜溫度是50°C 。 切割產生的片段包括5，磷酸脂和3，羥基和連接在被切割的RNA5，端的游離鳥 嘌呤核苷。本發明優選的核酶能在生理學溫度下有效地與耙序列雜交，從而 使其尤其適合體內使用。
可用本領域熟知的適合多核芬酸分子合成的方法化學合成核酶，以及編 碼這些核酶的DNA，和其它適合的多核苷酸分子。或者，Promega, Madison， Wis.， USA提供了一系列適合制備RNA分子比如核酶的規程。核酶還可以從 與RNA聚合酶啟動子，如T7 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶的啟動子可操 作地連接的DNA分子或其它多核苷酸分子(其通過轉錄產生RNA分子)制備 而成(如提供起始位點和轉錄模版的載體)。因此，本發明還提供了編碼本發明 核酶的多核普酸分子，如DNA或cDNA。當所述載體還包括與所述多核苷酸 分子可操作連接的RNA聚合酶啟動子時，可以通過將RNA聚合酶和適合的 核苷酸一起放置，從而在體外制備產生所述核酶。在獨立實施方式中，可將 DNA插入到表達框內(參見如，Gotten和Birnstiel (1989) EMBO J 8(12): 3861-3866; Hempel等(1989) Biochem. 28: 4929-4933,等)。
在合成之后，將具有穩定核酶能力的DNA分子與核酶連接來進行修飾，
從而使其對RNase有抗性。或者，可將核酶修飾成在脂質體傳遞體系中使用 的相應的疏代磷酸類似物。這種修飾還可以使核酶具有對核酸內切酶活性的 抗性。
可以根據常規慣例，合成、配制核酶或其編碼多核苷酸(如DNA載體)， 并施用給細胞、組織或生物體。下面將討論關于給藥和劑量的常規考慮。關 于含有Epac、 PLCs和/或PLD多核普酸抑制劑的組合物，下面討論了含至少 一種能促進多核普酸進入細胞內的成分的配方。本領域的技術人員應很容易 理解，如下面所述的多核普酸抑制劑一樣，核酶或其編碼多核苷酸一般也能 被導入到宿主細胞中。
當載體含有與RNA轉錄啟動子相連的編碼核酶時，當宿主細胞在利于該 載體轉錄的適合條件下生長時，RNA可以在該宿主細胞中產生。所述載體可 以是，但不限于質粒、病毒、逆轉錄轉座子和祐粒。所述載體的實例已在 美國專利號5,166,320中公開。其它代表性的載體包括但不限于腺病毒載體(如 WO 94/26914， WO 93/9191; KoIIs等(1994) PNAS 91(1): 215-219; Kass誦Eisler 等，(1993)Proc.Natl.Acad. Sci， USA, 90(24): 11498-502, Guzman等(1993) Circulation 88(6): 2838-48， 1993; Guzman等(1993) Cir. Res. 73(6): 1202-1207， 1993; Zabner等(1993) Cell 75(2): 207-216; Li等(1993) Hum Gene Ther. 4(4): 403-409; Caillaud等(1993) Eur. J Neurosci. 5(10): 1287-1291)，腺相關l型 病毒載體("AAV-l")或腺相關2型病毒載體("AAV-2")(參見WO 95/13365 ;Flotte 等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci， USA， 90(22): 10613-10617)，逆轉錄病毒載 體(如EP 0 415 731 、 WO 90/07936、 WO 91/02805、 WO 94/03622、 WO 93/25698、 WO 93/25234、美國專利號5,219,740、 WO 93/11230、 WO 93/10218)和皰發病 毒載體(如美國專利號5,288,641)。在基因治療中利用這些載體的方法是本領 域所熟知的，參見如Larrick和Burck (1991) Gene Therapy: Application of
Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York, New York, 和Kreigler (1990) Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company ， New York。
為了在體內利用這些載體來制備核酶，編碼核酶的核普酸序列優選地可 操作地與強啟動子比如lac、 SV40 B免期、SV40早期或人啟動子連接。
f2)催化性DNA
以類似于核酶的方式，DNA分子也具有催化(如核酸酶)活性。舉例來說， 高催化性物種已經通過定向進化和選擇而得以發展。從含50個隨機核苷酸的 IO"DNA群開始，進行連續輪的選擇性擴增，富集得到大量最能促進對位于 其它全-DNA序列中的靶核糖核普3'-0-P鍵的Pb2十-依賴性切割的個體。到第 五次循環時，該DNA群的整體反應速度是0.2 min"。在從該DNA群分離的 20個單獨序列的基礎上，分子間運作的催化性結構域的簡化形式轉換率為1 min"(參見如，Breaker和Joyce (1994) Chem Biol 4: 223-229)。
在后面的工作中，利用相似策略，在模擬的生理條件下，制備能切割幾 乎任何靶RNA底物的DNA酶。該酶由15個脫氧核普酸的催化結構域組成， 兩側是均由7-8個脫氧核苷酸組成的兩個底物識別結構域。該RNA底物通過 Watson-Crick》咸基配對連接，在^立于未配對噤^令和配對嘧咬殘基之間特定的磷 酸二酯處被切開。盡管DNA酶的大小較小，但在多個轉換條件下，DNA酶 的催化效力(kcat/Km)為約lC^M-imin-1,超過了任何其它已知的多核苷酸酶。 通過改變底物識別結構域的序列，可讓DNA酶#巴定不同的RNA底物(Santoro 和Joyce (1997) Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 94(9): 4262-4266)。修飾合適的 靶序列(如Santoro和Joyce所述，見上)可以很容易地讓DNA酶重新耙定Epac、 PLCs、和/或PLDmRNA，而且可以如上述Epac、 PLCs和/或PLD核酶基本
相同的方式來使用。
c. RNAi法
轉錄后基因沉默(PTGS)或RNA干擾(RNAi)是指當注入，或以其它方式導 入細胞時，雙鏈(有義鏈)RNA(dsRNA)特異性阻斷其同源基因表達的機制。該 方法是基于觀察到將反義或有義RNA鏈注射入線蟲(C. elegans)細胞會導致基 因特異性失活而形成的(Guo和Kempheus (1995) Cell 81: 611-620)。雖然由反 義鏈引起的基因失活是可預期的，但由有義鏈引起的基因沉默就是無法預料 的。令人吃驚的是，確定基因特異性失活實際上是由于痕量的污染dsRNA(Fire 等，(1998) Nature 391: 806-811)。
自此以后，已經在許多種生物體中證明存在此種模式的轉錄后基因沉默 植物、蒼蠅、錐體蟲、渦蟲、水螅、斑馬和小鼠(Zamore等(2000) Cell 101: 25-33; Gura (2000) Nature 404: 804- 808)。 RNAi活性與完全不同于轉座子-沉默、抗病毒防御機制和基因調節的功能(1999)Cell96: 303-306)有關。
通過將dsRNA注入組織，不僅可以使特異性基因在這些組織中失活，而 且可以在各種發育階段中失活。這與組織-特異性敲除或組織-特異性顯性失活 (dominant-negative)基因表達相反，其不會在發育過程的各種階段中讓基因沉 默(Gura (2000) Nature 404: 804-808)。
可以根據常，見慣例，配制dsRNA，并將它施用給細胞、組織或生物體。 下面將討論關于給藥和劑量的常規考慮以及含有至少一種能促進多核苷酸進 入細胞內的成分的配方(下面討論的是關于含有Epac、 PLCs和/或PLD多核苷 酸抑制劑的組合物)。本領域的技術人員將很容易理解，如下面描述的多核苦 酸抑制劑一樣，dsRNA —般也能被導入到宿主細胞中。另外，可以用一種或 多種載體來合成dsRNA，所述載體設計用于轉錄兩個雜交形成dsRNA的互補
RNA 4連(參見以上關于核酶的方法討論)。利用本文所述的或適合此目的的本 領域已知的任何技術，可將它們導入宿主細胞。
在導入細胞后，顯示dsRNA被切成21-23-核普酸片段。這些片段隨后靶 定其相應mRNA的同源區域，雜交并產生適合核酸酶的雙鏈底物，該核酸酶 將雙鏈底物降解成相同大小的片段(Hammond等(2000) Nature 404: 293-298; Zamore等(2000) Cell 101: 25-33)。
d."敲除"法
在另一種方法中，可以僅通過分別"敲除，，Epac、 PLCs和/或PLD基因來 抑制Epac、 PLCs和/或PLD。通常，這是通過破壞Epac、 PLCs和/或PLD基 因，破壞調節基因的啟動子或破壞啟動子和基因間的序列來實現的。這種破 壞可以是通過同源重組來特異性針對Epac、 PLCs和/或PLD進行，其中"敲除 構建體"包括與該構建體要靶定的結構域互補的側翼序列。敲除構建體插入(比 如插入Epac、 PLCs和/或PLD基因中)會破壞該基因。短語"基因的破壞"和"基 因破壞"是指將核普酸序列插入到天然DNA序列的 一 區域(通常是一種或多種 外顯子)和/或基因啟動子區域內，從而與野生型或天然存在的基因序列相比， 減少或防止該基因在細胞中的表達。通過實例的方式，可將核酸構建體制備 成含有編碼抗生素抗性基因的DNA序列，將其插入互補于需要破壞的DNA 序列(啟動子和/或編碼區)的DNA序列中。當隨后將該核酸構建體轉染入細胞 后，該構建體會整合入基因組DNA。這樣，由于該基因現在被抗生素抗性基 因破壞，因此該細胞和其后代將不再表達該基因或將以衰退水平表達。
可以用本領域技術人員已知的常規技術來制備敲除構建體。敲除構建體 可以是化學合成的或組裝的，比如利用重組DNA法。用選擇來剪切一個或多 個位點的特定限制性內切酶將用于制備所述敲除構建體的基因組DNA序列
消化，從而使新的編碼如標記基因的DNA序列可以被插入到該DNA序列的 該合適位點內。合適的標記基因插入位點是用于防止天然基因表達的位點； 該位點取決于各種因素，如要進行切割的序列的限制性酶切位點，以及是否 會阻斷外顯子序列或啟動子序列，或這兩者(即抑制啟動子功能或抑制天然外 顯子合成所必需的精確的插入位點)。優選地，選擇用于切斷DNA的酶將會 產生一長臂和一短臂，其中短臂有至少約300個堿基對(bp)。在某些情況下， 期望能實際上去除掉部分或甚至全部的要抑制的基因的一或多個外顯子，以 便當標記基因插入到敲除構建體內時，保持敲除構建體的長度能夠和原始的 基因組序列相當。在此種情況下，用合適的限制性核酸內切酶切割基因組 DNA,這樣就可以去除合適大小的片段。
標記基因可以是任何可測量和/或可分析的核酸序列；但通常是抗生素抗 性基因或其它基因，該基因在基因組中的表達或存在可被很容易地檢測到。 標記基因通常可操作地與其自己的啟動子連接或與來自任何來源的另一種強 啟動子連接，該啟動子在其要導入的細胞中有活性或容易被激活；但標記基 因并不必須與其自己的啟動子相連接，因為它可以利用將被抑制的基因啟動 子來轉錄。另外，標記基因通常包含與基因的3'端相連的polyA序列；該序 列用作終止基因轉錄。優選的標記基因是任何抗生素抗性基因，包括但不限 于neo(新霉素抗性基因)和p-gal①-半乳糖苷酶)。
在用合適的限制性內切酶消化基因組DNA序列之后，用本領域技術人員 熟知的方法將標記基因序列連^妄到基因組DNA序列內(參見如Berger和 Kimmel ， Guide to Molecular Cloning Techniques ， Methods in Enzymology ， 第 152巻，Academic Press ， Inc. San Diego, CA; Sambrook等(1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第二版)Vol. 1-3 ， Cold Spring Harbor Laboratory ， Cold Spring Harbor Press ， NY;和Current Protocols in Molecular Biology ， F.M.Ausubel等編,Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc.和John Wiley & Sons, Inc., (1994)增刊)。
可以利用基因治療運載工具(如逆轉錄病毒、脂質體、脂質、樹狀聚合物 (dendrimers)等)將所得敲除構建體運載至體內細胞。敲除基因的方法在文獻中 進行了詳述，為本領域技術人員所熟知(參見如Thomas等(1986) Cell 44(3): 419-428; Thomas等(1987) Cell 51(3): 503-512)1; Jasin和Berg (1988) Genes & Development 2: 1353-1363; Mansour等(1988) Nature 336: 348-352; Brinster 等(1989) Proc Natl Acad Sci 86: 7087-7091; Capecchi (1989) Trends in Genetics 5(3): 70-76; Frohman和Martin (1989) Cell 56: 145-147; Hasty等(1991) Mol Cell Bio 11(11): 5586-5591; Jeannotte等(1991) Mol Cell Biol. 11(11): 557814 5585;和Mortensen等(1992)Mo1 Cell Biol. 12(5): 2391-2395。
利用同源重組來改變外源基因表達還在美國專利5,272,071 、 WO 91/09955、 WO 93/09222、 WO 96/29411、 WO 95/31560和WO 91/12650中有 詳述。
雖然胚胎千(ES)細胞可用于制備敲除動物，但ES細胞并不是必需的。在 不同實施方式中，可利用體細胞核移植法來獲得敲除動物。在優選的實施方 式中，利用這種方法，從待敲除Epac、 PLCs和/或PLD基因的物種中獲得體 細胞。用構建4本轉染該細胞，所述構建體在Epac、 PLCs和/或PLD基因中產 生破壞(如通過同源重組)。比如通過對用于破壞天然基因的標記基因所編碼的 標記物的表達進行篩選，選出含有;j皮敲除Epac、 PLCs和/或PLD基因的細胞。 然后，將含有該敲除的細胞核置于未受精的去核卵子內(如已通過顯微外科手 術去除掉其中的天然胞核的卵子)。 一旦完成轉移，受體卵子就會正如它已接 受了精子受精一樣含有一套完整的基因。然后，在移植到宿主哺乳動物(與提 供卵子的是同一物種)之前，將該卵子培養一段時間，使該宿主哺乳動物懷孕，
生出包括核酸構建體的轉基因動物，該核酸構建體含有一或多個被破壞的
Epac、 PLCs和/或PLD基因。
據報道，在對培養的體細胞進行核轉移后獲得可育克隆哺乳動物可適用 于各種物種，包括但不限于青蛙(McKinnell(1962)J. Hered. 53, 199-207)、 小牛(Kato等(1998) Science 262: 2095-2098)、羊(Campbell等(1996) Nature 380: 64-66)、小鼠(Wakayama和Yanagimachi (1999) Nat Genet. 22: 127-128)、 山羊(Baguisi等(1999)Nat. Biotechnol. 17: 456-461)、猴(Meng等(1997) Biol. Reprod. 57: 454-159)和豬(Bishop等(2000) Nature Biotechnology 18: 1055-1059)。已用核轉移法獲得了轉基因動物克隆。因此，例如，已有報道通 過體細胞核轉移獲得了含有人抗凝血酶(antithrobin)III基因的轉基因山羊 (Baguisi等(1999) Nature Biotechnology 17: 456-461)。
通過利用能無性地繁殖的已分化的細胞源，體細胞核轉移簡化了轉基因 步驟。這就不需要保持細胞處于未分化狀態，這樣，基因修飾，隨機整合和 基因靶定，都會很容易實現。而且，通過將核轉移和能在體外對這些細胞進 行修飾和選擇的能力相組合，該方法比先前的轉基因胚胎技術更有效。
核轉移技術或核移植在文獻中是已知的。參見，特別是，Campbell等(1995) Theriogenology， 43: 181; Collas等(1994) Mol. Report Dev., 38: 264-267; Keefer等(1994) Biol. Reprod. ， 50: 935-939; Sims等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci， USA，卯6143-6147; WO 94/26884; WO 94/24274， WO 90/03432，美 國專利5,945,577、 4,944,384、 5,057,420等等。
e.胞內抗似Intrabodies、
在另一個實施方式中，可以通過導入核酸構建體來抑制Epac、 PLCs和/ 或PLD表達/活性，所述構建體將在耙細胞內表達胞內抗體。胞內抗體是一種
細胞內抗體，在本例下，能夠識別和結合Epac、 PLCs和/或PLD多肽。胞內 抗體用"抗體框"表達，該框包含(l)足量的編碼能結合靶標(Epac、 PLCs和/ 或PLD多肽)的抗體部分的核普酸，該核芬酸可操作地連接到(2)能讓該抗體在 感興趣的細胞內表達的啟動子。將編碼該胞內抗體的構建體運送至細胞內， 在該細胞內該抗體胞內表達，并與革巴標Epac、 PLCs和/或PLD結合，從而阻 斷靶標形成其正常活性。
在優選實施方式中，抗體框的"胞內抗體基因"包括編碼抗體重鏈可變(VH) 和輕鏈可變(VO結構域的cDNA,其能在DNA水平利用合適的寡核苷酸接頭 而連接，在翻譯時，形成能結合耙標如Epac、 PLCs和/或PLD蛋白的單個肽 (稱作單鏈可變片段"sFv")。優選地，胞內抗體基因并不編碼可操作的分泌序 列，這樣表達的抗體保留在細胞內。
適合在本發明方法中作為胞內抗體使用/表達的抗-Epac、 PLCs、和/或PLD 抗體可以很容易地采用各種方法制備。這些方法包括但不限于產生多克隆 抗體的常規方法，可對該方法進行改進而形成單鏈抗^f本；或篩選比如噬菌體 展示文庫以選出對Epac、 PLCs和/或PLD顯示高特異性和/或親和力的抗體的 常規方法。
采用適合將多核普酸導入細胞的任何方法，將抗體框運送至細胞內。優 選的運送系統在美國專利6,004,940中有說明。制備和利用胞內抗體的方法詳 述于美國專利6,072,036、 6,004,940和5,965,371中。
5.抑制劑與其它試劑的共給藥
在本方法的具4本實施方式中，將Epac、 PLCs和/或PLD抑制劑與止痛劑 一起共給藥，所述止痛劑通過與所述抑制劑不同的機制來起作用。在該實施 方式的一種變形中，止痛劑是通過調節不同的信號通道，比如蛋白激酶A通
道來起作用的。這些試劑的實例包括一氧化氮，MAPK(ERK1/2、 JNK)、神經 酰胺(cermide)、 Ca2+、 NaV1.8、 TRPV1。該實施方式可用于比如從效力和/或效 力持續時間來說獲得更全面的疼痛減輕，用于拓寬通過該方法治療的疼痛的 不同類型譜，和/或用于降低抑制劑和/或止痛劑達到預期效果所需的劑量。在 該實施方式中，當與選定的Epac、 PLCe和/或PLD抑制劑共給藥時，施用的 止痛劑量足以使患者的痛覺消失。
患者能耐受的任何類型的止痛劑都可以用于本發明的方法中。實例包括 蛋白激酶A(PKA)抑制劑、cAMP抑制劑、非甾體類抗炎藥物(如對乙酰氨基 酚)、前列腺素合成抑制劑、局部麻醉劑和阿片受體激動劑。
不是止痛劑但能用于治療伴有明顯疼痛的病癥的其它試劑包括抗驚厥 藥、抗抑郁藥和鎮靜藥。
可以通過同時給藥或順序給藥將Epac、 PLCs和/或PLC抑制劑與止痛劑 或其它試劑一起共給藥。在順序給藥時，首先給藥的試劑必須在施用第二個 給藥試劑時或在第二給藥試劑在生物體內產生活性時能對生物體發揮生理作 用。
B.組合物
為了便于研究和治療性應用，通常對Epac、 PLCs或PLD抑制劑進行配 制，從而以足以在耙位點抑制Epac、 PLCs或PLD的量將抑制劑運送到靶位 點。在抑制劑組合物中可以任選地包括止痛劑或其它試劑，以便將有效的量 運送至其把位點。
在所述方法特定實施方式中，將Epac、 PLCs和/或PLD抑制劑與止痛劑 配制在一起，所述止痛劑通過不同于所述抑制劑的機制來起作用。在該實施 方式的一種變形中，止痛劑是通過調節不同的信號通道，比如蛋白激酶A通
道來起作用的。這些試劑的實例包括一氧化氮、MAPK(ERK1/2, JNK)、神經 酰胺、Ca2+、 NaV1.8、 TRPV1。
患者能耐受的任何類型的止痛劑都可以用于本發明的方法中。如上所述， 實例包括蛋白激酶A(PKA)抑制劑、cAMP抑制劑、非甾體類抗炎藥物、前列 腺素合成抑制劑、局部麻醉劑和阿片受體激動劑。
如上所述，不是止痛劑但能用于治療伴有明顯疼痛的病癥的其它試劑包 括抗驚厥藥、抗抑郁藥和鎮靜藥。因此，這些試劑還可任選地包括在本發明 的組合物中。
本發明的抑制劑組合物任選地包括其它組分，包括如儲存液，比如合適 的緩沖液如生理緩沖液。在優選的實施方式中，所述組合物是藥學組合物， 而且另一組分是藥學上可接受的載體，如Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)，第6版，Osol編，1980中所描述的。
適合用于本發明的藥學上可接受的載體在所施用的劑量下對細胞、組織、
或患者是無毒的，可以包括緩沖液(如磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液和由其它有 機酸制成的緩沖液)、抗氧化劑(如抗壞血酸)、低分子量(小于約10個殘基)肽、 多肽(如血清白蛋白、明膠和免疫球蛋白)、親水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、 氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和/或賴氨酸)、單糖、二糖 和/或其它碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖和糊精)、螯合劑(如乙二胺四乙酸 [EDTA])、糖醇(如甘露醇和山梨醇)、成鹽平衡離子(如鈉)和/或陰離子表面活 性劑(如TweenTM、 PluronicsTM和PEG)。在一實施方式中，藥學上可接受的載 體是含水pH-緩沖溶液。
特定具體實施方式
包括緩釋藥學組合物。示例性的緩釋組合物包括與抑
制劑結合或包裹抑制劑的固態疏水聚合物的半透性基質。適合的聚合物的實 例包括聚酯、水凝膠、聚交酯、L-谷氨酸和T-乙基-L-谷氨酸酶共聚物、不可
降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物、和聚D-(-)-3-鞋基丁 酸。這些基質通常以一定的形狀存在，如薄膜或微膠囊。
當抑制劑是多肽時，示例性的緩釋組合物包括典型地通過s-氨基與聚亞
烴基乙二醇(如聚乙二醇[PEG])結合的多肽。PEG與多肽結合是熟知的降低致 免疫原性和延長體內半衰期的方法(參見如，Abuchowski, J.,等(1977) J. Biol. Chem. 252: 3582-86)。只要"聚乙二醇化"蛋白保持所需功能，任何常規的"聚 乙二醇化，，法都可以^吏用。
在另一個具體實施方式
中，緩釋組合物包括脂質體包裹的抑制劑。脂質 體是由不同類型脂質、磷脂和/或表面活性劑組成的小囊泡。這些組分通常以 類似于生物膜脂質排列的雙層形式排列。采用已知方法制備包含本發明所述 抑制劑的脂質體，如Epstein等(1985) PNAS USA 82: 3688-92;和Hwang等 (1980) PNAS USA, 77: 4030-34)中所述的方法。通常，這些制劑中的脂質體 是小的(約200-800埃)單層類型，其脂質含量大于約30mol。/。膽固醇，該特定 百分比是經調節能提供最佳治療的百分比。可以利用脂質制劑包括如卵磷脂、 膽固醇、和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)采用反相蒸發法制備可用的脂 質4本。如果需要，可以用特定孔徑的濾器過濾脂質體來獲得特定直徑的脂質 體。
本發明的藥學組合物可以以任何常規形式儲存，包括如水溶液或凍干的 塊狀物。通常，當給患者施用時這些組合物是無菌的。通過無菌過濾膜的過 濾可以很容易地實現水溶液的滅菌。如果組合物是以凍干形式保存的話，可 在凍干和重配之前或之后對組合物進4于過濾。
在一具體實施方式
中，本發明的方法使用包含Epac、 PLCs和/或PLD的 多核苷酸抑制劑或編碼該多肽抑制劑的多核普酸的藥學組合物。這些組合物 任選地包括其它成分，比如存儲液，如合適的緩沖液如生理緩沖液。在優選
的實施方式中，該組合物是藥學組合物，且另一組分是如上所述的藥學上可 接受的載體。
優選地，用于本發明的含有多核芬酸的組合物還包含能促進多核苷酸進 入細胞的組分。能促進多核普酸細胞內運輸的組分是已知的，包括如脂質、 脂質體、水油乳劑、聚乙烯亞胺和樹狀聚合物，它們中的任何一種都可在本 文所述的組合物中使用。脂質是其中使用最廣泛的組分，而且任何可用的脂 質或脂質配方都可用于本發明的多核普酸。通常，優選陽離子脂質。優選的
陽離子脂質包括N-[l-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-n，n,n-三甲基氯化銨(DOTMA)、 二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和/或二油酰基卵磷脂(DOPC)。
在另一實施方式中，多核苷酸與樹狀聚合物絡合，樹狀聚合物可用于將 多核苷酸導入細胞。樹狀聚合物聚陽離子是高度有序的三維寡聚物和/或聚合 物，通常通過反復的反應序列在核心分子或指定的起始物上形成，這些反應 序列添加寡聚物和/或聚合物并提供一 陽性變化的外表面。適合的樹狀聚合物 包括，但不限于"星放射狀(starburst)"樹狀聚合物和各種樹狀聚合物聚陽離 子。制備和利用樹狀聚合物將多核苷酸在體內導入細胞的方法是本領域技術 人員所熟知的，并詳述于如PCT/US83/02052和美國專利號4,507,466、 4,558,120、 4,568,737、 4,587,329、 4,631,337、 4,694,064、 4,713,975、 4,737,550、 4,871,779、 4，857，599和5,661,025中。
為了治療用途，將可用于本發明的多核芬酸以適合特定適應癥的方式來 配制。美國專利號6，001,651, Bennett等描述了一些適和用于寡核苷酸治療劑 的藥學組合物和制劑，以及這些寡核芬酸的給藥方法。
C.給藥
通常，本發明的藥學組合物是按照熟知的施用小分子藥物，以及治療性
多肽、肽和多核普酸的方法來進行給藥的。適合的給藥路徑包括，比如局部、 省爭l^內、腹腔內、腦內、腦室、月幾肉內、眼內、動樂^內或病灶內路徑。本發 明藥物組合物的給藥可以通過輸注、彈丸注射，或者如果組合物是緩釋制劑， 就通過適合特定制劑的方法來連續進行。
在某些實施方式中，所述組合物是利用傳統的經皮藥物傳遞系統，即經 皮"貼劑"通過皮膚來運送的，其中該組合物通常是包含在作為藥物傳遞工具來 與皮膚貼合的層狀結構中。在所述結構中，藥物組合物通常是包含在上面支 持層之下的一層或"儲庫，，中。應理解，本文中的術語"儲庫，，是指一些最終可用 于運送到皮膚表面的選定組合物。因此，舉例來說，儲庫可包括貼劑支持層 上膠粘劑中的組合物，或本領域技術人員已知的任一種不同的基質配方。貼 劑可以包括單一儲庫，或可以包括多種儲庫。
在一實施方式中，所述儲庫包括藥學上可接受的接觸粘附材料的聚合基 質，該基質在藥物傳送過程中讓系統與皮膚粘合。適合的皮膚接觸粘附材料
實例包括，但不限于聚乙烯、聚硅氧烷、聚異丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨酯 等。或者，該儲庫及皮膚接觸膠粘劑是以獨立和不同層存在的，膠祐劑在儲 庫下層，在此情況下，儲庫既可以是如上所述的聚合物基質或液體或水凝膠 儲庫，或也可以是其它的一些形式。這些層疊品中作為裝置上表面的支持層， 優選作為貼劑的主要結構元件使用，并能讓該裝置具有良好的彈性。優選地， 選作支持層的材料能基本不會讓存在的選定組合物和其它材料透過。
本發明所述的經皮貼劑可以包括限速貼劑膜。選定的貼劑大小和/或限速 膜應可以傳遞所需的經皮流速。還可以用釋放襯墊，比如聚酯釋放襯墊，如 本領域的常規一樣在給皮膚用貼劑之前，蓋住粘合層。該貼劑套件可以包裝 在鋁箔或其它合適的袋子中，同樣其是本領域常規的。
在其它實施方式中，將本發明的組合物以可移植的儲庫型制劑(depotformulation)給藥。設計儲庫型制劑使其實現活性劑的持續釋放的各種方法都 是已知的，而且適合在本發明中使用。通常，這種制劑的組分是生物相容的 且生物可降解的。生物相容的聚合材料已被廣泛應用于治療藥物傳遞和醫學 移植應用中，從而可以實現定位和持續釋放。參見Leong等，"Polymeric Controlled Drug Delivery" ， Advanced Drug Delivery Rev., 1: 199-233(1987); Langer， "New Methods of Drug Delivery", Science, 249: 1527-33(1990); Chien 等，Novel Drug Delivery Systems(l 982)。這些運輸系統具有提高治療效力和全 面降低毒性的潛力。
如果移植物是意欲作為藥物傳遞或其它控釋系統使用，那么利用生物降 解性聚合載體就是一種局部地并以受控方式傳輸治療劑的有效手段，參見 Langer等，"Chemical and Physical Structures of Polymers as Carriers for Controlled Release of Bioactive Agents", J. Macro. Science, Rev. Macro. Chem. Phys.， C23(l)， 61-126(1983)。這樣，需要的藥物總量會少些，而且還能將毒 副作用最小化。已經研究了的可能作為固體生物降解性材料的合成聚合物類 型實例包括聚酯(Pitt等，"Biodegradable Drug Delivery Systems Based on Aliphatic Polyesters: Applications to Contraceptives and Narcotic Antagonists"， Controlled Release of Bioactive Materials ， 19-44(Richard Baker編輯，1980);聚 (氨基酸)和偽聚(氨基酸)(Pulapura等"Trends in the Development of Bioresorbable Polymers for Medical Applications" ， J. Biomaterials Appl. ， 6: 1 ， 216-50(1992);聚氨酯(Bruin等，"Biodegradable Lysine Diisocyanate-based Poly(Glycolide-co-。 epsilon. Caprolactone)-Urethane Network in Artificial Skin"， Biomaterials, 11:4,291-95(19卯)；聚原酸酯(Heller等，"Release of Norethindrone from Poly(Ortho Esters)" ， Polymer Engineering ScL， 21: 11， 727-31(1981); 和聚酐(Leong等，"Polyanhydrides for Controlled Release of Bioactive Agents"，Biomaterials7: 5， 364-71(1986)。
因此，可將如Epac、 PLCs或PLD抑制劑組合物摻入到生物相容性聚合 組合物中，形成需要的外部形狀。然后，通常通過切口將這種固體移植物插 入患者體內。或者，可將由這些聚合組合物組成的小離散顆粒注入體內，如 利用注射器。在示例性實施方式中，可將抑制劑組合物包埋在聚(D,L-乳酸) 聚合物微球內，該微球體用懸浮在水、甘露醇、羧甲基纖維素和聚山梨醇酯 80稀釋液中。聚乳酸聚合物通常逐步地代謝成二氧化^碳和水，讓抑制劑釋放 到系統內。
在另一實施方式中，儲庫型制劑可通過注射器以液態聚合組合物形式注 入。可用作生物降解控釋藥物傳遞體系的液態聚合組合物在如美國專利號 4,938,763、 5,702,716、 5,744,153、 5,990,194、和5,324,519中說明。在以液體 狀態，或作為溶液注射之后，該組合物凝結成固^f本。
適合用于本申請的一類聚合組合物包括溶解在體液分散劑中的惰性熱塑 性聚合物或共聚物。將該聚合物溶液放置于體內，在體內一旦溶劑分散或擴 散入周圍身體組織，聚合物就會凝結或沉淀和固化。參見如Dunn等，美國專 利號5,278,201、 5,278,202、和5,340，849(公開了 一種熱塑性藥物傳遞體系，其 中固態、線性鏈、生物降解性聚合物或共聚物溶解在溶劑中而形成液態溶液)。
還可將Epac、 PLCs或PLD抑制劑組合物吸附在可4皮移植的膜比如硅橡 膠膜上，如國際7>開號WO 91/04014中所述。
D.劑量
抑制劑的劑量要足以抑制耙標(即Epac、 PLCs或PLD),優選沒有顯著毒 性。在具體的體內實施方式中，抑制劑的量足以減輕患者疼痛。在此實施方 式的變形中，在這些變形中將止痛劑或其它制劑(如抗驚厥藥、抗抑郁藥和/
或鎮靜藥)與抑制劑 一起共給藥，該止痛劑或其它制劑的量足以在患者內產生 有益效果(即在止痛劑情況下是止痛效力)。為了在體內施用，抑制劑和任意其 它可選制劑的劑量由比如治療對象、給藥路徑和患者狀況決定。因此，需要 臨床醫生根據需要來測定劑量并改善給藥路徑以便獲得最佳的治療效力。通 常，臨床醫生是從低劑量開始，并增加劑量直到獲得所需的治療效力。可以 從體外數據來推斷給定抑制劑的起始劑量。
減輕疼痛試劑的篩選方法
Epac、PLCs和PLD在介導疼痛中的作用讓這些分子成為降低疼痛試劑的 有吸引力的耙標。因此，本發明就提供了目的在于鑒定這些試劑的預篩選和 篩選方法。例如，可以根據試劑與Epac、 PLCs和/或PLD或編碼這些多肽任 一的多核苷酸的結合，對待測試劑進行預篩選。本發明的篩選方法可以通過 下述步驟來進行將待測試劑與Epac、 PLCs和/或PLD接觸；確定待測試劑 是否分別抑制Epac、 PLCs和/或PLD; 4艮如是的話，就選擇該待測試劑作為 潛在止痛劑。例如，可以就待測試劑對Epac、 PLCs和/或PLD或編碼它們的 多核苷酸(如Epac、 PLCs和/或PLD mRNA)的水平的影響或對Epac、 PLCs和 /或PLD功能的影響進行篩選。
通常，雖然非必須，本發明的預篩it/篩選方法是在體外進行的。因此， 一般篩選實驗是例如利用細胞裂解物或其部分中經純化或部分純化的組分， 在培養細胞中，或在生物樣品如組織或其部分中進行的。
A.基于與Epac、 PLCe和/或PLD的結合的預篩選
本發明提供了基于分析待測試劑與Epac、 PLCs和/或PLD的特異性結合 的預篩選方法。特異性結合Epac、 PLCs和/或PLD的試劑具備調節功能從而
調節疼痛的潛力。
因此，在一實施方式中，本發明的預篩選方法包括將待測試劑與Epac、 PLCs和/或PLD接觸。然后，確定待測試劑與被接觸的多肽的特異性結合。 如果檢測到了特異性結合，則選定該試劑作為潛在止痛劑。
通常，這樣的預篩選方法是利用簡單的樣品體外結合實驗而最便利地實 現的。待測試劑與多肽的特異性結合的分析手段是本領域技術人員所熟知的。 在優選的結合實驗中，將多肽固定，并暴露于待測試劑(其可被標記)，或者， 將待測試劑固定并暴露于多肽(其可被標記)。然后，洗滌該固定物，除去所有 的未結合材料并檢測已結合的材料。為了對大量待測試劑進行預篩選，通常 優選高通量實驗。以下對各種實-瞼模式進行更加詳細的描述。
B.基于與編碼Epac、 PLCs和/或PLD的多核苷酸的結合的預篩選
本發明還提供了基于篩選待測試劑與編碼Epac、 PLCs和/或PLD多核苷 酸的特異性結合的預篩選方法。特異性結合這些多核苷酸的試劑具備調節被 編碼多肽的表達，從而調節疼痛的潛力。
因此，在一實施方式中，本發明的預篩選方法包括將待測試劑與編碼 Epac、 PLCs和/或PLD的多核普酸接觸。然后，確定待測試劑與多核苷酸的 結合。如果檢測到了特異性結合，則選定該試劑作為潛在止痛劑。
通常，所述預篩選是利用簡單的樣品體外結合實驗而最便利地實現的， 該實驗方法是本領域技術人員所熟知的。在優選的結合實驗中，將多核苷酸 固定并暴露于待測試劑(其可被標記)，或者，將待測試劑固定并暴露于多核苷 酸(其可被標記)。然后，洗滌該固定物，除去所有的未結合材料并檢測已結合 的材料。為了對大量待測試劑進行預篩選，通常優選高通量實驗。以下對各 種實驗模式進行更加詳細的描述。C.基于Epac、 PLCs和/或PLD水平或Epac、 PLCs和/或PLD多核苷 酸水平的篩選
還可對待測試劑，包括比如那些在本發明預篩選法中鑒別出的試劑，進 行篩選，從而確定待測試劑是否會影響Epac、 PLCs和/或PLD的水平或編碼 這些多肽任一的多核脊酸的水平(如Epac、 PLCs和/或PLD mRNA)。能夠使 這些水平降低的試劑能夠潛在地降低疼痛。
因此，本發明提供了篩選能降低疼痛的試劑的方法，其中將待測試劑與 細胞4妄觸，這些細胞在不存在待測試劑時表達Epac、 PLCs和/或PLD。優選， 采用體外實驗來進行該方法。在這些實驗中，可將待測試劑與培養基中的或 存在于組織中的細胞接觸。或者，可將待測試劑與細胞裂解物或其部分接觸。 在存在和缺失(或存在少量)待測試劑的條件下，確定Epac、 PLCs和/或PLD 多肽或多核普酸(如mRNA)的水平，從而鑒定出能改變該水平的任何待測試 劑。如果水平降低，則選定該待測試劑作為潛在止痛劑。
關的任意物種的細胞或組織。通常，雖然非必要，天然表達Epac、 PLCs和/ 或PLD的細胞可用于本篩選方法。實例包括但不限于，如實施例1所述的培 養的背根神經中樞細胞。可用于對通過Epac來起作用的試劑進行篩選的細胞 實例包括小膠質細胞、胰腺(3-細胞、視網膜神經元、干細胞和白細胞。對通 過PLCs來起作用的試劑的篩選可以在例如N1E115成神經細胞瘤細胞、 HEK293細胞和角膜上皮細胞中進行。可用于對通過PLD來起作用的試劑進 行篩選的細胞實例包括PC12細胞、神經干細胞、肌細胞、C6神經膠質瘤細 胞、Ewing肉瘤細胞、腎上皮細胞和小腦粒細胞。或者，本方法中可以使用已 被設計來表達Epac、 PLCs和/或PLD的細胞。1. 樣本
如上所述， 一般，篩選實驗是在體外進行的，如在培養細胞中，在生物 樣A如腦)或其部分中進行。為了簡化描述，細胞培養物、生物樣本和部分在 下文中稱為"樣本"。 一般，樣本衍生自動物(如任意的前述研究動物)，優選衍 生自哺乳動物，更優選衍生自人。
如果需要，可以根據需要通過在合適的緩沖液中稀釋或濃縮來對樣本進
行預處理。可以使用任意的生理pH的標準含水緩沖液，這些緩沖液使用一種 或多種緩沖物質如磷酸鹽、Tris等。
2. 基于多肽的實驗
可采用本領域技術人員熟知的若干方法中的任意一種來對Epac、 PLCs 和/或PLD進行檢測和量化。適合檢測這些多肽的分析性生物化學法的實例包 括電泳、毛細管電泳、高效液相色譜(HPLC)、薄層層析(TLC)、超擴散 (hyperdiffusion)層析等，或各種免疫學方法如液態或凝膠沉淀反應、免疫擴散 (單向或多向)、免疫組織化學、親和層析、免疫電泳、放射免疫測定(RIA)、 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)、螢光免疫分析、Western印跡等。
在一實施方式中，采用結合實-驗來對Epac、 PLCs和/或PLD進行檢測/ 量化。簡要地說，將來自表達感興趣多肽的組織的樣本與合適的結合伴侶(例 如抗體)在— 一定條件下一 同放置，該條件經設計能在放置期間提供飽和濃度的 結合伴侶。在用結合伴侶處理后，對該樣本的結合進行分析。任何能結合感 興趣多肽的結合伴侶都可以在本實驗中使用，雖然如果該多肽是大量異構體 中的 一種，那么能特異性結合正在分析的特定異構體的結合伴侶是優選的。 除抗體之外，可對任何能直接結合Epac、 PLCs和/或PLD的Epac、 PLCs和/
或PLD抑制劑進行例如標記，并在該實驗中使用。Epac和PLD的示例性結 合伴侶在實施例1中進行了描述，即來自Santa Cruz Biotechnology的多克隆 兔抗-Epacl血清和PLD抑制劑l-丁醇。
在另一實施方式中，在電泳多肽分離(如1或2維電泳)中對Epac、 PLCs 和/或PLD進行檢測/量化。利用電泳技術來檢測多肽的方法是本領域技術人 員所熟知的(通常參見R. Scopes(1982)Polypeptide Purification, Springer-Verlag， N. Y.; Deutscher， (1990)Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Polypeptide Purification, Academic Press， Inc., N. Y.)。
該實施方式的一種變形^使用Western印跡(免疫印跡)分析來檢測和量化 Epac、 PLCs和/或PLD在樣本中的存在。 一般地，此技術包括通過凝膠電泳 基于分子量分離樣本多肽，將分離的多肽轉移到合適的固體支持物(如硝化纖 維素濾紙、尼龍濾紙或衍生化尼龍濾紙)上，將該支持物與特異性結合靶多肽 的抗體一起放置。可將特異性結合耙多肽的抗體直接標記，或者可以隨后用 特異性結合一抗結構域的標記抗體(如標記的羊抗鼠抗體)來進行檢測。
在優選的實施方式中，利用任何熟知的免疫測定法在生物樣本中對Epac、 PLCs和/或PLD進行檢測和/或量化(參見如美國專利4,366,241、 4,376,110、 4,517,288、和4,837,168)。免疫分析法的綜述還可參見Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Asai編，Academic Press, Inc. New York(1993); Basic和Clinical Immunology,第7版，Stites & Terr編(1991)。
常規的免疫測定法經常會利用"捕獲劑"來特異性地結合和固定待分析物 (此時是Epac、 PLCs或PLD)。在優選的具體實施方式
中，該捕獲劑是抗體。
典型地，免疫測定法還使用標記試劑來特異性地結合和標記由捕獲劑和 靶多肽形成的結合復合物。該標記試劑本身就可以是構成抗體/靶多肽復合物 的一部分。因此，標記試劑可以是特異性地識別已結合^i的多肽的經標記的
多肽或經標記的抗體。或者，標記試劑可以是第三部分，如特異性結合捕獲 劑/靶多肽復合物的另 一種抗體。能特異性結合免疫球蛋白恒定區的其它多肽，
如多肽A或多肽G也可以用作標記試劑。這些多肽是鏈球菌細胞壁的常規組 分。它們具有來自不同物種的免疫球蛋白恒定區表現出很強的非免疫原反應 性(一般參見Kronval等(1973)J. Immunol., 111:1401-1406，和Akerstrom(1985)J. Immunol, 135: 2589-2542)。
用于檢測靶多肽的優選免疫分析是竟爭性的或非竟爭性的免疫分析。非 竟爭性的免疫分析是直接對捕獲的耙多肽量進行測量的分析。在竟爭性分析 中，樣品中的把多肽將外加(外源)多肽從捕獲劑上置換(竟爭)下來，通過測定 這些外加多肽的量間接地測定樣品中耙多肽的量。在一種竟爭性分柝中，將 已知量的，此時是標記的Epac、 PLCs或PLD添加到樣本中，然后讓該樣本 與捕獲劑接觸。與抗體結合的標記Epac、 PLCs或PLD的量與存在于樣本中 的多肽濃度成反比。
適合用于本發明的可測標記包括采用分光鏡、光化學、生物化學、免疫 化學、電學、光學或化學方法可測的任何部分或組合物。實例包括用于用標 記的鏈霉素共輒體染色的生物素、磁新如Dynabeads )、熒光染料(如熒光素、 德州紅(texasred)、羅丹明、香豆素、噁喚、綠色熒光蛋白等，參見如Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)，放射性標記物(如3H、 125I、 35S、 14C、或32P)、 酶(如l束根過氧化物酶、堿性磷酸酶和其它ELISA的常用酶)和比色標記比如 膠體金(如直徑大小范圍40-80nm,高效散射綠光的金粒子)或有色玻璃或塑料 (如聚苯乙烯，聚丙烯，乳膠等)珠子。指導使用這些標記物的專利包括美國專 利號3,817,837、 3,850,752、 3,939,350、 3,996,345、 4,277,437、 4,275,149、和 4,366,241。
本發明的實驗根據本領域技術人員所熟知的常規方法來進行記分(以靶多
肽陽性或陰性或數量)。具體的記分方法由實驗形式和標記物的選擇來決定。
例如，可通過肉眼觀察由酶標記物產生的有色產物對Western印跡分析進行記 分。將在正確分子量處的清晰可見的著色條帶或斑點記分為陽性，而缺乏清 晰可見斑點或條帶則記分為陰性。條帶或斑點強度可以提供對靶多肽濃度的 定量測量。
在具體實施方式
中，采用微電機系統(MEMS)進行本發明的免疫測定法。 MEMS是整合到硅上的精^f鼓結構，其將機械、光學和流控元件與電學組合起 來，從而可以方便地檢測到感興趣的待分析物。適用于本發明的示例性MEMS 設備是Protiveris，多懸臂陣列。該陣列以特別設計的硅微懸臂化學-機械驅動和 隨后的徵懸臂偏轉的光學檢測為基礎。當一邊用蛋白、抗體、抗原、或DNA 片段包被時，在暴露于含互補分子的溶液中時，微懸臂就會彎曲。這種彎曲 是由于發生結合而使表面能變化所致。彎曲(偏轉)程度的光學檢測可以對結合 到微懸臂的互補分子的量進行測量。
可用于這些免疫測定法的抗體包括多克隆和單克隆抗體。
3.基于多核苷酸的分析
Epac、 PLCs和/或PLD表達水平的變化可以通過測量mRNA和/或書f生自 該mRNA的多核苷酸(如反轉錄cDNA等)的水平的變化來進行檢測。
多核苷酸可以按照本領域技術人員所熟知的任何方法從樣本制得。分離 和純化多核普酸的常規方法在Tijssen編輯，(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation的第三章，Elsevier, N. Y.和Tijssen 編輯中有詳細說明。
i. 基于擴增的實驗
在一實施方式中，可用基于擴增的實驗來檢測和任選地量化編碼Epac、 PLCs和/或PLD的多核苷酸。在示例性的基于擴增的實驗中，樣本中的Epac、 PLCs和/或PLD mRNA作為擴增反應的模板，該擴增反應用含有可檢測標記 物或標記系統成分的核酸引物進行。適合的擴增方法包括，但不限于，聚合 酶鏈反應(PCR)、反轉錄PCR(RT-PCR)、連接酶鏈反應(LCR)(參見Wu和 Wallace(1989)Genomics 4: 560， Landegren等(1988)Science 241: 1077，和 Barringer等(1990)Gene 89: 117)、轉錄擴增(Kwoh等(1989)Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 1173)，自主序列復制(Guatelli等(1990)Proc. Nat Acad. Sci. USA 87: 1874)、定點PCR、和連接接頭PCR等。
為了確定Epac、 PLCs和/或PLD mRNA的水平，可以使用本領域所熟知 的任何"定量，，擴增法。通常，定量PCR包括利用相同的引物對已知量的對照 序列同時進行共擴增。其可以作為內標，用于校準PCR反應。在PCR Protocols ， A Guide to Methods and Applications ， Innis等，Academic Press ， Inc. N. Y. ， (1990) 中提供了定量PCR的詳細規程。
ii. 基于雜交的實驗
核酸雜交只包括將核酸探針與樣本多核苷酸在一定條件下接觸，在該條 件下，探針能與其互補靶核苷酸序列通過互補堿基配對形成穩定雜交雙鏈。 然后，洗去那些不能形成雜交雙鏈的核酸，留下待檢測的雜交核酸， 一般通 過檢測結合的可測標記物或標記系統組分對雜交核酸進行檢測。利用核酸雜 交技術來檢測和/或定量多核普酸的方法是本領域技術人員所熟知的(參見 Sambrook等，見上)。雜交技術通常描述于Hames和Higgins(1985)Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press; Gall禾口 Pardue(1969)Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 63: 378-383;和John等(1969)Nature 223: 582-587中。優化 雜交條件的方法描述在如Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Elsevier ， N. Y.中。
本文用于檢測Epac、 PLCs和/或PLD mRNA的核酸探針可以是全長或小 于全長的這些多核苷酸。通常，根據經驗用短探針檢測特異性。優選核酸探 針是至少約15個堿基，更優選約20個堿基或更長長度(關于對用于核酸雜交 的核酸探針序列的選擇方法參見Sambrook等)。雜交探針的可視化可以定量 測定Epac、 PLCs和/或PLD mRNA的存在或缺失，可用標準方法(比如當對核 酸探針進行了放射性標記時，使用密度測定法)來量化Epac、 PLCs和/或PLD mRNA的水平。
許多其它的核酸雜交形式都是本領域技術人員所熟知的。標準形式包括 三明治實驗和竟爭或置換實驗。三明治實驗是商業上可用的檢測或分離多核 芬酸的雜交實驗。這些實驗使用一種共價固定到固體支持物上的"捕獲"核酸， 和一種溶液中的標記"信號"核酸。樣本提供把多核芬酸。捕獲的核酸和信號核 酸分別與靶多核苷酸雜交從而形成"三明治，，雜交復合體。
在一具體實施方式
中，本發明的方法可在基于陣列的雜交形式中使用。 在陣列形式下，大量的不同雜交反應可以基本"平行地"運行。這就在單個實驗 中對大量雜交進行了快速、基本同時的評價。在陣列形式下進行雜交反應的 方法是本領域技術人員所熟知的(參見如Pastinen(1997)Genome Res. 7 : 606-614; Jackson(1996)Nature Biotechnology 14:1685;Chee(1995)Science 21 A: 610; WO 96/17958， Pinkel等(1998)Nature Genetics 20: 207-211)。
列。例如，在一個簡單的具體實施方式
中，通過在固4本支持物(如3皮璃表面，
膜等)的不同位點上點樣(使用移液管手動地)不同核酸就能簡便地制備"低密 度"陣列。這種簡單的點樣方法已被自動化而制備出高密度點樣微陣列。例如，
美國專利號5,807,522描述了自動化系統的應用，其在表面上輕敲微毛細管讓 小體積的生物樣本沉積。重復該步驟獲得高密度陣列。還可以利用寡核苷酸 合成技術來制備陣列。因此，例如，美國專利號5,143,854和PCT專利公開號 WO 90/15070和92/10092教導了高密度寡核苷酸微陣列的光引導組合合成的 應用。在美國專利5,744,305、 5，800,992、和5,445,934中也描述了高密度陣列 的合成。
在優選的實施方式中，本發明使用的陣列包括"探針"核酸。然后，這些探 針分別與來自生物樣本的多核普酸中存在的它們的"耙，，核普酸序列雜交。或 者，可將該形式顛倒，由此將來自不同樣本的多核普酸形成陣列，然后用可 被差別性標記的 一種或多種探針對其進行探測。
用于在不同固體表面上固定核酸的許多方法都是本領域所已知的。各種 有機或無機聚合物，以及其它材料，天然的或合成的，都可以用做固4本表面 材料。說明性的固體表面包括，如硝酸纖維素、尼龍、玻璃、石英、重氮膜(紙 或尼龍)、硅氧烷、聚甲醛、纖維素和醋酸纖維素。此外，可以^t用塑料如聚 乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等。可用的其它材包括紙、陶瓷、金屬、非金屬、 半導體材料等。此外，可以使用形成凝膠的物質。這類材料包括，如蛋白質(如 明膠)、脂多糖、硅酸鹽、瓊脂糖和聚丙烯酰胺。當固體表面多孔時，根據系 統的性質，可使用不同的孔徑大小。
在制備表面時，可以使用大量的不同的材料，尤其是作為層制品的材料， 從而獲得各種性質。例如，可以使用蛋白(例如牛血清白蛋白)或大分子混合物 (如Denhardt，s溶液)，從而避免非特異性結合，筒化共價偶聯，和/或增強信號 檢測。如果需要化合物和表面之間形成共價鍵，那么表面一般就是多官能團
的或能被多官能化的。存在于表面上且可用于連接的官能團可以包括羧酸、 醛、氨基、氰基、烯基、羥基、巰基等。各種化合物與各種表面的連接方式 是眾所周知的，且在文獻中充分闡釋。
陣列可以由范圍在從約直徑1 mm到小至約1 nm的各種尺寸的靶元件組 成。已經描述了能夠對1 cm2區域定量熒光成像的相對簡單的方法，這些方法 實現了從單幅圖象中對大量靶元件中的數據的采集(參見如 Wittrup(1994)Cytometry 16: 206-213， Pinkel等(1998)Nature Genetics 20: 207-211)。
還可以采用微電機系統(MEMS)，如Protiveris，多懸臂陣列進行本發明的 雜交實驗。
多核苷酸檢測
通過可檢測標記物，可在上述的基于多核普酸的實驗中對Epac、 PLCs 和/或PLD多核芬酸進行檢測。本發明的以多核苷酸為基礎的實驗可以使用 上述討論的任何標記物。在進行雜交或擴增之前或之后，可將這些標記添加 到探針或引物或樣本多核苷酸上。所謂的"直接標記物"是在進行實驗前，直接 結合或引入至標記的多核普酸的可檢測標記物。相反，所謂的"間接標記物" 是在雜交后，與雜交雙鏈結合。在間接標記中，雜交雙鏈中的一個多核苷酸 會攜帶能與可檢測標記結合的組分。這樣，例如，可以在雜交之前將探針或 引物生物素化。在雜交之后，可以讓抗生物素蛋白-共輒熒光團與含生物素的 雜交雙鏈結合，提供了易于檢測的標記物。關于標記和檢測多核苷酸的具體 綜述，參見Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology ， Vol. 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes, P. Tijssen編，Elsevier, N. Y.， (1993》。
可以通過利用多核香酸擴增系統來提高雜交實驗的靈敏度，該系統成倍
增加被檢測的靶核普酸。這類系統的實例包括聚合酶鏈反應(PCR)系統和連接 酶鏈反應(LCR)系統。本領域描述的其它方法是以核酸序列為基礎的擴增 (NASBAO, Cangene， Mississauga, Ontario)和Q|3復制酶系統。
在優選的實施方式中，適用于本發明的基于擴增的實驗的引物包含兩種 熒光染料， 一個"報告因子染料，，和一個"淬火染料"。當完整時，由于淬火染料 的作用，引物會產生非常低水平的焚光。當引物切開或降解(如通過聚合酶的 核酸外切酶活性，見下文)后，報告因子染料就會發出熒光，并被合適的熒光 檢測系統檢測到。利用同時具備聚合酶和核酸外切酶活性的合適的DNA聚合 酶(如Taq DNA聚合酶)，采用一些技術(PCR、 RT-PCR、 RCA或其它擴增方 法)來進行擴增。該聚合酶合成新的DNA鏈，并在過程中，降解標記的引物， 造成熒光的增強。商業上可獲得的這種類型的熒光檢測系統包括Applied Biosystems的ABI Prism 系統7000 、7700或7900(TaqMan⑧)或Roche的Light Cycler 系統。
D.基于Epac、 PLCs、或PLD的作用的篩選
本發明還提供了基于確定待測試劑對Epac、 PLCs和/或PLD作用的影響 (如果存在的話)的篩選方法。Epac、PLCs和/或PLD的作用可以通過測定Epac、 PLCs和/或PLD的任一活性，或由Epac、 PLCs和/或PLD介導的應答來進行 測定。降低Epac、 PLCs和/或PLD作用的試劑能夠潛在地減輕疼痛。
因此，本發明提供了篩選減輕疼痛的試劑的方法，該方法將待測試劑與 細胞接觸，這些細胞在不存在待測試劑的條件下能表達Epac、PLCs和/或PLD ， 或其片段。優選地，采用體外實驗進行該方法。當待測試劑可與細胞接觸時， 細胞可以在培養基中或存在于組織中。在存在和不存在(或存在少量)待測試劑
的條件下確定Epac、 PLCe和/或PLD的作用水平，從而鑒定出任何能改變該 水平的待測試劑。如果Epac、 PLCs和/或PLD作用被削弱，選定該待測試劑 作潛在止痛劑。
可用于基于Epac、 PLCs和/或PLD作用的篩選的細胞或組織包括那些上 述與基于Epac、 PLCs和/或PLD水平或編碼這些多肽任一的多核苷酸水平的 篩選有關的任何細胞或組織。
Epac的作用可以采用任何用于分析Epac活性或Epac-介導應答的實驗來 進行測定。適合的實驗實例包括測定Epac-cAMP結合、Epac-介導的GTP 酶Rapl的活化、Epac-介導的MAP激酶的活化。
PLCs的作用可以采用任何用于分析PLCs活性或PLCs-介導應答的實驗 來進行測定。例如，該篩選方法可以分析待測試劑對PLCs-介導的磷脂酰肌醇 水解成三磷酸肌醇和甘油二酯(D A G)的影響。
PLD的作用可以采用任何用于分析PLD活性或PLD-介導應答的實驗來 進行測定。例如，該篩選方法可以分析待測試劑對PLD-介導的磷脂底物(如磷 脂酰膽^s威、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、溶血磷脂酰膽堿、 神經鞘磷脂、磷脂酰甘油、或N-酰基磷脂酰乙醇胺)水解成磷脂酸的影響。參 見如，Petersen, G.等(2000)J Lipid Res. 41: 1532。
E.待測試劑數據庫
在優選的實施方式中，通常涉及篩選大量待測試劑的篩選方法包括將在 任何上述預篩選或篩選方法中選出的任何待測試劑記錄在候選止痛劑數據庫 中。
術語"數據庫，，是指用于記錄和提取信息的工具。在優選的實施方式中，數 據庫還提供了對存儲信息進行分類和/或搜索的工具。數據庫可以利用任何便
利介質，包括但不限于紙質系統、卡片系統、機械系統、電子系統、光學系 統、磁系統或其組合。優選的數據庫包括電子(如基于計算機的)數據庫。用于 儲存和操作數據庫的計算機系統是本領域技術人員所熟知的，包括但不限于 "個人電腦系統"，大型機系統，在互聯網或局域網的分布節點，存儲在專門硬 件(如微型芯片)中的數據或數據庫等。
F.通過篩選鑒定出的待測試劑
當發現待測試劑能夠改變Epac、PLCs和/或PLD的水平；編碼Epac、PLCs 和/或PLD的多核普酸的水平；或Epac、 PLCs和/或PLD的作用水平時，本 發明的優選篩選方法進一步包括將待測試劑與載體組合，優選藥學上可接受 的載體，如上文所述。通常，當將組合物與細胞接觸時，待測試劑的濃度足 以改變Epac、 PLCs和/或PLD或其相應多核苷酸或其作用的水平。該濃度的 變化將根據具體的待測試劑和組合物所要進行的具體應用有所變化。本領域 的技術人員應可以理解，影響待測試劑與載體配制的具4本因素通常與上述的 減輕疼痛的方法中的因素相 一致。
在優選的具體實施方式
中，將待測試劑對動物給藥，以便測量所選待測 試劑降低患者疼痛的能力，如下所詳述。
G以減輕體內疼痛為基礎的篩選
本發明還提供了在體內篩選能減輕患者疼痛的試劑的方法。該方法包括 選擇Epac抑制劑、PLCs抑制劑或PLD抑制劑作為待測試劑，測量選定的待 測試劑減輕患者疼痛的能力。本方法可施用任何能抑制Epac、 PLCs和/或PLD 且能對患者給藥的試劑。因此，通過本發明的任何預篩選或篩選方法選定的 待測試劑都可以在體內進行檢測。或者，可以使用已知的Epac、 PLCs和/或PLD抑制劑。
如上述Epac、 PLCs和/或PLD抑制劑 一樣，可以將待測試劑進行配制來
給患者給藥。
本方法的對象可以是含有Epac、 PLCe和/或PLD且其疼痛癥狀可#1測量 的任何個體。合適的對象實例包括研究動物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、貓、 狗、以及猴子和其它靈長類動物和人。在優選的具體實施方式
中，使用為研 究疼痛應答建立的動物模型。例如，動物模型可以是如實施例1所述的測試 傷害感受彎曲反射的動物模型。
通常，在施加疼痛性刺激之前，將待測試劑對患者給藥，并檢測或觀察 該患者，確定該待測試劑是否能降低對刺激的具體應答。即測量應答，并與 在不存在待測試劑和/或存在少量待測試劑的情況下，所觀察的結果相比較。 如上所述Epac、 PLCs和/或PLD抑制劑一樣，可以采用任何合適的路徑來施 用待測試劑。通常，待測試劑的濃度能足以改變體內的Epac、 PLCs和/或PLD 多肽、多核苷酸或作用的水平。
試劑盒
本發明還提供了可用于實施本發明方法的試劑盒。在一實施方式中，本 發明的試劑盒包括在合適容器內的Epac、 PLCs和/或PLD抑制劑。在該實施 方式的變形中，將抑制劑配制在藥學上可接受的載體中。優選的試劑盒包括 給患者施用抑制劑以便減輕疼痛的說明。
可將包括在本發明試劑盒中的說明貼在包裝材料上，或插入包裝中。雖 然-說明書一般是書面或印刷材料，但并不限于此。任何能儲存這些說明并能 將其傳達給終端用戶的介質都在本發明的范圍內。所述介質包括但不限于， 電子儲存介質(如磁盤、錄像帶、磁帶、芯片)、光學介質(如CDROM)等。在此所用術語"說明，，可以包括提供該說明的互聯網網址。 實施例
下述實施例是用于說明，而并非限制所要求保護的發明。 實施例1
Epac介導炎性痛中從cAMP至PKC的信號傳遞IB4(+)-神經元特異性
機制
摘要
PKC的s異構體(PKCs)在神經性(糖尿病、酒精中毒、癌癥治療)以及急性 和慢性炎性痛模型中已經成為對機械性刺激致敏化的關鍵的第二信使。導致 PKCs激活的信號傳導通道還未知。最近的研究結果表明了從cAMP至PKC 的信號傳遞。連接兩個普遍存在的，通常被認為是獨立通路的cAMP和PKC 的機制仍然令人困惑。目前的工作表明，在培養的背根神經節(DRG)神經元中， 從cAMP至PKCs的信號傳導并不是通過蛋白激酶A(PKA)介導，而是通過最 近鑒定的cAMP-激活的烏嘌呤交換因子Epac介導。Epac在磷脂酶C(PLC)和 磷脂酶D(PLD)上游，它們兩個都是PKCs移位和激活所必需的。該信號通路 對同工凝集素B4-陽性(IB4(+))疼痛感受體具有特異性。另外，在行為模型中， cAMP通過Epac、 PLC/PLD和PKCs產生機械性痛覺過每史(觸痛)。通過描繪 該信號通路，這項工作提供了 cAMP至PKC信號傳導機制，為促分裂原活化 蛋白激酶(MAPK)通路激活蛋白Epac也刺激PKC的原理提供了證據，描述了 IB4(+)感覺神經元亞群特有的第一生理機能，并且發現了 G-蛋白耦合受體不 僅通過g-蛋白oiq和(3y而且通過Os激活pkc的機理的證據。
方法抗體
用于本研究的抗體和外源凝集素是來自BD Transduction Laboratories的 PKCs-特異性單克隆小鼠抗體；來自Santa Cruz Biotechnology的卩2-腎上腺素 受體(P2-AR)-特異性多克隆兔抗血清，多克隆兔抗-Epacl血清；來自Chemicon 的單克隆小鼠NeuN-特異性抗體；來自Molecular Probes的IB4-Alexa Fluor-568;來自Jackson Immunoresearch的驢兔特異性FITC偶聯，驢鼠特異 性羅丹明偶聯的二抗；和UCSF的Robert Messing博士提供的PKCs-特異性兔 血清(SN134)。
藥物
l-丁醇、烯丙洛爾、D-609、腎上腺素、佛司可林(forskolin)、(-)-異丙腎 上腺素和U-73343購自Sigma;獲自Fluka的2-丁醇；來自Calbiochem的雙 吲哚馬來酰亞胺(bisindolylmaleimide)I、霍亂毒素、sVl-2、 U-73122、 4-氰基-3-甲基異喹林、8-CPT-2'-0-Me-cAMP、 8-CPT;來自Abbott Laboratories的戊巴 比妥；來自Tocris Cookson的ICI 118,551和來自New England BioLabs的PKA 催化亞基。
化合物
用于本研究的化合物是來自Worthington Biochemical公司的胰蛋白酶； 來自Boehringer Mannheim的膠原酶；來自Invitrogen的Neurobasal A(w/o酚 紅)、B27;來自UCSF Cell Culture Facility的谷氨酰胺、MEM-培養基、Hanks-培養基、青霉素/抗生物素蛋白鏈菌素溶液；來自Sigma的BSA、 DMSO、谷 氨酸、多聚甲醛、TritonX-100;和來自Vector Laboratories的正常山羊血清、 Vectashield。動物
在雄性Sprague-Dawley大鼠(200-300 g， Charles River, Hollister, CA, USA)上進行行為實驗。在12小時光照/黑暗循環下，在San Francisco的
水可隨意得到。遵照NIH指導照料和使用動物。UCSF動物研究委員會批準 了實驗方案。盡最大努力將所用的動物數量最小化。
DRG-培絲
按照此前描述的方法(Khasar等，1999b)從雄性Sprague-Dawley大鼠 (200-300 g， Charles River, Hollister， CA， USA)獲得解離的背根神經節培養 物。用過量的Nembutal(每只動物50mg， s.c)麻醉大鼠。將L1-L6DRG移除， 去鞘(desheathed)，匯集，并與膠原酶(終濃度(f.c.)0.1250/。， 1 h， 37。C)共同放 置，然后用胰蛋白酶消化(f.c. 0.25%， 7 min， 37°C)。用火處理過的巴氏移液 管通過研磨將細胞分開。通過過濾(40jum網)將軸突殘端和死細胞除去，然后 離心(3min， 500 g)。細胞用12 ml Neurobasal A/B27—培養基重懸浮，并將每 個培育物0.5 ml(=0.5 DRG等同物)分盤至聚鳥氨酸/層粘蛋白預包被的玻璃蓋 片(12 mm直徑)上，于37°C ， 5% (302在24孔板上培養過夜。通過添加多達1 HM的乙醇(按照Invitrogen的技術支持，培育基中的乙醇濃度少于2.5%)來抵 消由于Neurobasal A培養基和其B27添加物在不同批次間的差異造成的在刺 激后不同的PKCs移位。
刺激
在培養15-20小時后，細胞就與蓋片附著，對細胞進行刺激。為了確保刺激能均一擴散，將500 nl培養基中的250 pl移出來，充分與各自的活化劑/抑 制劑混合，并加回到原來的培育基中。在刺激進行了 15分鐘之后，加入濃度 為10倍ICs()-值的抑制劑。根據文獻報道，在確定時間以 一 定濃度添加活化劑。 為所有的止痛劑都建立了時程(有些數據未顯示)。以同樣的方式處理陰性對照 (未剌激細胞)，除了不添加任何藥物制劑。雖然在體內實驗中使用了生理學刺 激物腎上腺素，但在體外使用(3-AR止痛劑異丙基腎上腺素對(3-AR亞型進行 鑒定。在處理之后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)將細胞洗滌一次，并用多聚甲醛(PFA) 將細胞固定(4%， 10min，室溫(RT))。
免疫細胞化學
用0.1% Triton X-100(10min，RT)將PFA-固定的細胞透性化，然后用0.1% 牛血清白蛋白(BSA)/PBS(5 min, RT)洗滌三次。在對非特異性結合位點進行封 閉(5。/oBSA/10o/o正常山羊血清/PBS, lh, RT)后，在1%BSA/PBS(過夜，4°C) 中用各自的一抗對培養物進行探測，洗滌三次(l。/oBSA/PBS， 5min, RT)，并 與二抗熒光團-偶聯抗血清(終濃度(f.c.)l: 200, lh， RT)共同放置。在最后三 次洗滌(PBS， 5 min， RT)之后，將培養物用Vectashield封在顯微鏡玻片上， 并用指甲油(nail polish)密封。
評價PKCs移位
細胞用Nikon Microphot FXA顯微鏡，50X油鏡進行評價。對每種培養物 的50個隨機挑選細胞進行評價。基于所評價的培養物數量，以每種評價培養 物的移位細胞平均百分lt/士標準平均誤差(SEM)對數據進行繪圖。全部計數通 過同一觀測者以盲法方式(blind fashion)完成。所有處理都在至少2個不同的 日子里，用不同大鼠的DRG-神經元重復進行。采用連到MRC 1000共聚焦顯
微鏡(Bio-Rad)的Zeiss Axiovert 100顯微鏡(CarlZeiss Inc。 )， 100X油浸物鏡獲 取共聚焦圖象。用Zeiss Axiovert 100顯微鏡，63x油浸物鏡獲取表面熒光圖象。
對機械傷害感受閾值的檢測
利用Randall-Selitto爪壓設備(Analgesymeter⑧，Stoetling)對傷害感受彎曲
反射進行量化，該設備給大鼠后爪背部施加線性增加的機械力。傷害感受性 機械閾值定義為讓大鼠縮爪的以克為單位的力。以前已經描述了該方法規程 (Taiwo和Levine， 1989; Dina等，2003)。基線縮爪閾值定義為注射待測試劑 之前的六個讀數的平均值。每只爪都獨立測量，并對各組大鼠各自進行實驗。 僅用一種止痛劑和/或拮抗劑對各組大鼠進行處理，通過皮內途徑進行外周注 射。在施用痛覺過敏介質30分鐘后，進行傷害感受閾值的測量。全部行為實 驗都在10.00和16.00小時間完成。如先前所述注射阻斷劑(Khasar等，1995; Khasar等，1999a)。因為膜透性較低，注射PKCs抑制劑(sVI-2)(Johnson等， 1996)和PKA催化亞基(Slice和Taylor， 1989)之前通常先用相同注射器施用2.5 pL蒸餾水，水被小氣泡隔開，產生低滲休克，從而提高細胞膜對藥物的透性 (Khasar等，1995; Khasar等，1999a)。在反映細胞結果后2分鐘后發生統計 學上顯著地機械痛覺過敏(Khasar等，1999a),在注射各刺激物之后30分鐘檢 測機械性閾值，該時間點是平臺期最大反應的時間點。
統計學分析
所有的統計比較都是按照單向ANOVA進行，隨后進行Dunnet，s多重比 較結果實驗，其p值已經確定。
結果
B,-腎上腺素受體的活化使得PKCs在DRG神經元中移位
為了研究PKCe第二信使信號通路上游，在解離的背根神經節神經元中對 PKCs移位進行了評價，這是激活PKCs的重要步驟(Dorn和Mochly-Rosen, 2002)和已確定的PKC活化替代測量(Cesare等，1999)。如通過用舒緩激肽和 佛波醇酯(Cesare等，1999)進行刺激而觀測到的，(3-腎上腺素受^p-AR)激動 劑異丙基腎上腺素也會誘導PKCs移位至DRG神經元細胞膜(圖1A)。由于強 烈的胞質PKCs信號，未對向其它胞內耙標的潛在移位進行評價。
劑量應答曲線證實1jxM異丙基腎上腺素會使最大量細胞產生移位(評價 的培養物11=8, 21.3。/()士2.8。/()PKCs移位細胞，圖1B)。 PKCs的移位是暫時的， 在大約30秒峰化，衰退90秒，5分鐘后返回至基線(圖1C)。由異丙基腎上腺 素誘導的移位是由p2-AR介導的，因其會被|32-AR特異性拮抗劑ICI 118,551(n=8， 3.00/o土l.lo/oPKCs移位細胞，圖1C)抑制。將ICI 118,551描述為 一種反向激動劑，不僅能阻斷受體活化而且能降低其基線活性(Bond等， 1995),表現為PKCs移位基線的下降。
PKCs移位由p^和AC而非PKA介導
為了確定p2-AR是通過cAMP將信號傳導至PKC，將描述充分的Os激活 劑霍亂毒素施用給細胞培養物， 一般會導致胞內cAMP升高。在處理30秒后， 觀察到PKCs向細胞膜的移位，90秒峰化(n-6，分別有15.2±3.0%和24.0±1.9% 的神經元顯示出PKCs移位(圖2B))。
由于as激活AC(Neves等，2002),用已知的AC激活劑佛司可林(forskolin) 來檢測AC在導致PKCs移位的信號級聯反應中的參與。最大應答時間為30 秒，佛司可林(forskolin)也會誘導PKCe向細胞膜的移位(『6， 22.3±4.2% PKCs
移位細胞(圖2B))。
由于cAMP激活PKA，對PKA在異丙基腎上腺素誘導的PKCs活化中的 參與度進行檢查。由于常用的PKA抑制劑H89也會抑制與p2-AR的配體結合 (Penn等，1999),而且無活性的cAMP類似物比如Rp-cAMP也有抑制其它 cAMP效應因子的風險，所以使用PKA特異性膜可透性抑制劑4-氰基-3-甲基 異喹啉(CMIQ)。該抑制劑封閉PKA的ATP結合位點(Lu等，1996)。用CMIQ 預培養15分鐘，完全消除了由于注射PKA催化亞基導致的體內的痛覺過敏 (Slice和Taylor， 1989)(圖2B)。因此，在用異丙基腎上腺素刺激之前，用濃度 高至其ICso值1000-倍的CMIQ預培養DRG培養物15分鐘。有趣的是，在存 在CMIQ時，PKCs像對照條件一樣仍會移位至細胞膜(1^6，圖2A)。因此， 盡管cts和AC參與信號從p2-AR至PKCs的信號傳導，而PKA并不參與。
Epac介導PKCs移位
由于cAMP不是通過PKA發出信號來誘導PKCs活性的，對cAMP激活 Epac而導致在解離的DRG神經元中PKCs移位的可能性進行了檢查。已經 開發了 一種 Epac 特異性活化劑，即 cAMP 類似物 8-CPT-2'-0-Me-cAMP(CPTOMe),用于區分PKA和Epac的介導效應(Enserink 等，2002; Rehmann等，2003)。用該化合物刺激神經元會導致PKCs強烈移 位至細胞膜，如用p2-AR、 (Xs和AC活化劑所觀察到的一樣，確證了之前的觀 察，即抑制PKA并不會改變PKCs移位程度(圖2B)，而且第一次將Epac置 于PKC的上游。
由于在90秒時CPTOMe導致最大量的細胞含有移位PKCs(n=6，用 CPTOMe-刺激30秒和90秒后，分別有20.3±2.6%和23.5±3.7%移位神經元)， 在后續對Epac的CPTOMe刺激的下游事件的研究中將使用該時間點。
PKCs移位是PLC和PLD依賴性的
DAG， PLC-家族成員產物，可以激活新型PKCs,比如PKCs。因此，對 磷脂酰膽酯(PC)和磷脂酰肌醇(PI)水解PLCs以及磷脂酶D在Epac-誘導的 PKCs移位中的參與進行檢測。
為了檢查PI-PLC的參與性，其中PLCs是一員(Schmidt等，2001)，在用 異丙基腎上腺素刺激30秒之前，將培養物用PI-PLC抑制劑U73122預培養 15分鐘。PKCs的移位完全被該抑制劑封閉。相反，U73122的無活性類似物， U73343，僅能稍微降低移位(>1=8，在U73122與U73343預處理培養物中，有 0.3土0.3%和15.3±1.9%PKCs移位細胞；在異丙基腎上腺素對照中，19.0士3.0% PKCs移位細胞(圖3A))。
雖然PI-PLC抑制劑U73122和其陰性對照U73343溶解在DMSO中，如 本文使用最高濃度所示例的，DMSO本身在較大濃度范圍內不會顯示任何抑 制性作用(稀釋度l: 200， n=8, 21.3±2.9% PKCs移位細胞,圖3A)。
另外，DAG不能直接由PLD產生，其先生成磷脂酸(PA)，然后PA代謝 為DAG(Rizzo和Romero， 2002)。而且，PLD生成的PA在RBL-2H3細胞中 已經顯示能直接對PKCs起作用(Jose Lopez-Andreo等，2003)。因此，用竟爭 性PLD抑制劑1-丁醇或其非干擾對照2-丁醇對培養物進行15分鐘預處理， 然后用1 nM異丙基腎上腺素刺激30秒。使用l-丁醇而非2-丁醇導致PKCs 移位細胞數量減少至基線水平(n二8， 1-丁醇預處理培養物中5.5±l.l%PKCs移 位細胞vs2-丁醇預處理培養物中16.0±2.4%PKCs移位細胞，圖3A)。
化合物D-609顯示能夠阻斷PC水解PLC(PC-PLC)，并保持PI-PLC和其 它PLC活性不變(Schutze等，1992)。在用異丙基腎上腺素刺激30秒之前， 用D-609將DRG神經元培養物預培養15分鐘，不會改變異丙基腎上腺素-誘
導的PKCs移位(11=8， 20.8±2.9%(D-609預處理)PKCs移位細胞，對比在異丙 基腎上腺素對照中19.0±3.0%,圖3A)，表明PC-PLC并不參與PKCs的激活。 因此，PI-PLC和PLD,而非PC-PLC，對于PKCs的異丙基腎上腺素誘導性 移位是必需的。
為了排除PLC和PLD活性會導致與PKCs不同的PKC亞型的活化，其 隨后會促發PKCs的激活，對PKC抑制劑雙"引哚馬來酰亞胺I(BIM)的作用進 行了研究。BIM通過封閉ATP-結合位點來抑制PKC活性，但在活化過程中 并不會抑制PKCs移位(Toullec等，1991)。同樣的，在用異丙基腎上腺素進行 刺激之前，用該抑制劑預處理培養物15分鐘。沒有出現PKCs移位細胞的減 少(11=8，在BIM處理的異丙基腎上腺素刺激細胞中，PKCs移位19.8±1.3%， 與在未處理的異丙基腎上腺素刺激化細胞中19.0±3.0%，圖3A)。因此，PI-PLC 和PLD并不是通過不同的PKC亞型起作用的而是對PKCs直接起作用。
PLC和PLD在Epac下游
為了研究PI-PLC和PLD是否在早期實驗描繪的as/AC/cAMP/Epac信號 通路的下游，而非可能的平行信號級聯下游(如導致脂肪酶激活的受體酪氨酸 激酶的反式活化(Luttrell等，1997; Lee和Chao, 2001),在用CPTOMe直接 激活Epac后，對U73122和U73343或1-和2-丁醇對PKCe移位的作用進行 評價。同樣地，在添加Epac活化劑CPTOMe并刺激90秒之前，用相應的抑 制劑或其無活性對照化合物預處理培養物15分鐘。如圖3B所示，兩種磷脂 酶的活性都是應答Epac的直接激活發生的PKCs移位所必需(i^6，PKCs移位 2細.9%在U73122, 23.7土3.6。/o在U73343, 8.7±1.5%在l-丁醇,21.8士2.7%在 2-丁醇預處理和CPTOMe刺激化細胞中，在CPTOMe刺激細胞中23.5±3.7%， 圖3B)。
發生在IB4+神經元中的B,-腎上腺素受^誘導的PKCs移位
雖然幾乎所有神經元都表達PKCs和卩2-AR(分別94.9%±1.8%0=409)和 99.8%±0.2%(11=407)神經元)，僅在20-35%神經元中檢測到了 PKCs移位。由 于使用的培養物體系包括促進不同功能的感覺神經元混合體，用非肽能感受 傷害神經元標記物IB4進行雙重染色鑒定出發生移位的神經元亞群。大量 PKCs移位的神經元在P2-AR刺激之后，顯示出很強的IB4細胞膜熒光信號(圖 5， 88.6±2.4%的PKCs移位細胞顯示IB4染色(評價的培養物n=4, IB4陽性 /PKCs移位細胞。/。 88.9%、 92.9%、 81.8%、 90.9%, PKCs移位細胞總數45))。
Epac激活PKCs從而誘導痛覺過敏
為了確定在培養的感受傷害神經元中的PKCs信號通路上游是否也適用 于體內的傷害感受體致衡痛覺過敏的PKCs信號傳導，進行了行為實驗。使 用與確定PKCs在P-AR激動劑-誘導痛覺過敏中的作用所使用的相同的模型 (Khasar等，199%)。結果顯示在體內用CPTOMe直接激活Epac會強烈地誘 導機械性痛覺過敏(縮爪閾值降低了 37.7士1.9%(用腎上腺素后(n=6)), 34.6±1.6%(用CPTOMe后(n二12》，鹽水注射后(『6)閾值增高了 0.4±1.8,圖 4A)。
接下來，對Epac是否通過激活PKCs來介導痛覺過敏的問題進行研究， 該研究通過在注射特異性PKCs抑制劑sVl-2后，用CPTOMe來刺激痛覺過 敏發生來進行。如圖4A所示，eVl-2抑制由CPTOMe誘導的痛覺過敏(用 CPTOMe后(n二12)縮爪閾值降低34.6±1.6%，用sVl-2后(n二6)增加1.6±2.7%, CPTOMe進入sVl-2預處理的爪中后(n二6)增加3.9±2.1%)。因此，體內Epac 活化也導致PKCs活化，其進而會導致機械性痛覺過敏。
最后，為了確定PI-PLC和PLD作為|32-AR和Epac-誘導性痛覺過敏介質 的作用，在用腎上腺素或CPTOMe進行刺激之前，先用各自的抑制劑和其無 活性對照，U73122/U73343(PI-PLC)和l-丁醇/2-丁醇(PLD),對爪進行預注射。 不進行刺激時，所有抑制劑都不會影響大鼠的基線敏感性(11=6， U73122 -4.4%±1.3%, U73343 2.8%±1.9%, 1-丁醇-0.0o/o±1.8%， 2-丁醇-8%±1.7%， 圖4B)。但如體外所顯示的，U73122以及1-丁醇會抑制CPTOMe-誘導性痛覺 過敏發生(CPTOMe 31.7%±0.8%(n=12)， U73122/CPTOMe -2.5%±2.0%(n=6)， l-丁醇/CPTOMe-0.5。/。士1.8o/。(n二6)),而各自的陰性對照，U73343和2-丁醇， 就不會(U73343/CPTOMe 30.9%土1.9%(11=6) ，2- 丁醇/CPTOMe 33.4%±1.7%(n=6))。因此，在體內，PI-PLC以及PLD都能作為機械痛覺過敏 的主要介質。
討論
Epac調節Gou/cAMP至PKCe的相互對話
對GPCR信號傳導的大量研究已經識別了會導致PKC活化的不同通路。 已經顯示G-蛋白oiq和Py(Gudermann等，1997),或生長因子受體的反式活化 (Luttrell等，1997; Lee和Chao， 2001),但非G-蛋白as能導致磷脂酶激活， 從而激活PKCs。近來，用佛司可4^(forskolin)激活AC的傷害感受體致敏的研 究表明G-蛋白Os可能會激活PKC(Gold等，1998; Parada等，2005)。利用已 知的as活化劑霍亂毒素，AC活化劑佛司可林(forskolin)和cAMP類似物 CPTOMe的工作為下述原理提供了證據，即事實上，G-蛋白as也介導激活 PKCs的GPCR信號傳導。
還沒有闡明關聯cAMP和PKC信號通路的機理。具體地說，封閉PKA 的ATP結合位點(Lu等，1996)的PKA抑制劑CMIQ并不會消除DRG神經元
中的prAR-誘導性PKCs移位，這說明在激活PKCs之前，as/cAMP第二信使 信號通路在PKA上游發生分支。本項工作驗證了下述假說，即最近鑒定的 cAMP， Epac的下游介質(deRooij等，1998; Kawasaki等，1998)可以介導此 相互對話。雖然已知Epac能激活MAPKs，但并不知道它能激活PKCs。使用 Epac-特異性cAMP類似物CPTOMe顯示激活Epac會誘導PKCe移位，從而 在DRG神經元中介導cAMP/PKC相互對話。
Epac通過PI-PLC和PLD激活PKCs
由磷脂酶產生的DAG能夠激活新型PKC，如PKCs。顯示(32-AR在 HEK293細胞中會導致PLCs激活(Schmidt等，2001)。利用抑制劑U73122所 得的結果表明參與PKCs活化的磷脂酶與PLCs屬于同一類型，也就是說 PI-PLC證明了其在卩2-AR/Epac-誘導的PKCs活化中的主要作用。
雖然PLC經常會在DAG生成中形成首次增加，PLD也可以通過產生磷 脂酸(PA)而促使DAG的增加，磷脂酸可隨后轉變成DAG(Nishizuka， 1992; Claphani和Neer, 1993)。但令人吃驚的是，發現不僅PLD參與PKCs移位， 而且是PKCs移位所必需的。在此方面重要的是，最近在RBL-2H3細胞中顯 示DAG以及PA會在兩個不同位點結合PKCs，而且都會促使PKCs至細胞膜 的粘附并活化(Jose Lopez-Andreo等，2003)。本項工作顯示PLD是PKCs在 傷害感受體內移位的必要組成成分。
Euac介導PKCs-依賴性機械性痛覺過敏
本工作研究了 Epac的激活是否會在體內通過PI-PLC和PLD導致PKCe-依賴性機械性痛覺過敏。已顯示PKCs依賴性痛覺過敏需要在感受傷害性神經 元中的PKCs活性，從而調節TTX-R鈉通道，該通道是疼痛中一個重要的效
應因子組分(Khasar等，1999b; Parada等，2003b)。已證明將PKCs調節劑注 射入大鼠后爪中是一種在感受傷害性神經元中調節PKCs活性從而調節 PKCs-依賴性痛覺過敏的合適方式(Khasar等，1999b; Parada等，2003b)。注 射Epac活化劑CPTOMe與prAR作用性腎上腺素以同樣的程度誘導機械性 痛覺過敏。Epac活化還會在體內導致PKCs激活，由于使用PKCs特異性抑 制劑sVl-2會完全削弱Epac活化劑-誘導的機械性痛覺過敏，從而確認了體外 描繪的信號通路。
確認了磷脂酶PI-PLC和PLD于體內在Epac/PKCs-誘導性痛覺過敏中的 主要作用。用U73122抑制PI-PLC或抑制劑l-丁醇抑制PLD都能夠完全地石皮 壞Epac-介導的機械性痛覺過敏，而各自的抑制劑對照，U73343和2-丁醇， 就顯示不起作用。因此，加入PI-PLC和PLD活性作為P2-AR-誘導性/PKCs-介導機械性痛覺過敏的新的基本組成成分。
Epac在IB4+傷害感受體中激活PKCs
發現IB4-表位位于GDNF-依賴性、小直徑、感受傷害神經元上，并且標 記了約30%的DRG-神經元(Molliver和Snider ， 1997; Hunt和Mantyh， 2001)。 這些神經元組成了約70%的分布于表皮的神經元(1^1等，2001),投射到脊髓 層IIi，而且可能參與神經性痛(Molliver等，1997; Bennett等，1998; Boucher 等，2000)。雖然IB4已經在疼痛模型中廣泛用于蛋白表達變化的描述性的研 究，但對于這些神經元的功能和機械重要性還了解不足。 <叉在20-35%的培養 DRG神經元中觀察到了 PKCs移位。即使(32-AR、 Epac(數據未顯示)和PKCs 幾乎在所有的DRG神經元中都有表達，但PKCs移位還是與IB4-表位的表達 高度相關。還不清楚此種特異性的分子基礎，而且#:可能是基于其它目前還 未鑒定的信號組分的差異表達，或者信號組分的差異調節。本觀察證實IB4(+)
神經元是傷害感受體，而且說明了 IB4-陽性和IB4-陰性/肽能傷害感受體之間 的功能差異。由于TTX-R鈉電流是通過PKCs和其它機制來調節的(Khasar 等，1999b)，因此我們對研究該其它機制是否還存在于IB4(+)神經元中感興趣。 盡管參與感受傷害的其它分子如TRPV1會在DRG神經元的不同亞群中表達 (Guo等，1999; Zwick等，2002)，這項工作第 一次表明該細胞機制局限在感 受傷害性神經元的IB4(+)亞型。
調節痛覺過敏的EDac和其它信號通路
總之，通過描述導致體外和體內PKCs激活的信號通路，本工作對疼痛中 的感覺神經元中的胞內信號通路進行了詳細分析。因此，該結果闡明了一種 新型的信號傳導機制，兩種普遍存在的信號通路cAMP和PKC之間的相互對 話，這兩種信號通路在各種系統比如神經元可塑性中使用。證據表明Epac是 這種相互對話中的一個重要元素。重要的是，DRG-神經元中的此種信號通路 僅限于IB4(+)傷害感受體，從而確立了第一個特異性針對這種傷害感受體亞 群的機制。描繪導致PKCs激活的級聯工作引入了三種用來治療疼痛的新靶 標，Epac、 PI-PKC(如PLCs)和PLD。另外，該工作提供證據證明不僅G-蛋白 ctq和py而且as都能激活PKC。
該結果提供了 一個強有力的切入點，以進一 步研究由其它炎性介質誘導 的痛覺過敏中的胞內信號通路。有趣的是，Epac和其下游靶標Rapl的文獻暗 示了與傷害感受體功能中的其它重要通路比如PKA和MAPK(Khasar等， 1999b; Aley等，2001; Stork和Schmitt， 2002)，整合素(Bos等，2003; Rangarajan 等，2003; Dina等，2004),和生長因子受體(Boucher等，2000)的進一步的相 互對話。
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應理解，本文描述的實施例和具體實施方式
僅是示意性的目的，本領域 技術人員可以對其進行各種修改和改變，而且都包括在本申請的精神和范圍 以及所附權利要求的保護范圍之內。本文所引用的所有公開出版物、專利和 專利申請以其整體引入本文以供一切目的的參考。
權利要求
1、減輕疼痛的方法，所述方法包括給有需要的患者進行有效量的選自下組的抑制劑的給藥:Epac抑制劑、磷脂酶C-ε(PLCε)抑制劑和磷脂酶D(PLD)抑制劑。
2、 如權利要求l所述的方法，其中所述給藥導致所述患者痛覺過敏降低。
3、 如權利要求2所述的方法，其中所述給藥對于所述患者的傷害感受無顯著影響。
4、 如權利要求l所述的方法，其中所述患者患有炎性痛。
5、 如權利要求4所述的方法，其中所述炎性痛是急性的。
6、 如權利要求4所述的方法，其中所述炎性痛是f曼性的。
7、 如權利要求4所述的方法，其中所述炎性痛是由于選自下組的病癥引起的 曬傷、關節炎、結腸炎、心肌炎、皮炎、肌炎、神經炎、粘膜炎、尿道炎、 膀胱炎、胃炎、肺炎和膠原血管病。
8、 如權利要求l所述的方法，其中所述患者患有神經性痛。
9、 如權利要求8所述的方法，其中所述神經性痛是急性的。
10、 如權利要求8所述的方法，其中所述神經性痛是慢性的。
11 、如權利要求8所述的方法，其中所述神經性痛是由于選自下組的病癥引起 灼痛、糖尿病、l交原血管病、三叉神經痛、脊髓損傷、腦干損傷、丘腦疼痛 綜合癥、I型復雜區域疼痛綜合癥/反射性交感神經營養不良癥、Fabry's綜合 癥、小纖維神經病、癌癥、癌癥化療、慢性酒精中毒、中風、膿胂、脫髓鞘 疾病、病毒性感染、抗病毒治療、艾滋病和艾滋病治療。
12、 如權利要求8所述的方法，其中所述神經性痛是由于選自下組的因素引起 的外傷、手術、截肢、毒素和化療。
13、 如權利要求l所述的方法，其中所述患者患有全身性疼痛癥。
14、 如權利要求13所述的方法，其中所述全身性疼痛癥選自下組纖維肌痛、 過敏性腸綜合癥和顳下頜關節紊亂癥。
15、 如權利要求l所述的方法，其中所述抑制劑是Epac抑制劑。
16、 如權利要求15所述的方法，其中所述Epac抑制劑直接對Epac起作用。
17、 如權利要求15所述的方法，所述方法還包括給患者施用以與Epac抑制劑 不同機制^^作用的止痛劑。
18、 如權利要求l所述的方法，其中所述抑制劑是PLCs抑制劑。
19、 如權利要求15所述的方法，其中所述PLCs抑制劑直接對PLCs起作用。
20、 如權利要求15所述的方法，所述方法還包括給患者施用以與PLCs抑制 劑不同機制^^作用的止痛劑。
21、 如權利要求l所述的方法，其中所述抑制劑是PLD抑制劑。
22、 如權利要求17所述的方法，其中所述PLD抑制劑直接對PLD起作用。
23、 如權利要求21所述的方法，其中所述PLD抑制劑是選擇法PLD抑制劑。
24、 如權利要求21所述的方法，所述方法還包括給患者施用以與PLD抑制劑 不同機制^^作用的止痛劑。
25、 如4又利要求1所述的方法，其中所述方法還包括施用選自下組的試劑蛋 白激酶A(PKA)抑制劑、cAMP抑制劑、非甾體類抗炎藥、前列腺素合成抑制 劑、局部麻醉劑、抗驚厥藥、抗抑郁劑、阿片受體激動劑和鎮靜藥。
26、 藥物組合物，包含(a) 選自下組的抑制劑Epac抑制劑、PLCe抑制劑和PLD抑制劑；和(b) 通過不同于所述抑制劑的機制^^作用的止痛劑。
27、 藥物組合物，包含(a)選自下組的抑制劑Epac抑制劑、PLCs抑制劑和PLD抑制劑；和 (b)選自下組的試劑蛋白激酶A(PKA)抑制劑、cAMP抑制劑、非甾體類 抗炎藥、前列腺素合成抑制劑、局部麻醉劑、抗驚厥藥、抗抑郁劑、阿片受 體激動劑和鎮靜藥。
28、 如權利要求25或26所述的藥物組合物，其中所述抑制劑是Epac抑制劑。
29、 如權利要求25或26所述的藥物組合物，其中所述抑制劑是PLCs抑制劑。
30、 如權利要求25或26所述的藥物組合物，其中所述抑制劑是PLD抑制劑。
31、 預篩選能減輕患者疼痛的試劑的方法，該方法包括(a) 將待測試劑與選自下組的多肽接觸Epac、 PLCs和PLD;(b) 確定該待測試劑是否特斧f生結合該多肽；和(c) 如果該待測試劑特異f生結合該多肽，則選擇該待測試劑作為潛在止痛劑。
32、 預篩選能減輕患者疼痛的試劑的方法，該方法包括(a) 將待測試劑與編碼選自下組的多肽的多核普酸接觸Epac、 PLCs和PLD;(b) 確定該待測試劑是否特異f生結合該多核脊酸；和(c) 如果該待測試劑特異性結合該多核普酸，則選#^亥待測試劑作為潛在止痛劑。
33、 如權利要求31或32所述的預篩選方法，其中所述多肽包括Epac。
34、 如權利要求31或32所述的預篩選方法，其中所述多肽包括PLCs。
35、 如權利要求31或32所述的預篩選方法，其中所述多肽包括PLD。
36、 如權利要求31或32所述的預篩選方法，其中所述方法還包括將特異f生結合 所述多肽或所述多核芬酸的任何待測試劑分別記錄在候選止痛劑數據庫中。
37、 如權利要求31或32所述的預篩選方法，其中所述接觸在體外。
38、 篩選能減輕患者疼痛的試劑的方法，該方法包括(a) 將待測試劑與選自下組的多肽接觸Epac、 PLCs和PLD;(b) 確定該待測試劑是否抑制該多肽；和(c) 如果該待測試劑抑制該多肽，則選4朽亥待測試劑作為潛在止痛劑。
39、 如權利要求38所述的篩選方法，其中所述多肽包括Epac。
40、 如權利要求38所述的篩選方法，其中所述多肽包括PLCs。
41、 如權利要求38所述的篩選方法，其中所述多肽包括PLD。
42、 如權利要求38所述的篩選方法，其中所述方法還包括將抑制所述多肽的任 何待測試劑都記錄在候選止痛劑數據庫中。
43、 如權利要求38所述的篩選方法，其中所述接觸在4本外。
44、 如4又利要求38所述的篩選方法，其中 所述步驟(a)中的接觸包括將待測試劑與在不存在該待測試劑的條件下表達所述 多肽的細月包接觸；或與該細胞的一部分接觸；平；且所述步辦c)中的選擇包*果所述多肽的水平、或編碼該多肽的多核苷酸水平 降低，則選#^亥待測試劑作為潛在止痛劑。
45、如權利要求38所述的篩選方法，其中:多肽的細胞接觸；或與該細胞的一部分接觸；所述步驟(b)中的確定包括確定所述多肽的作用7jc平；且所述步驟(c)中的選擇包紛p果所述多狀作用的水平降低，則選#^亥待測試劑作 為潛在止痛劑。
46、如權利要求38所述的篩選方法，還包括將所選定的待測試劑與藥學上可接 受的載體組合。
47、如權利要求38所述的篩選方法，還包括測量所選定的待測試劑在動物模型 中減輕疼痛的能力。
48、篩選能減輕患者疼痛的試劑的方法，該方法包括(a) 從下組中選擇一種抑制劑作為待測試劑Epac抑制劑、PLCs抑制劑和PLD 承卩制劑；牙口(b) 測量所選定的待測試劑在動物模型中減輕疼痛的能力。
49、試劑盒，包含(a) 在藥學上可接受載體中的選自下組的抑制劑Epac抑制劑、PLCe抑制劑和 PLD抑制劑；(b) 實^f又利要求l所述方法的說明書。
全文摘要
本發明提供了通過抑制Epac、PLCε和/或PLD來減輕患者疼痛的方法、組合物和試劑盒。另外，本發明提供了目的在于鑒定出減輕疼痛的試劑的各種預篩選和篩選方法。本發明的方法可以包括對結合Epac、PLCε或PLD的待測試劑進行分析。或者，可以對待測試劑的改變Epac、PLCε或PLD多肽、多核苷酸或其作用的水平的能力進行篩選。
文檔編號A61K31/47GK101378656SQ200680027934
公開日2009年3月4日 申請日期2006年6月5日 優先權日2005年6月7日
發明者喬恩·D·利文, 羅伯特·O·梅辛 申請人:加利福尼亞大學董事會