診斷和治療腫瘤的方法及組合物的制作方法

專利名稱：診斷和治療腫瘤的方法及組合物的制作方法
本分案申請是基于申請號為96199585.8，申請日為1996年11月27日，發明名稱為“診斷和治療腫瘤的方法及組合物”的中國專利申請的分案申請。
發明的背景本申請是1995年11月30日提交的美國臨時專利申請序號60/007,810的部分繼續申請。上述公開的全部內容沒有任何放棄地引入本文作為參考。
A.發明的領域本發明總地涉及腫瘤生物學領域。具體地說，本發明涉及治療磷狀細胞癌的組合物及方法。本發明還提供了檢查顯微殘留腫瘤和將腫瘤植入體腔內的動物模型，及其治療方法。
B.相關技術細胞增殖和細胞死亡的平衡率對于保持正常組織內環境穩定起重要作用。這種平衡的破壞是多步驟腫瘤發生過程中的一個主要因素，并且對凋亡或編程性細胞死亡的抑制是引起這種破壞的原因之一。這種缺陷的影響是災難性的，在美國每年造成50多萬人死亡。
在許多人類腫瘤的病因學中，有相當多的證據牽涉到腫瘤抑制基因p53基因的突變。有報告證明，包括代表性的結腸癌、膠質細胞瘤、乳腺癌、骨肉瘤和肺癌在內的幾種不同的人腫瘤細胞系的生長受到病毒介導的野生型p53基因轉移的功能性抑制。已顯示誘導野生型p53的外源p53表達可誘導結腸癌細胞系和人肺癌球體細胞的凋亡，提示p53在編程性細胞死亡中的作用。
患頭和頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)的病人受到常常對語言、吞咽和美容產生深遠影響之疾病的折磨。此外，由于一直是實施外形手術和放射治療，所以近30年來這些病人的約50％這一總存活率一直沒有改變。與全身性播散相反的主要在局部部位的復發，表明原發性腫瘤部位的微小殘余腫瘤是高死亡率的主要原因。基于這些事實，如果能夠有效地破壞SCCHN中的微小殘留病變將可改善腫瘤治療的效力。
發明概要因此，本發明的一個目的是提供改良的體內治療鱗狀細胞癌的方法。本發明的另一個目的是提供估測顯微殘余腫瘤發展及治療效果和在體腔內顯微植入腫瘤的方法。
在實現這些目的中，提供了一種治療患鱗狀細胞癌的病人的方法，其包括(a)提供包含在真核細胞中發揮功能的啟動子和編碼p53的多核苷酸的表達構建體，其中多核苷酸位于啟動子有義方向并在其控制下；以及(b)使該表達構建體與鱗狀細胞癌在體內接觸。
鱗狀細胞癌可以是頭和頸部癌瘤。鱗狀細胞癌的內源性p53可以是突變或未突變的。表達構建體最好是病毒載體，例如反轉錄病毒載體和腺病毒載體及腺相關病毒載體，特別是復制缺陷型腺病毒載體。在一特定實施方案中，標記p53基因，以便可以檢測從表達載體表達的p53。優選的標記是總疫學標記，如連續的抗體表位。
該方法進一步包括外科手術切除腫瘤，及切除后進一步使腫瘤床或“人工體腔”與表達構建體接觸。用于接觸腫瘤床的體積約為3ml至10ml。在利用腺病毒載體時，每次接觸中投用的腺病毒的量約為107、108、109、1010、1011或1012pfu。
也預期連續灌注表達構建體。將根據通過注射遞送的量來確定連續輸注中遞送的量，以便在給定的時間內達到大約同樣的總劑量，但使用連續輸注法可能達到稍大些有總劑量。
在另一實施方案中，將表達構建體注射到天然體腔如口、咽、喉、食管、氣管、胸腔、腹腔，或包括膀胱、結腸或其他內臟器官在內的中空器官腔。
還提供了確定對微小殘留腫瘤之治療效果的方法，其包括(a)提供帶有切割到皮下組織中之切口的嚙齒動物；(b)用腫瘤細胞接種切口；(c)用治療法處理該嚙齒動物；以及(d)估計該療法對腫瘤發育的影響。可在步驟(b)之后和步驟(c)之前封閉切口。另外，所說的處理方法可包括向切口內導入治療組合物，在封口后再打開切口并在導入所說的治療組合物后再封閉之。
可從下列詳細描述中進一步了解本發明的其他目的、特征和優點。但應明確的是，指出本發明優選實施方案的詳細描述和特定實施例只是以舉例說明的方式給出的，對于本領域技術人員來說，對該詳細描述的各種落入本發明的精神和范圍內的改動和改進都將是顯而易見的。
附圖簡要說明下列附圖構成本說明書的一個部分并包括在說明書內，其旨在進一步證明本發明的某些方面。可參考一個或多個附圖及本文對特定實施方案的詳細描述來更好地理解本發明。


圖1SCCHN細胞系Tu-138(實心三角)和Tu177(實心方塊)的轉導效率。以10到100的不同MOI用重組β-gal腺病毒感染細胞。從每個復制平皿上各記500個細胞得出β-gal陽性細胞的百分數。
圖2A和圖2BSCCHN細胞體外生長的抑制。(圖2A)模擬感染的Tu-138細胞(實心圈)、dl312感染細胞(實心三角)，及Ad5CMV-p53感染的細胞(實心方框)的生長曲線。(圖2B)模擬感染的Tu-177細胞(空心圈)、dl312感染的細胞(空心三角)和Ad5CMV-p53感染的細胞(空心方塊)的生長曲線。在每個指出的時間點，胰酶消化并計數三個平皿的細胞。將感染后每三個重復孔細胞計數的平均值±SEM對感染以來的天數作圖。
圖3A、圖3B、圖3C和圖3D四個SCCHN細胞系的復合生長曲線。(圖3A)Tu-138。(圖3B)Tu-177。(圖3C)MDA 686-LN。(圖3D)MDA886。模擬感染的細胞(實心圈)、dl312感染的細胞(實心三角)和Ad 5CMV-p53感染的細胞(實心方塊)。將感染后每三個重復孔的細胞計數平均值對自感染后的天數作圖；豎短線為平均標準差(SEM)。
圖4正常成纖維細胞系的生長曲線。模擬感染的細胞(實心圈)、dl312感染的細胞(實心三角)和Ad5CMV-p53感染的細胞(實心方塊)。
圖5A和圖5BSCCHN細胞系的復合生長曲線。圖5ATu-138；圖5BMDA 686LN；模擬感染的細胞(空心方塊)、dl312感染的細胞(空心三角)和Ad5CMV-53感染的細胞(實心圈)。在每個指出的時間點上，用胰酶消化并計數三個平皿的細胞。將每三個重復平皿細胞計數的平均值對感染后小時數作圖；豎短線為SEM。
圖6A和圖6B按TUNEL方法用生物素化的dUTP標記凋亡細胞中的DNA斷裂。感染后，在一時間過程研究中對細胞凋亡進行流式細胞計數分析。圖6A用復制缺陷型腺病毒dl312感染的Tu-138細胞(框1-框4)，用野生型p53腺病感染的Tu-138細胞(框5-框8)。圖6B用復制缺陷型腺病毒dl312感染的MDA 686LN細胞(A-D)，用野生型p53腺病毒感染的MDA 686LN細胞(E-H)。Ap代表細胞凋亡。
圖7A和圖7BSCCHN細胞系的復合生長曲線。圖7ATu-138；7BMDA 686LN；模擬感染的細胞(空心圈)，dl312感染的細胞(空心三角)，Ad5CMV-p53感染的細胞(空心方塊)和Ad5CMV-p53-FLAG感染的細胞(空心方塊)。在每個時間點，用胰酶消化并計數平均值對感染后小時數作圖；豎短線代表SEM。
優選實施方案的詳細描述迄今的資料提示，治療SCCHN的主要缺點之一是不能完全根除原發腫瘤部位或緊鄰局部或區域組織中的疾病。因此，設計本發明以提供得以更完全和有效地治療SCCHN，特別是破壞微小殘留腫瘤的基因治療方法學。可以單獨使用該方法學或作為更常規的治療方法如化學或放射治療或外科介入法的輔助方法使用之。此外，使用針對微小殘留腫瘤以及植入體腔內的微小腫瘤而特別設計的動物模型，本發明人已證明了這些方法的效力。本發明的詳細內容更全面地描述如下。
總地說來，現已觀察到不管腫瘤細胞的p53狀態如何，腫瘤p53基因治療都是有效的。令人驚奇的是，當使用攜帶野生型p53基因的病毒載體治療腫瘤時；已觀察到對其中細胞表達功能性p53分子的腫瘤的治療效果。這一結果不能基于目前對腫瘤抑制基因功能的了解預測到。另外，還發現也表達功能性p53分子的正常細胞顯然沒有受到病毒構建體高水平表達p53的影響。這就提出了這樣一種可能性，即p53基因治療法治療腫瘤可能比原來預期的有更為廣泛的適用性。
A.p53蛋白質和多核苷酸本申請整個文件中使用的術語“p53”是指舉例的p53分子以及所有其他種屬的p53同系物。“野生型”和“突變體”p53分別指表達正常腫瘤抑制因子活性的p53基因和缺乏或具有降低的抑制因子活性和/或具有轉化活性的p53基因。因此p53的“突變體”不僅僅是序列突變體，而且更是顯示有改變的功能特征的那些突變體。
目前認為p53是一種腫瘤抑制基因(Montenarh，1992)。發現以化學致癌、紫外光照射及包括SV40在內的幾種病毒轉化的許多細胞中都有高水平的p53。在許多人類腫瘤中p53基因是突變失活的常見靶，并已證明是常見人腫瘤中的最常見的突變基因(Mercer，1992)。其在50％以上的人NSCLC中(Hollestein等.，1991)和廣譜的其他腫瘤中都是突變的。
雖然含有突變的p53基因的腫瘤是根據本發明的優選靶，但權利要求的p53表達載體的應用延伸到治療具有野生型或功能性p53的腫瘤。盡管目前對有關機理還不完全了解，但本發明人已確定p53表達能限制表達功能性p53產物之腫瘤的生長，甚至誘導這些細胞中的凋亡過程。因此，雖然腫瘤的p53狀態可潛在地用于診斷方面，但對于本發明的實踐并不是重要的。這種現象不只限于SCCHN腫瘤，而且可應用于包括神經膠質瘤、肉瘤、癌、白血病、淋巴瘤和黑素瘤在內的各種惡性增生，其中包括皮膚、肝臟、睪丸、骨、腦、胰腺、頭和頸、胃、肺、卵巢、乳腺、結腸、前列腺和膀胱的腫瘤。
p53多肽p53基因編碼可與病毒蛋白質如大T抗原和E1B形成復合物的375氨基酸磷蛋白。該蛋白質見于正常組織和細胞中，但與許多被轉化的細胞或腫瘤組織相比，其濃度很小。令人感興趣的是，野生型p53似乎在調節細胞生長和分化中是很重要的。已顯示在某些情況下野生型p53的過量表達在人腫瘤細胞系中是抗增殖的。因此p53可作為細胞生長的負調節劑(Weinberg，1991)，并可直接抑制不受控制的細胞生長，或間接激活抑制這種生長的基因。因此，野生型p53的不存在或活化可能歸因于轉化作用。然而，有些研究指出，突變體p53的存在對于基因之轉化潛能的充分表達是必要的。
雖然野生型p53是認定為許多類型細胞中的特別重要的生長調節因子，但其遺傳學和生物化學特征似乎也顯示有一定的作用。錯義突變對于p53基因是常見的，并且對于癌基因的轉化能力是很關鍵的。由點突變促成的單一基因改變可產生致癌性p53。但與其他癌基因不同，已知p53點突變發生在至少30個不同的密碼子中，常常產生導致細胞表型轉變的顯性等位基因，而沒有降低純合性。此外，這些顯性失活的等位基因中有許多似乎在生物體中是被耐受的，并且可在生殖系中傳代。各種突變等位基因似乎從小的功能障礙到強的穿透性、顯性失活的等位基因排列的(Weinberg，1991)。
Casey和其同事已報導，將編碼野生型p53的DNA轉導到兩個人乳腺癌細胞，恢復了這些細胞中的生長抑制性控制(Casey et al.，1991)。也已證明了將野生型而不是突變體p53轉染到人肺癌細胞系中的相似效果(Takahasi et al.，1992)。p53野生型似乎比突變體基因更占優勢，并且當轉染到帶突變型基因的細胞內時將選擇性地對抗增殖。轉染的p53的表達并不影響帶內源性p53之正常細胞的生長。因此，這些構建體可被正常細胞攝入而沒有付效應。
因此有可能用野生型p53治療p53相關腫瘤以降低惡性細胞的數目。然而，如上所述的那些研究遠沒有達到這樣的目的，這至少是因為不能利用DNA轉染作用將DNA導入病人體內的腫瘤細胞中。
編碼p53的多核苷酸根據本發明的多核苷酸可編碼完整的p53基因、功能性p53蛋白區域或任何p53多肽。“互補”多核苷酸是能夠按照標準的Watson-Crick互計法則堿基配對的多核苷酸。即較大的嘌呤將與較小的嘧啶堿基配對以形成烏嘌呤與胞嘧啶配對(G:C)和腺嘌呤與胸腺嘧啶配對(A:T，對DNA來說)，或腺嘌呤與尿嘧啶配對(A:U，對RNA來說)的組合。在雜交序列中包括少見的堿基如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黃嘌呤及其他堿基并不干擾配對。
本文所使用的術語“互補序列”是指實質在其整個長度上互補的并且只有很少堿基錯配的多核苷酸序列。例如，長度為15個堿基的序列當它們有13或14位互補核苷酸時即被稱為互補。當然，“完全互補”的序列應是在其整長長度上完全互補并沒有錯配的序列。
也預期包括有低程序同源性的其他序列。例如，可設計在有限的區域有高度同源性但也含有非同源區的反義構建體(如核酶)。這些分子雖然有少于50％的同源性，但可以在適當條件下與靶序列結合。
多核苷酸可衍生于基因組DNA，即可以直接從特定生物體的基因組中克隆。但在其他實施方案中，多核苷酸可以是互補DNA(cDNA)。cDNA是使用信息RNA(mRNA)作模板制備的DNA。因此，cDNA并不含有任何中斷的編碼序列，并且通常幾乎只含有相應蛋白質的編碼區。在另一實施方案中，多核苷酸可以是合成的。
將基因組DNA的一部分與cDNA或合成的序列組合起來產生特定構建體可能是有利的。例如，當期望在最終構建體中有一個內含子時，則需要使用基因組克隆。可從p53以外的其他基因衍生得到內含子。cDNA或合成的多核苷酸可為構建體的保留部分提供更方便的限制性位點，并因此可用于序列的其他部分。
SEQ ID No1和SEQ ID No3分別提供了人和小鼠p53的DNA序列，SEQ ID No2和SEQ ID No4中則分別提供相應的氨基酸序列。
預期存在與本文公開序列不同的p53的天然變異體。因此，本發明不只限于使用所提供的p53的多核苷酸序列，而且還包括使用任何天然存在的變異體。本發明還包括這些序列的化學合成的變異體。
另一類型的序列變異體則得自密碼子變異。因為20個正常氨基酸的大多數都有幾個密碼子，所以p53可由許多不同的DNA編碼。參見下表將會識別這樣的變異體。
表1
考慮到遺傳密碼的簡并性，優選的是與本文公開的核苷酸序列有大約50％至75％，或有大約76％至99％相同核苷酸的序列。落在“p53編碼多核苷酸”范圍內的序列是能夠在細胞內條件下與上面列出的多核苷酸堿基配對的序列。
如上文指出的，雖然p53編碼序列可以是全長度基因組或cDNA拷貝，或其大片段，但本發明也可利用p53的較短的寡核苷酸。17堿基長的序列應在人基因組中只存在一種，并因此而足以確定獨特的靶序列。雖然較短的寡聚體更易于制備并增加體內可接近性，但在確定堿基配對的特異性中也包括許多其他因素。寡核苷酸與其互補靶的結合親合性及序列特異性隨長度增加而增加。預期使用8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個堿基對的寡核苷酸，例如用于制備p53突變體和用于PCR反應中。
在人基因組中17堿基長的任何序列應只存在一種，并因此而足以確定獨特的靶序列。雖然更短的寡聚體更易于制備并增加體內可接近性，但在確定雜交的特異性時還涉及許多其他因素。寡核苷酸與其互補靶的結合親合性及序列特異性隨長度的增加而增加。
在某些實施方案中，可望利用包括其他元件的構建體，例如包括C-5丙炔嘧啶的構建體。已顯示含有尿嘧啶和胞嘧啶的C-5丙炔類似物的寡核苷酸以高親合性結合RNA(Wagner et al.，1993)。
本領域技術人員也十分了解，生物學功能等同物蛋白質或肽的定義意味著一個對可在分子的限定部分內進行的改變數目有限制、并仍產生可接受水平的等同生物學活性之分子的概念。因此生物學功能等同物肽在本文中被限定為其中某些而不是大多數或所有的氨基酸可被取代的那些肽。具體地說，如涉及p16蛋白質的N末端，預期可在給定的肽內只有大約16個或更好有5個氨基酸被改變。當然，可很容易地制得并按照本發明使用多個有不同取代的不同蛋白質/肽。
氨基酸取代一般是基于氨基酸側鏈取代基的相對相似性，例如疏水性、親水性、電荷、大小等。對氨基酸側鏈取代基的大小、形狀和類型的分析揭示，精氨酸、賴氨酸和組氨酸都是帶正電荷的殘基；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸都是相似大小的；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一般都有相似的形狀。因此，基于這些考慮，精氨酸、賴氨酸和組氨酸；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸在本文中均分別限定為生物學功能等同物。
在進行改變時，可考慮氨基酸的親水指數。對每種氨基酸都基于它們的疏水性及電荷特征定出一個親水指數異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)，苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
在賦予蛋白質以活性生物學功能中，氨基酸親水指數的重要性是本領域都了解的(Kyte & Doolittle，1982，引入本文作為參考)。已知某些氨基酸可被其他具有相似親水指數的并仍保留相似生物學活性的氨基酸取代。在基于親水指數進行改變時，取代氨基酸的親水指數較好在±2之內，特別是在±1之內，最好在±0.5之內。
了解到氨基酸可由具有相似親水值并仍得到生物學等同物蛋白質的另一個氨基酸取代。如美國專利4,554,101中詳細描述的，已確定了下列氨基酸的親水值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
在基于相似親水值的改變中，取代氨基酸較好是其親水值在±2之內，特別是在±1之內，最好在±0.5之內。
B表達載體本申請中使用的術語“表達構建體”是指包括任何類型含有編碼基因產物之核酸的遺傳構建體，其中部分或所有核酸編碼序列均能夠被轉錄。轉錄物可以但不一定被翻譯成蛋白質。因此，在某些實施方案中，表達包括p53基因的轉錄及p53mRBA翻譯成p53蛋白質產物。在其他實施方案中，表達只包括轉錄編碼p53的核酸或其互補物。
為了使該構建體實現至少p53轉錄物的表達，編碼p53多核苷酸的多核苷酸將處于啟動子的轉錄控制之下。“啟動子”是指由宿主細胞合成機制識別的，或導入到合成機制中的，為啟動基因的特異性表達所需的DNA序列。短語“在轉錄控制下”是指啟動子處在與控制RNA聚合酶啟動和多核苷酸表達的多核苷酸相關的正確位置上。
本文所使用的術語啟動子是指一組圍繞RNA聚合酶II起始位點集合的轉錄控制組件。對啟動子如何組織的許多認識源于對包括HSV胸苷激酶(tK)和SV40早期轉錄單位的幾種病毒啟動子的分析。盡管最近的工作對其有所爭論，這些研究已顯示啟動子是由不同的功能性組件組成的，其中各包括大約7-20bp的DNA，并包括轉錄激活因子或抑制因子蛋白質的一個或多個識別位點。
在每個啟動子中至少一個組件的功能是確定RNA合成的起始位點。其中了解最清楚的是TATA盒，但在某些缺TATA盒的啟動子中，例如哺乳動物末端脫氧核苷轉移酶基因的啟動子和SV40晚期基因的啟動子，交迭起始位點本身的分離的元件有助于固定啟動部位。
附加啟動子元件調節轉錄起始的頻率。一般說來，這些元件都位于起始位點的上游30-110bp區域中，但最近的研究顯示許多啟動子也都含有起始位點下游的功能性元件。啟動子元件之間的間隔常常是可變的，這樣當元件倒轉或相對另一個移動時啟動子功能得以保存。在tk啟動子中，在活性開始降低之前，啟動子元件之間的間隔可增加到間隔50bp。依據啟動子的不同，似乎個別元件可協同或單獨發揮激活轉錄作用的功能。
據信對用于控制p53多核苷酸表達的特定啟動子的要求并不是絕對的，只要其能夠在靶細胞中以足夠高的水平表達該多核苷酸即可。因此，當以人細胞為靶時，最好使多核苷酸編碼區相鄰于能夠在人細胞中表達的啟動子并在其控制之下。一般說來，這樣的啟動子包括人或病毒啟動子。
在各個不同的實施方案中，可使用人巨細胞病毒(CMV)立即早期基因啟動子、SV40早期啟動子和勞斯肉瘤病毒長末端重復序列，以得到p53多核苷酸的高水平表達。本發明還包括使用本領域已知的其他病毒或哺乳動物細胞或細菌噬菌體啟動子以實現多核苷酸的表達，條件是表達水平足以產生生長抑制作用。
利用有已知性質的啟動子，可使轉染后多核苷酸的表達水平和方式最佳化。例如，選擇在特異性細胞中不活性的啟動子，如在酪氨酸酶(黑素瘤)、α胎兒蛋白和白蛋白(肝腫瘤)、CC10(肺癌)和前列腺特異性抗原(前列腺癌)中，將允將組織特異性表達p53多核苷酸。表2列出可用于本發明以調節p53構建體之表達的幾種元件/啟動子。該表并不是要詳盡地給出所有參予促成p53表達的可能的元件，而只是作為舉例而已。
增強子原來被檢測為增強從位于同一DNA分子上的遠距離啟動子轉錄的遺傳元件。這種跨越大的距離發揮作用的能力在有關原核生物轉錄調節作用的傳統研究中是幾乎沒有先例的。繼后的工作顯示，帶增強子活性之DNA區域的組織很象啟動子。即是說，它們是由許多個別元件組成的，其中每個部分與一個或多個轉錄蛋白結合。
增強子和啟動子之間的基本區別是操作上的。增強子區總體上必須能夠相隔一段距離刺激轉錄；這一點對于啟動子或其組成元件則不必。另一方面，啟動子必須有一個或多個在特定位點和特定方向上直接發動RNA合成的元件，而增強子則缺乏這樣的特性。啟動子和增強子常常是交迭的和連續的，似乎常常有很相似的組織模式。
也可使用其他任何啟動子/增強子組合(真核生物啟動子數據庫EPDB)來驅動p53構建體的表達。使用T3、T7或SP6胞漿表達系統是另一個可能的實施方案。如果提供適當噬菌體聚合酶，作為傳送復合體的一部分或作為附加的基因表達載體，則真核細胞可支持從某些噬菌體啟動子開始的胞漿轉錄。
表2
此外，選擇在對特異性生理學信號反應中受調節的啟動子可產生p53構建體的可誘導表達。例如，在人PAI-1啟動子控制下的多核苷酸即是可由腫瘤壞死因子誘導表達的。表3中列舉幾個啟動子/誘導物組合的例子
表3
在本發明的某些實施方案中，通過在表達載體中加入標記可于體外或體內鑒定細胞中表達載體的運送。該標志將使被轉化的細胞發生可鑒定的變化，以使易于鑒定表達。通常加入藥物選擇標志有助于克隆和選擇轉化體。另外，可利用酶，例如單純皰疹病毒胸苷激酶(tK)(真核細胞)或氯霉素乙酰基轉移酶(CAT)(原核細胞)。也可利用免疫學標志。利用什么選擇標志并不重要，只要其能夠隨編碼p53的多核苷酸一起表達即可。選擇性標志的其他例子是本領域技術人員熟知的。
表達構建體中典型地還包括實現轉錄物適當聚腺苷酸化的聚腺苷酸化信號。據信聚腺苷酸化信號的性質對于實踐本發明并不是關鍵的，任何這樣的序列均可使用。本發明人利用了SV40聚腺苷酸化信號，已知其在靶細胞中可方便地使用并充分發揮功能。另外，作為表達構建體的一個元件還包括終止子。這些元件可用于提高信號水平并使從構建體讀成其他序列的可能性減至最小。
在本發明的優選實施方案中，表達構建體包括病毒或衍生于病毒基因組的工程構建體。某些病毒通過受體介導的胞吞作用進入細胞、并且在某些情況下整合到宿主染色體中的能力，已使它們成為將基因轉移到哺乳動物細胞中的有吸引力的侯選載體。然而，因為已證明可直接攝入裸DNA，以及可經受體介導攝入DNA復合物(見下文的討論)，所以表達載體不一定是病毒，而可以是能夠支持在哺乳動物細胞中表達編碼基因的任何質粒、粘粒或噬菌體構建體，例如pUC或BluescriptTM質粒系列。
反錄病毒反錄病毒是一組以能夠在被感染的細胞中通過反轉錄過程將其mRNA轉變成雙鏈DNA為特征為單鏈RNA病毒(Coffin，1990)。然后所得DNA作為原病毒穩定地整合到細胞染色體中并直接合成病毒蛋白質。整合導致病毒基因序列在受體細胞和其子代中的保留。反錄病毒基因組合有分別編碼衣殼蛋白、聚合酶和被膜成分的三個基因gag、pol和env。見于gag基因上游的稱為ψ的序列具有在病毒粒子中包裝基因組的信號功能。在病毒基因組的5′和3′端存在兩個長的末端重復(LTR)序列。這些序列含有強啟動子和增強子序列，并且也是在宿主細胞基因組中整合所必需的(Coffin，1990)。
為了構建反錄病毒載體，將編碼p53的核酸插入到病毒基因組中取代某些病毒序列，以產生有復制缺陷的病毒。為了產生病毒粒子，構建含有gag、pol和env基因但沒有LTR和ψ成分的包裝細胞系(Mann etal.，1983)當含有人cDNA、連同反錄病毒LTR和ψ序列的重組質粒被導入該細胞系(例如用磷酸鈣沉淀法)時，ψ序列促使重組質粒的RNA轉錄物包裝到病毒顆粒中，然后后者被分泌到培養基內(Nicolas andRubenstein，1988；Temin，1986；Marn et al.，1983)。然后收集含有重組反錄病毒的培養基，可以進一步濃縮并用于基因轉移。反錄病毒能夠感染許多不同類型的細胞。然而，整合和穩定地表達還需要宿主細胞的分裂(Paskind et al.，1975)。
最近已發展了一種基于向病毒被膜中化學加入乳糖殘基的化學修飾，從而特異地導向反錄病毒的新方法。這種修飾可能允許通過唾液酸糖蛋白受體特異性地感染肝細胞。
在所設計的定向運送重組反錄病毒的另一方法中，使用抗反錄病毒被膜蛋白和抗特異性細胞受體的生物素化的抗體。使用鏈霉抗生物素，通過生物素成分偶聯抗體(Roux et al.，1989)。使用抗主要組織相容性復合物I類和II類抗原的抗體，證明可在體外用親嗜性病毒感染各種帶有那些表面抗原的人細胞。
腺病毒人腺病毒是有約36kb大小基因組的雙鏈DNA腫瘤病毒(Tooze，1981)。作為真核基因表達的模式系統，已對腺病毒進行了廣泛研究和充分鑒定，使之成為發展腺病毒為基因轉移系統的一個具有吸引力的系統。這一組病毒易于生長和操縱，并且在體外和體內表現出有寬的宿主范圍。在裂解性感染的細胞中，腺病毒能夠切斷宿主蛋白質合成，指引細胞機器合成大量的病毒蛋白質，并產生大量病毒。
基因組的E1區包括E1A和E1B，其編碼負責病毒基因組的轉錄調節作用的蛋白質，及少數細胞基因。E2(包括E2A和E2B)表達允許病毒復制功能蛋白質的合成，例如DNA結合蛋白質、DNA聚合酶及引導復制之末端蛋白質。E3基因產物防止因細胞毒性T細胞及腫瘤坯死因子引起的細胞溶解，并且似乎對病毒增殖很重要。與E4蛋白質相關的功能包括DNA復制、晚期基因表達以及宿主細胞關閉蛋白質合成。晚期基因產物包括大多數病毒粒子衣殼蛋白，并且這些蛋白質只在從主要晚期啟動子轉錄的單一初級轉錄物進行大部分加工后才表達。在感染的晚期，主要晚期啟動子(MLP)表現出高效率(Stratford-Perricaudet andPerricaudet，1991a)。
因為只有小部分病毒基因組要求是順式的(Tooze，1981)，所以腺病毒衍生的載體當與細胞系如293細胞結合使用時，可提供極好的取代大DNA片段的可能。已建立了Ad5轉化的人胚腎細胞系(Graham，et al.，1977)，以提供呈反式的基本病毒蛋白質。因此本發明人有理由認為，腺病毒的特征使之成為用于體內導向腫瘤細胞的良好候選病毒載體(Grunhaus & Horwitz，1992)。
腺病毒系統向細胞傳送外來蛋白質的特別優點包括(i)能夠由外來DNA取代相對大塊的病毒DNA；(iii)重組腺病毒的結構穩定性，(iii)腺病毒給人服用的安全性，和(iv)腺病毒感染與腫瘤或惡性增生沒有任何已知的聯系；(v)能夠獲得高深滴度的重組病毒；以及(vi)腺病毒的高感染性。
與反錄病毒相比，腺病毒載體的其他優點包括更高水平的基因表達。另外與反錄病毒序列不同，腺病毒復制不依賴于宿主基因復制。由于E1區中的腺病毒轉化基因可以很容易地缺失，并仍提供有效的表達載體，所以一般認為由腺病毒載體造成的致癌危險可以略不計(Grunhaus& Horwitz，1992)。
一般說來，腺病毒基因轉移系統是基于重組的、工程化的腺病毒，因缺失其部分基因組例如E1而使之成為復制功能不全的，并且仍保留其感染能力。當腺病毒基因組中還有另外的缺失時，編碼更大的外來蛋白質的序列可被表達。例如，E1和E3區均有缺失的腺病毒能夠攜帶達10Kb的外源DNA，并可以在293細胞中生長至高滴度(Stratford-Perricaudet and Perricaudet，1991a)。令人驚奇的是，也有關于在腺病毒感染之后持續表達轉基因的報導。
近年，已作為一種介導向真核細胞和整體動物中轉移基因的手段，研究了腺病毒介導的基因轉移。例如，在治療有罕見的隱性遺傳性疾病鳥氨酸轉氨甲酰酶(OTC)缺陷的小鼠中，發現可使用腺病毒構建體提供正常的OTC酶。遺憾的是，在17例中只有4例實現了OTC的正常水平表達(Stratford-Perricaudet et al.1991b)。因此，大多數小鼠的缺陷只得到部分糾正，并且沒有導致生理或表型改變。因此這些類型的結果難于鼓勵在腫瘤治療中使用腺病毒載體。
使用腺病毒向cotton大鼠的肺上皮中轉移節性纖維化跨膜轉導調節蛋白(CFTR)的嘗試也已取得了部分成功，但還不能評定被轉移的基因在動物上皮中的生物學活性(Rosenfeld等.，1992)。這些研究再次證明了基因轉移和CFTR蛋白質在肺呼吸道細胞中的表達，但沒有顯示生理學效應。Rosenfeld等人(Science，1991)證明了α1-抗胰蛋白酶的肺內表達，但也沒有顯示生理學效應。事實上，他們推測所觀察到的表達水平只是為保護人肺細胞所需水平的大約2％，即遠低了發揮生理學效應所需的水平。
經門脈內注射將人α1抗胰蛋白酶基因導入到正常大鼠的肝臟中，其被表達并使被導入的人蛋白質分泌到這些大鼠的血漿中(Jaffe et al.，1992)。然而，所獲得的產物水平不足以帶來治療價值。
這些結果不能證明腺病毒可以指導蛋白質在重組體細胞中達到足以發揮生理學作用的表達，因此也沒有提示腺病毒系統在用于腫瘤治療方面的適用性。再者，在本發明之前，認為p53不能被摻入到包裝細胞中，如用以制備腺病毒的細胞中(因其會產生毒性)。因為腺病毒的E1B與p53結合，所以認為這也是不可能合用腺病毒和p53技術的另一個基因。
作為表達構建體的其他病毒載體可利用其他病毒載體作為本發明中的表達構建體。可使用衍生于病毒如牛痘病毒(Ridgeway，1988；Baichwal and Sugden，1986；Couparet al.，1988)、腺相關病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal andSugden，1986；Hermonat and Muzycska，1984)和皰疹病毒的載體。它們為各種哺乳動物細胞提供幾種有吸引力的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal and Sugden，1986；Coupar et al.，1988；Horwich et al.，1990)。
隨著目前對缺陷型乙型肝類病毒的了解，已對不同的病毒序列的結構-功能關系有了新的認識。體外研究顯示，既使缺失高達其基因組的80％，病毒仍保留輔助病毒依賴性包裝和反轉錄能力(Horwich et al.，1990)。這提示大部分基因組都可被外來遺傳材料所取代。趨肝性和持久性(整合)是肝導向性基因轉移的特別有吸引力的性質。最近Chang等人將氯霉素乙酰轉移酶(CAT)基因導入鴨乙型肝類病毒基因組以代替聚合酶、表面和前表面編碼序列。將其與野生型病毒共轉染到鳥肝細胞瘤細胞系中。使用含有高滴度重組病毒的培養基感染初級鴨系肝細胞。轉染后檢測到穩定地CAT基因表達至少24天(Chang et al.，1991)。
C.基因輸送的替代方法為了實現p53構建體的表達，必須將表達載體輸送到細胞中。如上所述，遞送的優選機制是將表達載體包裹在感染性腺病毒顆粒中并通過病毒感染實現之。
本發明還包括幾種向培養的哺乳動物細胞中轉移表達載體的非病毒方法。這些方法包括磷酸鈣沉淀法(Graham and Van Der Eb，1973；Chen and Okayama，1987；Rippe et al.，1990)、DEAE-葡聚糖法(Copal，1985)、電穿孔(Tur-Kaspa et al.，1986；Potter et al.，1984)、直接微量注射(Harland and Weintraub，et al.，1985)、裝載DNA的脂質體法(Nicolau and Sene，1982；Fraley et al.，1979)、脂轉染胺試劑-DNA復合物法、細胞超聲處理法(Fechheimer et al.，1987)、使用高速度微粒的基因轟擊法(Yang et al.，1990)、聚陽離子法(Boussif etal.，1995)和受體介導的轉染法(Wu and Wu，1987；Wu and Wu，1988)。其中有些技術可成功地適用于體內、離體或體外應用。
在本發明的一個實施方案中，腺病毒表達載體可簡單地由裸重組載體組成。可用上文提到任何一種物理或化學可透過細胞膜的方法完成構建體的轉移。例如，Dubensky等人(1984)將多瘤病毒DNA以CaPO4沉淀物的形式注射到成年和新生小鼠的肝和脾臟中，證明了病毒可主動復制并造成急性感染。Benvenisty和Neshif(1986)也證明，直接腹腔內注射CaPO4淀淀的質粒導致轉染基因的表達。可以預見，也可以用相似方法體內轉移編碼p53構建體的DNA。
本發明向細胞內轉移裸DNA表達載體的另一個實施方案可包括顆粒轟擊。這種方法取決于將DNA包被的微粒加速到一定的高速度使之透過細胞膜并在不殺死細胞的情況下進入細胞的能力(Kleim et al.，1987)。已發展了幾種加速小顆粒的裝置。一種這類裝置依賴于高電壓放電以產生可提供動力的電流(Yang et al.，1990)。所用的微粒由生物學惰性物質如鎢或金微球組成。
體內轟擊的器官包括大鼠和小鼠的肝臟、皮膚和肌肉組織(Yang etal.，1990；Zelenin et al.，1991)。可能需要手術暴露組織或細胞，以消除槍和靶器官之間的干擾組織。可通過這種方法遞送編碼p53構建體的DNA。
在本發明的再一個實施方案中，可將表達載體截留在脂質體內。脂質體是以磷脂雙層膜和內部含水介導為特征的泡囊結構。多層脂質體具有由含水介質分離開的多個脂質層。當將磷脂懸浮于過量含水溶液中時它們即自動形成。在形成封閉的結構并截留脂質雙層之間的水和溶解的溶質之前，脂質成分進行自身重排(Ghosh and Bachhawat，1991)。本發明還試圖包括脂轉染胺試劑-DNA復合物。
脂質體介導的多核苷酸輸送和外來DNA的體外表達已獲得了很大成功。Wong等人(1980)證明了脂質體介導的送遞和外來DNA在培養的雞胚、Hela和肝癌細胞中表達的可行性。Nicolau等人(1987)成功地完成了于大鼠體內靜脈注射后脂質體介導的基因轉移。
在本發明的某些實施方案中，脂質體可與血細胞凝集病毒(HVJ)復合。這一現象表明有利于與細胞膜融合和促進脂質體包裹的DNA進入細胞(Kaneda et al.，1989)。在其他實施方案中，脂質體可與核非組蛋白染色體蛋白質(HMG-1)復合或用于與之聯合(Kato et al.，1991)。在另外的實施方案中，脂質體可與HVJ和HMG-1復合或用于與兩者結合。其中已將這樣的表達載體成功地用于在體外和體內轉移和表達多核苷酸，從而可應用于本發明。如在DNA構建體中利用噬菌體啟動子，亦可望在脂質體內包括這樣的啟動子和適當的噬菌體聚合酶。
向細胞內轉移表達載體的另一個機制是受體介導的送遞。這種方法的優點是幾乎在所有真核細胞中都可借助受體介導的細胞攝粒作用選擇性地攝入大分子。由于各種受體的細胞類型特異性分布，所以送遞可能是高度特異性的(Wu and Wu，1993)。受體介導的基因靶向載體一般由兩成分組成細胞受體特異性配體和DNA結合劑。已使用了幾種配體進行受體介導的基因轉移。鑒定最清楚的配體是脫唾液酸血清類粘蛋白(ASOR)(Wu and Wu，1981)和轉鐵蛋白(Wagner et al.，1993)。最近，已使用識別如ASOR的相同受體的合成的神經糖蛋白作為基因送遞載體(Ferkol et al.，1193；Perales et al.，1994)也已使用表皮生長因子(EGF)向鱗狀癌細胞送遞基因(Myers，EPO 0273085)。
在其他實施方案中，送遞載體可包括配體和脂質體。例如。Nicolau等人(1987)利用摻入到脂質體中的乳糖基神經酰胺(一種有末端半乳擴的脫唾液酸神經節苷酯)，并觀察到肝細胞內胰島素基因攝入的增加。因此，也可使用有或沒有脂質體的任何數目的受體-配體系統，將腺病毒表達載體特異地送遞到不同類型的細胞如肺、表皮或腫瘤細胞中。例如可使用表皮生長因子(EGF)作為在表現下調EGF受體的許多腫瘤細胞中介導p53構建體送遞的受體。可使用甘露糖將其導向肝細胞上的甘露糖受體。另外，同樣也可使用抗CD5(CLL)、CD22(淋巴瘤)、CD25(T細胞白血病)及MAA(黑素瘤)的抗體作為導向部分。
在某些實施方案中，可在離體條件下更容易地完成基因轉移。離體基因治療是指從動物體內分離細胞，于體外向細胞內送遞多核苷酸，然后將經過修飾的細胞回輸到動物體內。其可包括從動物體內手術除去組織/器官細胞和組織的初級培養物。Anderson等人(美國專利5,399,346)公開了離體治療方法。在離體培養期間，表達載體可表達p53構建體。最后，可將細胞重新導入原動物體內，或借助下述以醫學上可接受的形式投用于不同的動物體內。
D.藥物組合物和給藥途徑在考慮到根據本發明的腺病毒表達載體的臨床應用時，有必要制備作為適于所需應用之藥物組合物的復合物。這一般包括制備基本上沒有熱原以及其任對人或動物有害的雜質的藥物組合物。另外一般可期望利用適當的鹽和緩沖液使復合物更穩定并有利于靶細胞對復合物的攝入。
本發明的含水組合物包括溶解或分散于醫藥上可接受的載體或含水介質中的有效量的表達載體。這樣的組合物也稱為接種體。術語“醫藥上或藥理學上可接受的”是指當投用于動物或人體時不產生有害的、變應性的或其他不希望有的反應的分子單位和組合物。本文所說的“醫藥上可接受的載體”包括任何和所有溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌和抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑等。在藥物活性物質中使用這些介質和制劑是本領域已知的。除了與活性不相容者外，任何常規介質或制劑均可用于治療組合物中。也可以在組合物中摻入輔助活性成分。
可以在適合與表面活性劑如羥丙基纖維素混合的水中制備作為游離堿或藥學上可接受的鹽的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液態聚乙二醇、其混合物及油中制備分散體。在常規儲存和使用條件下，這些制劑含有阻止微生物生長的防腐劑。
本發明的表達載體和送遞載體可包括傳統的藥物制劑。可通過任何常規途徑投用本發明的治療組合物，只要能通過該途徑使靶組織得到即可。其中包括口服、含服、直腸、陰道和局部給藥。另外，也可通過原位、皮內、眼內、皮下、肌肉內、腹腔內或靜脈內注射給藥。正常情況下，其可作為包括生理學上可接受的載體、緩沖劑或其他賦形劑的醫藥上可接受的組合物給藥。
本發明的治療組合物可優選以可注射的組合物的形式，如溶液或懸浮液形式給藥；也可以固體形式存在，在注射前制成水溶液或懸浮液。這些制劑可以是乳化的。用于這些目的的典型組合物包括某種藥學上可接受的載體。例如，組合物可含有溶于每毫升磷酸鹽緩沖鹽水中的10mg、25mg、50mg或多達100mg的人血清白蛋白。其他藥學上可接受的載體包括水溶液、無毒性賦形劑，其中包括鹽、防腐劑、緩沖劑等。無毒性賦形劑的例子包括聚乙二醇、丙二醇、植物油及可注射的有機酯例如油酸乙酯。含水載體包括水、醇/水溶液、鹽水溶液、胃腸道外載體如氯化鈉、林格氏右旋糖等。靜脈內載體包括液體和營養添加劑。防腐劑包括抗微生物劑、抗氧劑、絡合劑及惰性氣體。按照已知的參數調整藥物組合物中各種成分的pH和準確濃度。
其他配方適用于口服給藥。口服配方包括例如藥品級甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等典型的賦形劑。組合物可以是溶液、懸液、片劑、藥丸、膠囊、緩釋配方或粉末等劑型。當局部給藥時，劑型可以是霜劑、軟膏、油膏、液體或噴霧劑。
基于預期的使用目的確定治療劑的有效量，例如用于(i)抑制腫瘤細胞增殖或(ii)排除腫瘤細胞。術語“單位劑量”是指適用于治療對象的物理上分離的單位，每個單位均含有經過計算足以產生所需的上述反應的、與其給藥途徑和治療方式相關的預定量的組合物。根據治療次數和單位劑量，給藥量取決于待治療之對象的狀況及所期望的保護作用。治療組合物的精確量也取決于醫生的判斷和病人的個體差異。
在某些實施方案中，可能希望向病人提供可連續給藥的治療組合物。就靜脈內或動脈內途徑來說，可借用于點滴系統完成之。就局部應用來說，可利用反復施用法。對于各種方法，均可使用緩釋配方以在長時間內提供有限但恒定量的治療劑。為了內部應用，最好在局部區域上進行連續輸注。在某些情況下可于手術后經導管插入進行輸注，然后連續投用治療劑。由臨床醫生根據特定病人的情況來選定輸注時間，但時間一般為從約1-2小時到約2-6小時，約6-10小時，約10-24小時，約1-2天，約1-2周或更長時間。一般說來，通過連續輸注投用的治療組合物的劑量將相當于單一或多次注射給定的、根據注射時間調整的劑量。但相信可通過輸注達到較高的劑量。
治療SCCHN的臨床方案已發展了有利于使用下文實施例中所述的腺病毒構建體治療SCCHN疾病的臨床方案。按照這個方案，選擇有頭頸部鱗狀細胞癌病史的病人。病人以前可能但不一定接受過化學、放射或基因治療。病人最好有足夠的骨髓功能(限定為外周血絕對粒細胞數＞2,000/mm3，血小板數為100,000/mm2)，足夠的肝功能(膽紅素≤1.5mg/dl)以及足夠的腎功能(肌酸酐＜1.5mg/dl)。
該方案要求通過腫瘤內注射單劑投用含有106至109p53腺病毒表達構建體之感染性顆粒的藥物組合物。對于≥4cm的腫瘤，將使用4-10ml體積的制劑(最好10ml)，而對于＜4cm的腫溜，則投用1-3ml(優選3ml)。也可以0.1-0.5ml體積在相隔約1cm左右的部位進行多部位注射。
療程約為兩周內進行6次注射。可根據臨床醫生的決定，每兩周連續的6次治療，或者以較小頻率(每月、每兩個月、每季度等)給藥。
對于適合于外科切除的病人，可按上述方法至少給予兩個連續的兩周療程的治療。在完成第二(或更多個如第三、第四、第五、第六、第七、第八等)療程的一周內，病人接受外科切除手術。在封閉切口前，向手術部位送遞10ml含有p53腺病毒表達構建體的藥物組合物(106-109感染性顆粒)，并使之保持接觸至少60分鐘。封閉傷口并在其中放入引流導管。在手術后第三天通過引流管再投用10ml藥物組合物并使之與手術床保持接觸至少2小時。然后抽吸除去，并在臨床上的適當時間去掉引流。
人工和天然體腔的處理復發性SCCHN的基本來源之一是腫瘤切除后仍在原發部位以及局部殘留的顯微鏡下可見的病變。此外，當天然體腔移值有微量腫瘤細胞時也會出現類似情況。有效地治療這樣的細微病變應是腫瘤治療方面的一個重要進步。
因此，在某些實施方案中，可手術切除腫瘤，造成一個“腔”。在外科手術時及手術之后(定期地或連續地)，向體腔內投用本發明的治療組合物。實質上就是“局部”處理腔的表面。組合物的體積應足以保證腔的整個表面與表達構建體接觸。
在一個實施方案中，給藥僅為向腫瘤切除后形成的腔內注射治療組合物。在另一個實施方案中，可以通過海綿、試子或其他裝置進行機械施用。這些方法均可在去除腫瘤之后及初次外科手術期間使用。在另一個實施方案中，在封閉手術切口部位之前將導管插入腔內。然后連續向腔內灌注一定時間。
這種治療方法的另一種形式是，在口、咽、食管、喉、氣管、胸腔、腹腔或包括膀胱、結腸或其他內臟器官在內的空器官腔等天然體腔內定向“局部”施用治療組合物。在這種情況下，腔中可能有或沒有明顯的原發性腫瘤。定向治療腔中的微小病變，但如果預先沒有除去可能存在于該腔內的原發性腫瘤塊或惡性病變前損傷，則有時也可能對其發揮作用。另外，可以利用各種方法在這些內臟器官或腔表面進行“局部施用”。例如，可以用溶液簡單地嗽口來進行咽部口腔施用。但在喉和氣管內局部治療時可能需要使用內窺鏡觀察并局部送遞治療組合物。膀胱或結腸粘膜等內臟器官可能需要用內導管灌注，或再次用內窺鏡直接觀察。對于胸腔和腹腔，可使用內導管或外科方法接近這些區域。
給藥后監測p53表達本發明的另一個方面包括在投用治療組合物后監測p53表達。因為不能觀察到微小腫瘤的破壞，所以確定靶部位是否已有效地接觸到表達構建體是很重要的。為此，可鑒定其中表達構建體主動產生p53產物的細胞。但重要的是，能夠區分外源性p53和存在于治療區域中的腫瘤和非腫瘤細胞中的p53。用微量示蹤元素標記外源性p53將為該分子而非內源性等同體的表達提供明確的證據。
一種這樣的示蹤元素是由PLAG biosystem提供的(Hopp et al.，1988)。FLAG多肽是一種八肽(AspTyrLysAspAspAspAspLys)，其小體積不能破壞所送遞的基因治療蛋白質的表達。使用抗FLAG蛋白質抗體跟蹤FLAG和感興趣的蛋白質的共表達。
也可使其他免疫學標志系統，例如6XHis系統(Qiagen)。為此，可使用任何線性抗原表位產生與p53的融合蛋白質，只要(i)沒有因融合而損害抗原表位的免疫學完整性，(ii)沒有因融合而損害p53的功能完整性即可。
E.聯合治療方案腫瘤細胞對DNA損傷劑的抗性代表了臨床腫瘤學一大問題。當前腫瘤研究的一個目的是找到通過與基因治療合用來改善化療和放療效果的途徑。例如，當借助逆轉錄載體系統將單純性皰疹胸苷激酶(HS-tK)基因送遞到腦中時，成功地誘導了對抗病毒劑更昔洛韋的敏感性(Culver，et al.，1992)。在本發明中，試圖包括與化學或放射治療干預聯合使用的p53治療。
為了使用本發明的方法和組合物殺死細胞，例如惡性或轉移細胞，一般可使“靶”細胞與表達載體和至少一種DNA損傷因子接觸。這些組合物應以殺死或抑制細胞的合并的有效量提供。這種方法可包括使細胞與表達載體及DNA損傷劑或因子在同一時間接觸。為此，使細胞與包括兩種因子的單一組合物或藥物制劑接觸，或者使細胞同時與兩種不同的組合物或制劑接觸，其中一種組合物包括p53表達載體，而另一種包括DNA損傷劑。
另外，p53治療也可以在DNA損傷劑治療之前或之后，其間隔時間從幾分鐘到幾周。在將DNA損傷劑和p53表達載體分別施用于細胞的實施方案中，一般應確保間隔時間不超過各自的送遞時間，這樣可使DNA損傷劑和表達載體仍能夠對細胞發揮聯合作用。在這種情況下，可期望使細胞與兩種藥劑在彼此給藥的大約6小時至1周內，較好在大約24-72小時內，最好以僅僅約48小時的延遲時間接觸。在某些情況下，希望延長治療時間，但各自的給藥間隔時間不超過幾天(2，3，4，5，6或7天)至幾周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
還希望一次以上投用p53構建體或DNA損傷劑。可利用各種組合方式，其中p53是“A”，DNA損傷劑是“B”A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BB/A/AA/B/BA/B/B/BB/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/BB/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A B/A/A/B為了殺死細胞，以有效殺死細胞的合并劑量將兩種藥劑送遞給細胞。
DNA損傷劑或因子在本文中限定為當施用于細胞時誘導DNA損傷的任何化合物或治療方法。這樣的制劑和因子包括誘導DNA損傷的幅射和波，例如γ幅射，X射線，UV幅射，微波，電發射等。各種化學化合物，也描述為“化學治療劑”，有誘導DNA損傷的功能，并可用于本文公開的聯合治療方法中。預期使用的化學治療劑包括例如阿霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、麥鬼臼毒吡喃糖苷(VP-16)、喜樹堿、放線菌素D、絲裂霉素C、順鉑(CDDP)和過氧化氫。本發明還包括聯合使用一種或多種DNA損傷劑，包括基于幅射的或真正的化合物，例如X射線和順鉑或使用順鉑與表鬼臼毒吡喃糖苷。在某些實施方案中，特別優選的是聯合使用順鉑和p53表達載體。
在按照本發明的腫瘤治療中，可使腫瘤細胞除與表達載體接觸外還與DNA損傷因子接觸。為此可用DNA損傷性幅射如X射線、UV光、g射線或微波照射面部腫瘤部位。另外，也可給病人投用治療有效量的含有DNA損傷化合物如阿霉素、5-氟尿嘧啶、表鬼臼素吡喃糖苷、喜樹堿、放線菌素D、絲裂霉素C，或更好是順鉑的藥物組合物，以使腫瘤細胞與DNA損傷劑接觸。可以制備DNA損傷劑并與上述p53表達載體合并，作為聯合治療組合物或試劑盒。
這里設計并顯示直接交聯多核苷酸特別是DNA的因子，以實現DNA損傷，產生協同抗腫瘤的組合。可使用順鉑和其他DNA烷化劑等藥劑。已將順鉑廣泛用于治療腫瘤，臨床上所用有效劑量為20mg/m2，每三周用5天，共3個療程。順鉑口服不吸收，因此必須通過靜脈內、皮下、腫瘤內或腹腔內送遞。
損傷DNA的藥劑還包括干擾DNA復制、有絲分裂和染色體分離的化合物。這樣的化學治療化合物包括阿霉素、表鬼臼素吡喃糖苷、維拉帕米、鬼臼毒素等。廣泛用于臨床治療腫瘤，通過靜脈內注射投用這些化合物，阿霉素的劑量范圍為25-75mg/m2，間隔期為21天；表鬼臼素吡喃糖苷的靜脈內劑量為35-50mg/m2，或口服雙倍靜脈內給藥劑量。
破壞多核苷酸前體和亞單位的合成和精確性的藥劑也導致DNA損傷。為此已發展了許多這樣的多核苷酸前體。特別有用的是已進行了廣泛試驗并容易得到的藥劑。因為5-氟尿嘧啶(5-FU)等藥劑優先作用于惡性增生組織，所以這種藥劑特別適用于定向殺傷腫瘤細胞。雖然毒性很大的5-FU可以在許多載體中應用(包括局部應用)，但通常使用靜脈內給藥，劑量為3-15mg/kg/天。
引起DNA損傷并已廣泛使用的其他因子包括已知的γ射線、X射線和/或向腫瘤細胞定向送遞的放射性同位素。還希望包括其他形式的DNA損傷因子如微波和紫外照射。很可能所有的這些因子都影響廣泛的DNA損傷或DNA前體、復制及DNA修復，并影響染色體的組裝和保留。X射線長期使用(3-4周)的每日劑量為50至200倫琴，單一劑量為2000到6000倫琴。放射性同位素的劑量范圍很寬，并取決于同位素的半壽期、發出幅射的的強度與類型和惡性細胞攝入。
有關問題技術人員可參見“Remington藥物科學”第15版，第33章，特別是624-652頁。依據被治療的病人的條件可適當改動劑量。負責給藥的人在任何情況下都要針對具體病人確定適當的劑量。另外，在給人用藥時，制劑應符合FDA對生物制品所規定的無菌性、熱原性及一般安全性要求。
發明人提議，向有p53相關腫瘤的病人體內區域性送遞p53表達載體將是為對抗臨床疾病而送遞治療有效基因的有效方法。同樣，也可以對病人身體特定的、受累的區域定向施加化學或放射治療。另外，在某些情況下，例如在已發生了廣泛轉移的情況下，全身送遞表達載體或DNA損傷劑可能是適合的。
也已證明細胞因子治療是聯合治療的有效部分。聯合治療也可利用多種不同的細胞因子。細胞因子的例子包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、TGF-β、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNFα、TNFβ、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDFG、IFN-α、IFN-β、IFN-γ。按照下述標準給藥方法投用細胞因子，給藥方法應與病人的狀況及細胞因子的相對毒性等臨床指征一致。
除了合用p53定向療法和化學、放射及細胞因子療法外，還期望合用其他基因療法。例如，同時定向K-ras和p53突變可改善抗腫瘤治療效果。可以想象以這種方式定向送遞其他腫瘤相關基因，例如p21、p16、p27、E2F、Dp基因家族、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEM-II、BRCA1、VHL、FCC、MCC，其他ras分子，myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、trk、ret、gsp、hst、bcl和abl。也可能希望聯合使用p53治療和基于抗體的基因治療，包括使用單鏈抗體構建體(其中抗體可與上述任何分子結合)，或聯合使用編碼以上列出的一種或多種細胞因子的基因。聯合使用p53與涉及細胞凋亡過程的其他基因如腺病毒E1A、Bax、Bd-Xs等也可能是有利的。
F、試劑盒可將抑制腫瘤細胞增殖所需的基本材料和試劑組裝在試劑盒中。其一般將包括選擇的腺病毒表達載體。還可包括用于表達載體復制的和用于這種復制的宿主細胞的各種培養基。這樣的試劑盒將包括各種試劑的不同容器。
當以一種或多種液體溶液形式提供試劑盒的成分時，溶液最好是水溶液，特別是無菌水溶液。為了體內使用，可將表達載體配制成藥學上可接受的可注射組合物。在這種情況下，容器可以是吸入器、注射器、吸移管、滴眼器或其他類似裝置，可從容器中將配制品施用于身體的患區例如肺，注射到動物體內，甚至與試劑盒的其他成分混合施用。
也可以以干燥的或凍干的形式提供試劑盒的成分。當以干燥的形式提供試劑或成分時，一般可加入適當的溶劑來重新溶解。可以想到，也可將溶劑加在另一個容器內并提供。
本發明的試劑盒典型地還包括一個容納為了市場出售而密封的小瓶的工具，例如其中放有所需小瓶的注射或吹氣成模的塑料容器。不管容器的數目或類型，本發明的試劑盒還都可能包括或裝有一個幫助注射/給藥或在動物體內置入最終的復合組合物的裝置。這樣的裝置可以是吸入器、注射器、吸移管、鑷子、計量匙、滴眼器或任何這類醫學上批準使用的送遞工具。
G.顯微腫瘤種植和殘留病變的動物模型本發明的另一個方面包括建立用于分析顯微殘留腫瘤和腫瘤細胞在體腔內的顯微植入的動物模型。本文所說的“腫瘤”可以指單個細胞或多細胞腫瘤塊。在顯微病變中，“腫瘤”將由一個或少數幾個肉眼不能觀察到的瘤細胞組成。
本文所述的動物模型是特別有利地模擬(i)頭和頸部腫瘤病人的手術后環境，特別是在疾病的后期階段，以及(ii)已建立了顯微腫瘤的病人的體腔。與其他腫瘤動物模型相似，該模型是經在動物體內接種腫瘤細胞而得到的。但區別在于在皮下造成一個生理學上相當于天然體腔或因手術切除瘤塊而產生之手術后空腔的袋。
本發明以裸鼠作為模型動物舉例。但實質上根據本發明，任何動物都可利用。特別優選的動物是常規用于實驗室研究的小的哺乳動物。最好是嚙齒類動物，如小鼠、大鼠、豚鼠及倉鼠。兔子也是優選的實驗動物。選擇動物的標準在很大程度上將取決于研究人員的特別愛好。
第一步是在實驗動物身上造成一個組織瓣。術語“組織瓣”是指動物身上接觸到靶組織的肉中的任何切割口。一般優選的切割部位是在動物的背部側翼，因為這代表了一個容易接近的部位。但應明確的是，可以在動物身上的其他位點切開，并且可依據例如所研究的特殊類型的治療方法等因素來選擇組織部位。
一旦暴露出靶組織，便使單個的或微小腫瘤中的癌細胞與組織部位接觸。向組織部位內種植瘤細胞的最方便的方式是將含有細胞的組織培養基的懸液施于暴露的組織上。可以使用無菌吸移管或其他方便的涂敷器簡單地進行瘤細胞施加。一般該過程在無菌條件下進行。
在一個實施方案中，在裸鼠的暴露的組織瓣內接種2.5×106個SCCHN細胞。為此目的，本領域技術人員將能很容易地確定細胞的適當數目。細胞數目將取決于例如動物大小、切口大小、瘤細胞本身的復制能力、腫瘤生長的時間、待試驗的抗腫瘤治療等多種因素。雖然建立適于特定類型腫瘤的最佳模型系統可能需要對所投用的細胞數目作出某些判斷，但這并不代表要進行過多的實驗摸索。動物試驗領域中的技術人員會理解到所需的這種最佳化條件。
例如，可以向動物輸送不同數目的細胞并在重新封閉組織瓣后監測細胞生長，以進行初步研究。自然，投予的細胞數目較大，則將形成顯微殘留腫瘤細胞的較大群體。
本研究中使用褥式縫線有效地封閉組織瓣。但本領域技術人員可以根據預期的特殊應用方式使用粘結、鉗夾、縫合等各種常規方法來封閉切口。
H.實施例下列實施例只是舉例說明某些特定實施方案，并且不應以任何方式構成對本發明范圍的限制。
實施例1通過重組腺病毒導入野生型p53基因抑制人頭和頸部腫瘤細胞生長材料和方法細胞系和培養條件。人SCCHN細胞系Tu-138和Tu-177均由M.D.Anderson腫瘤中心的頭頸外科部建立。Tu-138和Tu-177是分別由齦唇中度分化的鱗癌和咽部分化不良的鱗癌建立的。兩細胞系通過初級外植塊技術培育的，并在無胸腺裸鼠和SCID小鼠中是細胞角蛋白陽性和腫瘤原性的。這些細胞生長于添加有10％熱失活胎牛血清(FBS)和青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養基中。
重組腺病毒制備和感染。重組p53腺病毒(Ad5CMV-p53)(Zhanget al.，1994)含有插入到經修飾的5型腺病毒(Ad5)之E1缺失區域中的巨細胞病毒(CMV)啟動子、野生型p53cDNA，和小基因盒中的SV 40聚腺苷酸化信號。在293細胞中增殖病毒原種。感染后36-40小時收獲細胞，離心，重新懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中、裂解細胞，并經CsC1梯度純化除去細胞碎片。透析濃縮的病毒，分成若干等份并于-80℃保存。感染如下進行將DMEM/F12培養基和2％FBS中的病毒加于細胞單層上，恒定攪拌下37℃培養細胞60分鐘，然后加入完全培養基(DMEM/F12/10％FBS)并將細胞37℃保溫預定長的時間。
Northern印跡分析。用酸-硫氰酸胍法(Chomozynski and Aacchi，1987)分離總RNA。對20μg總RNA進行Northern分析。在5×SSC/5×Denhardt′s溶液/0.5％SDS/變性鮭魚精子DNA(20μg/ml)中以隨機引物方法使膜與p53cDNA探針雜交。剝離膜并也用RNA上樣對照的GAPDHcDNA探查。用密度儀(Molecular Dynamics Inc，Sunnyvale，CA)測定表達的p53的相對量。
Western印跡分析。感染后24小時在PIPA緩沖液(15mM NaCl、1.0％NP-40、0.5％DOC、0.1％SDS、50mM Tris，pH8.0)中超聲處理細胞5秒鐘，以制備總細胞溶胞產物。對樣品中的50μg蛋白質進行10％SDS-PAGE并轉移到Hybond-ECL膜(Amersham)上。用Blotto/Tween(5％無脂干奶粉、0.2％Tween 20，0.02％疊氮鈉(在PBS中))封閉膜并用第一抗體即小鼠抗人p53單克隆抗體PAb1801和小鼠抗人β肌動蛋白單克隆抗體(Amersham)，以及第二抗體即辣過氧化物酶結合的羊抗小鼠IgG(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)進行探測。按制造商提出的方法處理膜并顯色。
免疫組織化學分析。用3.8％甲醛固定被感染的細胞單層并用甲醇中的3％H2O2處理5分鐘。使用Vectastain Elite試劑盒(Vector，Burlingame，CA)進行免疫組化染色。所用的第一抗體是抗p53抗體PAb1801，第二抗體是抗生物素蛋白標記的抗小鼠IgG(Vector)。使用生物素化的辣根過氧化物酶ABC復合物試劑檢測抗原-抗體復合物。各免疫染色實驗中使用吸附前對照。然后使用Harris蘇木精(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)對細胞進行復染。
細胞生長檢測法。以2×104細胞/ml的密度將細胞一式三份鋪敷在6孔板中。用野生型(Ad5CMV-p53)或復制缺陷性腺病毒(作為對照)感染細胞。每2天收獲細胞，計數并用錐蟲蘭排除法確定存活率。
體內腫瘤生長抑制。在限定的無病原體環境中，檢測Ad5CMV-p53對裸鼠體內已建立的皮下腫瘤結節的影響。實驗是由動物保護和利用及重組DNA研究學會委員會審查并批準的。簡單地說，在吸入乙酰丙嗪/氯胺酮麻醉后，提起各動物身上的三個分立的皮下瓣，并使用鈍針頭皮下注射懸浮在150ml完全培養基中的5×106個細胞；細胞保留在帶水平褥式縫線的袋內。每個細胞系使用四只動物。4天后，再次麻醉動物并提起皮瓣，以送遞100ml 1)在右前瓣注入的Ad5CMV-p53(50MOI)；2)在右后瓣中注入復制缺陷性病毒(50MOI)；以及3)在左后瓣中注入的單獨的輸入介質。在給藥治療前所有注射部位都發展了皮下可見的和可觸到的結節。每天觀察動物并在第20天處死。按計算橫截直徑之乘積的方根方法計算平均腫瘤直徑，按球形估算出體內腫瘤體積。處死動物后，用千分尺測量切除之腫瘤的三維大小，以確定腫瘤體積。用非參數Friedman′s 2向ANOVA試驗法檢驗樣品之平均值間的差異顯著性；使用SPSS/PC+軟件包(SPSS Inc.，Chicago，I1)。
結果SCCHN細胞的腺病毒感染。用表達大腸桿菌β-gal基因的腺病毒感染T-138和Tu-177細胞，以確定這些細胞的最佳腺病毒轉導的條件。X-gal染色后計算藍色細胞的數目以估計轉導效率。被感染細胞的數目和所用的腺病毒顆粒的數目之間似乎存在線性關系。接種單一劑量100MOIβ-gal腺病毒的細胞表現60％為蘭色細胞(圖1)，而經多次感染則這一比例改善為100％。該載體在SCCHN細胞中的轉導效率與先前檢查的其他細胞系有很大差異與30至50MOI β-gal腺病毒保溫后，Hela、HepG2、LM2和人非小細胞肺癌細胞系顯示有97％至100％的感染效率(Zhang et al.，1994)。
外源p53mRNA在腺病毒感染的SCCHN細胞中的表達。選擇兩個人SCCHN細胞系進行這項研究兩細胞系Tu-138和Tu-177均具有突變的p53基因。使用最近創制的重組野生型p53腺病毒，即Ad5CMV-p53感染Tu-138和Tu-177細胞。感染后24小時，分離總RNA并進行Northern印跡分析。用被轉化的初級人胚腎細胞系293作為陽性對照，因為其可高水平表達p53基因產物，而以具有純合p53基因缺失的淋巴瘤細胞系K562作為陰性對照。所檢測到的模擬感染之細胞和復制缺陷型腺病毒dl312感染之細胞樣品中的2.8Kb內源性p53mRNA的水平相似。存在于Ad5CMV-p53之細胞內的內源性1.9Kb p53mRNA水平高達10倍，表明內源性p53cDNA被成功地轉導到這些細胞中，并得到有效地轉錄。令人感興趣的是，這些細胞中內源性p53mRNA的水平比實驗對照中的水平高5倍。Northern印跡沒有顯示Ad5CMV-p53(DNA)污染RNA的證據。
p53蛋白質在腺病毒感染的SCCHN細胞中的表達。進行Western印跡分析以比較p53mRNA水平與所產生的p53蛋白質的量。在從除K562細胞外的所有樣品中分離的細胞提取物中觀察到由單特異性抗p53抗體pAb1801識別的p53帶。細胞系293顯示有高水平的p53蛋白質。從模擬感染的Tu-138和Tu-177細胞中分離的樣品表現低水平的p53蛋白質。那些dl312腺病毒感染的細胞系中p53表達水平是相似的。在Ad5CMV-p53感染的細胞中測得的p53抗原的水平明顯高于兩細胞系中內源性突變蛋白質的水平。這一結果證明，由Ad5CMV-p53感染的細胞中產生的內源性p53mRNA被有效地轉譯成免疫反應性p53蛋白質。此外，對Ad5CMV-p53感染的細胞所作免疫組化分析提示了p53蛋白質的特征性核染色，而模擬感染的細胞則沒有顯示相似的染色，盡管這些細胞中也存在p53蛋白質。這種不能檢測到蛋白質的原因，可能是由于檢測方法的敏感性不足。
外源性p53對SCCHN細胞體外生長的影響。用對照病毒dl312感染的細胞生長速率與模擬感染之細胞的生長速率相似，而Ad5CMV-p53感染的Tu-138(圖2A)和Tu-177(圖2B)細胞的生長則受到顯著抑制。感染后24小時，發生了明顯的形態學改變，部分細胞群體圍繞起來并且它們的外膜形成皰。這些改變是可預測的構成編程性細胞死亡的一系列組織學過程的一部分。對Tu-138的影響比Tu-177細胞更大。用復制缺陷型腺病毒dl312感染的細胞證明了沒有細胞形態學異常的正常生長特征。生長試驗在4次重復的實驗中是可重現的。
體內腫瘤生長的抑制作用。各細胞系均用4只動物試驗。Tu-177組中的一只動物在第二次瓣手術和送遞治療藥物后死亡，估計是由于深度麻醉和繼后籠內交配引起損傷所致。尸體剖檢未發現轉移或全身性影響的證據。在動物的后側瓣上(即沒有接受Ad5CMV-p53的部位)見有適當大的腫瘤。在接受了Ad5CMV-p53的動物的右前瓣中未見明顯的腫瘤增大(p＜.04)。以前已在這些動物上確證Tu-177細胞生長速率較慢。早期殺死Tu-138組中的兩只動物，這是因為它們表現出生長迅速和對照腫瘤部位的潰瘍形成。在干預之前所有手術部位都出現了至少9mm3的損傷。表4中顯示了尸檢時所見的腫瘤體積。在Tu-177組中腫瘤體積沒有明顯的統計學差異，這可能反映樣本大小有限。
表4Ad5CMV-p53對裸鼠a腫瘤生長的影響
a以5×106細胞/瓣皮下注射細胞。處理后第20天測腫瘤大小。括號中的數字代表被測的動物數。
bAd5CMV-p53縮寫為p53；dl312為Ad5(dl312)的縮寫。
實施例2用p53腺病毒體內分子治療殘留的顯微頭和頸鱗狀細胞癌材料和方法細胞系和培養條件。所有確定的人SCCHN細胞系Tu-138、Tu-177、MDA 686-LN和MDA 886均在以前作過性質鑒定(Clayman etal.，1993；Sacks et al.，1988)。這些細胞生長在添加了10％熱滅活胎牛血清(FBS)和青霉素/鏈霉素的Dulbecco′s改良的Eagle′s培養基(DMEM/F12)中。
重組腺病毒制備和感染；細胞生長檢測；Western印跡分析。所有方法均已在實施例1中描述過。細胞生長試驗都按三份重復樣品進行。
用β-半乳糖苷酶腺病毒進行體內轉異。對O.C.T.冷凍組織切片進行標本的X-gal染色，以確定轉導效率。在冷PBS中洗8微米厚標本并于室溫下在0.5％戊二醛中固定5分鐘。然后用4℃PBS將玻片洗兩次，并在X-gal溶液(1.3mM MgCl2、15mM NaCl、44mM Hepes緩沖液(pH7.4)、3mM高鐵氰化鉀、3mM亞鐵氰化鉀、2％X-gal(溶于DMF))中保溫4小時。用蘇木精和伊紅復染。
免疫組織化學分析。將甲醛固定并石蠟包埋的體內動物實驗組織切成4-5μm厚度，于60℃干燥，脫蠟并用蒸餾水水合。然后用溶于蒸餾水中的0.5％皂苷處理切片并用蒸餾水淋洗幾次；用加在甲醇中的3％過氧化氫封閉內源性過氧化物酶活性，然后再用蒸餾水淋洗幾次。使用Sharp ModelR9M81微波爐(700瓦，2450MHz頻率)將切片在蒸餾水中微波照射3分鐘。冷卻后，換幾次蒸餾水洗切片并放在PBS中；使用如下所述的Hsa等人(1981)的抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復合物(ABC)方法進行免疫化學研究用正常馬血清封閉切片并于4℃下加兔抗人p53多克隆抗體(克隆OM-1，180(Signet Laboratories，Denham，MA)保溫過夜。然后用抗兔IgG Elite試劑盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)施加生物素化的抗兔IgG和ABC復合物，各保溫45分鐘。使用溶于含0.01％過氧化氫之PBS(pH7.6)中的0.5％DAB顯現免疫染色反應結果，用0.01％甲苯胺蘭復染，脫水，清洗并固定在Permount中。為了確定免疫染色反應的特異性，使用如用于試驗樣品的同樣方法，對鱗狀細胞癌細胞系的組織培養物的已知陽性cytospin及陰性兔單克隆抗體對照進行免疫過氧化物酶染色。
體內腫瘤生長的抑制作用。該方法步驟同實施例1中所述。對所有手術切割部位進行病理學評估，并就全身性毒性進行尸檢分析。
結果外源性p53對體外SCCHN細胞生長的影響。實施例1描述了具有內源性突變p53之SCCHN細胞系中Ad5CMV-p53對細胞生長的體外抑制作用。本實施例是確定是否具有內源性野生型p53的SCCHN細胞系也受到相似的影響。還研究了Ad5CMV-p53對非惡性生長的成纖維細胞的作用。
本研究選用4個人SCCHN細胞系Tu-138和Tu-177具有突變的p53基因，而MDA 686-LN和886兩細胞系則是野生型p53基因純合性的。使用衍生于正常成纖維細胞贅疣衍生的核型正常且非腫瘤原性的成纖維細胞系作為非惡性對照細胞系。對照病毒dl312感染的細胞具有與模擬感染的細胞相似的生長速率，而Ad5CMV-p53感染腫瘤細胞的生長則受到顯著地抑制(圖3A、3B、3C和3D)。感染后24至48小時，所有腫瘤細胞都出現明顯可見的形態學改變，部分細胞群體環繞起來并且其外膜形成皰。這些構成可預見的編程性細胞死亡的一系列組織學過程的一部分。有內源性突變p53的細胞中比有野生型p53的細胞較早出現這種影響。復制缺陷性腺病毒dl312感染的細胞證明了沒有形態學異常的正常生長特征。生長檢測是可在四次重復實驗中再現的。
外源性p53蛋白質在腺病毒感染的正常成纖維細胞中的表達及其對生長速率的影響。此外，還研究了Ad5CMV-p53對核型正常且為非腫瘤原性的成纖維細胞系的影響。在建立初級腫瘤細胞系期間分離這些細胞。感染后24小時，進行Western印跡分析以比較不同類型的被感染細胞所產生之蛋白質的水平。在從所有Ad5CMV-p53感染之樣品中分離的細胞提取物中觀察到由單特異性抗p53抗體PAb1801識別的p53帶。如實施例1中已描述的，p53腺病毒感染的細胞系Tu-138在轉導后顯示出可產生高水平的p53蛋白質，并用作對照。模擬感染的和dl312感染的細胞中保持相似的p53表達水平。Ad5CMV-p53感染的成纖維細胞顯示有比對照細胞更高水平的p53蛋白質。這一結果表明，正如由免疫反應性p53蛋白質的產生所證明的p53基因被有效地轉譯到Ad5CMV-p53感染的正常成纖維細胞中。免疫組織化學分析進一步證明Ad5CMV-p53感染之成纖維細胞的cytospin的蛋白質表達和轉導效率。該成纖維細胞系表現有正常生長速率和形態學，而不依賴于外來干預(模擬、復制缺陷型病毒或Ad5CMV-p53)(圖4)。這些實驗重復進行兩次并且也在他正常人成纖維細胞系中得到驗證。
體內轉導效率。為了檢測體內基因轉移的效率，于分子或對照干預后72小時切開皮下瓣部位。用腺病毒β-半乳糖苷酶標志載體進行劑量-效應實驗，說明該模型中的劑量-效應轉導效率。用Ad5CMV-p53感染后4天進行免疫組化分析以進一步證實之。兩實驗組均表現出以前已在體外實驗中描述的(實施例1)體內劑量反應。在包括腦、肝、肺、心臟、腹腔內臟器官及皮膚在內的其他器官系統中，超過1010PFU的病毒劑量均沒有影響p53的表達。這些實驗舉例說明了病毒滴度與轉導效率之間的劑量-效應關系，以及被轉導的基因在所需的外科模型領域內達到廣泛暫時表達的可能性。
體內腫瘤生長的抑制作用。設計這些實驗以確定是否體內Ad5CMV-p53介導的基因轉移會影響植入到皮下瓣中之SCCHN的建立或生長。為此目的，造成一個顯微殘留病變模型。在該模型中，提起無胸腺雌性裸鼠身上的三個皮下瓣并吸移接種2.5×106個腫瘤細胞。不使腫瘤細胞形成結節(一般是在4天內出現)，而是在接種腫瘤細胞后48小時進行單劑量分子干預。以這種方式，雖然沒產生肉眼可見的腫瘤，但在手術部位形成顯微腫瘤細胞，供以模擬外科切除所有肉眼可見腫瘤后的臨床難題。腫瘤的發育與腫瘤細胞的數目、指定的移植時間，以及Ad5CMV-p53的劑量直接相關。在接受顯微移植的腫瘤細胞(2.5×106)并用108或更多噬斑形成單位(PFU)的Ad5CMV-p53處理的小鼠中，只有兩只有腫瘤發育，兩動物均植入了野生型p53細胞系(MDA 886-LN)。所有其他細胞系都未見腫瘤發育(表5)。這些實驗清楚地證明，如果與Ad5CMV-p53接觸，顯微腫瘤細胞的生長可在體內受到有效地抑制。在第12周末時對外科部位進行大體和組織學分析以估測腫瘤形成(在過多腫瘤負重的情況下則較早處死動物)。表5中總結了腫瘤定居的數據。
表5Ad5CMV-p53對SCCHN的顯微殘留病變模型中腫瘤發生能力的影響
對實驗動物的腫瘤切片進行免疫化學分析。該細胞系具有野生型內源性p53基因。用活的MDA 686-LN腫瘤沒有沒有明顯的基礎免疫染色(模擬感染)。107PFU Ad5CMV-p53表現有外周腫瘤壞死，同時在腫瘤的更中心部分出現免疫染色。108PFUAd5CMV-p53顯示腫瘤的總體壞死，在具有包括基質和淺肌層在內的表達蛋白質的多層的整個外科袋中見有免疫染色。109PFUAd5CMV-p53顯示出與108PFU Ad5CMV-p53相似的結果，但整個外科部位增加了外源性p53表達并且水腫顯著。
使用作為其自身內部對照的動物，即使在接種后用Ad5CMV-p53處理外科手術部位，移植4.0×106個更多個細胞與移植2.5×106個腫瘤細胞相比明顯地提高了皮下移植物的定居率(P＜0.01)。在Ad5CMV-p53干預之前使移植的細胞定居72或96小時，同樣也增加腫瘤發生。劑量反應實驗確定，108和109PFUAd5CMV-p53在抑制移植了98小時的2.5×106個細胞的腫瘤積存中是同樣有效的(圖6)。被移植的腫瘤細胞系的內源性p53狀況(無論是突變的還是野生型的p53)對Ad5CMV-p53阻止腫瘤發育的效力影響很小。
實施例3在頭和頸部鱗狀細胞癌中轉移野生型p53腺病毒基因介導的凋亡誘導作用材料和方法細胞系和培養條件；重組腺病毒制備和感染。按實施例1和2所述步驟完成所有方法并維持細胞系。
DNA片段化分析。以不同的時間間隔與野生型p53腺病毒及復制缺陷型腺病毒對照物保溫后，收獲細胞，重新懸浮于300μl PBS并加入3ml提取緩沖液(10mM Tris，pH8.0，0.1M EDTA、20μg/ml RNAse，0.5％SDS)，并于37℃保溫1-2小時。保溫結束時，加入終濃度為100μg/ml的蛋白酶K，并將溶液在50℃水浴中放置至少3小時。用等體積0.5M Tris(pH8.0)飽和的苯酚提取DNA一次，然后用苯酚/氯仿重復提取。在1％瓊脂糖凝膠中分析沉淀的DNA。
細胞固定。就TUNEL方法來說，在溶于PBS(pH7.4)中的1％甲醛中，于冰上將細胞固定30分鐘。然后用3mlPBS洗細胞，并將懸浮于70％冰冷的乙醇中并于-20℃儲存備用。為進行細胞周期分析，只在70％冰冷的乙醇中固定細胞。
末端脫氧核苷轉移酶試驗。按照Gorczyca等人的方法(Gorczyca et al.，1993)進行試驗。簡單地說，在經過固定和洗滌之后，將細胞重新懸浮于50μl含有0.2M卡可酸鈉(pH7.0)、2.5mM Tris-HCl、2.5mM CoCl2(Sigma Chemical Company，st.Louis，MO)、0.1mM DTT(Sigma Chemical Company)、0.25mg/ml BSA(Sigma Chemical Company)、5單位末端轉移酶(Boehringer Mannheim Biochemicals Indianapolis，IN)以及0.5mM生物素-16-dUTP及濃度各為20μM的dATP、dGTP和dCTP的TdT緩沖液中。將細胞在此溶液中37℃保溫30分鐘，用PBS淋洗，并重新懸浮于100μl FITC，即含有4×SSC、0.1％Triton X-100和2.5μg/ml熒光素化的抗生物素蛋白(VectorLabs.Inc.，Burlingame，CA)的染色溶液。在室溫下暗處將試管保溫30分鐘。用含有0.1％Triton X-100的PBS淋洗細胞并重新懸浮于含有碘化丙錠(5μg/ml)和70μl(1mg/ml)RNAse的0.5mlPBS中。將試管于暗處在水上保溫30分鐘，然后進行流式細胞計數分析。
流式細胞計數分析。所有樣品均使用帶標準光學構型的EPICSProfile II流式細胞儀(Coulter Corp.，Mialeah，FL)進行分析。各份樣品至少收集5,000計數。使用Elite工作站軟件的immuno-4程序(Coulter Corp.，Hialeah，FL)從試驗直方圖中減去對照直方圖以確定TdT末端標記陽性率。
細胞生長試驗。在培養基平板上鋪敷細胞并按實施例1中所述方法監測生長情況。
體內凋亡分析。實施例2中已描述了SCCHN的顯微殘留病變模型的基因治療。
原位末端標記。按以前描述的方法進行(Wijsman et al.，1993)。簡單地說，在二甲苯中將石蠟切片脫蠟3次(每次5分鐘)，并將玻片浸入100％、90％、70％和30％乙醇溶液中各3分鐘，以水合。將玻片在0.75％H2O2(V/V，在100％甲醇中)浸漬20分鐘以失活內源性過氧化物酶。在PBS中洗玻片后，用加在0.1NHCl中的0.1％(W/V)胃蛋白酶(Fisher Scientific，Houston，TX)將切片37℃消化5分鐘，并用PBS徹底清洗。然后在濕箱內將切片與包括下列成分的末端標記混合物37℃保溫1小時0.5單位/μl末端脫氧核苷轉移酶、0.06mM生物素化的dUTP、10μl 5Xtdt緩沖液，加雙蒸水至50μl。將玻片浸入含有300mM NaCl和30mM檸檬酸鈉(滴于雙蒸水中)的緩沖液中終止反應。在PBS中洗玻片后，在濕箱中將切片與辣根過氧化物酶連接的抗生物素蛋白37℃保溫1小時。使用3，3′-二氨基聯苯胺染色并用甲基綠復染切片。
結果
p53腺病毒對SCCHN細胞系的生長抑制作用。上述實施例證明，重組腺病毒載體可將野生型p53基因有效地轉導到SCCHN細胞系中。結果，受攻擊的腫瘤細胞失去其體外和體內增殖的能力。這種抑制作用不依賴于細胞系的內源性p53狀態。在一周期間進行上述生長速率分析。本實施例研究野生型p53對SCCHN細胞生長的早期作用(即較早的時間間隔，小時)。
本研究中使用兩個有代表性的細胞系。細胞系Tu-138攜帶突變的p53基因，而細胞系MDA 686LN則具有野生型p53基因。用復制缺陷型病毒dl312感染的細胞具有與模擬感染的細胞相似的生長速率(圖5A和5B)。另一方面，Ad5CMV-p53感染的Tu138(圖5A)和MDA 686LN(圖5B)細胞的生長受到顯著抑制。與MDA 686LN相比，似乎外源性p53蛋白質對Tu138具有更早和更深遠的生長抑制作用。觀察到明顯的形態學改變，部分細胞群體圍繞起來并且其外膜形成水皰狀，出現相似于細胞凋亡的與開始生長抑制同時發生的改變。復制缺陷型腺病毒dl312感染的細胞證明有正常生長特征，且沒有組織形態學異常。重要的是，如上文實施例2中詳細描述的，在p53腺病毒感染核型正常的成纖維細胞、以及人口腔角質細胞(無限增殖化的但非致瘤的)之后沒有感察到這些作用。
DNA片段化分析。細胞凋亡區別于壞死的特征性標志之一是生物化學上可觀察到的DNA片段梯的出現。為了進一步證實在p53腺病毒感染之后細胞經受了凋亡這一見解，進行了DNA片段化分析。對經過復制缺陷型或野生型p53腺病毒感染后從活細胞中提取的染色體DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。在兩細胞系中出現相當于約200bp的DNA片段并注意到它們的整倍體。在Tu-138細胞系中于p53腺病毒感染后22小時出現片段化的DNA，而在MDA 686LN細胞系中，則在野生型p53感染后30小時，更明顯的是在48小時可見到片段化的DNA。模擬感染的和dl312感染的細胞中沒有見到可檢測的斷裂的DNA。
體外末端脫氧核苷轉移酶試驗。凋亡的另一個特征是形態學改變和導致染色質濃聚的核結構組織的破壞。已使用電子顯微鏡深入檢查了這些超微細胞改變。然而，由于最近的鑒定凋亡細胞的流式細胞儀方法能夠掃描和分析細胞群體，所以比電子顯微鏡受到了更多歡迎(Goorczyca et al.，1993)。本發明人利用于基于檢測延伸的DNA斷裂的TUNEL(末端脫氧核苷轉移酶介導的dUTP-生物素缺口末端標記)方法(Gorczyca et al.，1993)，以鑒定凋亡細胞。p53腺病毒感染后15小時，4.4％活的Tu-138細胞群體處于凋亡階段，而相比之下MDA 686LN細胞則沒有(圖6A圖6B)。p53腺病毒保溫后，隨著觀察時間的延長凋亡細胞數目也成比例地增加。在22小時，近31％的Tu-138細胞已發生凋亡。雖然凋亡的初始誘發時間延遲，但在p53腺病毒感染后48小時約有60％的MDA 686LN細胞處于凋亡階段。值得注意的是，用Tunel方法確定的凋亡細胞的比例可能被顯著地低估了，因為這種方法只是分析存活的細胞。這些數據與生長速度及DNA片段化分析密切相關。在使用模擬感染及復制缺陷型病毒對照物(100M.O.I)進行的對照實驗中，沒有檢測到經受凋亡的細胞群體。因此，凋亡并不是轉導的腺病毒基因產物本身的功能。
體內凋亡分析。上述實施例表明p53腺病毒抑制體外腫瘤形成。設計本實施例是為了顯示是否體內腫瘤生長抑制為凋亡的后果。進行原位末端標記分析以檢測實施例2中得到的石蠟包埋的切片中的凋亡細胞。很清楚，從已接受PBS處理(作為對照)的帶有MDA 686LN的動物體內分離的組織切片中沒有觀察到染色。另一方面，從用野生型p53腺病毒處理的帶有MDA 686LN的小鼠體內分離的組織切片則顯示出高度陽性染色，證明細胞凋亡確實參予了體內腫瘤生長的抑制過程。
在進一步的研究中，發明人力圖確定是否生長抑制作用的部分原因是由于誘導的p21蛋白質造成細胞周期受阻或主要因凋亡所致。Western印跡分析顯示，p21蛋白質在野生型p53腺病毒感染的SCCHN細胞中被誘導。然而，細胞周期分析顯示，盡管p21蛋白質在p53腺病毒感染的細胞中增加了，但與S期相比，在G1期細胞中并沒有該蛋白質的大量積聚。
實施例4p53-FLAG對頭和頸部鱗狀細胞的生長抑制作用基因治療試驗的有效標志材料和方法細胞系和培養條件。重組腺病毒制備和感染；Northern印跡分析；Western印跡分析；細胞生長試驗；細胞層體外免疫組織化學染色。按實施例1中所述步驟完成所有這些方法并維持細胞系。
p53-FLAG腺病毒的產生。用BamHI消化以從pC53-SN中切下p53cDNA序列，并克隆到pGEM7Z的BamHI位點中。然后用Accl和Kpn 1消化有正確插入方向的重組質粒，以從p53cDNA的3′端除去22氨基酸編碼序列。然后將含有FLAG肽(包括終止密子)之編碼序列之Accl-Kpn 1相容性末端的接頭連接到經過消化的質粒中以產生p53-FLAG融合基因。將所得p53-FLAG融合基因克隆到帶有人CMV啟動子和SV聚腺苷酸化信號的表達載體中。然后再將最后的構建體插入到穿梭載體pXCTL.1(Zhanget al.，1994)中，以得到重組p53-FLAG腺病毒。
體內顯微殘留病變實驗。使用如實施例1中所述的無胸腺裸鼠模型系統、在限定的無病原體環境中進行研究。完成兩組不同的重復實驗。第一組是使用AdCMV-p53-FLAG病毒在三個瓣中以下降濃度(1010pfu、109pfu、108pfu)進行的劑量-反應實驗。第4個瓣作為對照并隨機分為PBS或復制缺陷型腺病毒(DL 312)對照。第二組研究是使用1010pfu的AdCMV-p53-FLAG、AdCMV-p53和復制缺陷型腺病毒在三個分立的瓣中進行的。第4個瓣接種同樣體積(100μl)的無菌PBS。處理后48小時，殺死其中的兩只動物并取組織瓣進行免疫組化分析。其余的動物則觀察到第21天，然后處死。使用千分尺測量腫瘤大小以進行比較。
結果用AdCMV-p53和AdCMV-p53-FLAG病毒感染后mRNA的表達。檢查Tu-138和MDA 686-LN的p53mRNA表達。腺病毒感染后分離總RNA。進行Northern印跡分析。測得AdCMV-p53和AdCMV-p53-FLAG感染的細胞間有相似水平的AdCMV-p53mRNA。用AdCMV-p53和AdCMV-p53-FLAG感染后，Tu-138和MDA 686-LN的p53mRNA表達水平差不多。探知強度的變異與負載劑量有關。突變的p53細胞系Tu-138中p53mRNA的內源性表達見于道2和3中。在p53基因為野生型的MDA 686-LN細胞系中沒有顯著的內源性p53mRNA表達。這些數據提示，AdCMV-p53-FLAG與AdCMV-p53病毒一樣，也得到成功地轉導和有效地表達。Northern分析沒有發現AdCMV-p53DNA污染的證據。
外源性p53蛋白質在AdCMV-p53和AdCMV-p53-FLAG感染的SCCHN細胞系中的表達。進行Western印跡分析以比較由AdCMV-p53感染的和AdCMV-p53-FLAG感染細胞表達的蛋白質量。在兩個同時進行電泳的凝膠上使用單特異性p53抗體(PAb180)和抗FLAG M2抗體(IB73025)鑒定蛋白質帶。使用p53抗體(pAB 1801)檢測，可見用AdCMV-p53和AdCMV-p53-FLAG感染的兩細胞系有同樣高水平的p53蛋白質表達。另試驗了用AdCMV-p53感染的Tu-138和MDA 686-LN細胞。在復制缺陷型腺病毒感染的細胞或模擬感染組中沒有觀察到p53蛋白質表達的改變。當用小鼠抗FLAG M2抗體探查相似地進行電泳的凝膠時，p53-FLAG蛋白質表達的水平似乎相似于p53抗體探查得到的表達水平，但在那些用AdCMV-p53病毒感染的細胞中則沒見到可檢測的帶。在各細胞系中，模擬和DL312感染的細胞沒有顯現可檢測水平的免疫反應性p53或FLAG蛋白質。
AdCMV-p53和ADCMV-p53-FLAG對SCCHN細胞體外生長的影響。上文已詳細描述了在Tu-138和MDA686-LN細胞系中野生型p53治療的細胞毒性作用。Tu-138細胞系具有內源突變的p53基因，MDA686-LN細胞系則具有野生型p53基因。本研究試圖確定在通過插入FLAG序列重組AdCMV-p53病毒后是否可見到效率上的差異。
復制缺陷型腺病感染的細胞與模擬感染細胞具有相似的生長速率。用復制缺陷型腺病毒感染可見有弱細胞毒性作用(圖7A)。相反，用AdCMV-p53或AdCMV-p53-FLAG感染的那些細胞到第3天時則腫瘤細胞基本上全部死亡。組織學檢查顯示漿膜的水皰形成，其為凋亡的特征性改變，并已鑒定為Ad CMV-p53感染的SCCHN細胞系中細胞死亡的機制(實施例1)。如上文提到的，該作用對于Tu-138細胞系(突變的p53)比MDA 686-LN細胞系(野生型p53)更為突出。生長曲線分析在三次重復研究中是可以再現的，在AdCMV-p53和AdCMV-p53-FLAG病毒之間沒有觀察到明顯的差異，這提示加入FLAG肽并不影響p53的抑制細胞生長的能力。
腺病毒感染的SCCHN細胞系的免疫組織化學染色。使用標準免疫組織化學技術比較被感染細胞單層的p53和p53-FLAG蛋白質的表達。在MDA 686-LN細胞系中，DL312感染細胞的模擬感染中未能明確鑒定出p53和FLAG蛋白質。然而，在具有突變的p53基因的Tu-138中，內源染色則為p53陽性。當AdCMV-p53病毒感染細胞時，兩細胞系中均呈現強染色。肉眼觀察AdCMV-p53-FLAG病毒感染的細胞，可見染色強度和與抗體PAb1801呈陽性反應的細胞細胞數目與AdCMV-p53病毒感染的細胞相同。用AdCMV-p53-FLAG病毒感染的細胞也顯示與M2FLAG抗體呈強的免疫組化陽性。雖然染色質量不同，但兩者都是在核內，并且胞漿中染色程度較小。
體內生長抑制作用。使用108、109和1010噬斑形成單位(pfu)的AdCMV-p53-FLAG病毒，按實施例1中所述的顯微模型方法對Tu-138細胞系進行劑量研究，并與PBS或DL312處理的對照瓣進行比較。模擬感染的平均腫瘤大小為1205±205mm3。隨著分子干預中所用病毒濃度的增加，腫瘤大小以線性方式減小。那些用108、109和1010pfu AdCMV-p53-FLAG處理的瓣的平均腫瘤大小分別為637±113mm3、392±109mm3、193±74mm3。使用成對t檢驗將每只動物對自身進行比較，并在除用109和1010pfu處理瓣之間外，所有比較中都有顯著性劑量反應效果(p＜0.05)。很清楚，病毒的量越大，見到的腫瘤生長抑制作用越大。在進一步的研究中，將AdCMV-p53的效果與AdCMV-p53-FLAG的效果進行了比較。兩者活性上沒有明顯差異。
免疫組織化學證明顯微殘留病變動物模型中的外源腫瘤抑制作用。在證明AdCMV-p53和AdCMV-p53-FLAG的差不多的體外和體內活性后，發明人應用了免疫化學技術證明體內p53-FLAG融合蛋白質產物。使用Tu-138和MDA 686-LN細胞系，于處理后48小時收獲顯微殘留病變瓣，在甲醛中固定并用石蠟包埋。用AdCMV-p53-FLAG病毒處理腫瘤細胞的相鄰切片，對p53和FLAG施加染色。染色強度和陽性染色的細胞數目與感染中所用病毒的量直接成正比。MDA 686LN細胞中對照組為p53和FLAG抗體染色陰性。在Tu-138腫瘤細胞中記錄到p53的內源性染色。組織學標本分別用蘇木精和伊紅、p53抗體和FLAG抗體染色。FLAG M2抗體顯示特征性胞漿染色，相反p53抗體則顯示核內核色。此實驗第一次證明FLAG M2抗體對石蠟包埋的固定組織是有效的。染色證明外源性治療定向于腫瘤抑制作用，并且在體內模型中可使用FLAG系統鑒定外源性治療效果。
總之，可以看出共送遞FLAG蛋白質連同所需的基因治療提供了作為基因治療標志物的潛在實用性。本發明清楚地顯示其為與p53基因一起同時被啟動的，并且信息RNA和蛋白質的表達沒有降低。更重要的是，所送遞的腫瘤抑制基因的生物學活性沒有改變。當對甲醛固定石蠟包埋的組織進行免疫組化分析時，第一次證明FLAG抗體是有效的。這些因數提示，這種新的蛋白質在未來基因治療研究中作為示蹤劑的實用性。
實施例5使用p53腺病毒治療頭和頸部鱗狀細胞癌病人A患有不能手術的頭部SCCHN腫瘤的53歲男性病人。腫瘤塊直徑為6.5cm。檢查骨髓功能、血小板計數和腎功能后，病人通過8個不同的腫瘤內注射部位接受第一次在無菌磷酸鹽緩沖鹽水中稀釋的108個腺病毒-p53表達構建體的感染性顆粒來治療(總體積10ml)。每隔3天接受一次同樣的治療，總共給予6次治療。
第6次治療后3天，檢查腫瘤并發現其直徑大于4.0cm。組織學檢查顯示在腫瘤邊緣處有相當多的細胞斷片。進行第二療程的6個治療，其后發現腫瘤直徑大于2.0cm并有壞死。病人繼續接受每周一次的3個月治療，這時腫瘤已不明顯。
病人B患有可手術的頸部SCCHN腫瘤的44歲女性病人。腫瘤塊直徑為2.5cm。檢查骨髓功能、血小板計數的腎功能后，病人通過3個不同的腫瘤內注射部位第一次接受在無菌磷酸鹽緩沖鹽水中稀釋的5×107腺病毒-p53表達構建體的感染性顆粒來治療(總體積3ml)。每三天接受同樣治療，共給予6次治療。
第6次治療后3天切除腫瘤。將腫瘤床在6ml無菌磷酸鹽緩沖鹽水中浸浴60分鐘。去除接種物，關閉傷口并在瘤床內留一引流。在外科切除后4、7、10和14天，通過引流灌注在無菌磷酸鹽緩沖鹽水(總體積3ml)中稀釋的5×107腺病毒-p53表達構建體的感染顆粒。接觸腫瘤床兩小時后，抽吸除去接種物。治療終止后6個月觀察不到原發的、局部的或區域性的腫瘤。
實施例6在患有晚期再發性頭和頸鱗狀細胞癌病人的I期試驗中通過腺病毒載體轉移野生型p53基因在有活檢證實的再發性頭和頸部鱗狀細胞癌的病人中以對數增加劑量送遞含有正常“野生型”p53基因的腺病毒載體。在連續兩周內每周三次進行直接腫瘤注射。將病人分為兩類1)可切除的復發疾病，2)不可切除的復發疾病。
對那些歸為可切除疾病組的病人，在2周期間里的第6次基因轉移后72小時總地大體切除其再發腫瘤。手術期內及手術后72小時通過逆行導管灌送遞腺病毒載體。對不能切除的病人則在兩周周期內通過每月直接腫瘤注射反復進行基因轉移嘗試，直至觀察到病情進展或病人行為狀態惡化。對病人進行封閉式住院觀察以監視該治療方法的安全性，進行活組織檢查以估計基因轉移效率，對流出的載體進行體液分析，并進行尸檢分析。
方法研究對象。21名患有晚期復發性上通氣消化道鱗狀細胞癌的病人，符合東方合作腫瘤學研究組行為狀態2，將病人分入由患可切除(1組)或不可切除(2組)復發腫瘤病人組成的兩組研究對象中，表6和7中分別顯示了研究對象的特征和腺病毒載體的劑量。所有婦女都是妊娠試驗陰性并且所有病人都使用避孕方法。在加入研究之前得到了所有病人的書面同意。
基因轉移載體。本研究利用定名為Ad5CMVp53的帶有增強子(巨細胞病毒)-啟動子的復制缺陷型腺病毒血清型5載體。按Magenta，Inc.和Introgen Therapeutics，Inc.的良好制造規程生產噬斑形成單位范圍為109至1011的三批腺病毒載體，并冷凍(-70℃)運輸到University of Texas，M.D.Anderson Cancer Center。每一批對于利用Western印跡分析轉導及體外腫瘤細胞抑制生長試驗都是有效的。臨基因轉移前融解載體并在磷酸鹽緩沖鹽水(載體)中稀釋，并在4℃下送到病人房間內。
表6病人特征
表6(續)
表7治療期間載體劑量及血清或尿中存在或沒有腺病毒載體核苷酸
劑量。以對數增加的劑量將腺病毒載體投用于每組5個病人。在觀察以前述劑量治療的最后一個病人兩周后確定劑量增加。在前6個病人進入研究后，3個病人在獨立于可切除或不可切除組的各劑量水平上進入。所述的生物學載體的劑量是就總劑量而言的(噬斑形成單位)。每個惡性上皮細胞投用的估計的載體數目是不接近的。表7中顯示了給藥的總體積。注射到實體腫瘤中的腺病毒載體的體積是由臨床和放射顯影估計的腫瘤體積決定的。在直接觀察下并借助手工觸診將載體直接注射到復發的鱗狀細胞癌中。以腫塊上的1厘米增量間隔注射。基因轉移后，密切觀察治療對象至少1-1/2小時。在最后一次載體的基因轉移后保持72小時呼吸和體分泌分離。
載體的檢查。利用293細胞的病毒培養物以及聚合酶鏈反應(PCR)監測尿和血清樣品中播散的腺病毒載體。PCR中使用的引物是擴增對載體特異的腺病毒E1b區域和野生型p53基因5′末端的引物。然后Southern轉移PCR產物，以改善病毒檢測達到1-5個病毒顆粒，以及驗證PCR產物特異性。每反應中均檢測陽性和陰性對照物。
安全性。監測癥狀、生命信號及血細胞計數，并且每天對病人進行生理學檢查和記錄照象資料。在各個治療周期開始時進行胸部放射線照相、血液化學試驗及行為狀態分析。在每個基因轉移周期之前和之后檢測腺病毒抗體的血清滴度。在第一周期的第6次基因轉移后3天，得到腫瘤活檢組織(或外科切除)。每種情況下的標本均作為速凍的、病理學包埋的標本、以及甲醛固定的標本儲存之。
從血清或尿中提取核酸。用Cunningham等人(1995)改良的方法從0.5ml等份的血清或尿中提取Ad5CMV-p53腺病毒DNA。簡單地說，加入蒸餾水至1ml并用30％聚乙二醇(PEG)沉淀之。因為單用SDS不足以從其顆粒中釋出病毒DNA，所以在用PEG沉淀后向SDS溶液中加入蛋白酶K于50℃處理2-16小時(Norder et al.，1990)。用苯酚提取樣品，并于糖元存在下用乙醇沉淀之(Cunningham et al.，1995)。以14000g離心10分鐘(4℃)回收DNA，重新懸浮于0.3ml蒸餾水中，并再次用乙醇沉淀。用70％乙醇淋洗DNA沉淀物，真空干燥并溶解于10μl蒸餾水中。直接分析樣品或于-20℃儲存備用。在生物學安全性小室罩下進行核酸提取以防止標本的可能的交叉污染。
對從血清樣品中分離的DNA進行PCR反應。設計用于特異性地從腺病毒載體擴增p53基因的引物。上游引物(5′-CACTGCCCAACAACACCA-3′，SEQ ID No5)相當于p53基因的3′末端，下游引物(5′-GC CACGCCCACACATTT-3′，SEQ ID No6)相當于腺病毒5型的E 1B區域(野生型序列的核苷酸3517至3533)。各PCR反應試管均含有0.2mM各寡核苷酸，0.4mM dNTP、1XTaqPlus Long低鹽緩沖液(購自Stratagene)，0.6μl TagPlus Long(5U/ml)(購自Stratagene)和5μl試驗DNA。將樣品放在93℃3分鐘編程的、并有下列三步驟分布型的MJ Research Peltier熱循環儀(PTC-200)中93℃，30秒；65℃，45秒和72℃，45秒，共進行30或35次循環。在PCR循環結束時向各試管內加入5μl 6X加樣緩沖液(0.25％溴酚蘭，0.25％二甲苯青FF和15％Ficoll(400型；Pharmacia)，溶于水中)，并在1％瓊脂糖、含有溴乙錠(6μg/ml)的1XTBE凝膠上加樣。樣品以100V電泳1-1.5小時，然后在紫外光下照相。
聚合酶鏈反應(PCR)。在單一聚合酶鏈反應中只可使用5μl已制備好的DNA。對血清來說，PCR在含有2mM MgCl2、50mMKCl、0.1％Tritox X-100，200μM各種脫氧核苷三磷酸(dNTP)、10mM Tris-HCl(pH 9.0)、5μM各種引物和1.7單位TagDNA聚合酶(Promega)的20μl體積進行PCR。反應在94℃進行30秒，58℃30秒，和72℃60秒，共35次循環，然后于72℃延伸10分鐘。從Ad5CMV-p53的序列中選擇PCR引物，其中有義引物位于p53cDNA的3′末端(5′-GCCTGTCCTGGGAGAGACCG-3′，SEQ ID No7)，反義引物則選自腺病毒5型的E1B區域(5′-CCCTT AAGCCACGCCCACAC-3′，SEQ ID No8)。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產物(838bp片段)。將同樣的PCR產物亞克隆到pCR-Script載體(Stratagene)中，測序，并用凝膠純化的插入段作為探針以檢測PCR產物。對于尿液，則在含有2mM MgSO4、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、0.1％Triton X-100、20mMTris-HCl(pH8.8)、0.1％mg/ml牛血清白蛋白、200μM各種脫氧核苷三磷酸(dNTP)、5μM各種引物及2.5單位Tag Plus LongDNA聚合酶(Stratagene)的20μl體積中進行PCR。反應于93℃進行60秒，然后是93℃30秒，65℃45秒，和72℃45秒，共進行35次循環，然后于72℃延伸10分鐘。從Ad5CMV-p53的序列中選擇PCR引物，其中有義引物定位于p53cDNA的3′末端(5′-CACTGCCCAACAACACCA-3′，SEQ ID NO9)，反義引物則選自腺病毒5型的E1B區域(5′-GCCACGCCCACACATTT-3′SEQ ID No10)。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產物(724bp片段)。
Southern印跡分析。在用于證實PCR產物之特異性的Southern印跡分析中，將凝膠中的DNA變性并中和，然后以毛細吸收法轉印到尼龍膜(Hybond-H+，Amersham)上。在Rapid-hyb緩沖液(Amersham)中將膜于65℃預雜交15分鐘，并在含有32P標記的探針的同樣緩沖液中雜交1-2小時。于室溫下在0.1×SCC和0.1％SDS中將膜洗兩次，再于65℃下洗兩次(每次15分鐘)。于-70℃下將洗過的膜用增感屏對X光膠片曝光1-16小時。
對照組和試驗樣品的評價。伴隨每批樣品都包括下列對照組。在DNA分離步驟中，利用兩種“陰性”血清對照(合并的并等分的Introgen雇員的血清)和由10pfu或100pfu AdCMV-p53病毒強化的陰性血清組成的兩份陽性對照物。據此得到一個敏感性窗口，其中10(和100)pfu對照物為陽性，但陰性對照物為陰性。如果陰性對照物為陽性，則PCR只重復30次循環。如果10pfu對照為陰性，則再次用乙醇沉淀以進一步純化DNA，并重復進行PCR。上述兩個步驟總是將實驗參數放入適當的敏感性窗中。
在PCR階段，利用1ng AdCMV-p53DNA為陽性對照物(分離自臨床批量材料)，及水為陰性對照物。如果任何一對照物是不可靠的，則重復該批的PCR。實驗中沒有錯誤的陰性PCR對照物。
為了證實假定的陽性，重新從血清(連同幾種暫時相鄰的樣品)中分離DNA，并重復進行該DNA的PCR。只有當結果能夠再現時才將樣品評定為陽性。報告時，將兩次樣品分析中有一次為陽性的樣品看作是陰性。從數據中刪掉不能重復再現的(由于缺乏另外的未加工的樣品)假定陽性。
基因轉移的檢測效率。將外科切除的組織標本放在冷凍瓶內，立即快速冷凍，然后在液氮中保存備有。將冷凍樣品倒入已在液氮中預冷卻的不銹鋼Bessman組織粉碎器(Spectrum，Houston，TX)的室口內。用帶有鋼錘的Bessman杵錘擊5至10次，將組織粉粹成細粉末。將粉碎的組織移入每50mg組織含1ml TR1試劑(Molecular Research，Cincinnati，OH)的玻璃組織勻漿器中，并用Teflon杵上下擊打5-10次以勻漿化。
勻漿后，按TR1試劑生產商提供的說明書分離RNA。簡單地說，將勻漿移入聚丙烯離心管(Molecular Research)中并于室溫下儲存5分鐘，然后加入氯仿(每1ml TR1試劑加0.2ml)。強列混合樣品，室溫下繼續保溫15分鐘，并以12,000g 4℃離心15分鐘以從苯酚-氯仿相中分離出含RNA的水層。向水層中加入異丙醇并在室溫下保溫15分鐘以沉淀RNA。4℃下以12,000g離心15分鐘以回收RNA沉淀物，用75％乙醇洗一次，干燥，溶解于聚碳酸二乙酯(DEPC)處理的水中并檢測260mm吸光率以進行定量。將50μg RNA與60單位DNA酶I(Pharmacia，Piscataway，NJ)以260μl的總反應體積37℃保溫25分鐘，以除去污染的DNA。然后用苯酚-氯仿提取RNA，乙醇沉淀，用75％乙醇洗1次，在離心管中以最大速度4℃離心15分鐘以沉淀之，風干，重新懸浮于DEPC-水中并于-80℃儲存。在常規非變性0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離樣品以估測RNA質量，并經溴乙錠染色觀察28S和18S核糖體帶。為了排除樣品間的交叉污染并減少RNA酶活性，所有可再使用的RNA分離器具均在2％Liqui-Nox(FisherScientific)去污劑溶液中至少浸泡5分鐘，擦洗，移至10％漂白溶液中處理3分鐘，用去離子水徹底淋洗，用100％乙醇噴霧，干燥，浸入氯仿中，并在使用前再次干燥之。
在含有111ng隨機六聚體(Gibco BRL，Grand Island，NY)、40單位RNA酶抑制劑(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)、0.4mM各d NTP(Perkin Elmer，Foster City，CA)和在1×RT緩沖液(50mM Tris pH8.3，75mM氯化鉀、3mM氯化鎂、和20mM二硫蘇糖醇)中的30單位Superscript IIRNA酶H-逆轉錄酶(Gibco BRL)的23.5μl反應混合物中，使用1.5μg總細胞RNA進行逆轉錄。將RNA和隨機六聚體于70℃加熱10分鐘并在冰上冷卻，然后加入其余的反應混合物。將反應混合物與200單位逆轉錄酶于25℃保溫5分鐘，在加入另外100單位逆轉錄酶后于25℃繼續保溫10分鐘，以有利于引物退火，然后于42℃保溫50分鐘。于70℃加熱15分鐘失活逆轉錄酶以終止逆轉錄反應。于37℃用1單位RNA酶H(BoehringerMannheim)消化20分鐘以去除與cDNA互補的RNA。使用從感染了重阻腺病毒Ad5CMV-p53(100∶1感染復數)的頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)細胞系Tu 167中提取的RNA作為陽性對照，以檢測病毒轉錄的p53，并用不含p53轉錄單位的變異腺病毒載體dl312(1)感染的Tu 167細胞作為陰性對照。
為了檢測Ad5CMV-p53轉錄物，在含有溶于1×PCR緩沖液(50mM氯化鉀、10mM Tris pH9.0，0.1％Triton X-100)中的0.2mM各dNTP、15mM氯化鎂、1單位Tag聚合酶(Promega，Madison，WI)和各0.5mM各引物CMV2(5′GGTGCATTGGAACGCGGATT，SEQ ID No11)與P53EX3(5′GGGGACAGAACGTTGTTTTC，SEQ ID No12)的30μl反應體積中進行PCR。引物CMV2和P53EX3擴增與腺病毒衍生的p53轉錄物特異的295堿基片段。檢測Ad5CMV-p53轉錄物的PCR條件如下
94℃1分鐘，然后94℃，30秒，58℃40秒，70℃1分鐘，重復35次循環，以及70℃延伸10分鐘。
為確保PCR期間擴增的產物是要檢測的mRNA而不是RNA制劑中污染的DNA，還使用從其中未加逆轉錄酶的平行反應中得到的逆轉錄產物進行PCR。
為了檢查逆轉錄反應的完全性，進行對3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)特異的RT-PCR。在溶于1×PCR緩沖液中含有0.2mM各種dNTP、2mM氯化鎂、1單位taq聚合酶及0.5mM各種引物GATDH1(5′ACGGATTTGGTCGTATTGGG，SEQ IDNo13)和GAPDH2(5′TGATTTTGGAGGGATCTCGC，SEQ IDNO14)的30μl PCR混合物中稀釋3μl體積的逆轉錄反應物。GAPDH引物跨越人GAPDH基因中的3個外顯子并擴增對mRNA特異的231堿基產物。檢測GAPDH的PCR條件是94℃1分鐘，然后94℃30秒，60℃12秒，72℃1分鐘，進行35次循環，并于72℃延伸7分鐘。
使用Perkin Elmer Gene Amp 9600熱循環儀進行PCR，并且所有引物均為商業化合成的(Genosys，Woodlands，TX)。
免疫組織化學檢測腫瘤內基因。使用抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復合物(ABC)方法(1)對甲醛固定的石蠟包埋的組織切片進行免疫過氧化物酶研究。將標本切成3-4μm厚，在二甲苯中脫石蠟，并在遞降濃度(100-70％)的乙醇中再水合。用溶于甲醇中的3％過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性。在蒸餾水和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中洗幾次后，將切片與1∶10稀釋的正常馬血清保溫以盡可能地減少本底染色。然后于4℃下與抗p53單克隆抗體(DO-1，Oncogene Science，Inc.，Uniondale，NY；1∶80稀釋)和抗p21單克隆抗體(Oncogene Science，Inc.，1∶100)過夜保溫。使用ABC Elite試劑盒(Vector Laboratories，Brulingane，CA)完成過氧化物酶染色。使用含0.01％過氧化氫pH7.6的Tris-HCl緩沖液中的0.05％3，3′-二氨基聯苯胺顯現免疫染色反應結果。經兩次獨立的感察對200個細胞在10個連續高電場中的陽性核染色計數，進行結果評估。
DNA片段化的TUNEL檢測法。按照制造商提供的說明書，使用ApoptagTMPlus試劑盒(Oncor，Gaithersburg，M.D.)進行TUNEL檢測。用0.4％亞甲基綠復染玻片。估測相應蘇木精和伊紅染色的玻片中炎性細胞浸潤液的存在，并分為1-4級。
細胞病變效應檢測法。使用其中樣品內的任何病毒都可感染接受體細胞單層的檢測法監測病人尿樣品中Ad5p53的存在。監測那些出現細胞病變效應(CPE)的細胞它們圍繞起來并從表面脫離。用于CPE分析的病人尿樣品得自在第一療程的第二周期間，及在第0和第1天(預治療)收集的早晨第一次尿。將各約15ml樣品于-80℃下保存在15ml無菌錐形管中備用。在該檢測中形成接受體細胞單層的IT293細胞維持在37℃濕的10％CO2保溫箱中的加有10％FBS的DMEM中。對病人樣品試驗前2天，將細胞以2×105/孔的濃度放在12孔平板中。
檢測時，在冰浴中融化尿樣品，按1∶1比例將等分的樣品與DMEM混合，并使用0.22μm針筒式濾器無菌過濾。去除生長培養基后向各孔內緩慢加入350μl等分的1∶1混合物。然后將平板輕輕搖動15分鐘。30分鐘后，向各孔內加入2.0mis DMEM+10％FBS，以稀釋樣品。于檢測的第3天(72小時后)和第6天，向各孔內加入0.5ml等分的新鮮培養基，以盡可能地將細胞單層維持最多6-7天。
按一式三份檢測病人樣品。檢測稀釋的治療前樣品，并且每孔也用105pfu Ad5p53強化之，以檢測可能干擾用該方法進行檢測的任何尿液成分。對照孔接種分別用105、104、103、102或101pfu強化的單獨DMEM，不同的對照樣品各為一式兩份。在這些條件下105pfu強化于檢測的第2天引起CPE；每個后繼的天數里，下一個強化的對照也將顯示CPE。因此，檢測每份病人樣品中的CPE的時間就表明該樣品中Ad5p53的水平。
重組活性腺病毒。使用Biotechnology Services Division ofMicrobiological Associates，Inc.，(Rockville，Maryland)提供的A549細胞檢驗用于臨床試驗的腺病毒p53的RCA的存在。
統計學分析。使用單側研究設計。為了防止在過度毒性的試驗中涉及盡可能少的病人，補充一個Bayesian早期終止規則。使用WILCOXON信號等級檢驗和指配檢驗分別對治療前后顯示TUNEL和免疫組化染色之細胞的百分比進行比較。使用SurvpacSPSS統計學軟件包進行統計學分析。
反應和毒性。在該暫時分析中估測存活率和反應，但這些不視為分析的目的。該暫時分析的目的是確定該基因轉移策略的轉導潛力。可以在一周期基因治療后經過30天觀察來估計病人的反應和毒性。按照國家腫瘤研究所(National Cancer Institute)的通用毒性標準(Xref.)來估計治療的毒性作用。每個療程之前經CT掃描或頸部超聲檢查來估計對治療的反應。如果病人至少接受了一個療程的治療，后又作了適當的反應記錄，即可以估計病人的反應。那些外科切除其再發腫腫瘤的病人不可能作出反應估計，因為外科手術是在30天觀察其之前完成的。所有的CT掃描是由一位放射科專家評價的，而超聲圖由另一專家評估。部分反應限定為可檢測腫瘤之直徑乘積總和減小50％或更多；小反應限定為可檢測損傷的直徑乘積總和減小25％至＜50％。病情進展限定為直徑乘積之總和增大25％或更大。
檢測從治療開始到終止的存活時間。每個病人的反應均由包括頭和頸部外科腫瘤學家、放射醫學家和醫學腫瘤學家的數據管理委員會審查。
結果載體的檢查。基因轉移后達48小時，以PCR方法檢查病人血清和尿樣品中的腺病毒-載體DNA。載體的檢測限是1-5個病毒顆粒。從經受每種病毒劑量的基因轉移的病人中分離病毒DNA，但基因轉移48小時后則不作檢查。病毒劑量在107pfu以上時，病毒DNA的血清檢查隨病毒劑量增加而增加，但在基因轉移后48小時也檢測不到。
在PCR核苷酸分析之前，通過檢測細胞單層的CPE，首先分析尿樣品的感染性病毒。按上述方法將存在于尿中的病毒加于293細胞上，以監測CPE(CPE是作為細胞圍繞起來并離開平皿壁這一現象而觀察到的)。很少在標本中鑒定出CPE。其后在敷層培養物中(大于6天)見到CPE，并且這些結果被認為是模糊不清的。在任何情況下CPE都不是通過PCR和Southern印跡轉移同一尿樣品中的被檢測的腺病毒核苷酸證實的。
其他器官系統的病毒DNA分析。PCR分析證明，在109Ad5CMVp53基因轉移后2個月以上，在小心取樣以防止組織間交叉污染的快速冷凍尸體解剖標本中，發現皮膚、心肌、肝和睪丸組織有病毒DNA。腎實質、腎上腺和胰腺組織則未顯示有對該載體特異的病毒DNA序列。對這些尸體解剖標本進行免疫組化分析(沒有提示野生型p53蛋白質產物過表達的證據)。
對基因轉移的估計。在組織與載體接觸后至少1小時進行所有的分析。于4小時和48小時通過RT-PCR檢測到mRNA產物。相反，暴露于載體后1小時或更短時間冷凍的活檢標本中則沒顯示有p53mRNA。另外，從未經受基因轉移的手術部位得到的陰性對照樣品對PCR產物也是陰性的。以RT-PCR技術分析從四個病人得到的未轉導或轉導的活檢標本，以檢查Ad5CMVp53轉錄的mRNA的存在。得自兩個病人的被轉導的標本在EtBr染色的凝膠上為陽性，而在所有未被轉導的標本中則沒有檢測到Ad5CMVp53產物-盡管事實上可從所有標本中擴增出GAPDH。用Southern印跡法證實得自兩個陽性病人的295bp PCR產物的特異性。因為當從RT反應中除掉逆轉錄酶時沒有觀察到PCR產物，所以此處檢測到的259bp產物一定是從mRNA而不是污染DNA產生的。
免疫組化分析。在每個實驗中，所有病人的基因轉移前和轉移后標本與陽性和陰性對照同時分析。每個標本分析多個切片并與蘇木精和伊紅染色的以及TDT末端標記的標本相比較。在三個病人的注射載體后的活檢標本中證實了基因轉移，這些病人的轉移前活檢標本則沒有顯示內源性過表達的p53產物。在21個病人中的5人中(27％)，沒有顯著地內源性表達的p21(C1P/WAF1)；這一點證明了在病人基因轉移后的活檢標本中的基因轉移信息。在腫瘤相關的淋巴細胞及基質腫瘤細胞中也見到p53核蛋白的過表達，從而表明非腫瘤細胞也發生了轉導。
血清抗體反應。在反復注射載體后，所有病人中都誘導產生了腺病毒血清型5抗體。但初次基因轉移周期和繼后基因轉移療程相比，沒有發現轉導效率的明顯改變。以3×109pfu注射開始時可見有中度注射部位紅斑，但這些局部反應并不限制載體耐受性。在109pfu治療的病人中，盡管給予長達連續6個月的反復病毒注射，但任何病人中部沒有找到全身性過敏反應的證據。
病理學觀察。大部分活檢標本中都可辨識出針跡，并且在注射部位后的深部組織中證明有基因產物表達。同樣，在轉導區域中發現有末端標記細胞，提示在腫瘤細胞中誘導了凋亡，而基質或炎性細胞中則沒有凋亡。在病人中觀察到了炎性細胞，并且在接受109pfu或更多病毒劑量的病人中成為主要組織發現。令人感興趣的是，取樣的7號病人表達了內源野生型p53，證明一個療程基因轉移后，在其復發性2cm頸部腫塊的一系列切片的外科標本中有出血性壞死，而沒有存活腫瘤的證據。在標本中常常觀察到壞死及凋亡誘導作用的病理學現象。
臨床觀察。病人耐受了載體的直接腫瘤注射，其中最常見的不良反應是注射部位不適感。109pfu及更高滴度的載體注射證明有局部注射部位紅斑，盡管有全身性抗體滴度升高的證據，但未見有全身性超敏反應。5、10和16號病人在七個月的半隨訪期內沒有疾病證據。7和13號病人分別在其標示損傷區域表現有3和5個月的病情穩定。經CAT掃描和超聲波證實，20號病人表現有部分反應，但由于病情進展即脊髓和胸腔轉移而需從研究中去掉。
總之，對于患有頭和頸部復發性鱗狀細胞癌的病人，腺病毒介導的野生型p53基因轉移是安全的，并可通過直接腫瘤內注射或手術期內輸注載體來有效地轉導腫瘤和正常細胞。所有病人都未表現出可能限制載體投用或劑量升高的毒性。盡管出現全身性抗體反應，但沒有改變轉基因產物的表達。事實上，在切除的腫瘤標本內病理學所見的局部炎性反應可能是有益的。
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序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱BOARD OF REGENTS，THE UNIVERSITY OFTEXAX SYSTEM(B)街道201 WEST 7TH STREET(C)城市AUSTIN(D)州TEXAS(E)國家USA(F)郵政編碼(ZIP)78701(ii)發明名稱腫瘤診斷的方法和組合物(iii)序列數目14(iv)計算機可讀形式(A)介體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(v)目前申請數據(A)申請號未知(B)申請日本文并附(C)分類未知(vi)在先申請數據(A)申請號US 60/007,810(B)申請日30-NOV-1995(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征
(A)長度2066堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO1CAAAACCTAC CAGGGCAGCT ACGGTTTCCG TCTGGGCTTC TTGCATTCTG GGACAGCCAA 60GTCTGTGACT TGCACGTACT CCCCTGCCCT CAACAAGATG TTTTGCCAAC TGGCCAAGAC 120CTGCCCTGTG CAGCTGTGGG TTGATTCCAC ACCCCCGCCC GGCACCCGCG TCCGCGCCAT 180GGCCATCTAC AAGCAGTCAC AGCACATGAC GGAGGTTGTG AGGCGCTGCC CCCACCATGA 240GCGCTGCTCA GATAGCGATG GTCTGGCCCC TCCTCAGCAT CTTATCCGAG TGGAAGGAAA 300TTTGCGTGTG GAGTATTTGG ATGACAGAAA CACTTTTCGA CATAGTGTGG TGGTGCCCTA 360TGAGCCGCCT GAGGTTGGCT CTGACTGTAC CACCATCCAC TACAACTACA TGTGTAACAG 420TTCCTGCATG GGCGGCATGA ACCGGAGGCC CATCCTCACC ATCATCACAC TGGAAGACTC 480CAGTGGTAAT CTACTGGGAC GGAACAGCTT TGAGGTGCGT GTTTGTGCCT GTCCTGGGAG 540AGACCGGCGC ACAGAGGAAG AGAATCTCCG CAAGAAAGGG GAGCCTCACC ACGAGCTGCC 600CCCAGGGAGC ACTAAGCGAG CACTGCCCAA CAACACCAGC TCCTCTCCCC AGCCAAAGAA 660GAAACCACTG GATGGAGAAT ATTTCACCCT TCAGATCCGT GGGCGTGAGC GCTTCGAGAT 720GTTCCGAGAG CTGAATGAGG CCTTGGAACT CAAGGATGCC CAGGCTGGGA AGGAGCCAGG 780
GGGGAGCAGG GCTCACTCCA GCCACCTGAA GTCCAAAAAG GGTCAGTCTA CCTCCCGCCA 840TAAAAAACTC ATGTTCAAGA CAGAAGGGCC TGACTCAGAC TGACATTCTC CACTTCTTGT 900TCCCCACTGA CAGCCTCCCA CCCCCATCTC TCCCTCCCCT GCGATTTTGG GTTTTGGGTC 960TTTGAACCCT TGCTTGCAAT AGGTGTGCGT CAGAAGCACC CAGGACTTCC ATTTGCTTTG 1020TCCCGGGGCT CCACTGAACA AGTTGGCCTG CACTGGTGTT TTGTTGTGGG GAGGAGGATG 1080GGGAGTAGGA CATACCAGCT TAGATTTTAA GGTTTTTACT GTGAGGGATG TTTGGGAGAT 1140GTAAGAAATG TTCTTGCAGT TAAGGGTTAG TTTACAATCA GCCACATTCT AGGTAGGGGC 1200CCACTTCACC GTACTAACCA GGGAAGCTGT CCCTCACTGT TGAATTTTCT CTAACTTCAA 1260GGCCCATATC TGTGAAATGC TGGCATTTGC ACCTACCTCA CAGAGTGCAT TGTGAGGGTT 1320AATGAAATAA TGTACATCTG GCCTTGAAAC CACCTTTTAT TACATGGGGT CTAGAACTTG 1380ACCCCCTTGA GGGTGCTTGT TCCCTCTCCC TGTTGGTCGG TGGGTTGGTA GTTTCTACAG 1440TTGGGCAGCT GGTTAGGTAG AGGGAGTTGT CAAGTCTCTG CTGGCCCAGC CAAACCCTGT 1500CTGACAACCT CTTGGTGAAC CTTAGATCCT AAAAGGAAAT GTCACCCCAT CCCACACCCT 1560GGAGGATTTC ATCTCTTGTA TAGATGATCT GGATCCACCA AGACTTGTTT TAGCTCAGGG 1620TCCAATTTCT TTTTTCTTTT TTTTTTTTTT TTTCTTTTTC TTTGAGACTG GGTCTCTTTG 1680TTGCCCCAGG CTGGAGTGGA GTGGCGTGAT CTGGCTTACT GCAGCCTTTG CCTCCCCGGC 1740TCGAGCAGTC CTGCCTCAGC CTCCGGAGTA GCTGGGACCA CAGGTTCATG CCACCATGGC 1800CAGCCAACTT TTGCATGTTT TGTAGAGATG GGGTCTCACA GTGTTGCCCA GGCTGGTCTC 1860AAACTCCTGG GCTCAGGCGA TCCACCTGTC TCAGCCTCCC AGAGTGCTGG GATTACAATT 1920GTGAGCCACC ACGTCCAGCT GGAAGGGTCA ACATCTTTTA CATTCTGCAA GCACATCTGC 1980ATTTTCACCC CACCCTTCCC CTCTTCTCCC TTTTTATATC CCATTTTTAT ATCGATCTCT 2040TATTTTACAA TAAAACTTTG CTGCCA 2066
(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度293氨酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO2Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser1 5 10 15Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys20 25 30Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val Asp35 40 45Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys50 55 60Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu65 70 75 80Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu Ile Arg85 90 95Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe100 105 110Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp115 120 125Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly130 135 140
Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser145 150 155 160Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala165 170 175Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys180 185 190Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu195 200 205Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp210 215 220Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met225 230 235 240Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly245 250 255Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys260 265 270Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu275 280 285Gly Pro Asp Ser Asp290
(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度2066堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO3CAAAACTTAC CAGGGCAACT ATGGCTTCCA CCTGGGCTTC CTGCAGTCTG GGACAGCCAA 60GTCTGTTATG TGCACGTACT CTCCTCCCCT CAATAAGCTA TTCTGCCAGC TGGCGAAGAC 120GTGCCCTGTG CAGTTGTGGG TCAGCGCCAC ACCTCCAGCT GGGAGCCGTG TCCGCGCCAT 180GGCCATCCAC AAGAAGTCAC AGCACTTGAC GGGGGTCGTG AGACGCTGCC CCCACCATGA 240GCGCTGCTCC GATGGTGATG GCCTGGCTCC TCCCCAGCAT CTTATCCGGG TGGAAGGAAA 300TTTGTATCCC GAGTATCTGG AAGACAGGCA GACTTTTCGC CACAGCGTGG TGGTACCTTA 360TGAGCCACCC GAGGCCGGCT CTGAGTATAC CACCATCCAC TACAAGTACA TTTGTAATAG 420CTCCTGCATG GGGGGCATGA ACCGCCGACC TATCCTTACC ATCATCACAC TGGAAGACTC 480CAGTGGGAAC CTTCTGGGAC GGGACAGCTT TGAGGTTCGT GTTTGTGCCT GCCCTGGGAG 540AGACCGCCGT ACAGAAGAAG AAAATTTCCG CAAAAAGGAA GTCCTTTGCC CTGAACTGCC 600CCCAGGGAGC GCAAAGAGAG CGCTGCCCAC CTGCACAAGC GCCTCTCCCC CGCAAAAGAA 660AAAACCACTT GATGGAGAGT ATTTCACCCT CAAGATCCGC GGGCGTAAAC GCTTCGAGAT 720GTTCCGGGAG CTGAATGAGG CCTTAGAGTT AAAGGATGCC CATGCTACAG AGGAGTCTGG 780AGACAGCAGG GCTCACTCCA GCTACCTGAA GACCAAGAAG GGCCAGTCTA CTTCCCGCCA 840TAAAAAAACA ATGGTCAAGA AAGTGGGGCC TGACTCAGAC TGACATTCTC CACTTCTTGT 900TCCCCACTGA CAGCCTCCCA CCCCCATCTC TCCCTCCCCT GCCTTTTGGG TTTTGGGTCT 960TTGAACCCTT GCTTGCAATA GGTGTGCGTC AGAAGCACCC AGGACTTCCA TTTGCTTTGT 1020
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(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度293氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO4Lys Thr Tyr Gln Gly Asn Tyr Gly Phe His Leu Gly Phe Leu Gln Ser1 5 10 15Gly Thr Ala Lys Ser Val Met Cys Thr Tyr Ser Pro Pro Leu Asn Lys20 25 30Leu Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val Ser35 40 45Ala Thr Pro Pro Ala Gly Ser Arg Val Arg Ala Met Ala Ile His Lys50 55 60Lys Ser Gln His Met Thr Gly Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu65 70 75 80
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(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO5ACTGCCCAAC AACACCA 17(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO6GCCACGCCCA CACATTT 17(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO7GCCTGTCCTG GGAGAGACCG 20(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征
(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO8CCCTTAAGCC ACGCCCACAC 20(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO9CACTGCCCAA CAACACCA18(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO10GCCACGCCCA CACATTT 17(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO11
GGTGCATTGG AACGCGGATT 20(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO12GGGGACAGAA CGTTGTTTTC 20(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO13ACGGATTTGG TCGTATTGGG 20(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO14TGATTTTGGA GGGATCTCGC 20
權利要求
1.病毒載體用于制備治療人受試者口中惡性病變前損傷或癌損傷的藥物的用途，其中所述治療包括通過漱口用腺病毒載體接觸損傷，所述腺病毒載體包含編碼功能性p53的核酸節段，所述節段在人細胞中有功能的啟動子的轉錄控制下。
2.權利要求1的用途，其中所述損傷為惡性病變前損傷。
3.權利要求1的用途，其中所述損傷為癌損傷。
4.權利要求3的用途，其中所述癌損傷為鱗狀細胞癌損傷。
5.權利要求1的用途，其還包括對所述受試者施用第二種抗癌療法。
6.權利要求5的用途，其中所述第二種抗癌療法施用于所述口中。
7.權利要求5的用途，其中所述第二種抗癌療法為輻照、化療、細胞因子療法、手術或基因治療。
8.權利要求5的用途，其中所述第二種抗癌療法在所述腺病毒載體之前施用。
9.權利要求5的用途，其中所述第二種抗癌療法在所述腺病毒載體之后施用。
10.權利要求5的用途，其中所述第二種抗癌療法與所述腺病毒載體同時施用。
11.權利要求1的用途，其中所述腺病毒載體為復制不能型。
12.權利要求11的用途，其中所述腺病毒載體帶有E1缺失。
13.權利要求12的用途，其中所述腺病毒載體帶有E3缺失。
14.權利要求1的用途，其中所述啟動子為CMV IE、SV40早期或RSV LTR。
全文摘要
公開了使用表達p53的病毒載體治療鱗狀細胞癌的方法。在特定實施方案中，載體是復制缺陷的腺病毒。此外，還提供了在外科手術環境下和體腔中檢查顯微殘留病變的發展和治療效果的方法。
文檔編號A61P1/02GK101028523SQ20071000512
公開日2007年9月5日 申請日期1996年11月27日 優先權日1995年11月30日
發明者G·L·克雷曼 申請人:德克薩斯州立大學董事會