專利名稱：：白果內酯在制備治療帕金森病藥物中的用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種白果內酯在制備治療帕金森病藥物中的用途。
背景技術：
：1817年，英國醫生JamesParkinson報告了第一例帕金森病(Parkinson'sdisease,PD)，其主要臨床癥狀為震顫、強直、運動遲緩和姿勢步態異常。如今，PD已成為危害中、老年人健康的位居第二的神經退行性疾病(Neurodegenerativedisease,ND)。從全球范圍來看，帕金森病在西歐、北美的患病率約為70—180/10萬人，其年發病率在8—18/10萬人。其中40歲以上的成年人患病率大約為0.1%—0.2%,而65歲以上的老人更高，其患病率高達1%。國內最新流行病學調查結果顯示在55歲以上的中國人中，其患病率達1%，全國的PD患者約為500—700萬。隨著人口老齡化，PD的發病率必將進一步上升。帕金森病中神經元退行性病變的細胞和分子機制尚未完全闡明，目前主要有三種學說(1)氧化自由基損傷學說有足夠的證據表明PD患者多巴胺神經元受到氧化應激損害。PD患者死后尸檢中發現，黑質中一些氧化損害的標志物質明顯增加，包括脂質過氧化物丙二醛及過氧化氫、蛋白質和DNA的氧化產物碳酰化蛋白等。黑質DA神經元代謝活躍，消耗大量分子氧，以供線粒體呼吸，產生ATP，線粒體電子傳遞呼吸鏈滲漏即可產生活性氧(ROS)，其次DA在其合成、釋放、代謝過程中也伴有ROS的生成，引起氧化損傷。同時強抗氧化系統GSH-GSSG水平在中腦比其它腦區低。近年來生化分析研究發現，PD中黑質致密區內鐵水平升高，鐵代謝紊亂，誘發氧化應激，導致細胞死亡。(2)炎癥反應近年來諸多學者報道，PD患者腦脊液和黑質紋狀體系統中炎性細胞因子均較健康對照組增高。炎癥反應如何誘導DA能神經元變性的機制不明，目前普遍認為小膠質細胞激活釋放的致炎性細胞因子促發的毒性反應起重要作用。首先，致炎性細胞因子誘導的毒性機制主要是導致iNOS的激活，iNOS可以介導大量的NO的合成。Himot等研究發現黑質中表達iNOS的膠質細胞密度與健康組相比明顯增高。相應的PD患者CSF中亞硝酸鹽亦明顯增高，Liberatore等通過研究發現，缺乏iNOS基因的小鼠可部分對抗MPTP毒性，在基因水平進一步證實iNOS是MPTP導致DA能神經元變性所必需的；Iravani等也發現iNOS抑制劑可以部分抑制LPS誘導的DA能神經元變性。NO誘導的神經毒性可能通過幾種不同的作用機制1.NO可以與超氧自由基反應生成過氧化硝基化合物(ONOO.),ONOO—可以誘導酪胺酸殘基亞硝化生成3-硝基酪氨酸，此外ONOO—還可以啟動一系列的細胞毒性過程。在PD患者、MPTP和LPS模型的動物腦內-硝基酪氨酸免疫染色均增強進一步支持這一機制。2.NO可以破壞鐵穩態平衡，在PD患者黑質發現鐵濃度升高，鐵可通過Fentoii反應產生大量毒性自由基。此外，小膠質細胞源性致炎性細胞因子可以通過結合特定的細胞表面受體，直接促發細胞內死亡相關信號傳遞途徑。例如，在PD患者中發現膠質細胞表達TNF-a，而且其受體在黑質均增高。TNF-a可以激活Caspase途徑和神經酰胺途徑，而神經酰胺途徑不僅能放大Caspase途徑而且可以激活NF-kB，NF-icB的激活可以誘導多種炎癥相關基因的表達。Hunot等用免疫組化方法發現PD患者腦中細胞核內NF-kB呈陽性的多巴胺能神經元數量是正常人的70倍，提示NF-kB的活化與PD的發病機制密切相關。(3)基因缺陷目前研究發現IO個染色體定位以孟德爾遺傳方式與帕金森病連鎖。其中，5個涉及常染色體顯性遺傳4個以常染色體隱性遺傳方式傳遞，1個可能屬于晚發性散發帕金森病。在這些染色體定位中有4個基因已被克隆a-synuclein(突觸核蛋白)基因、parkin基因、DJ-1基因和UCH-L1基因。帕金森病主要病理特征是黑質多巴胺能神經元減少，最終導致其在紋狀體的神經末梢退變，導致紋狀體的DA含量減少，相應的膽堿能神經元活性增強，最終導致多巴胺和乙酰膽堿兩種遞質的平衡失調。表現為靜止性震顫、強直、運動緩慢及姿勢步態異常，可伴有智能減退、行為情感異常、言語錯亂等非運動癥狀以及其它合并癥。現有的治療帕金森運動癥狀的方法見表1。YanagisawaN認為21世紀藥物治療帕金森病的進展集中在以下幾個方面新的多巴胺受體激動劑的研究、神經營養因子的研究、特異性酶抑制劑的研究、肉毒素的應用及咖啡因在PD的新發現。其中除神經生長因子外都不能保護黑質多巴胺能神經元，神經生長因子雖然在動物實驗發現可保護黑質多巴胺能細胞少受神經毒素的損傷，但因其不能透過血腦屏障，必須直接大腦內注射才能有效，這一問題影響了它的使用。咖啡因是由流行病學調査發現的，但其神經保護作用在實驗室卻未得到證實。其它三類是雖然能改善PD病人的運動癥狀，但不能根本地保護黑質神經元免于死亡。從上可知，尋找新的能保護黑質多巴胺能細胞的藥物，然后結合現有改善PD運動癥狀的藥物，可有效地治療PD,提高PD患者的生活質量和存活年限，但目前為止，尚無預防或根治帕金森病的有關藥物或療法。表1.現有的治療帕金森病運動癥狀的方法<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>
發明內容本發明的目的是提供一種白果內酯在制備治療帕金森病藥物中的用途。本發明的技術方案是白果內酯是從植物葉中提取所得，近年來研究發現白果內酯有多方面的神經保護作用1.腦缺血時的神經保護作用提高細胞內細胞色素C氧化酶III亞單位和NADH脫氫酶I亞單位的mRNA水平、增加線粒體呼吸鏈3、4階段的氧耗和呼吸鏈控制速率，從而維持線粒體的氧化磷酸化，穩定線粒體的功能。2.降低低氧或低血糖時腦脊液中谷氨酸的釋放，抑制低氧或NMDA誘導的磷脂A2的激活、磷脂降解和膽堿外流，抑制GABA(A)受體的激活。3.降低無血清誘導的雞胚胎神經元的凋亡，抑制黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶系統生成的自由基誘導的PC12細胞凋亡，研究發現其能抑制早期氧化應激誘導的凋亡及減輕Caspase3、c-myc和p53的激活，減輕NO生成體3-morpholinosydnonimine對PC12細胞的細胞毒作用，并發現PC12胞內超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的水平升高，降低THP-1巨噬細胞內iNOS的蛋白和mRNA水平，增加鼠星型細胞中GDNF和VEGF的蛋白和mRNA水平。4.促外周神經再生作用。從上可知，白果內酯具有多方面的神經保護作用，包括保護線粒體、對抗神經興奮性毒性、對抗凋亡、抗氧化應激和抑制iNOS的表達。而PD發病機制中涉及到氧化應激，炎癥反應(iNOS的激活)，因此我們認為白果內酯對PD具有治療作用。目前在臨床上尚未有白果內酯單體制劑，對它的研究還在臨床前實驗研究階段。白果內酯的神經保護作用正逐漸受到重視，但迄今為止，尚未有人報道白果內酯對帕金森病的治療作用，本發明將首次探討白果內酯對實驗性帕金森病的治療作用及其機制。本發明用立體定位技術將神經毒素6-羥基多巴(6-OHDA)注射到左側大鼠黑質(Substantianigra,SN)制作PD大鼠模型。22天后，用左旋多巴(L-dopa)誘導大鼠向對側旋轉檢測大鼠的行為改變；24天后，免疫組化法測定黑質和紋狀體內酪氨酸羥化酶(TH)的表達；尼氏染色觀察黑質的病理改變。在6-OHDA注射之后，使用NF-kB核轉位抑制劑SN50,采用TUNEL和NF-kBp65熒光雙標記法探索6-OHDA誘導的黑質細胞凋亡與NF-kB的關系。黑質受損12h后，免疫組化檢測NF-kBp65、IkBouiNOS、p53、Bcl-2、HSP60蛋白的表達，24h后檢測p53蛋白的表達。分別取3h、6h、12h、24h和60h時間點，采用免疫組化法觀察腹腔注射白果內酯對NF國kBp65、lKBa、Bcl-2和iNOS的影響。實驗結果白果內酯可明顯減少L-dopa誘導的PD大鼠向對側旋轉圈數(P〈0.01);6-OHDA注射24天后，大鼠黑質TH陽性細胞大部分消失，但在腹腔注射白果內酯后，黑質TH陽性細胞存活明顯增多，其中10mg*kg-l*d-l的白果內酯的作用最強(P4.01);同時，白果內酯組大鼠同側紋狀體內TH的表達明顯高于模型組(P4.01);尼氏染色發現模型組大鼠損傷側的SN神經元大部分消失，并伴有大量的膠質細胞增生，但白果內酯組損傷側SN殘存的神經元較多，膠質細胞增生減少。黑質損傷48h時，NF-kBp65向核轉位的細胞TUNEL染色陽性，而在使用SN50后，未發生核轉位的神經元TUNEL染色明顯減少。與模型組相比，白果內酯在黑質受損3h、6h和12h時均能增強NF-kBp65向核轉位，而在24h和60h時其核轉位較模型組減少，相應的其抑制蛋白lKBa在3h、6h、12h和24h表達降低，而在60h有所增加；黑質受損后12h，白果內酯可提高黑質神經元HSP60的表達；在黑質損傷24h時發現，白果內酯可降低促凋亡蛋白p53的表達；與模型組相比，在6-OHDA注射3h、6h、12h和24h后，白果內酯組大鼠黑質iNOS蛋白的表達降低，而Bcl-2的表達升高。因此，白果內酯對帕金森病大鼠具有治療作用，其作用機制與雙向調控NF-kB的激活、降低細胞內促凋亡蛋白p53和iNOS的表達、增加抗凋亡蛋白Bcl-2和HSP60的表達有關。下面結合實施例對本發明作進一步的描述具體實施例方式實施例第一部分白果內酯對實驗性帕金森病大鼠的治療作用隨著人口老齡化，帕金森病的發病率正逐漸上升，目前的治療手段主要是藥物治療和手術治療，其中手術治療代價高，風險大，故限制了其推廣。而藥物治療現在主要有多巴胺替代療法，多巴胺受體激動劑等，對黑質神經元具有保護作用的藥物很少。我國是一個天然藥物大國，中藥資源十分豐富，基于白果內酯在抗缺血損傷，神經興奮損傷，氧化凋亡中的重要作用，而帕金森病人黑質內有在氧化應激，神經細胞凋亡等，考慮到兩者的相襯之處，故本發明將探討白果內酯對帕金森病大鼠的治療作用。材料和方法1.實驗動物SD大鼠，雄性，體重270士5g，清潔級，由蘇州大學醫學院實驗動物中心提供(生產許可證XCYK(蘇)No2002—0008，使用許可證SYXK(蘇)No2002—0037)。2.主要試劑2.1白果內酯。2.2左旋多巴，批號為013K0677,購自SIGMA公司2.3鼠抗TH單克隆抗體，購自SIGMA公司2.46-羥基多巴，批號為043K4622,購自SIGMA公司2.5水合氯醛，批號為W20040420,購自上海化學試劑公司2.6二甲亞砜，批號為0303B39，購自上海生工生物工程有限公司2.7焦油紫，購自SIGMA公司生產2.8無水乙醇，批號為0402073601，購自安徽特酒總廠2.9多聚甲醛，批號為F20010606，購自上海化學試劑廠2.10生理鹽水，批號為04030704，購自國營張家港市制藥廠2.11Triton-X100，批號為BR2681，購自華美生物工程公司2.12牛血清白蛋白，批號為BP0041,購自華美生物工程公司2.13銀杏總內酯(GGs),購自寧波利華制藥有限公司2.14CYTM3驢抗鼠IgG，批號為56908,購自JacksonImmunoresearchLaboratories,InC公司3.主要儀器3.1立體定位儀，美國Stoelting公司3.2微量注射泵，PO-2213,美國PicoPlusHarvardApparatus公司3.3振動切片機，VT1000S，德國Leica公司3.4微量進樣器，200309,中國上海醫用激光儀器廠3.5熒光顯微鏡，Te2000U，日本Nikon公司3.6脫色搖床，TY-20型，中國上海西巴斯生物技術開發有限公司4.實驗方法4.1試驗分組和給藥SD雄性大鼠，46只，體重260-280g，隨機分為六組模型組(Model),小劑量組(L-BB)，中劑量組(M-BB)，大劑量組(H-BB)，假手術組(Sham)，陽性對照組(GGs)，除假手術組6只外，其余各組均8只。白果內酯和陽性藥GGs溶解在二甲亞砜和生理鹽水的混合溶劑中(以5:4的比例混合)，小、中、大劑量組大鼠分別腹腔注射5、10、20mg-kg《(T1的白果內酯，陽性對照組大鼠腹腔注射10mgAg+d"的GGs，假手術組和模型組大鼠腹腔注射等量的混合溶劑。手術前預防給藥3天，手術后繼續給藥4天。6-OHDA溶解于生理鹽水中，濃度為4fig卞r1。除假手術組大鼠黑質內注射2fd的生理鹽水外，其余各組大鼠黑質內注射2(d的6-OHDA。4.26-OHDA損傷大鼠黑質制備PD類型實驗前預試，大鼠黑質致密部注射藍墨水后快速取腦，振動切片，鑒定注射部位是否準確，調整坐標，最后確定黑質致密部坐標為前囟后5.1mm，左旁開2.1mm,硬腦膜下7.8mm。實驗時，緩慢進針，注射速度0.4nPmiiT1，注射5min，留針lOmin。模型組和假手術組腹腔注射混合溶劑(DMSO和生理鹽水5:4混合)。手術后22天，腹腔注射50mg'kg丄d—1L-dopa誘導大鼠旋轉，注射15miii后記數各大鼠右側旋轉圈數，模型組小于lOr/min視不成功帕金森病模型。4.3大鼠腦片的制備手術24天后，4%水合氯醛(0.4g*kg-l)麻醉，打開胸腔，暴露心臟，于左心室開一小口并剪破右心耳，用0.1mol'L-V的PBS左心室灌流至流出液澄清后，用含0.1mol丄"PBS的4%多聚甲醛灌流固定，斷頭取腦，保存在含0.1mol丄'1的PBS的4%多聚甲醛，4'C保存過夜。冠狀面振動切片，45fiM。觀察針眼位置，若不在黑質部位視手術不成功并棄之。腦片在30%的甘油中-20'C保存備用。4.4免疫組化觀察大鼠黑質和紋狀體內TH蛋白的變化取上述腦片用0.1mol.L—1PBS清洗兩次，滴加1.0%牛血清白蛋白誦0.iy。TritonX-100后常溫搖床lh，取出腦片并用PBS清洗三次，滴加鼠抗TH單克隆抗體(1:3000)并在常溫下搖床lh，4'C孵育過夜。PBS清洗三次，滴加CYTM3驢抗鼠IgG(1:600)后常溫搖床lh，PBS清洗三次。鋪于載玻片，熒光封閉液覆蓋，加蓋蓋玻片，指甲油封片。熒光顯微鏡10倍物鏡下記數腦片同一冠狀面SN處的TH陽性細胞數，2倍物鏡下觀察紋狀體TH熒光密度。4.5Nissl染色檢測大鼠黑質神經元的損傷情況取上述腦冠狀切片貼于載玻片上，自然晾干后，依次浸泡在二甲苯中10min，100%的乙醇中10min，95°/。的乙醇中5min,70%的乙醇中5min，蒸餾水沖洗后放入PH值為3.9的0.5%的焦油紫溶液中染色30min，再用蒸餾水漂洗3min，然后依次在70%的乙醇，PH值為4.1的95%的乙醇，100%乙醇中脫色，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察大鼠黑質的形態學變化。實驗結果1.白果內酯對左旋多巴誘導的大鼠旋轉行為的影響左旋多巴可誘導6-OHDA損傷大鼠的健側旋轉，白果內酯和銀杏總內酯可明顯減少左旋多巴誘導的對側旋轉旋轉次數，其中10和20mg-kg—、(T1的白果內酯效果非常顯著(P<0.01)(表1.1)。提示白果內酯可減少左旋多巴誘導的大鼠對側旋轉次數。齊糧(mg'kg".d-1)nrotation(r'miiT1)假手術組6O.OO士O.OO模型組614.55±2.96^L-BB5610.07±2.69M-BB1060.00士0.0(TH-BB2060.00士0.00"GGs1060.00士0.0(T表l.l白果內酯對左旋多巴誘導的大鼠旋轉行為的影響.注統計結果采用學生t檢驗.結果以均數土標準差表示.A表示P^.05，與假手術組.*和**表示P<0.05、P<0.01，與模型組比較.2.白果內酯對大鼠黑質TH陽性細胞的影響TH免疫組化發現6-OHDA注射24天后，大鼠黑質TH陽性細胞幾乎消失。與模型組相比，白果內酯組大鼠黑質TH陽性細胞增多，其中10mg.kg^(T1的白果內酯效果最為顯著(P<0.01)，陽性藥銀杏總內酯也可減輕TH陽性細胞的缺失(表1.2，圖1.1和圖1.2)。3.白果內酯對紋狀體TH蛋白表達的影響TH免疫組化發現6-OHDA注射24天后，紋狀體TH蛋白消失明顯。而與模型組相比，白果內酯組大鼠紋狀體TH蛋白增加，其中10mg，kg^cT1的白果內酯效果最為顯著(P<0.01)，陽性藥銀杏總內酯也可減輕TH熒光密度的消失(圖1.3)。假手術組6217.33±16.10模型組64.67±1.21AAL-BB566.67±2.25M-BB10656.50±17.78**H誦BB20641.00±13.28**GGs10648.67±7.97**表1.2白果內酯對大鼠黑質殘存TH陽性細胞的影響.注統計結果采用學生t檢驗.結果以均數士標準差表示.AA表示P<0.01，與假手術組比較.*和**表示P<0.05、P<0.01，與模型組比較.圖1.1損傷黑質內TH陽性細胞數.注統計結果采用學生t檢驗.結果以均數±標準差表示.#和##表示P<0.05、P<0.01，與假手術組比較.*和**表示P<0.05、P<0.01，，與模型組比較.n-6圖1.2TH免疫組化顯示白果內酯對損傷黑質內TH陽性細胞的保護作用.假手術組A(X20)和H(X200).模型組B(X20)和I(X200).L-BB:C(X20)和dJ(X200).M-BB:D(X20)和K(X200).H誦BB:E(X20)和L(X200).GGs:F(X20)和M(X20O).藍色箭頭指的是TH陽性細胞.圖1.3免疫熒光顯示白果內酯對同側紋狀體TH熒光強度的影響.(I)假手術組A，模型組B，L-BB:C，M-BB:D，GGs:E(X20).(II)圖像分析軟件分析各組大鼠(n=6)同側紋狀體TH平均熒光強度.統計結果采用學生t檢驗.結果以均數土標準差表示.##表示P<0.01，與假手術組比較.*和**表示卩<0.05、P<0.01，與模型組比較.4.Nissl染色檢測白果內酯對黑質形態學變化的影響Nissl染色發現6-OHDA注射24天后，模型組大鼠黑質神經元幾乎消失并伴有大量的膠質細胞增生。而與模型組相比，白果內酯組大鼠黑質神經元較多，膠質細胞增生減少，其中10mg'kg《d—1的白果內酯效果最為顯著，陽性藥GGs也可減輕神經元的缺失(圖1.4)。圖1.4白果內酯對6—OHDA損傷黑質神經元的保護作用.大鼠預先服用白果內酯并用6—OHDA損傷.Nissl染色大鼠腦片.假手術組A(X20)和G(X200).模型組B(X20)和H(X200).L-BB:C(X20)和I(X200).M-BB:D(X20)和J(X200).H-BB:E(X20)和K(X200).GGs:F(X20)和L(X200).綠色和黃色箭頭分別指向神經元和膠質細胞.小結1.大鼠在6-OHDA損傷22天后，L-dopa誘導的大鼠向對側旋轉作用可被白果內酯抑制。2.白果內酯可抑制6-OHDA產生的大鼠黑質TH陽性細胞及同側紋狀體內TH蛋白減少作用。3.白果內酯可抑制6-OHDA產生的大鼠黑質神經元減少和膠質細胞增生作用。以上結果提示白果內酯對6-OHDA所致實驗性大鼠帕金森病具有一定的治療作用。第二部分白果內酯對實驗性帕金森病大鼠治療作用的機制研究一、白果內酯對6-OHDA損傷大鼠黑質DA神經元NF-kB通路激活的影響Hunot等用免疫組化方法發現PD患者腦中細胞核內NF-kB呈陽性的多巴胺能神經元數量為正常人的70倍，提示NF-kB的激活與PD的發病機制有關，NF-kB是一種重要的核轉錄因子，在調控細胞凋亡中發揮關鍵作用。因此我們在這部分實驗中主要觀察在6-OHDA誘導的黑質DA神經元死亡過程中細胞凋亡與NF-kB的關系，同時探討白果內酯對NF-kB及其抑制蛋白lKBa的影響。材料與方法1.實驗動物SD大鼠，雄性，體重270士5g,由蘇州大學醫學院實驗動物中心提供(生產許可證XCYK(蘇)No2002—0008，使用許可證SYXK(蘇)No2002—0037)。2.主要試劑2.2兔抗NF-kBp65多克隆抗體，批號為弁J119，購自SantaCruz公司2.3鼠抗TH單克隆抗體，購自SIGMA公司2.4兔抗IKBa多克隆抗體，批號為弁H259，購自SantaCruz公司2.5InSituCellDeathDetectionKit,POD，批號為11684817910，購自Roch公司2.6CYTM3驢抗兔IgG，購自JacksonImmunoresearchLaboratories'InC公司2.7FITC驢抗鼠IgG，購自JacksonImmunoresearchLiaboratories，InC公司2.8FITC驢抗兔IgG，購自JacksonImmunoresearchLaboratories，InC公司3.主要儀器3.1激光共聚焦顯微鏡，SP2，德國Leica公司3.2電熱鼓風干燥箱，CS101-2EB，重慶四達實驗儀器有限公司實驗方法4.1不同劑量的白果內酯對大鼠黑質lKBa蛋白的影響4.1.1實驗分組和給藥方案SD雄性大鼠，34只，體重260-280g，隨機分為五組模型組(Model),小劑量組(L-BB)，中劑量組(M-BB)，大劑量組(H-BB)，假手術組(Sham),除假手術組6只外，其余各組均7只。白果內酯溶解在二甲亞砜和生理鹽水的混合溶劑中(以5:4的比例混合)，小、中、大劑量組大鼠分別腹腔注射5、10、20mg，kg丄d"的白果內酯，假手術組和模型組大鼠腹腔注射等量的混合溶劑。手術前預防給藥3天。大鼠黑質內注射6-OHDA方法同論文第一部分所述。4.1.2免疫組化腦片制備取6-OHDA損傷后12h時間點大鼠。免疫組化腦片制備方法見第一部分4.34.1.3免疫組化觀察大鼠黑質lKBa蛋白的變化免疫組化方法見第一部分4.4，其中兔抗lKBa多克隆抗體的稀釋度為1:50,CYTM3驢抗兔IgG為1:800。4.2不同時間點白果內酯對大鼠黑質lKBa蛋白的影響4.2.l實驗分組和給藥方案90只SD雄性大鼠，260-280g，隨機分為三組模型組(Model),中劑量組(M-白果內酯)，假手術組(Sham)，除假手術組6只外，其余各組均42只。白果內酯溶解在二甲亞砜和生理鹽水的混合溶劑中(以5:4的比例混合)，中劑量組大鼠腹腔注射10mg，kg"-cT1的白果內酯，假手術組和模型組大鼠腹腔注射等量的混合溶劑。手術前預防給藥3天。大鼠黑質內注射6—OHDA如同論文第一部分所述。4.2.2免疫組化腦片制備分別取黑質損傷后3h、6h、12h、24h、48h和60h不同時間點的模型組和中劑量組大鼠各7只，假手術在3h時間點6只。免疫組化腦片制備方法見第一部分4.3。4.2.3免疫組化觀察黑質lKBa蛋白的變化方法同本節4.1.3。4.3不同劑量白果內酯對大鼠黑質DA神經元中NF-KB激活的影響4.3.1實驗分組和給藥方案方法同本節4.1.1。4.3.2免疫組化腦片制備腦片是本節4.1.2保存的腦片。4.3.3免疫組化雙標記觀察大鼠黑質DA神經元中NF-kB蛋白的變化取上述腦片用0.1MPBS清洗兩次，滴加1.0。/。牛血清白蛋白-0.1。/。TritonX-100后常溫搖床lh，取出腦片并用O.lmol'I/1PBS清洗三次，滴加鼠抗TH單克隆抗體(1:3000)和兔抗NF-kBp65多克隆抗體(1:40)，并在常溫下搖床1h，4'C孵育2天。0.1MPBS清洗三次，先滴加FITC驢抗鼠IgG(1:600)，常溫搖床1h，PBS清洗三次。滴加CYTM3驢抗兔IgG(1:800)后常溫搖床lh，0.1rnol.I/1PBS清洗三次。鋪于載玻片，熒光封閉液覆蓋，加蓋蓋玻片，指甲油封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察黑質TH陽性細胞內NF-kBp65的轉位。4不同時間點白果內酯對黑質DA神經元中NF-KB激活的影響4.4.1實驗分組和給藥方案方法同本節4.2.1。4.4.2免疫組化腦片制備腦片是本節4.2.2保存的腦片。4.4.3免疫組化雙標記觀察黑質DA神經元中NF-kB蛋白的變化方法同本節4.3.3。熒光雙標記檢測NF-kB與細胞凋亡的關系4.5.1實驗分組和給藥方案SD雄性大鼠，12只，體重260-280g，隨機分為三組模型組(Model),假手術組(Sham)，SN50組，每組4只。模型組大鼠黑質內先注射2fil的6-OHDA(4jig卞l—4后留針5min,后注射1(il無生物活性的SN50(10ng卞l—"，留針10min。SN50組大鼠黑質內先注射2fil的6-OHDA(4ng卞l—^后留針5min，后注射1nl的SN50(—種選擇性的NF-kB核轉位抑制劑，10Hg卞廠"，留針10min。假手術組大鼠黑質內先注射2jil的生理鹽水后留針5min，之后注射1fil的生理鹽水(10ng^1—"，留針10min。黑質坐標如前所述。4.5.2大鼠腦片的制備取6-OHDA注射后48h時間點大鼠。腦片的制備方法同第一部分4.3。4.5.3熒光雙標記檢測NF-kB與細胞凋亡的關系取上述腦片用0.1mol.L—1PBS清洗兩次，滴加1.0%牛血清白蛋白-0.1%TritonX-100后常溫搖床lh,取出腦片并用PBS清洗三次，滴加兔抗p65多克隆抗體(1:40)并在常溫下搖床1h，4'C孵育48h。PBS清洗三次，滴加FITC驢抗兔IgG(1:600)后常溫搖床1h，PBS清洗三次。鋪于載玻片，維持腦片潮濕，滴加TUNEL反應液于腦片上并加蓋一層塑料薄膜，放于潮濕的盒子中，在37"C電熱鼓風干燥箱中孵育1h，取出腦片用0.1mol丄—的PBS清洗干凈，最后熒光封閉液覆蓋，加蓋蓋玻片，指甲油封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察黑質p65及TUNEL染色共表達。實驗結果1.不同劑量的白果內酯對大鼠黑質lKBa蛋白的影響實驗發現，與假手術組比較，在黑質內注射6-OHDA后12h時，模型組大鼠黑質lKBa蛋白的表達降低(P^).01)。與比模型組相比，各白果內酯組大鼠黑質神經元內lKBa的表達的更低(P〈0.01)，其中10mg'kg—^d—1的白果內酯組最能促進大鼠黑質lKBa蛋白表達下降(圖2.1-1.11)。2.不同時間點白果內酯對黑質lKBa蛋白的影響在黑質損傷后3h、6h、12h、24h和60h時，與假手術組相比，模型組大鼠黑質IkBoi的表達逐漸降低(P〈0.01)。同模型組比較，10mg'kg"'(T1的白果內酯組大鼠黑質神經元內lKBa表達在3h、6h、12h和24h時較低(P〈0.01)，而在60h時表達升高(P〈0.01)(圖2.2-I.11)。3.不同劑量白果內酯對大鼠黑質DA神經元中NF-KB激活的影響結果發現，大鼠黑質損傷12h時，模型組大鼠TH陽性細胞內NF-kBp65的核轉位顯著；與模型組大鼠比較，白果內酯各劑量組均可增強NF-KBp65在該時間點的轉位，其中10mg'kg人d"的白果內酯作用最強(圖2.3)。4.不同時間點白果內酯對大鼠黑質DA神經元中NF-KB激活的影響在黑質損傷后3h、6h、12h、24h和60h時，模型組大鼠黑質TH陽性細胞中NF-kBp65的核轉位逐漸增強，在24h時達到高峰，之后持續激活。10mg*kg—、d"的白果內酯對NF-kBp65的核轉位影響不一，其中在3h、6h和12h時能促進其核轉位，而到24h和60h時又能抑制NF-kBp65的核轉位(圖2.4-2.8)。5.熒光雙標記檢測大鼠黑質NF-kB與細胞凋亡的關系實驗發現，假手術組大鼠黑質內未發現TUNEL染色，p65蛋白也未發生核轉位，模型組大鼠黑質有大量的TUNEL染色陽性細胞，p65發生了核轉位的細胞也共表達了TUNEL染色。而SN50組大鼠黑質內TUNEL染色相對減弱，大部分細胞未發現核轉位的p65，這些細胞中未發生TUNEL染色。(圖2.9)。圖2.1黑質內注射6-OHDA12h后IkBa的表達.(I)A:假手術組，B:模型組，C:L-BB.D:M-BB.E:H-BB.藍色箭頭指向黑質神經元.(X400)(n)黑質內IkBci陽性細胞數.注統計結果采用學生t檢驗.結果以均數士標準差表示.##表示P<0.01，與假手術組比較.*和**分別表示P<0.05、P<0.01，與模型組比較.11=6圖2.2黑質損傷后不同時間點白果內酯對IkBa表達的影響.(I)假手術組A，模型組B、D、F、H、J，M國BB:C、E、G、I、K.6—OHDA注射后3h:B和C，6—OHDA注射后6h:D和E，6—OHDA注射后12h:F和G，6—OHDA注射后3h:H和I，6—OHDA注射后60h:J和K.藍色箭頭指向黑質神經元.(X400)(II)黑質內注射6-OHDA后IkBa陽性細胞數的變化.統計結果采用學生t檢驗.結果以均數土標準差表示.##表示P<0.01，與假手術比較.**表示P<0.01，與模型組比較.11=6圖2.3黑質內注射6-OHDA12h后白果內酯對TH陽性細胞內NF-kBp65核轉位的影響.在6-OHDA損傷的黑質內TH陽性細胞內發現核內有p65存在.這種核轉位可被白果內酯加強其中M-BB效果最強.綠色和紅色熒光分別代表TH和NF-kBp65，.標尺20jim.圖2.4黑質損傷3h后TH陽性細胞內發祥p65發生了核轉位.這種核轉位可被M-BB加劇.綠色和紅色熒光分別代表TH和NF-KBp65，.標尺20fim.圖2.5黑質內注射6-OHDA6h后白果內酯對TH陽性細胞內NF-kBp65核轉位的影響.在6-OHDA損傷的黑質內TH陽性細胞內發現核內有p65存在.這種核轉位可被M-BB加劇.綠色和紅色熒光分別代表TH和NF-kBp65，.標尺20(im.圖2.6黑質內注射6-OHDA12h后白果內酯對TH陽性細胞內NF-kBp65核轉位的影響.在6-OHDA損傷的黑質內TH陽性細胞內發現核內有p65存在.這種核轉位可被M-BB加強.綠色和紅色熒光分別代表TH和NF誦kBp65，.標尺20fim.圖2.7黑質內注射6-OHDA24h后白果內酯對TH陽性細胞內NF-kBp65核轉位的影響.在6-OHDA損傷的黑質內TH陽性細胞內發現核內有p65存在.這種核轉位可被M-BB減輕.綠色和紅色熒光分別代表TH和NF陽kBp65，.標尺20拜.圖2.8黑質內注射6-OHDA60h后白果內酯對TH陽性細胞內NF-kBp65核轉位的影響.在6-OHDA損傷的黑質內TH陽性細胞內發現核內有p65存在.這種核轉位可被M-BB減輕.綠色和紅色熒光分別代表TH和NF-kBp65，.標尺20拜.圖2.9黑質內注射6-OHDA48h后，p65核轉位抑制劑SN50對6-OHDA誘導的細胞凋亡的影響.在6-OHDA損傷黑質內發現核內p65核TUNEL染色共表達于同一細胞中.但在使用SN50后，未發生p65核轉位的神經元TUNEL染色減少，TUNEL陽性細胞明顯減少.p65和TUNEL染色共表達由激光共聚焦顯微鏡檢測所得.標尺40fim.二、白果內酯對6-OHDA損傷大鼠黑質促凋亡蛋白p53、iNOS表達的影響PD患者黑質區可見小膠質細胞和巨噬細胞劇增，iNOS的表達和活性大為提高，且伴隨黑質區DA神經元的喪失，提示iNOS可能在PD的發生和發展中具有重要作用。病理條件下，iNOS的表達和活性增高可誘導產生過多的NO，過多的NO可以介導細胞損傷。iNOS蛋白是NF-kB核轉錄因子的下游調控蛋白，我們在這部分觀察了白果內酯對6-OHDA損傷大鼠SN內iNOS蛋白的影響。p53蛋白是一種腫瘤抑制物也是一種重要的凋亡促進蛋白，當細胞的DNA受到輻射等因素損傷時，p53的N-末端會因磷酸化而影響其和DNA結合的能力，從而被激活，誘導細胞生長停滯、衰老、分化、凋亡及介導DNA修復。p53基因又是NF-kB下游調控基因，我們的前文的實驗發現白果內酯對NF-kB有調控作用，本節觀察白果內酯對6-OHDA損傷大鼠黑質p53蛋白表達是否有調控作用。材料與方法1.實驗動物SD大鼠，雄性，體重270士5g，由蘇州大學醫學院實驗動物中心提供(生產許可證XCYK(蘇)No2002—0008，使用許可證SYXK(蘇)No2002—0037)。2.主要試劑2.1白果內酯。2.26-羥基多巴，批號為043K4622,購自SIGMA公司2.3兔抗iNOS多克隆抗體，批號為12004，購自中杉金橋生物公司2.4CYTM3驢抗兔IgG，購自JacksonImmunoresearchLaboratories，InC公司2.5鼠抗p53單克隆抗體，批號為#1018,購自SantaCruz公司2.6免疫組化超敏SP試劑盒，批號為Kit—9706/9707/9708，購自福州邁新生物技術開發有限公司2.7蘇木精，購自上海化學試劑公司3.主要儀器同上節34.實驗方法4.1不同劑量的白果內酯對大鼠黑質iNOS蛋白的影響4.1.1實驗分組和給藥方案方法同本部分第一節4.1.14.1.2免疫組化腦片制備腦片是本部分第一節4.1.2保存的腦片。4.1.3免疫組化觀察黑質iNOS蛋白的變化方法同本部分第一節4.1.3，兔抗iNOS多克隆抗體的稀釋度為1:40。4.2不同時間點白果內酯對大鼠黑質iNOS蛋白的影響4.2.1實驗分組和給藥方案方法同本部分第一節4.2.14.2.2免疫組化腦片制備腦片是方法同本部分第一節4.2.2保存的腦片。4.2.3免疫組化觀察大鼠黑質iNOS蛋白的變化免疫組化方法同本部分第一節4.2.3，兔抗iNOS多克隆抗體的稀釋度為4.3不同劑量的白果內酯對大鼠黑質p53蛋白的影響4.3.1實驗分組和給藥方案方法同本部分第一節4.1.14.3.2免疫組化腦片制備損傷24h時，大鼠4%水合氯醛(0.4g*kg—"麻醉，打開胸腔，暴露心臟，于左心室開一小口并剪破右心耳，用0.1mol.I/1的PBS左心室灌流至流出液澄清后，以含0.1mol丄"PBS的4。/。多聚甲醛灌流固定，斷頭取腦，保存在含0.1mol'L—1的PBS的4%多聚甲醛中固定6天，脫水，石蠟包埋，冠狀面石蠟切片，片厚2fiM。4.3.3免疫組化觀察黑質p53蛋白的變化免疫組化根據SP超敏試劑盒說明操作(鼠抗p53單克隆抗體的稀釋度為1:40)，最后蘇木精復染。顯微鏡IO倍物鏡下計數黑質p53陽性細胞數，40倍物鏡下攝影。實驗結果1.不同劑量的白果內酯對大鼠黑質iNOS蛋白的影響結果發現，與假手術組比較，黑質損傷12h時模型組大鼠黑質細胞大量表達iNOS。白果內酯使6-OHDA損傷大鼠黑質內iNOS陽性細胞數減少(P<0.01)。其中10mg-kg-、d—1的白果內酯大鼠黑質最為顯著(圖2.10—i.n)。2.不同時間點白果內酯對大鼠黑質iNOS蛋白的影響在黑質損傷后3h、6h、12h和24h的時間點發現模型組的大鼠黑質iNOS表達比正常對照組明顯升高(P<0.01)，在12h時表達到高峰。10mg'kg-^d-1的白果內酯在3h、6h、12h、24h時間點都能明顯降低iNOS的表達(P<0.01)(圖2.10—I.11)。不同劑量的白果內酯對大鼠黑質p53蛋白的影響結果發現，與正常對照組相比，24h時模型組大鼠黑質p53的表達顯著增加"<0.01)。5mrkg《cT1的白果內酯與模型組比較無差異性，但10、20mg.kg—、d-i的白果內酯組大鼠黑質內p53的表達明顯降低(P〈0.05)(圖2.12—III)。圖2.10黑質內注射6-OHDA12h后iNOS的表達.(I)A:假手術組，B:模型組，C:L-BB.D:M-BB.E:H-BB.(X400)(II)大鼠黑質內iNOS陽性細胞數.統計結果采用學生t檢驗.結果以均數土標準差表示.##表示P<0.01，與假手術組比較.**表示P〈0.01，與模型組比較.n=6圖2.11黑質損傷后不同時間點白果內酯對iNOS表達的影響.(I)假手術組A，模型組B、D、F、H，M-BB:C、E、G、I.6-OHDA注射后3h:B和C，6-OHDA注射后6h:D和E，6-OHDA注射后12h:F和G，6-OHDA注射后24h:H和I.(X400)(II)黑質內注射6-OHDA后iNOS陽性細胞數的變化.統計結果采用學生t檢驗.結果以均數士標準差表示.##表示P<0.01，與假手術比較.**表示PO.01，與模型組比較.n=6圖2.12黑質內注射6-OHDA24h后p53的表達.(I)A:假手術組，B:模型組，C:L-BB.D:M-BB.E:H-BB.紅色箭頭指向黑質內神經元(X400)(II)大鼠黑質內p53陽性細胞數.統計結果采用學生t檢驗.結果以均數士標準差表示.##表示P<0.01，與假手術組比較.*表示P〈0.05，與模型組比較.n=6三、白果內酯對6-OHDA損傷大鼠黑質抗凋亡蛋白Bcl-2、HSP60表達的影響Bcl-2蛋白是一種重要的凋亡抑制蛋白，增加Bcl-2蛋白的表達在PD的治療中具有重要的意義。目前，基因水平治療PD主要是轉基因治療，但還處于實驗階段，Bcl-2基因是PD的治療基因之一。白果內酯以前未見報道有調控Bcl-2的作用，因此我們通過6-OHDA誘導Bcl-2表達降低，在此基礎上觀察白果內酯對Bcl-2表達的影響。HSP60屬于熱激蛋白，主要存在與線粒體內，在胞漿內也有少量表達，在維護細胞穩定和保護細胞免受應激及其它損傷中具有重要作用。HSP60在6-OHDA誘導的大鼠黑質DA細胞損傷中的作用未見報道，前文我們發現白果內酯對Bcl-2表達有升高作用，而HSP60可升高Bcl-2的表達，為了探討白果內酯升高Bcl-2表達是否與HSP60有關，本研究通過觀察6-OHDA注射大鼠黑質后HSP60的表達情況，白果內酯對HSP60的干預作用，探討BB神經保護作用是否與HSP60相關。材料與方法1.實驗動物SD大鼠，雄性，體重270士5g，由蘇州大學醫學院實驗動物中心提供(生產許可證XCYK(蘇)No2002—0008，使用許可證SYXK(蘇)No2002—0037)c2.主要試劑2.1兔抗Bcl-2多克隆抗體，批號為弁G1403，購自SantaCruz公司2.2兔抗HSP60多克隆抗體，購自SantaCruz公司3.主要儀器3.1立體定位儀，美國Stoelting公司3.2微量注射泵，PO隱2213，美國PicoPlusHarvardApparatus公司3.3振動切片機，VTIOOOS，德國Leica公司3.4熒光顯微鏡，Te2000U,日本Nikon公司4.實驗方法4.1不同劑量的白果內酯對大鼠黑質Bcl-2蛋白的影響方法同本部分第二節4.3.1，其中大鼠在6-OHDA注射12h后進行免疫組化實驗。不同時間點白果內酯對大鼠黑質Bcl-2蛋白的影響4.2.1實驗分組和給藥方案方法同本部分第一節4.2.1。4.2.2免疫組化腦片制備腦片是本部分第一節4.2.2保存的腦片。4.2.3免疫組化觀察大鼠黑質Bcl-2蛋白的變化方法同本部分第一節4.1.3。不同劑量的白果內酯對大鼠黑質HSP60蛋白的影響4.3.1實驗分組和給藥方案方法同本部分第一節4.1.1。4.3.2免疫組化腦片制備腦片是本部分第一節4.1.2保存的腦片。4.3.3免疫組化觀察大鼠黑質HSP60蛋白的變化方法同本部分第一節4.1.3。實驗結果1.不同劑量的白果內酯對大鼠黑質Bcl-2蛋白的影響與正常對照組比，模型組黑質神經元內Bcl-2的表達減少(P〈0.01)，各劑量的白果內酯可不同程度地增加bcl-2的表達，其中10mg'kg—、d—1的白果內酯作用最強(P〈0.01)(圖2.13-I.11)。2.不同時間點白果內酯對大鼠黑質Bcl-2蛋白的影響不同時間點的免疫組化觀察發現，在3h時模型組大鼠黑質內Bcl-2表達就顯著降低(PO.Ol)，相應的此時IOmg'kg人d"的白果內酯組大鼠Bcl-2表達升高(P〈0.01)。同樣，在6h、12h和24h時間點，模型組大鼠黑質內Bcl-2表達逐漸、持續降低，其中在3h-6h時間段降低幅度較大，到24h時，其表達幾乎消失。與模型組相比，10mgAg^(T1的白果內酯組大鼠黑質在各吋間點都能明顯升高Bcl-2的表達(P〈0.01)，在6h達到高峰(圖2.14—I.11)。3.免疫組化檢測大鼠黑質HSP60的表達結果發現，與正常對照組相比，12h時模型組大鼠黑質HSP60的表達明顯減少(P<0.01)。5mg.kg-hd-l的白果內酯大鼠黑質與模型組比較無差異性，但10、20mg*kg-l'd-l的白果內酯可顯著增加HSP60的表達(P<0.05，P<0.01)(圖2.15—I.11)0圖2.13黑質內注射6-OHDA12h后Bcl-2的表達.(I)A:假手術組，B:模型組，C:L-BB.D:M-BB.E:H-BB.紅色箭頭指向黑質神經元.(X400)。(II)黑質內Bcl-2陽性細胞數.注統計結果采用學生t檢驗.結果以均數±標準差表示.##表示P<0.01，與假手術組比較.*和**分別表示P<0.05和P<0.01，與模型組比較.n-6圖2.14黑質損傷后不同時間點白果內酯對Bcl-2表達的影響.(I)假手術組A，模型組B、D、F、H，M-BB:C、E、G、I.6-OHDA注射后3h:B和C，6-OHDA注射后6h:D和E，6-OHDA注射后12h:F和G，6-OHDA注射后24h:H和I.藍色箭頭指向黑質神經元.(X400)(II)黑質內注射6-OHDA后Bcl-2陽性細胞數的變化.統計結果采用學生t檢驗.結果以均數土標準差表示.##表示P<0.01，與假手術組比較."表示P〈0.01，與模型組比較.n=6圖2.15黑質內注射6-OHDA12h后HSP60的表達.(I)A:假手術組，B:模型組，C:L-BB.D:M-BB.E:H-BB.藍色箭頭指向黑質神經元.(X400)(II)大鼠黑質HSP60陽性細胞數.統計結果采用學生t檢驗.結果以均數土標準差表示.##表示P<0.01，與假手術組比較.*和**分別表示P<0.05和P<0.01，與模型組比較.n-6小結在本實驗條件下，白果內酯對實驗性帕金森病大鼠的治療作用與下列機制有關一.白果內酯對6-OHDA損傷大鼠黑質NF-KB通路激活的影響l.大鼠黑質內注射6-OHDA誘導NF-kB的抑制蛋白lKBa的降解在3h、6h、12h、24h、60h呈逐漸增強趨勢，24h開始加快，60h時表達幾乎消失；白果內酯在3h、6h、12h和24h時間點可加劇lKBa的降解，而在60h時抑制其降解。2.大鼠黑質內注射6-OHDA誘導黑質TH陽性細胞內的p65發生核轉位，12h后逐漸增強，在24h時達到髙峰，之后持續激活。白果內酯在3h、6h和12h時能促進p65發生核轉位，而到24h和60h時又能抑制NF-kBp65的核轉位。3.大鼠黑質內注射6-OHDA誘導的TUNEL陽性染色與p65核轉位平行，共表達于同一神經元中。而NF-kB轉位抑制劑SN50可減輕p65核轉位，TUNEL染色明顯減少，提示NF-kB的激活對6-OHDA誘導的細胞凋亡有促進作用。二.白果內酯對6-OHDA損傷大鼠黑質促凋亡蛋白p53、iNOS表達的影響1.大鼠黑質內注射6-OHDA后3h、6h、12h、24h，黑質細胞表達iNOS逐漸增強，在12h達到高峰，白果內酯可降低各個時間點iNOS的表達。2.大鼠黑質內注射6-OHDA后24h，可明顯增加黑質p53的表達，白果內酯可抑制其表達。三.白果內酯對6-OHDA損傷大鼠黑質抗凋亡蛋白Bc卜2、HSP60表達的影響1.6-OHDA損傷大鼠黑質后6h、12h，Bcl-2的表達逐漸降低，24h時幾乎消失，白果內酯可恢復其表達，其作用在6h達到高峰，之后逐漸減弱。2.大鼠黑質內注射6-OHDA12h后，可使黑質HSP60表達下降，白果內酯可恢復其表達量。以上結果提示1.NF-kB通路激活參與6-OHDA誘導的黑質神經元死亡，白果內酯的神經保護作用與其調控NF-kb激活有關。2.白果內酯通過降低NF-kB的下游靶蛋白p53、iNOS的表達發揮抗凋亡作用3.白果內酯通過升高抗凋亡蛋白Bcl-2、HSP60的表達發揮抗凋亡作用討論一.白果內酯對帕金森病大鼠的治療作用給大鼠單側黑質內注射6-OHDA制備6-OHDA單側損傷大鼠PD模型，因單側紋狀體內DA耗竭，表現為自發運動和身體姿勢不對稱，比如自發旋轉。由于單側DA耗竭和DA受體超敏，某些DA受體激動劑可誘導單側黑質一紋狀體通路損傷大鼠對側旋轉，這種藥物誘導的旋轉與大鼠DA耗竭及不對稱的DA受體激動相平行，DA耗竭越嚴重旋轉越厲害，DA受體激動的程度越高，旋轉也越嚴重。因此DA受體激動劑誘導的大鼠旋轉行為可反應大鼠黑質一紋狀體通路的損傷程度。目前常用于誘導單側損傷模型大鼠旋轉的藥物有阿樸嗎啡(健側旋轉)、L-dopa(健側旋轉)。我們的實驗發現，6-OHDA損傷后L-dopa誘導大鼠健側旋轉(IOr.miiT1以上)，這時的紋狀體內TH染色幾乎消失，說明黑質紋狀體通路已經被嚴重損傷，在給予白果內酯治療后能夠明顯減少L-dopa誘導大鼠對側旋轉次數，提示白果內酯能夠減輕損傷側紋狀體內DA受體的超敏和DA耗竭，改善PD大鼠的行為缺陷。免疫組化觀察發現，6-OHDA單側損傷大鼠模型中，TH陽性細胞明顯減少，白果內酯能夠保護大鼠黑質多巴胺能細胞，提示白果內酯對實驗性PD大鼠具有治療作用。為了進一步證實白果內酯保護黑質紋狀體通路免受6-OHDA的神經毒性，我們用TH免疫組化法觀察了黑質DA陽性細胞投射在紋狀體的神經末梢狀況，實驗發現6-OHDA可使紋狀體TH染色消失，由此提示黑質DA陽性細胞投射在紋狀體的神經末梢發生了根本性的退變；而白果內酯能夠增加紋狀體內的TH陽性密度，也就是保護了黑質DA神經元投射在紋狀體的神經末梢。為了證實6-OHDA誘導的黑質神經元死亡，我們進一步的Nissl染色實驗觀察了黑質神經元胞體的存活情況。實驗發現，6-OHDA誘導黑質神經元死亡，并伴有大量的膠質細胞增生，而在使用白果內酯干預后，6-OHDA損傷大鼠黑質神經元數目明顯增多，膠質細胞增生減少。提示白果內酯可保護黑質神經元抵抗6-OHDA的神經毒性。由上可知，白果內酯通過保護黑質DA神經元，抑制6-OHDA損傷所致黑質DA神經元投射在紋狀體上的神經末梢退變，減輕紋狀體DA的耗竭和DA受體超敏，從而保護大鼠黑質一紋狀體通路，由此減少6-OHDA損傷所致L-dopa誘導大鼠健側旋轉次數，改善PD大鼠的行為缺陷，提示白果內酯對實驗性帕金森病大鼠有一定的治療作用。1.白果內酯調控6-OHDA損傷大鼠黑質NF-kB通路激活NF-KB是一種能與免疫球蛋白K輕鏈基因的增強子KB序列特異結合的蛋白因子，在細胞受到氧化應激、炎癥介質、病毒感染等多種刺激后，NF-kB可被激活，從而啟動相關基因的轉錄，在機體的器官發育、炎癥反應、感染和組織損傷中發揮重要作用。目前，國內外許多文章報道了NF-kB和細胞凋亡的關系，有些學者認為NF-kB抗細胞凋亡，而有些則認為NF-kB可以誘導細胞凋亡。多數研究結果認為NF-kB在細胞凋亡中具有雙向作用，既能保護細胞免于凋亡又能促進凋亡，其不同作用可能與活化時間、部位、誘導因子、調控不同的靶基因DNA序列而轉錄不同蛋白質進而影響凋亡的進程、與其同時激活的其它信號轉導途徑的影響等密切相關。我們的實驗發現，在6-OHDA損傷后3hNF-KB未被激活，而在6h時開始激活并進入核內，隨著時間的后推，其激活程度逐漸增強，在24h時達到高峰，60h時持續高表達，與此相對應的，其胞漿內抑制蛋白lKBa在6-OHDA損傷后逐漸降解，3h-6h時變化相對較小，在12h時顯著，表現為胞漿內表達減少，核內表達增加，而在24h、60h時其表達幾乎消失。提示NF-kB信號通路的激活參與了6-OHDA誘導的黑質神經細胞凋亡。Tunel與p65雙標記實驗發現，6-OHDA損傷后60h時，在黑質處，NF-kB激活的神經元Tunel染色陽性，但在使用NF-kB核轉位抑制劑SN50后，黑質凋亡的神經細胞明顯減少，NF-kB未激活的神經元Tunel染色較少，提示NF-kB在6-OHDA注射后60h可促進黑質神經元的凋亡。而大鼠在預先給予白果內酯后，發現在6-OHDA損傷早期的3h-12h時，白果內酯可誘導NF-kB的核轉位及其抑制蛋白lKBa的降解，而在黑質損傷后24h、60h時可明顯抑制NF-kB的激活，且增加其抑制蛋白lKBa表達，故我們推測白果內酯抑制6-OHDA誘導的多巴胺能細胞凋亡與其調控NF-kB的激活有關。其損傷早期觀察到的白果內酯促進NF-kB激活，可能原因有兩個在黑質損傷早期，白果內酯確實能促進NF-kB激活；另外一個原因可能是模型組大鼠黑質在6-OHDA的損傷下黑質神經元已經大量死亡，而白果內酯組大鼠因為給予了神經保護劑白果內酯，使得大部分的黑質神經元免于凋亡，這時觀察到的白果內酯促進NF-kB激活可能與白果內酯組大鼠黑質細胞數較多有關。有趣的是，在大鼠黑質損傷6h時，白果內酯上調Bcl-2表達的作用最強，而這時其又能促進NF-kB的激活，有文獻報道Bcl-2通過激活NF-kB保護細胞免受凋亡，同樣的也有文獻報道了NF-kB保護細胞是通過上調Bcl-2的表達，因此我們推測在黑質損傷早期這兩者之間相互促進，共同發揮抗細胞凋亡作用。但在6-OHDA損傷后24h、60h,NF-kB的持續激活可能與細胞凋亡密切相關，我們的Tunel與p65雙標記實驗證實了這點，相反地，這個時間段內發現白果內酯可明顯抑制NF-kB的激活及增加IkB(x的表達，提示白果內酯保護受6-OHDA損傷的黑質多巴胺能細胞的機制之一可能是在損傷早期先激活NF-kb發揮抗凋亡作用，而后在NF-kB發揮促凋亡作用時抑制其活化。2.白果內酯下調6-OHDA損傷大鼠黑質促凋亡蛋白p53、iNOS的表達前文我們探討了白果內酯調控6-OHDA損傷大鼠黑質NF-kB的作用，而受其調控的下游靶蛋白iNOS和p53在細胞凋亡中具有重要作用，因此我們研究了白果內酯對它們表達的影響。自從1987年Palmer等發現血管內皮細胞可以合成一氧化氮以來(NO)，其在生理、病理、藥理等的廣泛作用已越來越引起人們的重視。目前的研究業已證明NO有第二信使和神經遞質的性能，在一定的條件下NO又能對神經細胞產生毒性作用。NO在體內是由L-精氨酸和分子氧在三種不同的一氧化氮合酶(NOS)催化下生成的。根據NOS的細胞或組織來源不同，將NOS分為三型nNOS(神經元型)、eNOS(內皮細胞型)和iNOS(誘導型)，前二者是原生型，具有鈣離子依賴性表達，后者在生理條件下不被表達，當神經元損傷或免疫機制參與時以非鈣離子依賴性表達，并介導遲發性神經元損傷。Youdim等研究揭示，PD患者黑質區可見小膠質細胞和巨噬細胞劇增，iNOS的表達和活性大為提高，且伴隨黑質區DA神經元的喪失，提示iNOS可能在PD的發生和發展中起了重要作用。iNOS的表達和活性增高后可誘導產生過多的NO，過多的NO可以介導細胞損傷。我們的實驗發現6-OHDA損傷大鼠黑質后，黑質區大量表達iNOS，根據不同時間點的免疫組化發現，iNOS的表達在注射6-OHDA后逐漸增加，在12h時達到高峰，間接提示有大量的NO的產生。NO在介導6-OHDA的神經毒性中具有重要作用，我們的實驗發現白果內酯可明顯抑制黑質受6—OHDA損傷后各時間點表達iNOS，間接地降低黑質NO的產生，減輕6-OHDA的神經毒性，從而保護受6-OHDA損傷的神經元。iNOS基因是NF-KB轉錄調控的下游基因之一，所以隨著NF-kb在黑質受損后逐漸激活，iNOS蛋白的表達水平也逐漸升高，在12h達到髙峰，但隨后的下降可能與黑質神經元大量死亡有關。由于iNOS基因轉錄激活過程中NF-KB信號通路不是唯一的途徑，這可能是白果內酯在大鼠黑質損傷早期促進NF-KB激活，但又抑制iNOS表達的原因。p53蛋白是一種腫瘤抑制物，它可控制蠕蟲、果蠅及人類等大多數動物的細胞數。當細胞的DNA受到輻射等因素損傷時，p53的N-末端會因磷酸化而影響其和DNA結合的能力，從而被激活，誘導細胞生長停滯、衰老、分化、凋亡及介導DNA修復。若損傷的細胞處于G1期，p53觸發細胞周期限制點。如果損傷的細胞已進入S期，那么p53觸發細胞凋亡。P53蛋白通過靶基因P21WAF1/eiP1抑制周期依賴性激酶誘導Gl/S阻滯，還能通過14-3-3sigma抑制Cdc25c參與G2/M關卡的調控。Qin等發現781海人藻酸誘導的大鼠紋狀體細胞凋亡是通過激活NF-kB，從而增強p53的表達，使用NF-kB抑制劑SN50能夠減少p53的表達，因為p53基因是NF-kB下游調控基因，從而抑制細胞凋亡的發生，證實了p53在細胞凋亡中具有十分重要的作用。p53誘導細胞凋亡的機制可能是(1)降低細胞內源性Bcl—2蛋白的表達并抑制其功能；(2)提高細胞內Bax蛋白的表達，使Bcl-2/Bax蛋白比例失調而促進細胞凋亡。我們的實驗發現，6-OHDA損傷后24h,NF-kB的激活達到高峰，相應的，其下游調控蛋白p53的表達升高，提示p53在6-OHDA誘導的多巴胺能細胞凋亡中發揮了重要作用，然而，當大鼠預先給予白果內酯后，可明顯抑制6-OHDA誘導的黑質細胞內p53表達的升高，這與白果內酯在大鼠黑質損傷24h時抑制NF-kB的轉位相呼應，提示白果內酯保護受6-OHDA損傷的多巴胺能細胞與其降低胞內p53的蛋白水平有關，而下調p53蛋白可能原因是抑制NF-kB的激活。3.白果內酯上調6-OHDA損傷大鼠黑質抗凋亡蛋白Bcl-2、HSP60的表達Bcl-2蛋白是一種重要的凋亡抑制蛋白，轉基因動物和基因轉染實驗表明，Bcl-2基因及其表達蛋白可以抑制多種組織細胞凋亡，延長細胞壽命，并且它能抑制多種因素如脂質過氧化、電離輻射、血清及生長因子缺乏等引起的細胞凋亡，故也稱"存活基因"。其主要通過自身二聚或與Bax蛋白形成異二聚體來發揮其調控細胞凋亡的功能，Bax-Bcl-2異二聚體可以抵消Bcl-2-Bcl-2同二聚體的抑凋亡作用，而發揮促凋亡的功能。線粒體膜上的Bcl-2在調控細胞凋亡過程中發揮及其重要的作用，至少在三個水平發揮抑制凋亡的功能。我們的實驗結果表明，經典的多巴胺能神經元毒物6-OHDA可顯著減少黑質神經元表達Bcl-2蛋白，在黑質損傷后3h時，其表達已經很低，隨著時間的延長，表達逐漸消失。有文獻報道Bcl-2蛋白可通過調節核轉錄因子kb來發揮其抗氧化作用或抑制氧化自由基的產生，抑制細胞凋亡，因此我們推測模型組大鼠黑質早期NF-kB未能激活可能與早期Bcl-2表達減少有關。近來SiRNA研究表明，Bcl-2基因的沉默可以誘導p53依賴的凋亡途徑活化。同樣活化和穩定狀態的p53可以改變Bcl-2的表達率，從而誘導凋亡的發生，推測模型組大鼠黑質p53的激活與損傷早期Bcl-2表達降低有關。但是在使用白果內酯后Bcl-2表達明顯升高，在6-OHDA注射6h后這種抑制Bcl-2表達減少的作用達到高峰，其表達升高可能與促進NF-kB激活、降低p53的表達有關。提示白果內酯保護受6-OHDA損傷的多巴胺能神經元的機制可能與上調Bcl-2的表達有關。熱休克蛋白(HSPs)是一類廣泛存在于所有原核和真核細胞內，具有高度保守性的蛋白家族，當生物細胞受到某些應激剌激和其它損傷因素作用而發生應激反應時，就會大量合成，對細胞起一定的保護作用。HSP60是熱休克蛋白家族成員，在大鼠早期發育及成年時腦中都有HSP60的基礎表達，其主要存在于線粒體中，在胞漿中也有少量表達。在細胞受到應激或損傷時，有些文獻報道HSP60表達升高，而有些則報道其表達降低，這可能與細胞所在環境和觸發條件有關。HSP60保護細胞免于凋亡的機制主要是通過調控Bcl-2家族和穩定線粒體膜電位。過表達HSP60可增加抗凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2的表達，降低促凋亡蛋白Bax和Bad的表達，升高Bcl-xl的表達是通過抑制其泛素化之后的蛋白水解，也可與Bcl-xl、Bax結合形成復合物，這可能也是HSP60行使抗凋亡的機制之一。線粒體凋亡途徑的激活主要是由Bcl-2家族中抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比率，而HSP60能夠的上調抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表達，下調促凋亡蛋白Bax和Bad的表達，從而抑制細胞凋亡。我們的實驗發現，6-OHDA可誘導大鼠黑質內神經元HSP60減少，而使用白果內酯后可明顯減輕其表達減少，此點可能是前文提到白果內酯能維持Bcl-2表達的原因之一，提示白果內酯保護黑質神經元與其減輕HSP60表達減少有關。結論本發明首次證實了植物提取物白果內酯對實驗性帕金森病大鼠的治療作用及其機制研究。1.白果內酯可減少L-dopa誘導的PD大鼠對側旋轉次數，改善PD大鼠的行為缺陷，保護黑質TH陽性細胞抵抗6-OHDA的毒性，保護黑質一紋狀體通路，提示白果內酯對實驗性帕金森病大鼠具有一定的治療作用。2.本實驗研究顯示NF-kb信號通路激活參與6-OHDA誘導的細胞凋亡，并發現白果內酯在黑質損傷早期促進NF-kB激活，而在損傷后期抑制其持續激活，因此，白果內酯通過雙向調控黑質NF-kB激活，從而保護黑質多巴胺能細胞。3.白果內酯對6-OHDA所致黑質內細胞促凋亡蛋白p53和iNOS的高表達具有抑制作用。4.白果內酯可增加6-OHDA所致損傷的黑質抗凋亡蛋白Bcl-2和HSP60表達。綜上所述，白果內酯對實驗性大鼠帕金森病具有一定的治療作用，其機制與雙向調控NF-kB的激活、降低細胞內促凋亡蛋白p53和iNOS的表達、增加抗凋亡蛋白Bcl-2和HSP60的表達有關。基于以上實驗證據，我們得出結論白果內酯對帕金森病具有一定的治療作用。圖1.1損傷黑質內TH陽性細胞數；圖1.2TH免疫組化顯示白果內酯對損傷黑質內TH陽性細胞的保護作用；圖1.3免疫熒光顯示白果內酯對同側紋狀體TH熒光強度的影響；圖1.4白果內酯對6—OHDA損傷黑質神經元的保護作用圖2.1黑質內注射6-OHDA12h后IkBa的表達；圖2.2黑質損傷后不同時間點白果內酯對IkBa表達的影響；圖2.3黑質內注射6-OHDA12h后白果內酯對TH陽性細胞內NF-kBp65核轉位的影響；圖2.4黑質損傷3h后TH陽性細胞內發祥p65發生了核轉位；圖2.5黑質內注射6-OHDA6h后白果內酯對TH陽性細胞內NF-kBp65核轉位的影響；圖2，6黑質內注射6-OHDA12h后白果內酯對TH陽性細胞內NF-kBp65核轉位的影響；圖2.7黑質內注射6-OHDA24h后白果內酯對TH陽性細胞內NF-kBp65核轉位的影響；圖2.8黑質內注射6-OHDA60h后白果內酯對TH陽性細胞內NF-kBp65核轉位的影響；圖2.9黑質內注射6-OHDA48h后，p65核轉位抑制劑SN50對6-OHDA誘導的細胞凋亡的影響；圖2.10黑質內注射6-OHDA12h后iNOS的表達；圖2.11黑質損傷后不同時間點白果內酯對iNOS表達的影響；圖2.12黑質內注射6-OHDA24h后p53的表達；圖2.13黑質內注射6-OHDA12h后Bcl-2的表達；圖2.14黑質損傷后不同時間點白果內酯對Bcl-2表達的影響；圖2.15黑質內注射6-OHDA12h后HSP60的表達。權利要求1.一種白果內酯，其特征在于制備治療帕金森病藥物中的用途。全文摘要本發明公開一種白果內酯在制備治療帕金森病藥物中的用途，白果內酯對帕金森病大鼠具有治療作用，其作用機制與雙向調控NF-κB的激活、降低細胞內促凋亡蛋白p53和iNOS的表達、增加抗凋亡蛋白Bcl-2和HSP60的表達有關，據此說明白果內酯對帕金森病具有一定的治療作用。文檔編號A61P25/00GK101095674SQ200710022139公開日2008年1月2日申請日期2007年4月30日優先權日2007年4月30日發明者勞安娜,周文軒,梁中琴,殷夢龍,秦正紅,趙喜林,郭次儀,陳仲良,顧振綸申請人:蘇州中藥研究所