專利名稱：藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及藤黃酸的新用途，具體涉及藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應用。
背景技術：
血管生成(angiogenesis)是指源于已經存在的毛細血管和毛細血管后靜脈的新生毛細血管生成。血管是輸送氧、營養物質和代謝產物的重要途徑，沒有血管支持的組織或器官難以生存，因此與機體內器官和組織形成過程相伴隨會發生血管形成。由于組織或器官對氧與營養物質的需要及對代謝產物清除的依賴，心臟和血管系統是胚胎發育過程中最早形成的器官。生理性的血管生成只存在于生殖系統和傷口愈合的過程，是短暫并且受到嚴格控制的。
血管生成是一復雜過程，主要由連續的10個步驟組成1、對缺氧做出反應，損傷或疾病組織合成釋放血管生成因子；2、血管生成因子與內皮細胞上各自的受體結合；3、受體結合使內皮細胞激活；4、蛋白酶釋放，溶解基質膜；5、內皮細胞移動、增值；6、黏附分子幫助出芽的血管向前延伸；7、產生基質金屬水解蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)來溶解細胞外基質；8、血管生成素與Tie-2相互作用調節小管生成；9、EphB-ephrinB系統調節管狀結構連接成環；10、周細胞參與新生血管的穩定性調節。
血管生成是一個及其復雜的過程，不僅有內皮細胞、平滑肌纖維等許多成分參加其中，它還涉及到多種起重要作用的酶和蛋白質。
腫瘤血管生成，是腫瘤研究中一個較新的領域。一百多年前人們就已發現腫瘤組織較正常組織富含血管。1945年，Algire首先提出了“腫瘤血管生成”的概念。1971年，Folkman最早提出腫瘤生長是血管依賴性的，但當時這種觀點并未為人所接受，而在這8年后毛細血管內皮細胞培養技術的建立，11年后第一個血管生成抑制劑的發現，13年后第一個血管生成活性蛋白的純化等一系列工作的完成，則使這一觀點為越來越多的證據所支持，并使這一領域成為腫瘤研究的熱點及腫瘤治療的新策略。
腫瘤的生長有兩個明顯不同的階段，即從無血管的緩慢生長階段轉變成有血管的快速增殖階段，血管生成使腫瘤能夠獲得足夠的營養物質，是促成上述轉變的關鍵環節。如果沒有血管生成，原發腫瘤的生長不會超過1-2mm3。
關節炎(如類風濕性關節炎)、視網膜病(如糖尿病性視網膜病、視網膜靜脈閉塞、早熟性視網膜病)、血管瘤、銀屑病等疾病均需要對病變組織血管生成進行控制。
藤黃酸(gambogic acid，GA，C38H44O8)是中藥藤黃中有效成分之一。藤黃是藤黃科植物藤黃所分泌的干燥樹脂。實驗結果表明藤黃酸可以抑制動物移植瘤的腫瘤生長，在體外可以抑制腫瘤細胞的生長。目前沒有藤黃酸作為抑制血管生成藥的報道。
發明內容
本發明的目的是提供藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應用。
本發明的技術方案是藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應用，尤其是藤黃酸在制備抑制腫瘤、關節炎(如類風濕性關節炎)、視網膜病(如糖尿病性視網膜病、視網膜靜脈閉塞、早熟性視網膜病)、血管瘤、銀屑病等疾病的血管生成藥物中的應用。
根據本發明可以將治療有效量的藤黃酸和藥學上允許的任意一種輔料制成藥物組合物，也可以添加其他與藤黃酸沒有拮抗作用的其他抗血管生成的藥物。其制劑可以是藥學上允許的任意一種劑型，包括但不限于片劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、口服液、注射劑、脂質體等。藤黃酸的用量可根據用藥途徑、患者年齡、體重、體表面積、所治療的疾病類型和嚴重程度等變化，其日劑量可以在1～5mg/Kg體重范圍，可以一次或多次施用。
本發明的有益結果本發明公開了藤黃酸新的用途，即藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應用。實驗表明，藤黃酸對雞胚尿囊膜血管生成、大鼠動脈環血管生成、血管內皮細胞遷移、血管內皮細胞小管生成、腫瘤細胞分泌血管內皮生長因子等均有顯著的抑制作用，可用于制備抑制血管生成的藥物。
圖1藤黃酸抑制雞胚尿囊膜血管生成照片。其中A，對照；B，0.9ng GA；C，4.5ngGA；D，22.5ng GA。
圖2藤黃酸抑制大鼠動脈環血管生成的顯微鏡圖。其中A，對照；B，10-6mol/LGA；C，5×10-6mol/L GA；D，2.5×10-5mol/L GA。
圖3藤黃酸抑制內皮細胞遷移的顯微鏡圖。其中A，對照；B，0.5×10-6mol/L GA；C，1×10-6mol/L GA；D，2×10-5mol/L GA。
圖4藤黃酸抑制內皮細胞小管生成的相差顯微鏡圖。其中A，對照；B，0.5×10-6mol/L GA；C，1×10-6mol/L GA；D，2×10-5mol/L GA。
圖5藤黃酸抑制肺癌細胞A549分泌VEGF的ELISA檢測結果圖。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。
實施例1藤黃酸抑制雞胚尿囊膜血管生成。
目的和原理在雞胚絨毛尿囊膜的血管生成早期，機體免疫系統尚未完全建立，對各種異物幾乎不發生排斥反應，將含藥物載體置于其表面，可觀察到藥物對血管生成的影響。由于其對抗血管生成藥物敏感，目前仍被認為是一種較理想的藥物篩選模型。
方法受精雞胚置于孵化箱中孵化9天(氣室端向上)。然后將雞胚用酒精擦拭后靜置15分鐘，在雞胚的上方劃一個2×2cm大小的開窗位置，用剪刀磨切開窗，吹去蛋殼上磨切的粉塵，揭去開窗處的蛋殼，再用虹膜剪刀剪破殼膜，暴露出絨毛尿囊膜。按分組將不同量的藤黃酸(A對照組，不加藤黃酸；B藤黃酸低劑量組，0.9ng GA；C藤黃酸中劑量組，4.5ng GA；D藤黃酸高劑量組，22.5ng GA)加在經高壓滅過菌的0.5×0.5cm大小的Whatman濾紙上，然后將濾紙放在絨毛尿囊膜兩條大血管間的無血管部位，用滅菌透明膠帶封窗。
結果與評價雞胚放入孵化箱中孵化兩天，揭去封窗的透明膠帶，拍照，結果見圖1。與對照組比較，給予藤黃酸后，血管生成受到抑制，大的血管較少，說明藤黃酸可以抑制雞胚尿囊膜血管生成，并呈劑量依賴性。
實施例2藤黃酸抑制體外培養的大鼠動脈環血管生成。
目的和原理將大鼠主動脈環包埋于凝膠基質中，觀察內皮細胞從血管內膜出芽并形成毛細血管樣結構。
方法體重100～120g的雄性Wistar大鼠一只，脫臼法處死，取胸主動脈，去除外圍結締組織和脂肪組織，剪成長約1mm的動脈環，用M199無血清培養液漂洗。將大鼠主動脈段包埋于24孔板中的纖維蛋白膠中，用M199培養液(對照組，不含藤黃酸)及含有不同濃度的藤黃酸的培養液進行體外培養，每2至3天換液1次。
結果與評價內皮細胞從動脈段切口處向外生長，形成具有分枝的微血管樣結構。7天后于倒置顯微鏡下觀察動脈環附近內皮細胞和新生血管的生成情況并拍照。結果見圖2(其中A為對照組；B為10-6mol/L GA組；C為5×10-6mol/L GA組；D為2.5×10-5mol/LGA組)。與對照組比較，給予藤黃酸后，動脈環的毛細血管樣結構生成減少，說明藤黃酸抑制大鼠動脈環血管生成，并呈劑量依賴性。
實施例3藤黃酸抑制內皮細胞遷移。
目的和原理內皮細胞遷移實驗采用transwell細胞培養小室進行。孔徑為8μm的多聚碳酸鹽濾膜將小室分隔成上下兩層。在生長因子刺激下，內皮細胞通過阿米巴運動穿過8μm的濾孔，附著在濾膜的背面。利用該模型可評價藥物對內皮細胞遷移能力的影響。
方法將內皮細胞給予含有不同濃度藤黃酸的1640培養基作用30分鐘，然后將2.5×105個/ml HUVEC的細胞懸液400μl，加入到上室，下室加入600μl含刺激因子及不同濃度的1640培養液，于5％CO2孵箱37℃中培養4小時。
結果與評價取出濾膜，刮去膜上未遷移細胞，用100％甲醇固定濾膜，并以蘇木精—伊紅染色，甘油封片，最后利用顯微鏡觀察并拍照，結果見圖3(其中A為對照組；B為0.5×10-6mol/L GA組；C為1×10-6mol/L GA組；D為2×10-5mol/L GA組)。與對照組相比，給予藤黃酸后，內皮細胞的遷移能力受到抑制，說明藤黃酸可以抑制內皮細胞的運動，并呈劑量依賴性。
實施例4藤黃酸抑制內皮細胞小管生成。
目的和原理matrigel為大鼠ESH肉瘤細胞外基質提取物，富含IV型膠原，其成分與基底膜十分相似，可代替天然基底膜。可利用內皮細胞在matrigel上爬行、融合形成小管來觀察研究藥物對血管生成的影響。
方法將matrigel鋪到96孔板上，80μl/孔，37℃，放置30min使其凝固。將內皮細胞分別給予含有不同濃度藤黃酸的培養基作用30分鐘，然后每孔加入1×105個/ml內皮細胞懸液100μl。于5％CO2孵箱37℃培養8小時后在相差顯微鏡(×400)下觀察小管生成情況并拍照，每孔選擇五個不同部位，計數小管生成量并進行統計學分析。
結果與評價內皮細胞在matrigel中生長8小時后，細胞會由原來的多角形變成長梭形，并向凝膠基質中延伸生長，呈線形排列而形成管狀結構，多個小管相互連接形成三維網狀結構。結果見圖4(其中A為對照組；B為0.5×10-6mol/L GA組；C為1×10-6mol/LGA組；D為2×10-5mol/L GA組)。與對照組相比，給予藤黃酸后內皮細胞網絡狀結構受到破壞，說明藤黃酸可以抑制內皮細胞小管生成，并呈劑量依賴性。
實施例5藤黃酸抑制腫瘤細胞分泌血管內皮生長因子(VEGF)。
目的和原理通過酶聯免疫原理，檢測藥物對細胞分泌VEGF的影響。
方法肺癌細胞A549(3×105/孔)接到六孔培養板，待細胞貼壁后，給予不同濃度藤黃酸(分別為0，0.5μM，1μM，2μM)，12h后收集細胞上清，使用ELISA試劑盒，測定VEGF蛋白的含量。
結果與評價將測得的VEGF的濃度/細胞數作為評價藥物對VEGF分泌影響的指標，結果見圖5。與對照組(即GA為0)相比，藤黃酸可以抑制腫瘤細胞分泌VEGF，并呈劑量依賴性。
權利要求
1.藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于抑制血管生成藥物為抑制腫瘤血管生成的藥物。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于抑制血管生成藥物為抑制關節炎病變組織的血管生成的藥物。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于關節炎是類風濕性關節炎。
5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于抑制血管生成藥物為抑制視網膜病病變組織的血管生成的藥物。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于視網膜病是糖尿病性視網膜病、視網膜靜脈閉塞或者早熟性視網膜病。
7.根據權利要求1所述的應用，其特征在于抑制血管生成藥物為抑制血管瘤病變組織的血管生成的藥物。
8.根據權利要求1所述的應用，其特征在于抑制血管生成藥物為抑制銀屑病病變組織的血管生成的藥物。
全文摘要
本發明公開了藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應用。本發明提供了藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應用，特別是在制備抑制腫瘤、關節炎、視網膜病、血管瘤、銀屑病等疾病的病變組織血管生成的藥物中的應用。根據本發明提供的應用，可將藤黃酸制備成抑制血管生成的藥物，擴大了藤黃酸的應用領域。
文檔編號A61P17/00GK101049327SQ200710022230
公開日2007年10月10日 申請日期2007年5月10日 優先權日2007年5月10日
發明者郭青龍, 楊嵐, 尤啟冬, 盧娜, 顧紅燕, 齊琦 申請人:中國藥科大學