專利名稱：：用于預防和治療肝病的含有甘草素的組合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及含有甘草(licorice)根的提取物和從其中分離到的甘草素(liquiritigenin)作為有效成分用于預防和治療肝病的組合物及其用途。
背景技術：
：肝病是現代人類最常發生的疾病之一，由于人類暴露于各種不利環境下所致例如，污染物質，毒性物質例如酗酒、抽煙等等以及心理壓力，心理壓力能通過休息恢復但它也能引發其它疾病例如免疫系統疾病。根據報道，毒性物質例如撲熱息痛、四氯化碳、D-半乳糖胺等等會引起肝毒性，特別是撲熱息痛經常用作標準肝毒性指標來評價新藥或新試劑的治療和保護作用(D.J.Jollow等人，/尸/2amwc0/.￡xp.77^.,巡，195-202頁，1973)。過量的撲熱息痛引發肝損傷，其特征在于繼發性肝損傷，例如肝細胞廣泛性壞死，然而有效量的撲熱息痛為有效的抗炎劑和退熱劑(B.H.Rumack,/7e^to/ogy，迎，10-15頁，2004)。撲熱息痛的這種毒性通過肝臟內細胞色素P450，B卩NAPQ1(N-乙酰-對-苯醌亞胺)對撲熱息痛的代謝引起。當給予有效量的撲熱息痛時，GSH(谷胱甘肽)可以有效地將其解毒，然而當給予過量的撲熱息痛時，其不能從人體排泄出去，導致對肝器官的毒性作用(J.D.Gibson等人，C7ze肌7bx/co/.,2,580-585頁，1996)其特征在于肝中心性壞死、肝細胞惡化和炎癥細胞出現(D.Zakin等人，i^pato/ogy，759-762頁，1990)。人體GSH的濃度通常保持在常規水平，但是在特定異常條件下它會突然降低，導致對外部毒性物質的敏感性增加(E.Y.park等人，C&m.5/o/./"fera""m,82-96頁，2005)。迄今為止，NAC(N-乙酰半胱氨酸)是己知的唯一治療劑用于治療由撲熱息痛引起的毒性。仍然需要開發更有效的藥劑來治療由撲熱息痛引起的毒性。甘草根是甘草(G/jc^r/n'加wra/e"^FISCH)、光果甘草(G^c^r/z/加g/flZ)raL)等等屬于豆科的植物的根，且己報道甘草根含有三萜皂苷例如甘草酸和數種黃酮類化合物例如甘草素、甘草苷(liquiritin)、新甘草苷、新異甘草苷等等，它們用于治療咳嗽、胃漬瘍和高血壓等等。然而，在上面引用的任一文獻中沒有報道或公開甘草提取物或甘草素對有毒物質誘導的肝病的治療作用，公開的這些文獻并入本文以供參考。因此，本發明人努力尋找增加肝保護功效的有效藥劑，并通過各種體外和動物模型試驗來研究甘草素的藥理學作用，最終本發明人發現甘草提取物或甘草素作為肝保護劑能有效治療和預防肝病。
發明內容技術問題本發明一方面提供了含有甘草提取物或從其中分離到的甘草素作為活性成分用于預防和治療肝病的藥物組合物。本發明也提供了通過保護哺乳動物肝細胞來治療肝病的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物有效量的上面所述的提取物或從其中分離到的化合物，以及其藥學上可接受的載體。本發明也提供了上面所述的提取物或從其中分離到的化合物在制備用于治療或預防人或哺乳動物肝病的藥物中的用途。本發明也提供了含有預防和改善肝病有效量的上面所述的提取物或從其中分離到的化合物作為活性成分用于通過保護肝細胞來預防或改善肝病以及營養學上可接受添加劑的健康功能食品。技術方案因此，本發明的一個目標是提供了含有有效量的甘草提取物或從其中分離到的甘草素作為活性成分用于預防和治療肝病的藥物組合物，該藥物組合物還含有藥學上可接受的載體。本發明的另一個目標是提供了甘草提取物或從其中分離到的甘草素在制備用于治療或預防人或哺乳動物肝病的藥物中的用途。本發明的另一個目標是提供了通過保護哺乳動物肝細胞來治療肝病的方法，所述的方法包括給予所述哺乳動物有效量的甘草提取物或從其中分離到的甘草素，以及其藥學上可接受的載體。本文公開的甘草提取物包括甘草(g/_yc,r/2/Z"wra/era^)、光果甘草(g/yqFT/2/z"g/WraL)或其類似植物，優選甘草的提取物，且該提取物可以通過用蒸餾水、低級醇例如甲醇、乙醇等等或其混合物，優選甲醇提取而得到，更優選是得到富含甘草素的甘草提取物，例如其通過下列步驟組成的方法進行制備采用重復的柱層析法純化甘草提取物從而得到純化的甘草苷組分；進行酸水解并用堿中和溶液的pH;且采用柱層析從而得到本發明目標的富含甘草素的提取物。本發明的另一個目標是提供了藥物組合物，該藥物組合物含有有效量的甘草提取物或從其中分離到的甘草素和DDB(4,4，-二甲氧基-5,6,5，,6，-二亞甲基二氧基聯苯-2,2，-二甲酸二甲酯)作為活性成分用于預防和治療肝病的混合物(combination),該藥物組合物還含有藥學上可接受的載體。本發明的另一個目標是提供了甘草提取物或從其中分離到的甘草素和DDB的混合物在制備用于治療或預防人或哺乳動物肝病的藥物中的用途。本發明的另一個目標是提供了通過保護哺乳動物肝細胞來治療肝病的方法，所述的方法包括給予所述哺乳動物有效量的甘草提取物或從其中分離到的甘草素和DDB的混合物，以及其藥學上可接受的載體。本發明另一方面提供了含有預防和改善肝病有效量的甘草提取物或從其中分離到的甘草素以及營養學上可接受添加劑的健康功能食品，所述的甘草提取物或從其中分離到的甘草素作為活性成分通過保護肝細胞來預防或改善肝病。本發明另一方面提供了預防和改善肝病有效量的含有甘草提取物或從其中分離到的甘草素和DDB的混合物以及營養學上可接受添加劑的健康功能食品，所述的混合物作為活性成分通過保護肝細胞來預防或改善肝病。本文公開的肝病包括急性或慢性肝炎、肝腫大、肝膿腫、肝硬化和肝癌，優選為急性或慢性肝炎和肝硬化。可以在本發明中使用的草藥包括，但并非限制于相同屬的植物，這對本領域技術人員是顯而易見的，且該草藥用于相同或相似的目的并能替代本發明的草藥用來預防和治療肝病。治療肝病的藥物組合物以所述組合物的總重量計，可以包括約0.01-95w/w%，優選0.5-50w/wM的本發明提取物或化合物。根據下面優選的實施方案可以制備本發明提取物和化合物。對于本發明，上面所述的甘草提取物或從其中分離到的甘草素可以通過下面的操作制備；例如，將甘草，如甘草(g/ycy廳/^awra/era^)洗滌、干燥，并用l-20倍，優選5-15倍體積的蒸餾水、醇例如甲醇、乙醇等等或其混合物混合，優選甲醇；在從O至室溫的溫度范圍，優選室溫下吸附(enfleurage)該溶液，持續時間范圍從12小時至1周，優選48-72小時，或將該溶液加熱回流提取，溫度范圍為80-120°C，優選高于105°C，持續時間范圍為1-24小時，優選2-5小時，提取進行2-5次，或將該溶液用超聲、回流或常規提取方法提取；過濾溶液從而得到本發明的甘草提取物粗品。為了得到更優選的本發明富含甘草素的提取物，將通過上面步驟制備的甘草提取物重復進行柱層析，采用混合溶劑系統洗脫從而得到富含甘草苷的甘草提取物;使用強酸例如HC1將提取物進行酸水解從而除去甘草苷的糖部分；用堿溶液例如NaOH中和反應物；且將該溶液進行硅膠柱層析，采用混合溶劑系統(CHCl3和丙酮)洗脫從而得到富含甘草素的本發明提取物。為了得到本發明純的甘草素，將富含甘草素的提取物進一步純化例如采用硅膠柱層析或重結晶方法從而得到本發明的甘草素。為了得到本發明甘草提取物或從其中分離到的甘草素和DDB的混合物，將通過上面方法制備的甘草提取物和甘草素與DDB混合，混合比例范圍從1-20:1至1:10(w/w%)，優選1-10:1-5(w/w%)，更優選1:1-2(w/w%)從而得到本發明的混合組合物。本發明的另一個目標是提供了制備上面所述甘草提取物和從其中分離到的甘草素的方法，所述的甘草提取物和從其中分離到的甘草素用于制備有效治療或預防肝病的組合物。本發明的另一個目標是提供了從甘草提取物制備富含甘草素提取物的方法，該方法包括下列步驟洗滌、干燥甘草；與10-15倍體積的蒸餾水、醇例如甲醇、乙醇等等或其混合物混合；在從0至室溫的溫度范圍吸附該溶液，持續48-72小時；過濾殘余物從而得到甘草提取物粗品；將提取物重復進行柱層析，采用混合溶劑系統洗脫從而得到富含甘草苷的甘草提取物；使用強酸將提取物進行酸水解從而除去甘草苷的糖部分；用堿溶液中和該溶液；將該溶液進行硅膠柱層析，采用混合溶劑系統(CHCl3和丙酮)洗脫從而得到本發明富含甘草素的提取物。通過本領域已知的常規方法，可以將本發明化合物轉化成它們藥學上可接受的鹽或溶劑合物。對于鹽，可以采用與藥學上可接受的游離酸形成酸加成鹽，這可以通過常規方法制備。例如，將化合物溶解于過量酸溶液后，鹽從水溶性有機溶劑例如甲醇、乙醇、丙酮或乙腈中沉淀出來從而制備其酸加成鹽，且將等量的化合物和用水或醇例如乙二醇單甲醚稀釋的酸的混合物加熱，接著通過蒸發干燥或減壓過濾得到其干燥的鹽的形式。可以使用有機酸或無機酸作為上面所述方法中采用的游離酸。例如，有機酸如甲磺酸、對甲苯磺酸、乙酸、三氟乙酸、枸櫞酸、馬來酸、琥珀酸、草酸、苯甲酸、乳酸、羥乙酸、葡糖酸、半乳糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、葡糖醛酸、門冬氨酸、抗壞血酸、甲酸、香草酸、氫碘酸等等，和無機酸如鹽酸、磷酸、硫酸、硝酸、酒石酸等等可以在本文中使用。進一步講，本發明化合物的藥學上可接受的金屬鹽可以通過使用堿來制備。可以通過常規方法制備其堿金屬或堿土金屬鹽，例如，將化合物溶解于過量堿金屬氫氧化物或堿土金屬氫氧化物溶液后，過濾掉不溶的鹽并將剩余的濾液蒸發和干燥以得到其金屬鹽。作為本發明的金屬鹽，鈉、鉀或鈣鹽適于藥用且可以通過將堿金屬鹽或堿土金屬鹽與合適的銀鹽例如硝酸銀反應來制備相應的銀鹽。如果本文沒有特別說明，化合物藥學上可接受的鹽包括化合物能形成的所有酸性或堿性鹽。例如，本發明化合物藥學上可接受的鹽包括在羥基上形成的鹽例如鈉、鈣和鉀鹽；在氨基上形成的鹽例如氫溴酸鹽、硫酸鹽、氫硫酸鹽、磷酸鹽、氫磷酸鹽、二氫磷酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、枸櫞酸鹽、酒石酸鹽、乳酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽(mesylate)和對甲苯磺酸鹽(tosylate)等等，它們可以通過本領域常規的方法制備。本發明的另一個目標是提供了含有通過上面所述的方法得到的粉末形式、提取形式或干燥提取形式的藥物提取物粗品作為活性成分用于預防和治療肝病的藥物組合物。當本發明的提取物或化合物經口服和靜脈內給藥后，通過上面所述的方法制備的本發明組合物在撲熱息痛誘導的肝毒性動物模型中能顯著降低LDH和ALT酶的血藥濃度、中心性壞死和炎癥。當測試提取物的口服急性毒性時，該提取物對死亡率、臨床癥狀、體重變化和尸體剖檢時肉眼檢査沒有明顯的作用。治療肝病的藥物組合物以所述組合物的總重量計，可以包括約0.01-99.9w/w%，優選0.1-卯w/w。/。的本發明上面的藥物組合物粗品。根據使用方法，本發明組合物可另外包括常規載體、佐劑或稀釋劑。根據用途和應用方法，優選所述載體用作合適的物質，但并非限制如此。Remington'sPharmaceuticalScience(MackPublishingco，EastonPA)的文本中列出了合適的稀釋劑。在下文中，下列的配制方法和賦形劑只是示例性的，絕非限制本發明。本發明的組合物可以用作藥物組合物，該藥物組合物包括藥學上可接受的載體、佐劑或稀釋劑，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠、海藻酸、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯垸酮、水、甲基羥基苯甲酸酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羥基苯甲酸酯(propylhydroxybenzoate)、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。制劑可以另外包括充填劑、抗凝劑、潤滑劑、濕潤劑、調味劑、乳化劑、防腐劑等等。可以將本發明組合物經上述配制，這樣再采用本領域已知的任何方法將其給藥至患者后，活性成分會快速、持續或延緩釋放。例如，本發明組合物可以溶解于常用來配制注射劑的油脂、丙二醇或其它溶劑中。載體的合適實例包括生理鹽水、聚乙二醇、乙醇、植物油、十四酸異丙酯等等，但并不僅局限于它們。為了局部給藥，本發明化合物可以配制成軟膏和乳膏的形式。含有本發明組合物的藥物制劑可以任何制劑形式，例如口服劑型(粉劑、片劑、膠囊、軟膠囊、水溶液藥劑(aqueousmedicine)、糖漿劑、酏劑丸劑(elixirspill)、粉劑、囊劑、顆粒劑)，或局部用制劑(乳膏、軟膏、洗劑、凝膠、香膏、貼片、糊劑、噴霧溶液、氣霧劑等等)，栓劑，或無菌注射劑(溶液、混懸液、乳劑)。藥物劑型中的本發明組合物可以它們藥學上可接受的鹽形式使用，也可以單獨使用或適當的聯合使用，以及與其它藥學上的活性化合物組合使用。本發明組合物所需劑量的變化取決于目標物的身體狀況和體重、嚴重度、藥物劑型、給藥途徑和時間，且本領域技術人員可以選擇所需劑量。然而，為了得到所需的效果，通常推薦給予本發明組合物的量以體重/天計為0.01-10g/kg，優選l-5g/kg。可以每天給予單劑量或多劑量，以組合物的總重量計，藥物組合物粗品應該為0.01-80重量%，優選0.5-50重量％。可以將本發明藥物組合物經各種途徑給予動物目標物例如哺乳動物(大鼠、小鼠、家畜或人)。所有給藥途徑都可采用，例如，可以經口服、經直腸或經靜脈內、肌內、皮下、皮內、膜內、硬膜外或腦室內注射給藥。本發明另一方面提供了含有預防和改善肝病有效量的上面的提取物或化合物以及營養學上可接受添加劑的健康功能食品，所述的提取物或化合物作為活性成分通過保護肝細胞來預防或改善肝病。本發明的健康功能食品的藥物組合物粗品可以粉末形式、提取形式或干燥提取形式使用。以組合物的總重量計，用于預防和改善肝病的健康功能食品組合物可以包括約0.01-95w/w%，優選0.5-80w/w。/。的上述本發明組合物。本文上面所述的組合物可以加到食品、添加劑或飲料中，用于預防和改善肝病。為了實現預防和改善肝病的目的，其中在食品或飲料中的上面所述的藥物組合物粗品的量以用于健康食品組合物的食品總量計，其通常范圍為約0.1-15w/w%，優選l-10w/w%，和以100ml健康飲料組合物的比例計為l-30g，優選3-10g。如果本發明的健康飲料組合物含有上面所述的藥物組合物粗品，其作為必需組分以所示的比例存在，則對其它液體組分沒有特別的限制，其中其它組分可以是各種防臭劑或天然的碳水化合物例如常規飲料等等。上面所述的天然碳水化合物的實例是單糖例如葡萄糖、果糖等等；二糖例如麥芽糖、蔗糖等等；常規糖例如糊精、環糊精；和糖醇例如木糖醇和赤蘚糖醇等等。除了上面所述的那些防臭劑，其它的防臭劑為天然防臭劑例如甜味蛋白(taumatin)、甜菊提取物例如levaudiosideA、甘草酸等等，和合成的防臭劑例如糖精、阿司帕坦(aspartam)等等可以用作調味劑。上面所述的天然碳水化合物的量以本發明飲料組合物100ml的比例計通常范圍為約1-20g，優選5-12g。除了上面提到的組合物中的組分，其它組分為各種營養素、維生素、礦物或電解質、合成的調味劑、著色劑、在采用乳酪、巧克力等情況下要使用的改善劑、果膠酸及其鹽、海藻酸及其鹽、有機酸、防護膠粘劑、pH控制劑、穩定劑、防腐劑、甘油、醇和用于碳酸飲料中的碳化劑等等。除了上面提到的那些，其它組分可以是用于制備天然果汁的果汁、果汁飲料和蔬菜飲料，其中該組分可以獨立使用或聯合使用。組分的比例不是很重要，但通常范圍為本組合物的約0-20w/w。/o每100w/w%。包括上面提及的藥物組合物粗品的可添加食品(addablefood)實例是各種食品、飲料、口香糖、維生素復合物、健康改善食品等等。在不背離本發明的主旨或范圍的情況下可以對本發明的組合物、用途或制備進行各種改良和變化，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。有益效果本發明涉及含有甘草提取物或從其中分離到的甘草素的組合物，當本發明的提取物或化合物經口服和靜脈內給藥至有毒物質誘導的肝毒性動物模型時，能顯著降低LDH和ALT酶的血藥濃度、中心性壞死和炎癥。因此，本發明的組合物可用于預防和治療肝病且可以安全和有效的用于肝保護。通過下面詳細的說明并結合隨附的附圖，可以更清楚的理解本發明上述和其它的目標、特征和其它優點，其中；圖1顯示用撲熱息痛-誘導肝損傷的大鼠接受4天治療后，甘草素(LQ)治療組和DDB治療組保肝作用的比較；圖2顯示用撲熱息痛-誘導肝損傷的大鼠接受4天治療后，甘草素(LQ)治療組、DDB治療組和其混合物治療組保肝作用效果的比較；圖3顯示撲熱息痛-誘導肝損傷的大鼠接受甘草素(LQ)和DDB的混合物治療4天后的組織化學分析結果(CV、PS、N、HD);圖4表示撲熱息痛-誘導肝損傷的大鼠接受尾靜脈注射甘草素治療2天后，該治療對ALT和LDH濃度的作用；圖5表示撲熱息痛-誘導肝損傷的大鼠接受尾靜脈注射甘草素(LQ)治療2天后的組織化學分析結果(CV、N、HD、H);圖6a和6b表示撲熱息痛-誘導肝損傷的GSH衰竭大鼠接受甘草素(LQ)口服治療2天后的組織化學分析結果(CV、PS、N、HD);圖7顯示撲熱息痛-誘導肝損傷的大鼠在口服接受甘草素(LQ)治療前3天時的組織化學分析結果(CV、PS、N、HD)。具體實施例方式實現發明最好的模型在不背離本發明的主旨或范圍的情況下對本發明的組合物、用途或制備進行各種改良和變化，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。通過下面的附圖和實施例能更具體的解釋本發明。然而，應理解本發明并不以任何方式局限于這些實施例。發明模型下面的實施例和實驗實施例進一步說明本發明，但并不是限制本發明的范圍。實施例l、本發明甘草提取物(EL)的制備將購自首爾Kyung-dong市場的3kg甘草(G(vc戸/7/zawra/e服S)洗滌，干燥并加入15升的100%甲醇。在室溫下放置該溶液72小時，過濾提取液從而得到290g的甘草提取物粗品(以下稱為EL)。實施例2、本發明富含甘草素的甘草提取物(LEL)的制備將實施例1中制備的290g提取物(EL)進行硅膠柱層析(60cm，230-400目)采用從CHCl3至混合溶劑(CHCl3-MeOH=50:1—15:1)的溶劑洗脫，得到43g的純化組分。將該組分進一步進行硅膠柱層析(50cm，230-400目)采用混合溶劑的溶液(CHCl廣丙酮-20:1—1:1)洗脫，得到27g富含甘草苷的組分(以下稱為LAF)，即組分32-67。27g富含甘草苷的組分(LAF)與INHC1在100°C反應2小時以水解甘草苷的糖部分，并用mNaOH中和反應物。將溶液進行硅膠柱層析(50cm，230-400目)采用混合溶劑系統(CHCl3和丙酮)洗脫，得到15g本發明富含甘草素的提取物(以下稱為LEL)。實施例3、本發明甘草素(LQ)的制備將實施例2中制備的27g富含甘草苷的組分(LAF)進一步進行硅膠柱層析(50cm，230-400目)采用混合溶劑(CHC13-MeOH=50:1—15:1)的溶液洗脫，得到22g純化的白色粉末狀的甘草苷。22g的甘草苷與INHC1在100°C反應6小時以水解甘草苷的糖部分，并用1HNaOH中和反應物。將溶液進行硅膠柱層析(50cm，230-400目)采用混合溶劑系統(CHCl3禾口丙酉同)洗脫，得到12g本發明的甘草素(以下稱為LQ)。實施例4、本發明混合物的制備4-1、混合物(CO的制備將實施例1中制備的干燥提取物粗品(EL)與DDB(PharmakingPharmaceuticalCo.)混合，混合比例為1:1，該混合物在下面的實驗中作為測試樣品使用(以下稱為Cl)。4-2、混合物(C2)的制備將實施例2中制備的干燥富含甘草素的提取物(LEL)與DDB(PharmakingPharmaceuticalCo.)混合，混合比例為1:1，該混合物在下面的實驗中作為測試樣品使用(以下稱為C2)。4-3、混合物(C3)的制備將實施例3中制備的干燥甘草素(LQ)與DDB(PharmakingPharmaceuticalCo.)混合，混合比例為1:1，該混合物在下面的實驗中作為測試樣品使用(以下稱為C3)。參考實施例-實驗操作1-1、試劑和實驗動物實驗使用的撲熱息痛(SigmaChemicalCo.)禾QBSO(SigmaChemicalCo.)購自商業公司。將撲熱息痛溶解于40%的PEG蒸餾水溶液(No.400)中且將DDB溶解于0.5%的甲基纖維素蒸餾水溶液(No.400)中。實驗使用體重為140-160g的雄性斯普拉-道來大鼠(Sprague-Dawleyrats,SamtakoCo.Korea)且允i午它4門進食(Harlan，teklan，USA)和飲水。在使用前將所有動物放置在控制環境，溫度為22士2。C且濕度為55士5。/。，12小時的光暗周期，持續至少一周。1-2、統計學使用藥理學計算分析所有結果。測試組間的顯著性通過ANOVA(單向方差分析法)評價且通過Newmann-Keuls試驗方法測定(*p<0.5，**p<0.01)。實驗實施例1、經口服給藥的本發明提取物和化合物對大鼠模型中撲熱息痛誘導的肝損傷的作用為了研究實施例中得到的本發明提取物和化合物對肝損傷的抑制作用，在過程中進行下列實驗。1-1、試驗操作將甘草素溶解于40%的甲基纖維素蒸餾水溶液(25mg/kg和5mg/kg)和參考實施例中制備的DDB溶液(50mg/kg和100mg/kg)中，將其口服給藥至大鼠，每天一次持續4天。治療結束24小時后，將參考實施例中制備的撲熱息痛溶液(1.2g/kg)口服給藥至大鼠以產生肝毒性。治療24小時后，切開腹腔取出肝器官和血液以測試實施例中得到的發明提取物和化合物對肝損傷的作用。1-2、肝損傷指標的測試結果本領域已知的肝損傷指標，即為ALT(R.Rej,C7/".C72em.,24,1971-1979頁，1978)和LDH(S.Sherlock等人，5/ac^〃5W潔e,London,23頁，2002)在大鼠血液中的活性，本發明提取物和化合物對這些指標的作用進行了測定。1-2-1、甘草素和DDB的作用作為結果，由撲熱息痛產生的血液ALT和LDH酶增加的活性，在口服25mg/kg和50mg/kg劑量的甘草素治療組被顯著降低(見圖1)且給予50mg/kg和100mg/kg劑量的DDB治療組也顯著降低了由撲熱息痛產生的血液ALT和LDH酶增加的活性。1-2-2、甘草素和DDB的混合物的作用實施例4中制備的甘草素和DDB的混合物以50mg/kg/天的劑量經口服給藥至大鼠并持續4天。作為結果，甘草素和DDB的混合物在各組顯示出更明顯地對由撲熱息痛產生的血液ALT和LDH酶增加活性的降低作用(見圖2)。1-3、組織病理學試驗的結果進行肝器官的組織病理學試驗以測定本發明提取物和化合物對由撲熱息痛誘導的肝臟壞死和炎癥的作用。結果，甘草素顯著降低肝臟中心性壞死和炎癥，這證實了甘草素的直接預防活性。DDB抑制其它毒性物質誘導的肝臟炎癥，但對肝臟中心性壞死和炎癥降低很少。甘草素和DDB的混合物在各組顯示出對肝臟壞死和炎癥相似的降低作用(見圖3和表1)。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>0<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實驗實施例2、經靜脈內給藥的發明提取物和化合物對大鼠模型中撲熱息痛誘導的肝損傷的作用為了研究實施例中得到的發明提取物和化合物對肝損傷的抑制作用，在過程中進行下列實驗。2-1、試驗操作將甘草素溶解于40%的甲基纖維素蒸餾水溶液(5mg/kg和15mg/kg)中，將其靜脈內給藥至大鼠尾部每天一次持續2天。治療結束3小時后，將參考實施例中制備的撲熱息痛溶液(1.2g/kg)口服給藥至大鼠以產生肝毒性。誘導24小時后，切開腹腔取出肝器官和血液以測試實施例中得到的本發明提取物和化合物對肝損傷的作用。2-2、試驗結果結果，由撲熱息痛誘導的血液ALT和LDH酶增加的活性，在甘草素靜脈給藥劑量5mg/kg和15mg/kg治療組和甘草素的治療組被顯著降低(見圖4)。靜脈給藥的甘草素顯著降低肝臟中心性壞死和炎癥，這證明靜脈內給藥的甘草素比口服給藥更有效(見圖5和表1)。實驗實施例3、在大鼠模型中甘草素對GSH衰竭的肝損傷的作用為了研究實施例中得到的本發明提取物和化合物對肝損傷的抑制作用，在過程中進行下列實驗。3-1、試驗操作將甘草素溶液(25mg/kg和50mg/kg)和DDB溶液(50mg/kg和100mg/kg)注射給藥至大鼠尾部每天一次持續2天。治療結束3小時后，將2mmole/kg體重的BSO(丁硫氨酸亞砜胺)腹膜內給藥至大鼠，以使大鼠GSH(谷胱甘肽)水平衰竭。治療1小時后，將參考實施例中制備的撲熱息痛溶液(1.2g/kg)口服給藥至大鼠以產生肝毒性。誘導12小時后，測定大鼠的存活率且切開腹腔取出肝器官以測試實施例中得到的本發明提取物和化合物對肝損傷的作用。3-2、試驗結果GSH水平的衰竭會使肝毒性惡化，基于這個事實本發明人測試了用單一甘草素和其與DDB的混合物治療GSH衰竭的肝損傷的抑制作用。結果，撲熱息痛和DDB的聯合給藥顯示出肝細胞的廣泛性壞死(l圖6a和表1)。口服給藥甘草素能顯著降低肝細胞壞死，然而DDB治療卻不能降低該壞死(見圖6b)。甘草素和DDB的聯合給藥有效抑制撲熱息痛誘導的肝損傷(見圖6b和表l)，這證明甘草素和DDB的聯合給藥也顯示出對GSH衰竭的肝損傷的有效抑制作用。此外，靜脈內給藥2天的甘草素也明顯抑制肝損傷(見圖6b和表1)。觀察存活率后，與對照組相比，聯合治療組進一步地降低存活率至27%，而撲熱息痛治療組在存活率上并沒有顯示任何改變。出人意料的是，甘草素治療組的存活率顯著提高且甘草素和DDB的聯合治療組進一步提高了存活率，如表1所示。實驗實施例4、進行治療為了研究實施例中得到的本發明提取物和化合物對肝損傷的治療效果，在過程中進行下列實驗。4-1、試驗操作將參考實施例中制備的撲熱息痛溶液(1.2g/kg)口服給藥至大鼠以誘導肝毒性。誘導1小時后，將甘草素溶液(50mg/kg)口服給藥至大鼠一天一次，持續2天。在撲熱息痛給藥前，所有測試大鼠已經禁食24小時。誘導24小時后，切開腹腔取出肝器官以測試實施例中得到的本發明化合物對肝損傷的作用。4-2、試驗結果結果，口服給藥的甘草素比陰性對照組更顯著的抑制肝細胞壞死，該陰性對照組只用PEG400(40%)而不是甘草素進行治療(見圖7)，這證明了甘草素對肝細胞損傷的直接治療作用。在下文中，將描述配制方法和賦形劑的種類，但本發明并非僅局限于此。下面描述了典型的制備實施例。注射劑的制備甘草素(LQ)10mg甘露醇180mgNa2HP04-12H2026mg注射用蒸餾水最佳用量通過下列方式制備注射制劑溶解活性組分，調節pH至約7.然后將所有組分裝入2ml安瓿瓶并用常規注射劑制備方法滅菌。粉末的制備甘草素25mgDDB50mg玉米淀粉20mg乳糖30mg硬脂酸鎂最佳用量通過混合上面的組分和裝入密封包裝來制備粉末制劑。片劑的制備甘草素(LQ)lOOmg玉米淀粉10mg乳糖50mg硬脂酸鎂最佳用量通過混合上面的組分和壓片來制備片劑。膠囊的制備甘草素DDB50mg乳糖50mg玉米淀粉28mg滑石粉2mg硬脂酸鎂最佳用量通過混合上面的組分和裝入膠,，即通過常規膠囊的制備方法來制備片劑。軟膠囊的制備甘草素500mg聚乙二醇400400mg濃縮甘油'(conc-glycerin)55mg蒸餾水35mg將PEG和濃縮甘油混合在一起，然后加入蒸餾水。在60。C于約1500轉/分(rpm)攪拌混合物至均質，然后將該混合物冷卻至室溫從而用作膠囊內含物。通過常規制備方法制備膠囊的涂層，例如將所有的組分，即132mg的明膠、52mg的濃縮甘油、6mg70。/。的二山梨醇溶液、著色劑例如乙基香草醛、涂層基質例如巴西棕櫚蠟混合在一起以制備軟膠囊。混懸液的制備甘草素(LQ)500mg高麥芽糖漿10g糖(Sugar)30mgCMCNalOOmg檸檬香精適量蒸餾水100ml通過本領域已知的常規制備方法制備混懸劑。將組分裝入lOOOml棕色瓶并通過常規液體制備方法來滅菌。液體的制備甘草素(LQ)lOOOmg糖20g多糖20g檸檬香精20g通過下列方式制備液體制劑溶解活性組分，然后將所有組分裝入lOOOml的安瓿瓶中，并通過常規液體制備方法滅菌。健康食品的制備甘草素(LQ)lOOOmg維生素混合物最佳用』維生素A乙酸酯70mg維生素El.Omg維生素B,0.13mg維生素B20.15mg維生素B60.5mg維生素Bu0.2mg維生素C10mg維生素H10mg煙酰胺1.7mg葉酸泛酸鈣礦物混合物硫酸亞鐵氧化鋅碳酸鎂磷酸二氫鉀50mg0.5mg最佳用量1.75mg0.82mg25.3mg15mg55mg90mglOOmg24.8mg上面提及的維生素和礦物混合物可以在許多方面變化。這種變化不應看成背離本發明的主旨和范圍。枸橡酸鉀碳酸鈣氯化鎂健康飲料的制備甘草素(LQ)lOOOmg枸櫞酸lOOOmg寡糖100g杏濃縮物2g牛磺酸lg蒸餾水900ml通過下列方式制備健康飲料溶解活性組分，混合，在85。C攪拌1小時，過濾，然后將所有組分裝入lOOOml的安瓿瓶中，并通過常規健康飲料制備方法滅菌。雖然本發明如此描述，但很明顯相同的方法可以在許多方面變化。這種變化不應看成背離本發明的主旨和范圍，且所有的這類變化對本領域技術人員而言是顯而易見的，并包含在權利要求的范圍之內。工業實用性如本發明所述，當本發明的提取物或化合物經口服和靜脈內給藥至有毒物質誘導的肝毒性動物模型時，它們能顯著降低LDH和ALT酶的血藥濃度、中心性壞死和炎癥。本發明的組合物可用于預防和治療肝病且可以安全和有效的用于肝保護。權利要求1、一種藥物組合物，其含有作為活性成分的預防和治療肝病有效量的甘草提取物或從其中分離到的甘草素，及含有藥學上可接受的載體。2、根據權利要求1所述的藥物組合物，其中所述的甘草是甘草或光果甘草。3、根據權利要求1所述的藥物組合物，其中所述的提取物用蒸餾水、低級醇或其混合物提取。4、根據權利要求1所述的藥物組合物，其中所述的提取物是富含甘草素的甘草提取物，其通過下列步驟組成的方法進行制備采用重復的柱層析法純化甘草提取物從而得到純化的甘草苷組分；進行酸水解并用堿中和溶液的pH;采用柱層析從而得到目標的富含甘草素的提取物。5、根據權利要求1所述的藥物組合物，其中所述的提取物或甘草素進一步包括DDB(4,4'-二甲氧基-5,6,5，,6，-二亞甲基二氧基聯苯-2,2，-二甲酸二甲酯)。6、根據權利要求1所述的藥物組合物，其中所述的肝病是急性或慢性肝炎、肝腫大、肝膿腫、肝硬化或肝癌。7、甘草提取物或從其中分離到的甘草素在制備用于治療或預防人或哺乳動物肝病的藥物中的用途。8、一種通過保護哺乳動物肝細胞來治療肝病的方法，所述的方法包括給予所述哺乳動物有效量的甘草提取物或從其中分離到的甘草素，以及其藥學上可接受的載體。9、一種從甘草提取物制備富含甘草素的提取物的方法，所述的方法包括下列步驟洗滌、干燥甘草；用5-15倍體積的蒸餾水、醇例如甲醇、乙醇等等或其混合物混合；在從0至室溫的溫度范圍內吸附該溶液，持續48-72小時；過濾殘余物從而得到甘草提取物粗品；將其重復進行柱層析，釆用混合溶劑系統洗脫從而得到富含甘草苷的甘草提取物；使用強酸將提取物進行酸水解從而除去甘草苷的糖部分；用堿溶液中和該溶液；將該溶液進行硅膠柱層析，采用混合溶劑系統(CHCl3和丙酮)洗脫從而得到本發明富含甘草素的提取物。10、一種健康功能食品，其含有預防和改善肝病有效量的甘草提取物或從其中分離到的甘草素作為活性成分通過保護肝細胞來預防或改善肝病以及營養學上可接受添加劑。11、根據權利要求10所述的健康功能食品，所述的提取物或甘草素進一步包括DDB(4,4'-二甲氧基-5,6,5，,6，-二亞甲基二氧基聯苯-2,2，-二甲酸二甲酯)。全文摘要本發明涉及用于預防和治療肝病的含有甘草素的組合物。換言之，本發明涉及含有甘草提取物或從其中分離到的甘草素的組合物，當本發明的提取物或化合物經口服和靜脈給藥至有毒物質誘導的肝毒性動物模型時，它們能顯著降低LDH和ALT酶的血藥濃度、中心性壞死和炎癥。因此，本發明的組合物可用于預防和治療肝病且可以安全和有效的用于肝保護。文檔編號A61K31/352GK101365465SQ200780001856公開日2009年2月11日申請日期2007年1月5日優先權日2006年1月9日發明者金盈佑,金相建,金相贊申請人:特別大學校產學協力團