通過唾液酸粘附素靶向巨噬細胞的制作方法

專利名稱：：通過唾液酸粘附素靶向巨噬細胞的制作方法
技術領域：
：總體上，本發明涉及將貨物(cargo)靶向送遞至細胞的組合物和方法。具體而言，本發明涉及將貨物靶向送遞至表達唾液酸粘附素的細胞的組合物和方法。
背景技術：
：基于各種目的，包括藥物介入以及臨床生物測定和研究生物測定，需要將某物質專門送遞至靶向細胞。在最好避免非靶向細胞暴露于待送遞的物質的情形下，例如在非靶向細胞的暴露會導致不良副作用的情形下，特別需要靶向送遞。例如，治療介入可能需要消除、抑制、刺激和/或激活某一具體的細胞或細胞類型。在這種情況下，為了避免不良副作用，例如對非靶向細胞和細胞類型的抑制或刺激，將有效獲得所需結果的物質優先送遞至靶向細胞是有利的。靶向送遞還可以使用較少待送遞物質來實現所需效果。一直需要實現將物質靶向送遞至細胞的組合物和方法。
發明內容本發明的實施方案提供了一種將貨物部分送遞至細胞的方法，所述方法包括將表達唾液酸粘附素的細胞與具有唾液酸粘附素結合部分和貨物部分的綴合物相接觸。該唾液酸粘附素結合部分結合由細胞表達的唾液酸粘附素，并與該貨物部分一起被內化，藉此將該貨物部分送遞至該細胞內。天然表達唾液酸粘附素的細胞是已知的，特別包括巨噬細胞。7由本發明所提供的具體方法包括誘導或增強唾液酸粘附素在天然情況下產生少量或不產生唾液酸粘附素的細胞內表達。唾液酸粘附素表達的誘導或增強包括唾液酸粘附素表達構建體的轉染和/或有效誘導或增強唾液酸粘附素表達的試劑的給予。唾液酸粘附素的表達通過以下各種方法中的任何一種確定，包括唾液酸粘附素特異性抗體的結合、編碼唾液酸粘附素的mRM的檢測等。在具體的實施方案中，唾液酸粘附素結合部分是主要特異性結合唾液酸粘附素的抗體。這類抗體包括但不限于小鼠抗豬唾液酸粘附素mAb41D3、小鼠抗人唾液酸粘附素mAb7D2和小鼠抗豬唾液酸粘附素mAbMCA2316。在本發明方法的其它實施方案中，唾液酸粘附素結合部分為唾液酸粘附素配體。在具體實施方案中，包含在綴合物中的貨物部分為細胞內某一反應的刺激物。例如，在一個實施方案中，綴合物為細胞內免疫應答的刺激物。在其它的具體實施方案中，在細胞中刺激免疫應答的綴合物可在受試者內刺激免疫應答。因此，貨物部分可為抗原。還提供了其中該貨物部分作為細胞的抑制劑的本發明的實施方案。例如，在具體實施方案中，包含在綴合物中的貨物部分為細胞毒劑。細胞毒劑的實例為核糖體失活蛋白，但并不限于此。作為核糖體失活蛋白的具體細胞毒劑為皂草素(saproin)。在其它的實施方案中，貨物部分為抗微生物劑。包含在綴合物中的抗微生物劑可有效抑制微生物，例如但不限于細菌、病毒、真菌或原生動物《在本發明方法的某些實施方案中，貨物部分為細胞因子。任選地，該貨物部分為核酸。被送遞的核酸任選為表達構建體。另外任選將表達構建體包含于諸如但不限于細菌質粒或病毒載體等的載體內。核酸貨物任選為反義構建體，例如但不限于反義寡核苷酸、siRNA、shRNA或表達反義核酸的表達載體。在貨物部分為抗原的情況下，該抗原任選為蛋白、肽、糖蛋白或糖肽。這類抗原可以是合成的，例如但不限于經重組產生或經化學合成的蛋白質或者肽；這類抗原也可以是天然的，例但不限于從細胞、病毒或生物體分離得到的抗原。在具體的實施方案中，為抗原的貨物是病毒蛋白、病毒肽、病毒糖蛋白或病毒糖肽。在具體的實施方案中，綴合至唾液酸粘附素結合部分的抗原為流感病毒血凝素或其抗原性部分。流感病毒血凝素的特定抗原部分由SEQIDNo.3或其同源物編碼。在具體的實施方案中，包含在本發明的綴合物內的病毒血凝素為SEQIDNo.4的流感病毒血凝素或其同源物。與將貨物送遞至細胞的綴合物相接觸的細胞是在體外的或者在體內的。在本發明方法的其它實施方案中，細胞由可有效誘導或增強唾液酸粘附素在該細胞內表達的細胞因子處理。例如，由有效誘導或增強唾液酸粘附素表達的細胞因子處理的細胞為單核細胞、單核細胞系、巨噬細胞和巨噬細胞系。在具體的實施方案中，人細胞和/或人來源的細胞系由有效誘導或增強唾液酸粘附素表達的細胞因子處理。人來源的細胞系的一個實例是人單核細胞系THP-1。在其它具體的實施方案中，豬細胞和/或來源于豬的細胞系被有效誘導或增強唾液酸粘附素表達的細胞因子處理。有效誘導或增強唾液酸粘附素表達的合適的細胞因子包括干擾素cc(IFN-oc),以及肺瘤壞死因子-oc(TNF-a)和干擾素-Y(IFN-Y)的組合物。本發明提供的組合物包括綴合至貨物部分的唾液酸粘附素結合部分。在本發明的組合物的具體實施方案中，唾液酸粘附素結合部分為抗體或唾液酸粘附素配體。本發明提供了一種在受試者內刺激針對病毒抗原的免疫應答的方法，該方法包括給予受試者含有綴合有病毒抗原的唾液酸黏附素結合部分的組合物。在具體的實施方案中，作為病毒抗原的貨物是病毒蛋白、病毒肽、病毒糖蛋白或病毒糖肽。在具體的實施方案中，綴合有唾液酸結合部分的病毒抗原為流感病毒血凝素或其抗原部分。流感病毒血凝素的特異性抗原部分由SEQIDNo.3編碼。還提供了方法和組合物，其中綴合有唾液酸粘附素結合部分的病毒抗原為豬繁殖和呼吸綜合征病毒、豬繁殖和呼吸綜合征病毒蛋白或豬繁殖和呼吸綜合征病毒蛋白的抗原部分。任選地，唾液酸粘附素結合部分為抗體或唾液酸粘附素配體。包含在本發明綴合物中的特異性抗體包括單克隆抗體41D3、單克隆抗體7D2和單克隆抗體MCA2316。在具體的實施方案中，包含唾液酸粘附素結合部分和貨物的綴合物由唾液酸粘附素結合部分和貨物之間的化學鍵合產生。在其他的實施方案中，包含唾液酸粘附素和貨物的綴合物由包括表達融合蛋白在內的重組技術產生。在具體的實施方案中，本發明的一種刺激免疫應答的方法包括給予受試者的細胞因子應答細胞一定量有效誘導或增強唾液酸粘附素的表達的細胞因子。有效誘導或增強唾液酸粘附素在INF-oc應答細胞中表達的特異性細胞因子是INF-ct。INF-ct應答細胞可通過本領域已知的方法鑒定，這些方法包括但不限于INF-ot受體的檢測。具體的INF-源的細胞系(例如但不限于人單核細胞系THP-1)。巨噬細胞是INF-cc應答細胞的另一個實例。本發明的實施方案提供了一種針對受試者內抗原刺激免疫應答的方法，該方法包括給予受試者包含綴合有抗原的唾液酸結合部分的組合物。在本發明的其他實施方案中，提供了一種針對唾液酸粘附素結合能力和/或唾液酸粘附素結合刺激的細胞內化活性對化合物進行篩選的方法，該方法包括給予有效誘導或增強唾液酸粘附素表達的細胞因子；給予所述化合物；并針對所述化合物與唾液酸粘附素的特異性結合進行分析和/或針對唾液酸粘附素結合刺激的細胞內化活性進行分析。在具體的實施方案中，有效誘導或增強唾液酸粘附素表達的細胞因子為INF-oc。例如，化合物為抗唾液酸粘附素抗體或唾液酸粘附素配體，確定該化合物的特異性結合的分析的實例包括將該化合物與細胞在唾液酸粘附素結合部分的典型結合條件下(例如在基本為生理條件下)孵育并檢測結合。對結合的檢測可包括例如對與所述化合物結合的受體的檢測。例如，對該化合物的內化的檢測可通過以下步驟實現透化細胞，與結合所述化合物的試劑(例如但不限于抗體)孵育，然后對該試劑進行檢測。提供了一種轉染細胞的方法，該方法包括給予表達唾液酸粘附素的細胞綴合有表達構建體的唾液酸粘附素結合部分。在具體的實施方案中，表達唾液酸粘附素的細胞是由唾液酸粘附素表達構建體轉染的細胞。在其他實施方案中，該細胞為穩定表達唾液酸粘附素的細胞系。在又一些實施方案中，該細胞由細胞因子處理，以誘導或增強唾液酸粘附素表達《本發明提供了將貨物送遞給細胞的試劑盒，該試劑盒包括表達唾液酸粘附素的細胞和唾液酸粘附素結合部分。任選地，所提供的試劑盒包括用于將貨物綴合至唾液酸粘附素結合部分的試劑。包含在本發明試劑盒內的細胞任選為細胞系。在另一種情況下，包含在試劑盒內的唾液酸粘附素結合部分被綴合至貨物。在具體的實施方案中，綴合有唾液酸粘附素結合部分的貨物為表達構建體。提供了一種治療受試者病理狀態的方法，包括給予受試者治療有效量的綴合有治療性貨物部分的唾液酸粘附素結合部分，其中所述治療性貨物部分被送遞至受試者的表達唾液酸粘附素的細胞，由此治療所述病理狀態。在具體的實施方案中，該治療性貨物部分為該細胞的抑制劑，例如但不限于細胞毒劑。抑制劑的實例為皂草素。在具體的實施方案中，由本發明方法治療的病理狀態其特征在于在該細胞中存在病原體。在其他的實施方案中，該病理狀態為自身免疫疾病或癌癥。在治療自身免疫疾病的實施方案中，所包括的貨物部分為巨噬細胞激活和/或發炎的抑制劑。這類抑制劑包括但不限于巨噬細胞激活和/或發炎的抑制劑，例如IL-IO、TGF-P、6-(甲基亞硫酰基)己基異硫氰酸酯、倍半萜色酮以及它們的組合。圖1示出巨噬細胞于37'C與邁Ab41D3孵育之后，唾液酸粘附素結合部分在不同時間的特異性結合和內化。圖2A示出用本發明的唾液酸粘附素結合部分/抗原綴合物進行初次免疫接種之后，抗原特異性IgM血清滴度的平均值土SEM，其中正方形符號表示用偶聯有Sn特異性mAb41D3的HSA進行免疫接種的豬；三角形符號表示用偶聯有無關對照mAb的HSA進行免疫接種的豬；并且圓形符號表示用游離HSA進行免疫接種的豬。圖2B示出用本發明的唾液酸粘附素結合部分/抗原綴合物進行初次免疫接種之后，抗原特異性IgG血清滴度的平均值土SEM，其中正方ii形符號表示用偶聯有Sn特異性mAb41D3的HSA進行免疫接種的豬；三角形符號表示用偶聯有無關對照mAb的HSA進行免疫接種的豬；并且圓形符號表示用游離HSA進行免疫接種的豬。圖2C示出進行加強免疫接種之后，抗原特異性IgG血清滴度的平均值士SEM,其中正方形符號表示用偶聯有Sn特異性mAb41D3的HSA進行免疫接種的豬；三角形符號表示用偶聯有無關對照mAb的HSA進行免疫接種的豬；并且圓形符號表示用游離HSA進行免疫接種的豬。圖3示出與用非唾液酸粘附素結合部分/細胞毒劑綴合物處理的細胞相比較，用唾液酸粘附素結合部分/細胞毒劑綴合物處理的表達唾液酸粘附素的細胞群中活細胞的百分比。圖4示出與用唾液酸粘附素結合部分/細胞毒劑綴合物處理的不表達唾液酸粘附素的細胞相比較，用唾液酸粘附素結合部分/細胞毒劑綴合物處理的表達唾液酸粘附素的細胞群中活細胞的百分比。圖5為一系列由流式細胞分析形成的直方圖，示出具體的唾液酸粘附素結合部分的結合和內化情況。圖6A為數碼照片的靜電復印圖，示出在純化期間獲得的不同級分中天然流感病毒血凝素的存在情況和純化的SDS-PAGE分析，該分析包括使用針對H1N1病毒的HA的單克隆抗體通過蛋白質印跡對HA進行檢測。圖6B為教碼照片的靜電復印圖，示出圖6A示出樣本中的總蛋白使用考馬斯亮藍染色的檢測情況。圖7A是數碼照片的靜電復印圖，示出具有V5-His標簽的重組HA產生的SDS-PAGE分析，其中該蛋白在不存在胎牛血清的情況下產生。圖7B是數碼照片的靜電復印圖，示出具有V5-His標簽的重組HA產生的SDS-PAGE分析，其中該蛋白在存在胎牛血清的情況下產生。圖8A是數碼照片的靜電復印圖，示出在HA的純化過程中采集的不同級分的SDS-PAGE蛋白質印跡分析。圖8B是數碼照片的靜電復印圖，示出在圖8A示出HA的純化過程期間采集的相同級分的SDS-PAGE考馬斯亮藍分析。圖9A是數碼照片的靜電復印圖，示出SDS-PAGE蛋白印跡分析，該分析示出抗體13D12與分離的天然HA偶聯的可視情況。圖9B是數碼照片的靜電復印圖，示出SDS-PAGE蛋白印跡分析，該分析示出抗體41D3與分離的天然HA偶聯的可視情況。圖10是一系列由流式細胞分析形成的直方圖，示出具體的唾液酸粘附素結合部分的結合和內化情況。圖ll是數碼照片的靜電復印圖，示出在抗體-皂草素綴合方案期間采集的不同樣本的SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色。圖12示出用13D12-HA或41D3-HA免疫接種的豬的平均免疫-過氧化物酶單層分析滴度。具體實施例方式鮮有有效的靶向送遞組合物和方法能將所需貨物送遞至靶向細胞。特定受體唾液酸粘附素(Sn)被鑒定為本發明耙向送遞組合物和方法的靶標。唾液酸粘附素，也被稱為綿羊紅細胞受體(SER)或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素1(Siglec-1),屬于I型凝集素的Siglec家族，并且專門在主要存在于脾臟、淋巴結、骨髓、肝臟、結腸和肺的巨噬細胞亞型表達，但不會在血單核細胞表達，如以下參考文獻所述Crocker,P.R.，etal.,1991,EmboJ10:1661-9;Crocker,P.R.,etal，1994，EmboJ13:4490-503;Duan，X.，etal，1998，JVirol72:4520-3;Hartnell，A.，etal"2001,Blood97:288-96，andVanderheijden,N.，etal.，2003，JVirol77:8207-15。Sn的高表達還在獲自類風濕性關節炎患者的組織中的炎性巨噬細胞中檢測到，并且還在與乳腺癌細胞密切接觸的浸潤巨噬細胞上檢測到，如Hartnell，A.，etal，2001，Blood97:288-96;andNath，D.，etal，1999,Immunology98:213-9所述，唾液酸粘附素(Sn)最初被鑒定為小鼠的居留骨髓細胞上依賴于唾液酸的綿羊紅細胞受體(SER),并且現在還在包括人、大鼠和豬在內的多種哺乳動物體內被表征，如Crocker,P.R.，andS.Gordon,1989，JExpMed169:1333-46;Crocker,P丄，andS.Gordon,1986,JExpMed164:1862:75;andVanderheijden,N.，etal.，2003，JVirol77:8207-15所述。本發明提供了一種綴合物組合物，它包含綴合有貨物部分的唾液酸粘附素結合部分。包含綴合有貨物部分的唾液酸粘附素結合部分的綴合物組合物可用于將貨物部分送遞至表達唾液酸粘附素的細胞。本文所使用的術語"核酸"是指任何形式具有一個以上核苷酸的RNA或MA分子，包括單鏈的、雙鏈的寡核苷酸或多核苷酸。術語"核苦酸序列"用來指單鏈形式核酸的寡核苷酸或多核苷酸中核苷酸的順序。可以理解的是，由于遺傳密碼子的簡并性，多個核酸可以編碼同一多肽。術語"蛋白"、"多肽"和"肽"在本文中互換用來指通過肽鍵連接的兩個或多個氨基酸。術語蛋白包括經修飾的蛋白和肽，例如但不限于經糖基化的、經磷酸化的、泛素化的、肉豆蔻酰化的(myristoylated)、棕櫚酰化的和乙酰化的蛋白和肽。術語"表達構建體，，指重組核酸或合成核酸，該核酸包括編碼蛋白的核酸以及一個或多個與編碼所述蛋白的核酸有效連接的調控核酸序列，所述調控核酸序列指導至少編碼該蛋白的核酸在細胞內的轉錄。術語"轉染"指的是將外源核酸引入細胞。術語"有效連接，，指一核酸與另一核酸之間的功能關系。通常，有效連接的核酸是毗鄰的。一個例外是增強子的有效連接，該增強子與另一核酸是非毗鄰的，并且與之具有功能關系。術語"疫苗"指藥物組合物，包括在受試者內刺激免疫應答的至少一種抗原o術語"免疫接種"指給予疫苗以在受試者內刺激免疫應答。可對受試者進行免疫接種，以對該受試者進行疾病預防或者治療。術語"抗原"指包含一個或多個表位的分子，該表位可通過宿主免疫系統例如免疫細胞來刺激抗原特異性應答。抗原可包括肽、蛋白、糖蛋白、多糖、脂質、神經節苷脂、它們的一部分，以及它們的組合。術語"刺激免疫應答"指激發或增強免疫應答。術語"同源物"指通過與參比蛋白之間的氨基酸序列和/或結構同源性來表征的蛋白。通常，參比蛋白的同源物與參比蛋白具有至少50%、優選至少75%、更優選至少80%、85°/。、90%、91%、92°/。、93%、94%、95%、96°/L97%、98%、99%或更高的同一性。舉例來說，同源物為從另一物種分離得到的參比蛋白的直系同源物。同源物包括與參比蛋白相比具有一個或多個氨基酸置換、缺失或插入的蛋白。術語參比蛋白的"生物活性同源物"指通過與該參比蛋白的氨基酸14序列和/或結構同源性表征的蛋白，它與該參比蛋白尤其是天然存在的參比蛋白相比具有基本相似的功能、結構和/或生物化學性質。一類同源物是經保守修飾的蛋白和/或其片段。經保守修飾的蛋白或其片段為包含由化學性質上相似的氨基酸對氨基酸進行置換的蛋白或肽。例如，每個氨基酸可被描述為具有一個或多個以下特征帶正電的、帶負電的、脂肪族的、芳香族的、極性的、疏水的和親水的。保守置換是指用具有特定結構或功能特征的一個氨基酸置換具有相同特征的另一個氨基酸。酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；堿性氨基酸包括組氨酸、賴氨酸和精氨酸；脂肪族氨基酸包括異亮氨酸、甘氨酸、亮氨酸和纈氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；極性氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、纈氨酸、酪氨酸和色氨酸；并且親水性氨基酸包括天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。氨基酸還可以通過相對大小來進行描述，丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸，通常全都被認為是較小的氨基酸。同一性百分比可通過對氨基酸或核酸序列(包括參比序列和推定同源序列)進行比較來確定。例如，用于確定同一性百分比的算法包括以下文獻中的算法S.KarlinandS.Altshul，PMS，90:5873-5877，1993;T.Smithan線Waterman,Adv.Appl.Math.2:482-489，1981,S.NeedlemanandC.Wunsch，J.Mol.Biol,48:443-453，1970，W.PearsonandD.Lipman，PMS，85:2444-2448,1988;以及納入計算機執行的其他算法，例如但不限于公眾可從美國國立生物技術信息中心例如http:〃麗.ncbi.nlm.nih.gov獲取的GAP、BESTFIT、FASTA、TFASTA和BLAST。唾液酸粘附素結合部分唾液酸粘附素結合部分與唾液酸粘附素特異性結合。本文所使用的術語"特異性結合"旨在表示包含在本發明綴合物中的唾液酸粘附素結合部分優先與唾液酸粘附素相互作用，而不會與其它蛋白或其它分子發生顯著相互作用。綴合有貨物部分的唾液酸黏附素結合部分具有唾液酸粘附素特異性結合活性，并因此賦予本發明的綴合物以唾液酸粘附素特異性結合活性。具體而言，綴合有貨物部分的唾液酸粘附素結合部分會結合由細胞所表達的唾液酸粘附素的胞外部分。另外，唾液酸粘附素結合部分會與存在于靶細胞的細胞膜的唾液酸粘附素特異性結合，并刺激本發明的綴合物被攝入至該細胞內。在一個實施方案中，唾液酸粘附素結合部分為抗體。術語"抗體"指多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)、嵌合抗體、人源化抗體，以及抗原結合抗體片段和具有抗原結合功能性的分子。術語"抗體"包括具有四條多肽鏈(通過二硫鍵連接在一起的兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈)的完整免疫球蛋白。術語"抗體"還包括唾液酸粘附素結合抗體片段，例如包括但不限于諸如Fab片段、Fab，片段、F(ab，)2片段、Fd片段、Fv片段、scFv片段等片段，以及結構域抗體(dAb)。包含在本發明的綴合物中的抗唾液酸粘附素抗體和/或唾液酸粘附素結合抗體片段能結合唾液酸粘附素并刺激將該綴合物攝入到該細胞內。包含在本發明綴合物中的抗體或抗體片段特異性結合唾液酸粘附素。優選的唾液酸粘附素結合部分以高于它結合Siglec家族的另一成員的親和力結合唾液酸粘附素。優選的包含在本發明綴合物中的唾液酸粘附素結合部分其特征在于對唾液酸粘附素有至少約lx1()SM^的特異性結合活性。在其它實施方案中，優選的唾液酸粘附素結合部分對唾液酸粘附素有至少約1xlO^-1的特異性結合活性。在另一些實施方案中，優選的唾液酸粘附素結合部分對唾液酸粘附素有至少約1x10Vi的特異性結合活性。抗唾液酸粘附素抗體和唾液酸粘附素結合抗體片段可由任何方法來提供，例如包括但不限于免疫接種、分離和純化、完整免疫球蛋白的酶切、所需唾液酸粘附素結合肽或蛋白的化學合成、通過重組核酸技術生產。也可采用這些方法的組合。抗唾液酸粘附素抗體可使用用作抗原的全長唾液酸粘附素或唾液酸粘附素的肽片段通過免疫接種來制備。舉例而言，這類蛋白和肽可為人、豬、綿羊、大鼠、小鼠或其它動物的唾液酸粘附素蛋白或肽。包含在本文中的示例人、小鼠和豬唾液酸粘附素蛋白序列和編碼人、小鼠和豬唾液酸粘附素的核酸序列為SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9和SEQIDNo.10。來源于多個物種的唾液酸粘附素的胞外部分已^皮表征具有唾液酸結合位點，這在以下文獻中舉例說明Nath，D.etal，J.Biol.Chem.，270:26184-26191，1995;Vinson,M.etal.，J.Biol.Chem"271:9267-9272，1996;Hartnell，A.etal,,Blood，97:288—296;和Vanderheijden，N.etal.，2003，J.Virol.77:8207-15。例如，人唾液酸粘附素的胞外部分從第l位氨基酸延伸至第1642位氨基酸，豬唾液酸粘附素的胞外部分從第l位氨基酸延伸至第1643位氨基酸，并且小鼠唾液酸粘附素的胞外部分從第l位氨基酸延伸至第1638位氨基酸，每個序列均參見本文所描述的序列。在制備唾液酸粘附素結合抗體中用作抗原的唾液酸粘附素片段優選包括一個或多個Ig樣結構域。抗原可通過各種已知方法中的任何一種方法制備得到，包括從天然來源分離、重組產生或通過化學合成技術。在制備唾液酸粘附素結合抗如果需要，可通過與載體分子例如牛血清白蛋白或匙孔血藍蛋白連接，從而增強唾液酸粘附素或者其它抗原的肽部分的免疫原性。這類連接可通過各種方法中的任何一種方法進行，例如包括但不限于綴合以及融合蛋白的表達。可將經重組表達的蛋白和肽(例如但不限于唾液酸粘附素和唾液酸粘附素片段)標記，從而簡化分離。例如，可對這類蛋白和肽進行Fc標記。抗體、抗原結合片段及其形成方法在本領域是已知的，并且這類抗體、抗原結合片段和方法在以下參考文獻中進一步詳細描述，例如AntibodyEngineering,Kontermann，R.andDubel，S.(Eds.),Springer,2001;Harlow,E.andLane,D.，Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1988;Ausubel，F.etal.，(Eds.)，ShortProtocolsinMolecularBiology,Wiley,2002particularlychapter11;J.D.Pound(Ed.)ImmunochemicalProtocols,MethodsinMolecularBiology,HumanaPress;2nded.，1998;B丄C.Lo(Ed.)，AntibodyEngineering:MethodsandProtocols,MethodsinMolecularBiology,HumanaPress,2003;andKohler，G.andMilstein，C,Nature,256:495-497(1975)，制備唾液酸粘附素結合部分的上下文中，術語"抗原"指唾液酸粘附素或其抗原性肽部分。在一個具體的實施方案中，唾液酸粘附素的抗原性部分包括存在于表達唾液酸粘附素的細胞外的唾液酸粘附素的一部分。這個部分優選包括唾液酸結合結構域。作為唾液酸粘附素結合部分的抗體可使用天然唾液酸粘附素(例如所附氨基酸序列)和/或其肽片段作為抗原來制備得到。作為唾液酸粘附素結合部分的抗體還可使用唾液酸粘附素、經修飾的唾液酸粘附素和/或其片段作為抗原來制備得到。在一個具體的實施方案中，唾液酸粘附素結合部分為單克隆抗體41D3。單克隆抗體41D3(mAb41D3)為小鼠抗豬唾液酸粘附素單克隆抗體。單克隆抗體41D3在以下文獻中得以描述Vanderheijden，N.etal.，2003，JVirol77:8207-15和D磁,X.etal.，1998，JVirol72:4520-3。雜交瘤產生的單克隆抗體41D3保藏于CNCM(法國微生物保藏中心，InstitutePasteur,28，RueduDocteurRoux，F-75724ParisCedex15)，并被給予獲取號1-2719。在另一個具體的實施方案中，唾液酸粘附素結合部分為結合人唾液酸粘附素的小鼠單克隆抗體7D2(mAb7D2)。mAb7D2針對含有人唾液酸粘附素N端四個結構域的Fc融合蛋白產生。mAb7D2在Hartnell，A.etal.，Blood,97:288-96，2001中得以進一步描述，并且可以商購獲得。唾液酸粘附素結合部分的另一個具體實例為描述于例如Builido,R.，TissueAntigens,1997,49(4):403-13中的小鼠抗豬唾液酸粘附素單克隆抗體MCA2316，并且是可以商購獲得。在本發明綴合物組合物的另一個實施方案中，唾液酸粘附素結合部分為唾液酸粘附素配體。如上所述，唾液酸粘附素為結合唾液酸的免疫球蛋白樣凝集素。唾液酸粘附素結合唾液酸，特別是oc2-3唾液酸殘基和一些a2-6和a2-8唾液酸殘基。舉例說來，這類唾液酸殘基包括Siacc2-3Galp1-3GalNAc、Siaoc2-3Galpl-3GlcNAc和Siaoc2-3Galp1-4GIcNAc、Siacx2-6Galp卜3GalMc和Siacc2-8Neu5Acot2-3Galpl-3GalNAc。因此，在其中唾液酸粘附素結合部分為唾液酸粘附素配體的實施方案中，唾液酸粘附素結合部分優選包括唾液酸化的有機結構，例如但不限于唾液酸化的蛋白或肽、配體和/或碳水化合物。在另一個實施方案中，唾液酸粘附素結合部分包括唾液酸粘附素的天然的經唾液酸化的配體。唾液酸粘附素的天然的經唾液酸化的配體為天然存在并且在體內結合唾液酸粘附素的唾液酸化的結構。舉例而言，天然的經唾液酸化的配體包括CD43、半乳糖型C型凝集素1以及MUC1抗原。唾液酸粘附素的天然的經唾液酸化的配體可從天然來源分離得到，或者重組產生，用于包含到本發明的綴合物組合物中。另一個天然的唾液酸粘附素配體為豬動脈炎病毒蛋白。貨物部分如上所述，本發明的綴合物組合物包括唾液酸粘附素結合部分和貨物部分。貨物部分是待送遞至靶細胞的物質。在一個實施方案中，貨物部分為靶細胞中應答的刺激物。例如，貨物部分任選為巨噬細胞內免疫應答的刺激物。貨物部分還可為靶細胞內一氧化一氮產生的刺激物。例如，作為巨噬細胞刺激物的貨物部分的實例包括白細胞介素-4、白細胞介素-10、白細胞介素-13、巨噬細胞刺激蛋白、CD40配體和干擾素-Y。其它刺激物包括脂膜酸、胞壁酰三肽TNF-oc、GM-CSF、脂多糖和胞外基質蛋白。在一個具體的實施例中，作為免疫應答刺激物的貨物部分為抗原。包含在本發明綴合物中的抗原可為任何類型的抗原，例如包括但不限于肽、蛋白、脂質、碳水化合物以及這些或者那些抗原性物質的組合。抗原可來源于任何來源，因此可為經分離的天然物質、經重組產生的物質、經化學合成的物質或者以其他方式提供的物質。抗原的性質有賴于所需結果。通常，所包含的抗原是作為待送遞至抗原呈遞細胞的貨物部分，目的是刺激受試者的免疫系統，以產生針對該抗原的免疫應答。在一個具體實施方案中，所包含的作為貨物部分的抗原為豬動脈炎病毒的肽或蛋白。還提供了包含貨物部分的綴合物，該貨物部分為靶細胞的抑制劑。示例性抑制劑包括巨噬細胞活性的抑制劑、炎癥的抑制劑以及常規的細胞抑制劑。g，l刺由俗仏血厶'巨噬細胞活性和炎癥，例如在自身免疫疾病中，包括但不限于內毒素血癥、多發性硬化、類風濕性關節炎、和紅斑多良瘡。巨噬細胞活性和炎癥的抑制劑包括抗炎性細胞因子和抗炎性化合物，例如但不限于IL-IO、TGF-P、6-(甲基亞硫酰基)己基異硫氰酸酯和倍半萜色酮(包括從阜康阿魏(Ferulafukanensis)分離得到的那些)。在另一個實施方案中，作為靶細胞抑制劑的貨物部分為細胞毒劑。細胞毒劑可包含在本發明的送遞至細胞的綴合物中，目的是抑制或者破壞該細胞。例如，可靶向巨噬細胞，用于通過細胞毒劑進行抑制或破壞，目的是抑制巨噬細胞活性，例如炎癥活性。在另一個實施例中，將細胞毒劑送遞至表達唾液酸粘附素的細胞，目的是抑制微生物感染。細胞毒劑可為任何可與唾液酸粘附素結合部分綴合從而產生本發明的綴合物的細胞毒劑。示例性細胞毒素貨物部分為用作抗腫瘤劑的藥物。抗腫瘤劑在例如Goodmanetal.,GoodmanandGilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,8thEd.,MacmillanPublishingCo"1990中有述。例如，這類藥物包括阿西維辛(acivicin)、阿柔比星(aclarubicin)、阿考達峻(acodazole)、阿克羅寧(acronine)、阿多來新(adozelesin)、阿地白介素(aldesleukin),阿利維A酸(alitretinoin)、另'J噤醇(allopurinol)、六曱蜜胺(altretamine)、安波霉素(ambomycin)、雙氯胺蒽職(ametantrone)、氨磷汀(amifostine)、氨魯米特(aminoglutethi邁ide)、安吖咬(amsacrine)、阿那曲唾(anastrozole)、氨茴霉素(anthramycin)、跳霜(arsenictrioxide)、門冬酰胺酶(asparaginase)、曲林菌素(asperlin)、阿扎胞苷(azacitidine)、氮替派(azetepa)、阿佐霉素(azotomycin)、巴馬司他(batimastat)、節替派(benzodepa)、比卡魯胺(Mcalutamide)、比生群(bisantrene)、曱磺酸雙奈法德(bisnafidedimesylate)、比折來新(bizelesin)、博來霉素(bleomycin),布會那(brequinar)、溴匹立明(bropirimine)、白消安(busulfan)、放線菌素C(cactinomycin)、卡普睪酮(calusterone)、卡培他濱(capecitabine)、卡醋胺(caracemide)、卡貝替姆(carbetimer)、卡輛(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、卡柔比星(carubicin)、卡折來新(carzelesin)、西地芬戈(cedefingol)、塞來考昔(celecoxib)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、西羅里霉素(cirolemycin)、順賴(cisplatin)、克拉屈濱(cladribine)、克立那托敏使朗(crisnatolmesylate)、環碌酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞香(cytarabine)、達卡巴漆(dacarbazine)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地西他濱(decitabine)、右奧馬輛(dexormaplatin)、地扎p瓜寧(dezaguanine)、地扎p瓜寧敏使朗(dezaguaninemesylate)、地吖酸(diaziquone)、多西他賽(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、屈洛昔芬(droloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、屈他雄酮(dromostanolone)、達佐霉素(duazomycin)、依達曲沙(edatrexate)、依氟鳥氨酸(eflomithine)、依沙f星(elsamitrucin)、恩洛鈿(enloplatin)、恩普氨酯(enpromate)、依匹艱咬(epipropidine)、表柔t匕星(epirubicin)、厄布洛哇(erbulozole)、依索比星(esorubicin)、雌莫司汀(estramustine)、雌莫司；丁(estramustine)、依他硝峻(etanidazole)、依托泊香(etoposide)、依托泊香(etoposide)、氣笨乙嗜胺(etoprine)、法倔哇(fadrozole)、法扎拉濱(fazarabine)、芬維A胺(fenretinide)、氟尿香(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、氟尿嘧咬(fluorouracil)、氟西他濱(flurocitabine)、磷會酮(fosquidone)、福司曲星(fostriecin)、氟維司群(fulvestrant)、吉西他濱(gemcitabine)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲(hydroxyurea)、伊達比星(idarubicin)、異環磷酰胺(ifosfamide)、伊莫福新(ilmofosine)、白細胞介素11(IL-2，包括重組白細胞介素11即rlL2)、白細胞介素oc-2a、白細胞介素a-2b、白細胞介素a-nl、白細胞介素a-n3、白細胞介素P-Ia、白細胞介素y-Ib、異丙柏(iproplatin)、伊立替康(irinotecan)、蘭瑞肽(lanreotide)、來曲峻(letrozole)、亮丙瑞林(leuprolide)、利阿哇(liarozole)、洛美曲索(lometrexol)、洛莫司汀(lomustine)、洛索蒽職(losoxantrone)、馬索羅酚(masoprocol)、美登素(maytansine)、鹽酸雙氯乙基曱胺(mechlorethaminehydrochlride)、曱地孕酮(megestrol)、曱地孕酮(melengestrolacetate)、美法侖(melphalan)、美諾立爾(menogaril)、巰噤呤(mercaptopurine)、曱氨蝶呤(methotrexate)、甲氨蝶呤21(methotrexate)、氯苯氨咬(metoprine)、美妥替派(meturedepa)、米丁度胺(mitindomide)、mitocarcin、絲裂紅素(mitocromin)、米托潔林(ndtogillin)、米托馬星(mitomalcin)、絲裂霉素(mitomycin)、米托司培(mitosper)、米托坦(mitotane)、米托蒽疲(mitoxantrone)、麥考酚酸(mycophenolicacid)、奈拉濱(nelarabine)、諾考達唾(nocodazole)、諾拉霉素(nogalamycin)、ormnaplatin、奧昔舒侖(oxisuran)、紫杉醇(paclitaxel)、培門冬酶(pegaspargase)、培利霉素(peliomycin)、溴新斯的明(pentamustine)、培洛霉素(peplomycin)、培磷酰胺(perfosfamide)、p底泊溴烷(pipobroman)、旅泊舒凡(piposulfan)、鹽酸p比羅蒽鵬(piroxantronehydrochloride)、普卡霉素(piicamycin)、普洛美坦(plomestane)、吟菲爾鈉(porfimer)、泊非審素(porfiromycin)、波尼莫司打(prednimustine)、丙卡巴胖(procarbazine)、噤羅霉素(puromycin)、噤羅霉素(puromycin)、p比峻吹喻菌素(pyrazofurin)、利》皮腺苦(riboprine)、羅谷亞胺(rogletimide)、沙芬戈(safingol)、沙芬戈(safingol)、司莫司汀(semustine)、辛曲秦(simtrazene)、sparfosate、司帕霉素(sparsomycin)、鍺螺胺(spirogermanium)、螺莫司打(spiromustine)、螺鉑(spiroplatin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、磺氯苯脲(sulofenur)、他利霉素(talisomycin)、他莫昔芬(tamoxifen)、tecogalan、替力口氟(tegafur)、替洛蒽醒(teloxantrone)、替莫泊芬(temoporfin)、替尼泊苦(teniposide)、替羅昔隆(teroxirone)、睪內酪(testolactone)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥噪呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、塞峻吹林(tiazofurin)、替拉扎明(tirapazamine)、托泊替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、曲托龍(trestolone)、曲西立濱(triciribine)、三曱曲沙(trimetrexate)、曲普瑞林(triptorelin)、妥布氯峻(tubulozole)、烏拉莫司汀(uracilmustard)、烏瑞替派(uredepa)、伐普肽(vapreotide)、維替泊芬(verteporfin)、長春械(vinblastine)、疏酸長春新威(vincristinesulfate)、長春地辛(vindesine)、長春地辛(vindesine)、長春匹定(vinepidine)、長春甘酉旨(vinglycinate)、長春羅新(vinleurosine).、長春瑞濱(vinorelbine)、長春羅定(vinrosidine)、長春利定(vinzolidine)、伏氯喳(vorozole)、折尼輛(zeniplatin)、凈司他丁(zinostatin)、zoledronate和佐柔比星(zorubicin)。具有細胞毒性的貨物部分還可為可藥用的鹽類、酯類、酰胺類、水合物和/或這些或其他細胞毒素中的任何一種的前藥。在又一個具體實例中，具有細胞毒性的貨物部分為具有細胞毒性的核糖體失活蛋白皂草素。在一些實施方案中，可以包含毒劑以抑制或破壞與該細胞有聯系的病理微生物。例如，已知可將細菌、病毒和原生動物隔離于某些細胞內。病原體例如包括但不限于克氏錐蟲、結核分支桿菌、沙門菌屬種、腦膜炎雙球菌、HIV和羅斯河病毒，可藏匿于來自于宿主免疫系統的巨噬細胞，并由此引起持續的感染，如以下文獻所述Aquaro，S.，etal.，2002,AntiviralRes55:209-25;Brodsky，I.E.，etal.,2005，MolMicrobiol55:954-72;Jones,C，etal,,2003，MolMicrobiol49:1213-25;Monack，D.M.，etal.，2004，JExpMed199:231-41;Monteiro,V.G.，etal.，2005，ParasitolRes97:380-5;Rengarajan:J.,etal.，2005，ProcNatlAcadSciUSA102:8327-32和Way,S.J.，etal.，2002，Virology301:281-92。真菌是可存在于宿主免疫系統的病原體的另一個實例。因此，在本發明的綴合物組合物的一個實施方案中，有效抑制生物體的毒劑是被送遞至被該生物體感染的細胞的貨物部分。例如，這類毒劑包括抗細菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑和抗原蟲劑。抗細菌劑的具體實例包括四環素(例如但不限于多西環素、四環素土霉素、地美環素和米諾環素)、內酰胺(例如但不限于青霉素和先鋒霉素)、氨基糖苷類(例如但不限于慶大霉素、新霉素和鏈霉素)、大環內酯類(例如但不限于阿奇霉素、克拉霉素、林可霉素和紅霉素)、硝基咪唑(例如但不限于雙唑泰栓和替硝唑)、全諾酮類(例如但不限于西諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星和左氧氟沙星)、利福平、萬古霉素和克林霉素。抗病毒劑的具體實例包括阿巴卡韋(abacavir)、阿昔洛韋(acyclovir)、安潑那韋(amprenavir)、aplaviroc、atazanavir、brecanavir、darunavir、地拉韋咬(delavirdine)、dexelvucitabine、去羥肌香(didanosine)、disoproxil、依法韋侖(efavirenz)、恩曲他濱(emtricitabine)、enfuvirtide、etravirine、泛昔洛韋(famciclovir)、膦沙那韋(fosamprenavir)、更昔洛韋(ganciclovir)、茚地那韋(indinavir)、拉米夫定(lamivudine)、洛匹那韋(lopinavir)、maraviroc、洛匹那韋(nelfinavir)、奈韋拉平(nevirapine)、利托那韋(ritonavir)、沙奎那韋(saquinavir)、司他夫定(stavudine)、替諾福韋延胡索酸酉旨(tenofovirf腿rate)、替拉那韋(tipranavir)、vicriviroc、扎西他濱(zalcitabine)和齊多夫定(zidovudine)。抗原蟲劑的具體實例包括阿4L賄哇(azanidazole)、氯會(chloroquine)、雙哇泰栓(metronidazole)、尼莫哇(nimorazole)、奧硝峻(ornidazole)、塞克硝峻(secnidazole)、西奈芬凈(sinefungin)、替諾尼哇(tenonitrozole)、temidazole、替賄哇(tinidazole)。抗真菌劑的實例包括唑類，舉例來說，包括但不限于咪康唑(miconazole)、ketonazole、伊曲康哇(itraconazole)、氟康峻(fluconazole)、伏立康哇(voriconazole)、泊沙康峻(posaconazole)、雷夫康峻(ravuconazole)、特康唾(terconazole)、克霉峻(clotrimazole)、舍他康峻(sertaconazole)、益康峻(econazole)和芬替康峻(fenticonazole);以及多烯類化合物，舉例來說，包括但不限于那他霉素(natamycin)、非律平(filipin)、制霉菌素(nystatin)和兩'法霉素B(amphotericinB)。在具體的實施方案中，貨物部分為核酸。例如，貨物核酸可為DNA、RNA、多核香酸、寡核苷酸、反義多核苷酸或寡核苷酸或者siRNA。核酸可編碼蛋白或肽，例如mRNA。貨物核酸可為線性的、環形的、超螺旋狀的、單鏈的或雙鏈的、三鏈的或四鏈的。在一個具體的實施方案中，貨物核酸包括表達構建體。將包含有唾液酸粘附素結合部分和貨物核酸表達構建體的綴合物送遞至表達唾液酸粘附素的細胞，可使得編碼蛋白或肽的表達構建體在該細胞內表達。在其他實施方案中，作為靶細胞的抑制劑或刺激物的貨物部分可為核酸。例如，核酸抑制劑可編碼抑制劑或刺激物。或者，核酸自身作為刺激物或抑制劑。在一個實施方案中，核酸貨物為抑制劑，被送遞至表達唾液酸粘附素的細胞以抑制蛋白的表達和/或核酸的轉錄和/或翻譯。核酸抑制劑的示例性實例包括siMA、反義多核苷酸、反義寡核苷酸和核酶。核酸抑制劑可含有天然存在的核酸和/或含有經修飾的核酸，例如但不限于磷硫酰。Crooke，S.T.，AntisenseDrugTechnology:Principles,Strategies,andApplications，CRCPress,2001和Engelke,D.，RNAInterference(廳i):TheNuts&BoltsofsiRMTechnology,DMPress,2004。被送遞的核酸抑制劑能抑制體外、離體和/或體內的表達唾液酸粘附素的細胞(尤其是巨噬細胞)中的所需耙標。例如，被送遞核酸抑制劑能夠抑制感染表達唾液酸粘附素的細胞的微生物蛋白或核酸的功能或其合成，以抑制微生物感染。在另一個實施例中，送遞核酸抑制劑來抑制表達唾液酸粘附素的細胞的加工或功能。例如，需要抑制或消除表達唾液酸粘附素的細胞。炎或功能。可送遞抑制性核酸貨物例如核苷酸類似物，以抑制或消除這樣的細胞。在一個實施方案中，核酸貨物為刺激物，被送遞至體外、活體外和/或體內的表達唾液酸粘附素的細胞，目的是刺激該表達唾液酸粘附素的細胞的加工或功能。例如，核酸貨物包括編碼肽或蛋白的質粒，免疫應答需針對該肽或蛋白進行。將質粒貨物送遞至生物體內的表達唾液酸粘附素的巨噬細胞，該肽或蛋白在此生產并刺激免疫應答。編碼肽或蛋白的質粒優選為這樣一種表達構建體，它含有編碼該肽或蛋白的核酸，以及表達該肽或蛋白所要求或所需要的一個或多個調控核酸序列。例如，這類調控序列包括啟動子、增強子、剪接信號、轉錄起始位點、轉錄終止信號、多腺苷酸化信號、內核糖體進入位點(IRES)以及它們的組合。合適的啟動子包括在組成上具有活性的啟動子、誘導型啟動子和細胞型特異性啟動子。可將核酸貨物直接地或間接地綴合至唾液酸粘附素結合部分。例如，可將核酸綴合至唾液酸粘附素結合部分，從而在該核酸和該唾液酸結合部分之間形成一個鍵。例如，碳二亞胺如l-乙基-3-[3-二曱基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride，EDC),可用來與存在于核酸的5，端25磷酸基團形成磷酸酯，然后與唾液酸粘附素結合部分的氨基基團偶聯，從而產生含有氨基磷酸酯鍵的綴合物。在另一個實施方案中，核酸通過例如接頭或其它分子間接綴合至唾液酸粘附素結合部分。例如，唾液酸粘附素結合部分可綴合至帶正電的蛋白。帶正電的蛋白可與核酸接觸，從而在帶正電的蛋白和帶負電的核酸之間基于電荷進行鍵合。在本文中，帶正電的蛋白的實例包括硫酸魚精蛋白和聚賴氨酸。貨物部分任選包括微生物和/或來源于該微生物的抗原性分子。例如，貨物部分可為病毒、細菌、原生動物和/或來源于這類生物體的抗原性分子。包含在這類綴合物中的^t生物優選^:殺死或滅活。在一個優選的實施方案中，病毒性貨物部分為完整的病毒或其綴合至唾液酸粘附素結合部分的部分。這樣的病毒可為任何類型的病毒，包括用于刺激針對該病毒的抗原性應答的病毒。在具體的實施方案中，包含在綴合物中作為貨物部分的病毒為豬病毒病病毒。豬病毒病病毒包括豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)、2型豬環病毒屬、細小病毒組和偽狂犬病病毒。在具體的實施方案中，豬病毒病病毒作為貨物部分包含在用于給藥的本發明綴合物中，以刺激針對該病毒的免疫應答。在具體的實施方案中，具體的豬病毒病病毒蛋白或豬病毒病病毒蛋白的抗原性部分作為貨物部分包含在本發明的綴合物中。例如，在本發明綴合物的一些實施方案中，PRRSV膜蛋白GP3、GP4、GP5或基質(M)和/或其抗原性部分為貨物部分。在另一些實施方案中，貨物部分為2型豬環病毒衣殼蛋白(CAP)、細小病毒組衣殼蛋白VP2和/或偽狂犬病病毒gB、gC和/或gD蛋白和/或其抗原性部分。任選地，病毒蛋白和/或其抗原性部分的組合作為貨物部分包含于本發明綴合物的實施方案中。PRRSV的實例為歐洲型PRRSVLelystad病毒(獲取號No.M96262)和美國型PRRSVVR-2332(獲取號No.U87392)。在其他實施方案中，作為貨物部分包含在綴合物中的病毒為人病毒病病毒。人病毒病病毒1型單純皰滲病毒、2型單純皰滲病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、巨細胞病毒、麻滲病毒、腮腺炎病毒、風疹病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、脊髓灰質炎病毒、人乳頭狀瘤病毒和冠狀病毒。在具體的實施方案中，人病毒病病毒作為貨物部分包含在用于給藥的本發明的綴合物中，目的是刺激針對該病毒的免疫應答。在具體的實施方案中，具體的人病毒病病毒蛋白或人病毒病病毒蛋白的抗原性部分作為貨物部分包含在本發明的綴合物中。例如，貨物部分任選為1型單純皰瘆病毒gB、gC和/或gD蛋白；2型單純皰滲病毒gB、gC和/或gD蛋白；水痘-帶狀皰滲病毒gH:gL復合物、gB和/或gC蛋白；巨細胞病毒gM:gN復合物和/或gB蛋白；麻滲病毒血凝素蛋白(H)和/或融合蛋白(F);腮腺炎病毒血細胞凝集素神經氨酸酶(HN)和/或融合蛋白(F);德國麻疹病毒包膜蛋白El和/或E2;曱型肝炎病毒衣殼蛋白VP1和/或VP2;乙型肝炎病毒衣殼蛋白S、M、L和/或HbsAb;丙型肝炎病毒包裝糖蛋白El和/或E2;人免疫缺陷病毒(HIV)gpl20;脊髓灰質炎病毒VP1、VP2和/或VP3蛋白；人乳頭狀瘤病毒L1蛋白；冠狀病毒突起蛋白，例如但不限于SARS冠狀病毒突起蛋白(S);和/或這其中的任何一種的抗原性部分。在具體的實施方案中，人乳頭狀瘤病毒L1蛋白為16、18、6和/或ll型人乳頭狀瘤病毒Ll蛋白和/或其抗原性部分。病毒蛋白的組合任選作為貨物部分包含在本發明綴合物的實施方案中。流感病毒是人和動物疾病的主要因素。4艮據在該病毒表面上的兩種蛋白血細胞凝集素(也被稱為血凝素)和神經氨酸酶的具體特征，可對流感病毒進行分類和命名。依據血凝素蛋白的特征，已經鑒定出至少十六種不同的流感病毒亞型。這些亞型被稱為H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、HI1、H12、H13、H14、H15和H16。已經鑒定出各亞型的多個流感病毒毒抹，并且有很多都通過對病毒糖蛋白血凝素進行核酸測序和/或蛋白測序進行了表征。流感病毒蛋白血凝素的核苷酸和蛋白序列為本領域所知，并且公眾可經由美國國立生物技術信息中心(NCBI)Entrez蛋白和核苷酸搜索和檢索系統獲得，該搜索和檢索系統由許多資料提供者匯編，包括GenBank、RefSeq和PDB，并且包括SwissProt、PIR、PRF、PDB、genpept，并從包含在本文的GenBank和RefSeq獲取號中所標注出來的編碼區翻譯。與本文包括的獲取號相關的蛋白和核酸序列對適合作為貨物部分包含在本發明綴合物中的流感病毒血凝素進行了表征。具體而言，適合作為貨物部分包含在本發明綴合物中的流感病毒亞型HI凝血素的蛋白序列具有如下的獲取號，并且公眾通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)Entrez蛋白搜索和檢索系統可獲得AAF87274;AAF87282;AAF87284;AAN64900;AAN64902;AAN83988;AAQ10372;AAQ10387;AAQ10394;AAT81327;AAT81329;AAT81330;AAT81336;AAT81338;ABB19551;ABB19618;ABB79979;ABC02277;ABD62781;ABD94965;ABD95075;ABD95152;ABD95229;ABD95284;ABD95306;ABF47869;ABF82896;ABG柳74;ABI21200;ABI21222;ABJ09327;ABK40028;AB021716;AB021724;AB032992;ABP49327;ABP49382;ABP49481;BAE53729;BAE96533;BAE96534;BAE96536;BAF03629;CAA40728;AAF87278;AAF87279;AAF872S0:AAF87281;AAN64卯3;AAN64904;AAN64905;AAQ10390;AAQ10391;AAR90881;AAT81331;AAT8]332;AAT81333;AAT81334;AAT81335;AAT93388;AAY56898;ABA43189;ABB19562;ABB21772;ABC86237;ABD61518;ABD62843;ABD79255;ABD94987;ABD95240;ABD95251;ABD95273;ABF47891;ABF82662;ABF82684;ABF82841;ABF82863;ABF82918;AB腿78;ABI84948;ABI93028;ABJ16686;ABK40006;ABK40557;ABN50917;ABN51066;AB固088;ABO21709;AB021723;CAA40730;CAA86563;CAA91082;AAA16808;AAA16813;AAA16880;AAA訓5;AAA43142;AAA43153;AAA43168;AAA43170;AAA43171;AAA43175;AAA43231;AAA43240;AAC57415;AAK40318;AAK51344;AAK51345;AAK51347;AAN46827;AAN64894;AAN64896;AAP69688;AAP69691;AAP79971;AAU09400;ABA08519;ABA42247;ABB03123;ABB04972;ABB80045;ABB84190;ABB86887;ABD77675;ABD78071;ABD94789;ABE12248;ABF47693;ABG72868;ABG72869;ABG79952;ABI54437;ABI54444;ABI54445;ABO21730;AB021731;ABO33006;ABO52038;AB052258;ABP49305;ABP49360;BAF31892;CAA86560;CAA86561;CAA86562;CAC18524;AAA43158;AAA43169;AAA43173;AAA43176;AAA43190;AAA43194;AAA43225;AAA43232;AAA43283;AAK40314;AAK40315;AAK51348;AAN64897;AAN64898;AAN64899;AAP79977;AAX56530;AAZ79549;ABA08497;ABA12707;ABA42258;ABB51962;ABB53603;ABB82194;ABB82205;ABB82216;ABB86877;ABB86917;ABB86929;ABB柳37;ABB86946;ABC40522;ABD77708;AAA43661;AAA43680;AAF06945;AAF06946;AAF87275;AAF87276;AAF87283;AAN64901;AAQ10369;AAQ10373;AAQ10380;AAQ10385;AAQ10386;AAQ10388;AAQ10395;AAQ10396;AAT81328;AAT81337;AAT81339;AAT81340;AAT85679;ABA12729;ABB19571;ABB19607;ABB19628;ABB20429;ABB79990;ABC40631;ABD61540;ABD61735;ABD62061;ABD79101;ABDS5261;ABD95053;ABD95064;ABD95086;ABD95163;ABD95218;ABD95295;ABF71860;ABF82852;ABF82874;ABF82885;ABF82907;ABI92379;ABI96088;ABI96091;AB騰93;AB畫97;ABI96098;ABI96101;AB腿07;ABI96108;ABI96111;ABJ09151;ABJ53493;ABK40510;ABK40579;ABK40601;ABM22246;AB038384;ABO38406;BAA96109;BAA96114;BAA96115;BAA96122;BAA96124;BAA96125;CAA35094;AAA58799;AAA58801;AAA65544;AAA65546;AAA65551;AAA65553;AAA65554;AAA74285;AAA74289;AAA74291;AAA74293;AAA74299;AAA91616;AAA92279;AAB03291;AAB27052;AAB29091;AAB39351;AAB50958;AAB50966;AAG22555;ABD77917;ABD77928;ABD77950;ABD78038;ABD94778;ABE12634;ABE26991;ABF47583;ABG48049;ABG72867;ABI20826;ABI51313;AB154438;ABI84617;ABI92302;ABI95250;ABI96094;ABI96095;ABI96096;ABI96104;ABI96105;ABI96106;ABJ53427;ABJ53504;ABK40689;ABM22224;AB038318;ABO38340;ABO44046;BAA96111;BAA96112;BAA96117;BAA96118;BAA96121;BAA96126;BAA96127;BAA96128;BAA96131;BAF47397;AAA65547;AAA65548;AAA65549;AAA65550;AAA65556;AAA65557;ABG37362;ABG66973;ABG66975;ABI21211;ABI21233;ABJ16609;ABM21960:ABM66864;ABN50928;ABN51077;ABN59423;ABN59434;AB021725;ABO52104;ABP49316:ABP49338;ABP49349;BAE53730;BAE96535;BAE96537;BAE96541;BAE96542;BAF03627;29CAA40729;CAA82950;CAA91083;AAA16779;AAA16809;AAA16812;AAA16879;AAA16905;AAA43161;AAA43167;AAA43172;AAA43206:AAA43209;AAA43233:AAA43234;AAA43238;AAC53845;AAC53846;AAC57166;AAK40317;AAK51342;AAK51343;AAK51346;AAF06947;AAF75994;AAF80098;AAF80099;AAF87277;AAQ10367;AAQ10368;AAQ10389;AAQ10392;AAQ10393;AAZ38627;ABA42575;ABB19574;ABB19667;ABD63063;ABD79112;ABD85123;ABD94976;ABD94998;ABD95130;ABD95141;ABD95262;ABF47880;ABF82673;ABF82819;ABF82830;ABF82929;ABG66976;ABG66977;ABG88344;ABK39995;ABK40534;ABK40546;ABK40568;ABN50756;ABN50900;ABO33025;ABO52280;ABP49393;ABP49448;BAE96538;BAE96539;BAE96540;CAA40731;CAA42444;AAL60444;AAL87869;AAL87871;AAM76686;AAM76689;AAM76690;AAP34322;AAP69678;AAP69679;AAP69681;AAZ74374;ABA08464;ABA18037;ABB19518;ABB19529;ABB19540;ABC66233;ABC66236;ABD77719;ABD77807;ABD77818;ABD77972;ABD94811;ABD95328;ABD95339;ABE11657;ABE11723;ABE11812;ABE11922;ABE12032;ABF21277;ABG26243;ABG26791;ABG26813;ABG26824;ABG26945;ABG67477;ABI21530;AB121552;ABI21574;ABI22109;ABI30367;ABI96117;ABI96118;AB196123;AAA67338;AAA72339;AAA74296;AAA74297;AAA74298;AAA79714;AAA79727;AAB03292;AAB39352;AAB50960;AAB50961;AAB50962;AAB50963;AAB50964;AAB50965;AAL60449;AAL87868;AAM22277;AAM22278;AAM76691;AAP34323;AAP34324;AAT65329;AAZ83977;ABA06510;ABA42324;ABC66239;ABD78093;ABD95350;ABD95712;ABE11668;ABE11690;ABE11834;ABE11856;ABE11878;ABE11889;ABF21278;ABF47561;ABF82940;ABG26835;ABG88300;ABG88311;ABG88333;ABG88542;ABI85225;AAK51352;AAN64893;AAN64895;AAP69687;AAP69692;AAP79964;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209975'AY209976;AY209977;AY209978;AY209979;AY209980;AY209981;AY209982;AY20卿3，AY209984;AY209985;AY209986;AY209987;AY209988;AY209989;AY422014;AY422015AY422016;AY422017;AY633180;AY633196;AY633228;AY633364，AY633388;AY684893;CY003847;CY003855;CY003863;CY003871;CY003879;CY003887;CY003907;CY003914;CY003922;CY003936;CY003944;CY003952;CY003960;CY003968;CY003976;CY003984;CY003992;CY004554;CY005413;CY005538;CY005546;CY005765;CY005808;CY014556;CY014558;CY014601;CYO14608;CY014609;CY014710;CY014821;CY014829;CY014976;CY015135;CY017693;CY0脂7;CY020317;CY020373;CY02O381;CY020389;CY020397;CY020405;CY020413;CY020517;CY020541;CY020549;CY021013;CY021021;CY021069;CY021125;CY021789;CY02畫;CY021813;D13575;D13576;D13577;D13578;D13579;D13580;DQ006282;DQ006283;DQ009917;DQ017486;DQ017493;DQ508841;DQ508881;J02127;J02154;L11125;L11126;L11127;L11128;L11129;L11130;L11131;L11132;L11133;L11134;L11135;L11136;L11137;L11138;L11139;L11140;L11141;L11142;L20406;L20407;L20408;L20409;L20410;AB275406;AB275414;AB275620;AB275628;AB275861;AB276115;AB292785;AB296074;AB298281;AF116197;AF116198;AF116199;AF116200;AF116201;AF116202;AF116203;AF116204;AF116205;AF116206;AF116207;AF116208;AF116209;AF116210;AF1簡1;AF231356;AF270716;AF270717;AF270718;AF270719;AF270720;AF270721;AF270722;AF270723;AF270724;AF270725;AF270726;AF270727;AF270728;AY180398;AY180399;AY180400;AY180401;AY180402;AY180403;AY209952andAY209953.適合作為貨物部分包含在本發明綴合物中的流感病毒亞型H3血凝素的核酸序列具有如下的獲取號，并且公眾通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)Entrez核酸搜索和檢索系統可獲得AB013806;AB013807;AB013808;AB013809;AB013810;AB013811;AB013812;AB013813;AB014060;AB014061;AB014062;AB019354;AB019355;AB019356;AB019357;AB043705;AB043706;AB043707;AB043708;AB221016;AB221017;AB221018;AB221019;AB221020;AB22腿；AB221022;AB221023;AB221024;AB221025;AB221026;AB221027;AB221028;AB22腳;AB221030;AB22腦；AB221032;AB221033;AB221034;AB221035;AB243867;AB243868;AB243869;AB243870;AB243871;AB243872;AB243873;AB246366;AB259101;AB259102,AB259103;AB259104;AB259105;AB259106;AB259107;AB259108;AB259109;AB259110;AB259111;AB259112;AB259739;AB259740;AB259741;AB262301;AB262302;AB262303;AB262304;AB270992;AB270993;AB270994;AB270995;AB270996;AB270997;AB270998;AB270999;AB271000;AB27醒；AB27層2;AB271489;AB271490;AB271491;AB271492;AB271493;AB271494;AB271495;AB271496;AB271497;AB271柳;AB271503;AB271504;AB271505;AB271506;AB27151〗；AB271512;AB271513;AB271514;AB271515;AB271516;AB271517;AB271524;AB271525;AB271526;AB271527;AB271528;AB271529;AB271530;AB27聽;AB271810;AB271811;AB271812;AB271813;AB271814;AB271815;AB271816;AB271817;AB271818;AB271819;AB271820;AB271821;AB271822;AB271823;AB271824;AB27簡;AB271826;AB271827;AB271828;AB271829;AB271830;AB27腿;AB271832;AB271833;AB27腦;AB271835;AB271836;AB271837;AB271838;AB271839;AB271840;AB27腿;AB27畫;AB271843;AB271844;AB271845;AB271846;AB271847;AB271848;AB271849;AB271850;AB275283;AB276113;AB277754;AB284320;AB289341;AB292402;AB2類0;AB292660;AB292668;AB295605;AF008656;AF008657;AF008658AF008667AF008676AF008685AF008694:AF,03:A柳8712AF008721AF008730AF008739.AF008748AF008757AF008766AF008775:AF00隨AF008793AF00剛2AF008659;AF008660;AF008661;AF008662;AF008663;AF008664;AF008665;AF008666AF008668;AF008669;AF008670;AF008671;AF008672;AF008673;AF008674;AF008675AF008677;AF008678;AF008679;AF008680;AF008681;AF008682;AF008683;AF008684:AF008686;AF0O8687;AF008688;AF0O8689;AF00869O;AF008691;AF008692;AF008693細08695;AF008696;AF008704;AF0O8705;AF008713;AF008714;AF008722;AF008723;AF008731;AF008732;AF008740;AF008741;AF008749;AF0O8750;細08758;AF0O8759;AF008767;AF008768;AF008776;AF008777;AF008785;AF008786;細08794;AF008795;AF0O88O3;AF0O88O4;AF008697;AF008698;AF0O8699;AF008706;AF008707;AF0O8708;AF008715;AF008716;AF0O8717;AF008724;AF008725;AF008726;細08733;AF008734;AF薩35;AF008742;AF008743;AF008744;AF008751;AF008752;AF008753;AF008760;AF00隨；AF008762;AF008769;AF008770;AF0O8771;扁08778;AF008779;AF008780;AF008787;AF008788;AF008789;AF008796;AF008797;AF008798;AF008805;AF008806;AF008807;細08700;AF008701;AF0O8702AF008709;AF008710;AF008711細08718;AF008719;AF0O8720:AF008727;AF008728;AF008729腦08736;AF008737;AFOO固細08745;細08746;AF008747細08754;細08755;AF008756AF008763;AFO08764;AF008765細08772;扁08773;AF008774:AF008781;AF008782;AF008783;細08790;細08791;AF008792AF008799;AF008800;AF008801AF008808;AF008809;AF008810:AF008811,AF008812;AF008813;AF008814;AF008815;AF008816;AF008817;AF008818;AF008819,AFO08820;AF008821;AF008822;AF008823;AF008824;AF008825;扁08826;AF008827;AF008828;AF008829;AF008830;AF國31;AF008832;AF008833;AF008834;AF008835;AF008836;AF008837;AF008838;AF008839;AF008840;AF008841;AF008842;AF008843;細08844;AF008845;AF008846;AF畫47;AF008848AF008849;細08850;AF008851;AF008852;AF008853;細08854;AF008855;AF008856;AF008857,AF0O8858;AF008859;AF008860;AF008861;AF008862;AF008863;AF008864;AF008865;AF008866;AF008867;AF008868;AF008869;AF008870;AF008871;AF008872;AF008873;AF00隨;AF008875;AF,76;AF008877;AF008878;AF0O8879;AF008880;扁08881;AF008882;AF00鵬3，AF008884,AF008885;AF008886;AF00咖7;AF008888AF008889;AF008890;AF008891;AF008892;AF008893,AF008894,AF008895,AF00腳6;AF008897;AF008898;AF008899;AFO08900;AF008901;AF008902;AF00國;細08904;AF00,;AF008906;AF008907;AF008908;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;DQ482667;EF200063;J02100;J02106;J02107;J02108;J02161;AB292779;AB292783;AB296076;AB298283;AF310986;AY684895;CY005923;CY005924;CY006002;CY006003;CY006004;CY006005;CY014593;CY014595;CY014679;CY014687;CY014719;CY014806;CY017075;CY017765;CY017845;CY0讓5;CY020941;CY020949;CY020965;CY021133;CY021141;CY021149;CY021165;CY021173;CY021181;CY021245;CY021253;CY021437;CY021445;CY021469;CY021613;CY021645;CY021653;CY021661;CY021669;CY021685;D90306;DQ080993;DQ327835;DQ424858;DQ424859andDQ424860.適合作為貨物部分包含在本發明綴合物中的流感病毒亞型H12血凝素的核酸序列具有如下的獲取號，并且公眾通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)Entrez核酸搜索和檢索系統可獲得AB288334;AB288843;AF310990;AF310991;AF310992;AM286685;CY005920;CY005925;CY006006;CY006007;CYO06008;CY012840;CY014598;CY014636;CY016419;CY017733;CY017853;CY021293;CY021301;D90307;DQ787811andJ02104.適合作為貨物部分包含在本發明綴合物中的流感病毒亞型H13血凝素的核酸序列具有如下的獲取號，并且公眾通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)Entrez核酸搜索和檢索系統可獲得AB284988;AB285094;AB292664;AM087220;AM087221;AY684886;AY684887;CY005914;CY005931;CY005932;CYO05979;CY014603;CY014694;CY014720;D90308;K00383;M26089;M26090andM26091.適合作為貨物部分包含在本發明綴合物中的流感病毒亞型H14血凝素的核酸序列具有如下的獲取號，并且公眾通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)Entrez核酸搜索和檢索系統可獲得AB289335andCY014604.適合作為貨物部分包含在本發明綴合物中的流感病毒亞型H15血凝素的核酸序列具有如下的獲取號，并且公眾通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)Entrez核酸搜索和檢索系統可獲得CY006010;CY006033;CY006034;L43917;CY006032;AB295613;CY006009andL43916.適合作為貨物部分包含在本發明綴合物中的流感病毒亞型H16血凝素的核酸序列具有如下的獲取號，并且公眾通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)Entrez核酸搜索和檢索系統可獲得CY005933;CY014599;CY015160;AY684888;AY684889;AY684890andAY684891.因此，任選包含作為貨物部分的編碼流感病毒血凝素的核酸序列。在具體的實施方案中，流感病毒血凝素蛋白或其抗原性部分包含在用于送遞至受試者的綴合物組合物中，以增強針對流感病毒的免疫應答。在其他實施方案中，綴合有唾液酸粘附素結合抗體的病毒可用作基因轉移栽體，目的是在靶細胞中表達所需核酸。這樣的病毒在本領域中是已知的，包括例如皰滲病毒、腺病毒和腺伴隨病毒。在另一些實施方案中，病毒貨物部分為不表達非病毒蛋白的病毒或其一部分。在一個實施方案中，貨物部分病毒為豬動脈炎病毒。綴合貨物部分可通過各種方法中的任何一種綴合至唾液酸粘附素結合部分。所選擇的綴合方法將取決于該貨物和該唾液酸粘附素結合部分的化學性質。本發明實施方案的綴合物包括通過(共價或非共價)化學鍵合以及通過重組技術(包括融合蛋白的產生)連接在一起的唾液酸粘附素結合部分和貨物，例如使用編碼唾液酸粘附素結合部分和貨物的核酸表達構建體產生得到的綴合物。在具體的實施方案中，貨物部分和唾液酸粘附素結合部分經由這些部分上的游離官能團通過化學方式連接在一起。例如，這樣的官能團包括氨基、羧基、羥基和巰基。例如，貨物部分和唾液酸粘附素結合部分之間的連接為酯、醚、曱酸酯、碳酸酯、二硫化物、肽和酰胺。術語"連接"指在兩個部分之間通過化學反應形成的鍵或基團，從而使得各部分通過共價方式直接或間接偶聯。在一個實施方案中，唾液酸粘附素結合部分和貨物部分之間的連接在胞內環境是不穩定的，因此，唾液酸粘附素結合部分和貨物部分會隨細胞攝入而分離。例如，連接會對水解、酶解或其他形式的裂解敏感，從而使得貨物部分隨與唾液酸結合部分這種形式分離而提供所需效應。酯鍵是在細胞內對水解敏感的連接的一個實例。二硫鍵是隨細胞攝入對裂解敏感的另一個實例。在其他實施方案中，貨物部分會在綴合至唾液酸粘附素結合部分時提供所需效應。在一個實施方案中，一個以上貨物部分可包含在綴合物組合物中。另外，一個以上唾液酸粘附素結合部分可包含在綴合物組合物中。在唾液酸粘附素結合部分和貨物部分之一或兩者包含肽和/或蛋白時，貨物部分和唾液酸粘附素結合部分的官能團(用于綴合這些部分)可在肽或蛋白一者或兩者的N端或C端或在其末端之間。在形成本發明綴合物的過程中，保護基團可添加至唾液酸粘附素結合部分和/或貨物部分。這類基團、其形成和用途描述于ProtectiveGroupsinOrganicSynthesisbyT.W.GreeneandP.G.M.Wuts，JohnWiley&Sons,1999。例如，用于綴合貨物部分和唾液酸粘附素結合部分的綴合化學試劑包括偶聯劑，例如但不限于戊二醛、碳二亞胺、琥珀酰亞胺酯、聯苯胺、高碘酸鹽、異硫代硫酸鹽以及它們的組合。本發明的綴合物任選使用重組技術來產生。例如，在具體的實施方案中，綴合物是核酸構建體的表達產物，該核酸構建體包括編碼融合蛋白的表達構建體，所述融合蛋白包含唾液酸粘附素結合部分或其一部分以及直接與所述唾液酸粘附素結合部分或其一部分連接或通過中間接頭連接的貨物部分。在具體的實施方案中，編碼融合蛋白的表達構建體編碼抗唾液酸粘附素抗體或抗唾液酸粘附素抗體的片段。因此，在具體的實施方案中，包含編碼貨物部分和抗唾液酸粘附素抗體或其一部分的核酸的表達構建體編碼融合蛋白。例如，在具體的實施方案中，編碼本發明融合蛋白的表達構建體編碼與抗唾液酸粘附素抗體的一部分連接的貨物，所述抗唾液酸粘附素抗體包含抗唾液酸粘附素抗體的可變區，例如但不限于重鏈可變區和/或輕鏈可變區、單鏈VL-VH區和/或H鏈C區。在具體的實施方案中，編碼融合蛋白的表達構建體編碼貨物部分和mAb41D3或mAb41D3的一部分。在更為具體的實施方案中，編碼融合蛋白的表達構建體編碼流感病毒血凝素和mAb41D3或mAb41D3的一部在具體的實施方案中，編碼融合蛋白的表達構建體編碼貨物部分和mAb7D2或mAb7D2的一部分。在更為具體的實施方案中，編碼融合蛋白的表達構建體編碼流感病毒血凝素和和mAb7D2或mAb7D2的一部分。在具體的實施方案中，編碼融合蛋白的表達構建體編碼貨物部分和mAbMCA2316或mAbMCA2316的一部分。在更為具體的實施方案中，編碼融合蛋白的表達構建體編碼流感病毒血凝素和mAbMCA2316或mAbMCA2316的一部分。編碼抗體區域和包含抗體區域的融合蛋白的核酸的克隆和表達為本領域所知，如以下文獻例示J.D.Pound(Ed.)ImmunochemicalProtocols,MethodsinMolecularBiology,HumanaPress;2nded"1998，chapter43;R.KontermamiandS.Dubel(Eds.)，AntibodyEngineering,SpringerLabManuals,Springer,2001;andB丄C.(Ed.)，AntibodyEngineering:MethodsandProtocols,MethodsinMolecularBiology,HumanaPress,2003。貨物部分和唾液酸粘附素結合部分可直接連接形成綴合物。或者，將接頭連接于貨物部分和唾液酸粘附素結合部分兩者，從而使得這些部分通過該接頭間接連接。根據待綴合部分的性質，接頭可為同基雙功能(homobifunctional)接頭或異基雙功能(hetero—bifunctional)接頭。此外，接頭可為多功能的，使得可連接一個以上貨物部分和/或一個以上唾液酸粘附素結合部分。通常，接頭具有約1-20個骨架碳原子。但是，接頭也可以更大或更小。任選地，接頭由表達構建體中的核酸編碼。在一些實施方案中，接頭可為天然的或合成的聚合物。例如，合適的聚合物包括瓊脂糖、羧甲基纖維素、纖維素、葡聚糖和聚氨基聚苯乙烯。優選的聚合物為聚丙烯酰胺、PE0(聚乙烯)或PEG(聚乙二醇)隔離物。在一個實施方案中，包含唾液酸和/或唾液酸化結構的唾液酸粘附素結合部分可與貨物部分直接或間接綴合。例如，唾液酸殘基可綴合至含有脂質的貨物部分，以形成糖脂綴合物組合物，并且/或者通過N鍵或0鍵綴合至蛋白或肽貨物部分，以形成本發明的糖肽或糖蛋白綴合物。唾液酸殘基還可綴合至接頭。藥物組合物和給藥本發明的綴合物可單獨或作為藥物組合物的一部分給予受試者。本發明的綴合物組合物時刻通過多種途徑給予受試者，例如包括但不限于靜脈內給藥、口服給藥、胃腸外給藥、肌內給藥、皮下給藥和粘膜給藥。本發明的藥物組合物包括本發明的綴合物和可藥用載體。術語"可藥用"指在不會引起顯著的不良生物效應、并且不會以有害方式與藥物組合物的任何其他組分相互作用的情況下，可同本發明的綴合物組合物一起給予受試者的物質。舉例說來，適合給藥的藥物組合物包括生理上可接受的無菌水溶液或非水溶液、分散液、懸液或乳液，以及于無菌注射溶液或分散液中復水的無菌粉劑。合適的水性載體和非水性栽體、稀釋劑、溶劑或運載體(vehicle)的實例包括水、乙醇、多元醇(例如但不限于丙二醇、聚乙二醇、丙三醇等)、其合適的混合物、植物油(例如但不限于橄欖油)和可注射的有機酯(例如但不限于油酸乙酯)。例如，恰當流動性的維持可通過使用包衣例如但不限于卵磷脂、通過維持所需顆粒大小(就分散劑而言)以及使用表面活性劑。適合注射的組合物任選包括生理生可接受的無菌水溶液或非水溶液、分散液、懸液或乳液，以及于無菌注射溶液或分散液中復水的無菌粉劑。合適的水性載體和非水性載體、稀釋劑、溶劑或運載體的實例包括水、乙醇、多元醇(例如但不限于丙二醇、聚乙二醇、丙三醇等)、其合適的混合物、植物油(例如但不限于橄欖油)和可注射的有機酯(例如但不限于油酸乙酯)。例如，恰當流動性的維持可通過使用包衣例如但不限于卯砩脂、通過維持所需顆粒大小(就分散劑而言)以及使用表面活性劑。本發明的藥物組合物還可含有佐劑，例如但不限于防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。可通過各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥苯曱酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等來保證阻止微生物的活動。還可包含等滲劑例如糖類、氯化鈉等。可注射藥物形式的延長吸收可通過使用延緩吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來實現。其他示例性佐劑包括具有免疫剌激性的佐劑，例如但不限于弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、氫氧化鋁例如可商購的Alhydrogel(AccurateChemical&ScientificCo，Westbury，NewYork)、以及Gerbu佐劑(獲自C-CBiotech,Poway,California)。口服給藥的固體劑型包括膠嚢、片劑、丸劑、粉劑和顆粒劑。在這樣的固體劑型中，本發明的綴合物與以下物質混合至少一種惰性慣用賦形劑(或載體)，例如但不限于檸檬酸鈉或磷酸二鈣；或(a)填充劑或膨脹劑，例如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合劑，例如羥甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠；(c)潤濕劑(humectant),例如丙三醇；(d)崩解劑，例如瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、褐藻酸、某些復合硅酸鹽和碳酸4丐；(e)溶解阻滯劑，例如石蠟；(f)吸收加速劑，例如季胺類化合物；(g)濕潤劑，例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸收劑，例如高嶺土和膨潤土；以及(i)濕潤劑，例如滑石、硬脂酸鉀、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉；或其混合物。就膠嚢劑、片劑和丸劑而言，劑型還可包含緩沖劑。相似類型的固體組合物也可用作使用賦形劑例如乳糖以及高分子量聚乙烯二醇等的軟膠嚢和硬膠嚢中的填充劑。固體劑型例如但不限于片劑、錠劑、膠嚢劑、丸劑和顆粒劑可由包衣和殼(例如但不限于腸溶包衣以及本領域已知的其它物質)來制備。它們可含有遮光劑，并且還可為這樣的組合物它們以延緩方式在腸道的某一部分中釋放一種或多種活性化合物。本發明綴合物的微嚢制劑也在考慮之中。用于口服給藥的液體劑型包括可藥用的乳液、溶液、懸液、糖漿和酏劑。除了本發明的綴合物之外，液體劑型可含有本領域常用的惰性稀釋劑，例如但不限于水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苯曱醇、苯曱醇、苯甲酸卡酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二曱基酰胺、油脂(尤其是棉花子油、花生油、玉米胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、丙三醇、2-四氫呋喃甲醇、聚乙烯二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯，或這些物質的混合物等。除了這類惰性溶劑之外，本發明的藥物組合物還包含佐劑，例如但不限于濕潤劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、調味劑和芳香劑。除了本發明的綴合物之外，懸液還含有懸浮劑，例如乙氧基化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁97(aluminummetahydroxide)、膨潤土、瓊脂-瓊脂和西黃蓍膠，或者這些物質的混合物等等。藥物制劑更為具體的細節可參見PharmaceuticalDosageForms:Tablets,eds.H.A.Liebermanetal.，NewYork:MarcelDekker，Inc.,1989;L.V.Allen,Jr.etal.，Ansel'sPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,8thEd.，Philadelphia,PA，Lippincott,Wi11iams&Wilkins，2004;andRemington,TheScienceandPracticeofPharmacy,21sted.，Lippincott,Williams&Wilkins，Philadelphia,PA，2006。在一個實施方案中，本發明的綴合物任選與非綴合的治療試劑和/或診斷試劑一起送遞。例如，在這一方面合適的治療試劑和/或診斷試劑包括止痛劑、抗生素、抗體、抗原、消炎藥、抗腫瘤劑、抗病毒劑、Y或P射線發射物質、酶和激素。另外，可將兩種或多種綴合物組合物給予受試者。本發明的藥物組合物的劑量會隨諸如(但不限于)以下的各種因素而異給藥途徑；待給予組合物的受試者的年齡、健康和體重；受試者癥狀的性質和程度；如果還有的話，以及所需效果。通常，本發明的綴合物的日劑量介于每千克受試者體重的約0.001-100毫克之間。日劑量可以兩份或多份分份劑量給予，以獲得所需效果。本發明的藥物組合物還可制備為緩釋形式，以獲得所需結果。例如，適合通過注射給藥的胃腸外組合物包括溶于緩沖鹽水中的以重量計1°/。本發明的綴合物。方法
技術領域：
：本發明提供了將貨物部分送遞給細胞的方法，該方法包括將表達唾液酸粘附素的細胞與本發明的綴合物相接觸。存在于綴合物中的唾液酸粘附素結合部分結合由細胞表達的唾液酸粘附素，并且所述綴合物凈皮內化至所述細胞內。該細胞可以是體內的、活體外的或體外的。唾液酸粘附素主要由巨噬細胞表達。因此，在本發明方法的一個實施方案中，提供了靶向巨噬細胞的藥物送遞系統。因此，在這樣一個實施方案中，與經綴合的唾液酸粘附素結合部分和貨物部分相接觸的細胞為巨噬細胞。與本發明方法中的綴合物組合物相接觸的細胞在自然情況下表達唾液酸粘附素，或者可被誘導來表達唾液酸粘附素。在這樣一種方法中，可靼向除巨噬細胞之外的細胞。例如，細胞可由編碼唾液酸粘附素的表達構建體轉染，從而使得唾液酸粘附素在該細胞內表達。表達構建體包含編碼全長唾液酸粘附素或其一部分的核酸，任選與調控元件連接。已從多個物種分離出編碼唾液酸粘附素的全長核酸，示例性核酸序列和被編碼的唾液酸粘附素蛋白在本文中述及。例如，與編碼唾液酸粘附素的核酸有效連接的調控元件包括啟動子、增強子、復制起點、多腺苷酸化信號和轉錄終止序列。表達構建體及其形成方法為本領域所知，例如在Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001;andAusubel，F.etal.，(Eds.)，ShortProtocolsinMolecularBiology,Wiley,2002中有述。在具體的實施方案中，編碼唾液酸粘附素蛋白的表達構建體編碼在本文中,皮鑒定為SEQIDNo,5、SEQIDNo.7、SEQIDNo.9的唾液酸粘附素蛋白或其具有生物活性的同源物。在具體的實施方案中，編碼唾液酸粘附素蛋白的表達構建體包含在本文中被鑒定為SEQIDNo.6、SEQIDNo.6或SEQIDNo.IO的核苷酸序列。推定唾液酸粘附素同源物的生物學活性很容易由本領域的技術人員所確定，例如使用本文所描述的功能分析或本領域已知的其他功能分析中的任何一種。編碼唾液酸粘附素的表達構建體可依據本領域已知的方法來形成。例如，在Vanderheijden,N.etal.，2003，J.Virol.77:8207-15中述及的含有克隆至pcDM3.1載體(Invitrogen)的豬唾液酸粘附素cDM的pcDM3.1/Sn質粒為唾液酸粘附素表達構建體。在具體的實施方案中，由表達構建體轉染來誘導或增強唾液酸粘附素在該細胞中表達的細胞可被瞬時轉染。或者，可產生表達唾液酸粘附素的穩定細胞系。多種細胞中的任何一種均可用于產生穩定表達唾液酸粘附素的細胞系。具體的實例包括但不限于THP-I細胞、PK-15細胞、3D4/31細胞和HEK293T細胞。表達所需蛋白的穩定細胞系的產生方法為本領域所知，病在標準的分子生物學參考文獻例如S.0zturkandW.-S.Hu(Eds.)，CellCultureTechnologyforPharmaceuticalandCell—BasedTherapies,BiotechnologyandBioprocessingSeries,CRCPress,2005.中以示例方式給出。簡要說來，細胞由編碼唾液酸粘附素的表達構建體轉染。例如，細胞包含SEQIDNo.6、SEQIDNo.6或SEQIDNo.IO或編碼SEQIDNo.5、SEQIDNo.7或SEQIDNo.9的另一條序列或其同源物的表達構建體轉染。被轉染的表達構建體還編碼針對選擇試劑的抗性基因，包括但不限于新霉素抗性基因(G418)。賦予選擇試劑以抗性的表達構建體為本領域所知，并且可商購或使用標準的分子生物學技術構建。例如，細胞可依據標準的轉染方法來轉染，包括但不限于磷酸鉀技術和lipofectin技術，如Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001和Ausubel，F.etal.，(Eds.)，ShortProtocolsinMolecularBiology,Wiley,2002所述。轉染之后，將細胞于例如含有選擇試劑例如0.5g/L新霉素的培養基中在細胞培養板或細胞培養孔中孵育。在與選擇試劑一同孵育之后，未被轉染或不表達抗性標記的細胞將死亡，通常在幾天之后。將死亡的細胞從活著的被轉染的細胞附近移去，目的是選擇特定的克隆。例如，通常將經轉染的細胞單獨置于孔中或置于克隆缸中，目的是選擇一個或多個穩定轉染的細胞系。一旦單獨的集落已生長，則可對它們的唾液酸粘附素表達情況進行分析，例如通過ELISA。還針對唾液酸粘附素結合部分和/或綴合物以及該結合部分和/或綴合物至該細胞的攝入情況對被穩定轉染的細胞進行了進一步分析。被穩定轉染的細胞可用于本發明的方法中。例如，表達唾液酸粘附素的穩定細胞系被用于本發明的通過送遞包含唾液酸粘附素結合部分和核酸的綴合物來轉染細胞的方法中。在本發明方法的其他實施方案中，細胞由有效誘導或增強唾液酸粘附素在該細胞內表達的試劑處理。在本發明方法的具體實施方案中，細胞由有效誘導或增強唾液酸粘附素在該細胞內表達的細胞因子處理。例如，由有效誘導或增強唾液酸粘附素表達的細胞因子處理的細胞為單核細胞、單核細胞系、巨噬細胞和巨噬細胞系。在具體的實施方案中，人細胞和/或來源于人的細胞系由有效誘導或增強唾液酸粘附素表達的細胞因子處理。來源于人的細胞系的一個實例是人單核細胞細胞系THP-I。有效誘導或增強唾液酸粘附素表達的合適的細胞因子為干擾素-a(INF-a)。在一個具體的實施方案中，用INF-a處理人單核細胞來誘導或增強唾液酸粘附素的表達。例如，單核細胞可從血液中分離，并在體外用INF-ot處理。唾液酸粘附素的表達可通過各分析來評估，例如包括但不限于免疫分析。在其它實施方案中，將有效量的INF-a給予受試者，從而在體內誘導或增強唾液酸粘附素在細胞中表達。例如，有效量介于每毫升受試者血液10-5QQ單位INF-a。本發明提供了使用本發明的包含貨物核酸尤其是貨物表達構建體的綴合物轉染細胞的方法。在一個具體的實施方案中，將表達唾液酸粘附素的細胞與包含唾液酸結合部分和貨物表達構建體的綴合物相接觸，目的是在該細胞內表達編碼蛋白或肽。將使用唾液酸粘附素結合部分和貨物表達構建體的轉染用于體外或體內的表達唾液酸粘附素的細胞中。將使用本發明提供的綴合物進行的轉染用于升高細胞內所需蛋白或肽的水平，例如用于產生經重組表達的蛋白，目的是例如研究該蛋白的功能叱。本發明的包括將表達唾液酸粘附素的細胞與綴合物組合物相接觸的方法可用于刺激受試者內的免疫應答，目的是例如對該受試者進行疫苗接種。免疫接種是最早使用且最為有利的用于刺激生物體抵御感染的工具之一。簡要說來，免疫接種是一種給予生物體抗原來刺激該生物體的免疫系統，從而提供細胞和/或分子防御應答的方法。盡管通過將抗原非細胞靶向地給予生物體來進行免疫接種是有效的，但是在一些情況下必須給予大量的抗原來獲得所需應答。此外，非細胞靶向給予需要較長時間和/或更多次的抗原加強給予來獲得有效的免疫應答。因此，需要刺激受試者內免疫應答的組合物和方法。本發明提供了這樣一種方法，包括給予受試者有效量的本發明的包含綴合有抗101原的唾液酸粘附素結合部分的綴合物組合物。例如，可刺激免疫應答來抑制病原體感染，或刺激抗肺瘤應答。例如，可針對與所給予的作為本發明綴合物一部分的抗原相結合的抗體對受試者的血清進行分析來測量免疫應答。例如，可應用的免疫分析包括在給予綴合物之前或之后一次或多次對樣本進行的ELISA。在一個實施方案中，給予將抗原有效靶向抗原呈遞細胞(尤其是巨噬細胞)的組合物包含在本發明提供的方法中。在一個具體的實例中，針對豬呼吸和繁殖綜合征(PRRS)病毒對豬進行免疫接種是本發明方法的一個實施方案。PRRS病毒是豬的感染性疾病，它會引起嚴重的呼吸病變以及流產。正如在Weensvoort，G.，etal.，1991，VeterinaryReview.13:121—130所述的那樣，已對病毒劑進行了鑒定。然而，目前尚且沒有針對該病的有效治療方法，通常只能通過毀滅豬群來加以控制，這導致養豬人損失慘重。本發明提供了針對PRRS病毒對豬進行免疫接種的疫苗和方法。將包含與豬唾液酸粘附素結合的唾液酸粘附素結合部分的綴合物組合物綴合至PRRS病毒、PRRS蛋白、或者PRRS病毒或蛋白的抗原性部分。將該綴合物組合物給予豬，其量可有效刺激免疫應答。給藥途徑可為任何常規途徑，例如包括但不限于靜脈內給藥、肌內給藥、腹膜內給藥、皮下給藥、口服給藥、粘膜給藥以及它們的任一組合。在另一個實例中，針對流感病毒對受試者進行免疫接種是本發明方法的一個實施方案。流感病毒是多種物種的感染性疾病，會導致嚴重的呼吸綜合征和死亡。本發明提供了針對流感病毒對受試者進行免疫接種的疫苗和方法。將包含與唾液酸粘附素結合的唾液酸粘附素結合部分的綴合物組合物綴合至流感病毒、流感病毒蛋白、或者流感病毒或蛋白的抗原性部分。在具體的實施方案中，本發明提供了針對甲型流感病毒對受試者進行免疫接種的組合物和方法。將該綴合物組合物給予受試者，其量可有效刺激針對流感病毒的免疫應答。給藥途徑可為任何常規途徑，例如包括但不限于靜脈內給藥、肌內給藥、腹膜內給藥、皮下給藥、口服給藥、粘膜給藥以及它們的任一組合。在具體的實施方案中，本文提供了針對流感病毒對受試豬進行免疫接種的組合物和方法。本發明的針對流感病毒的免疫接種方法和組合物不限于受試豬，并且可用于對流感病毒感染敏感的其他受試者，例如但不限于人類和鳥類。在具體的實施方案中，用于針對流感對受試者進行免疫接種的綴合物組合物包含唾液酸結合部分和流感病毒血凝素蛋白或其抗原性部分。在一個具體的實例中，用于針對流感病毒對受試者進行免疫接種的綴合物組合物包含由SEQIDNo.3編碼的蛋白或其同源物。在另一具體的實例中，用于針對流感病毒對受試者進行免疫接種的綴合物組合物包含SEQIDNo.4所定義的蛋白或其同源物。在傳統上，采用一些抗原例如滅活疫苗或亞單位疫苗來獲得所需抗體滴度很困難，需要多次給予該抗原。使用本發明的包含與唾液酸粘附素特異性mAb偶聯的抗原的組合物，將抗原靶向送遞至表達唾液酸粘附素的巨噬細胞，可提高抗原特異性抗體的滴度。與給予未綴合的抗原相比，靶向送遞會引發更為有效的免疫應答，原因在于抗體在給藥后很快出現并且達到高滴度。因此，在一個實施方案中，刺激受試者的免疫系統的方法包括單次給予本發明的具有抗原貨物部分的綴合物組合物。在本發明可供選擇的實施方案中，可實行額外給予這樣的綴合物。術語"受試者"指本發明的綴合物所給予的脊推動物。在具體的實施方案中，受試者優選為哺乳動物，更優選為人。在其他的實施方案中，優選的受試者是豬。但是，術語受試者并不限于受試人或受試豬，并且本發明的方法和組合物可與多種動物中的任何一種動物一起使用，例如包括牛、馬、雞和其他家禽、山羊、嚙齒類、貓、狗和鳥類。有效量是足以獲得預期效益或所需效果的量。通常，有效量范圍在每千克受試者體重約0.001-100毫克。在本發明方法的其他實施方案中，靶向表達唾液酸粘附素的細胞的目的是消除或抑制該細胞。例如，在某些疾病狀態例如但不限于類風濕性關節炎下，需要消除或抑制表達唾液酸粘附素的巨噬細胞。類風濕性關節炎的特征在于存在被激活的滑膜巨噬細胞，所述滑膜巨噬細胞會引發出現滑膜炎和關節受損。本發明方法的另一個實施方案涉及送遞治療劑來抑制病原性感染。因此，本發明方法的一個實施方案包括將本發明的包含抗微生物藥貨物部分的綴合物組合物靶向送遞至巨噬細胞。這樣的把向送遞系統使得在使用非靶向送遞系統例如全身給予游離抗微生物藥時具有不良副作用的抗微生物藥得以使用。本發明組合物和方法的實施方案在以下的實施例中例示。這些實施例的提供其目的僅在于說明，而不能被認為是對本發明組合物和方法的范圍的限定。實施例實施例1本實施例描述了對唾液酸粘附素結合部分與唾液酸粘附素結合的評估分析，同時還描述了對已結合的唾液酸粘附素結合部分被攝入至細胞內的評估分析。在該實施例中，表達唾液酸粘附素的原代豬肺泡巨噬細胞被用于評估唾液酸粘附素結合部分的結合和/或攝入。如Wensvoort，G.，C.etal.，1991，VetQ13:121-30所述，豬肺泡巨噬細胞分離自4-6周齡普通比利時長白豬(PRRSV陰性豬群)。簡而言之，夾住各半肺的主支氣管，并將注射針頭插入遠端。注射冷的PBS(3x20ml)，然后按摩肺組織病抽吸。可抽吸到約75%的BAL液，將將其置于冰上。BAL細胞通過離心自液體里分離，并將細胞用于實驗中。采用mAb41D3的染色表明，該方法通常會使得表達唾液酸粘附素的巨噬細胞的純度高于95%。于371C在潮濕的5%C02氛圍下于添加有如下物質的Earle，sMEM中培養該細胞10。/。胎牛血清(FBS)、2mML-谷氨酰胺(BDHChemicalsLtd.)、"/。非必需氨基酸(GibcoBRL)、1mM丙酮酸鈉和抗生素。巨噬細胞優選在使用前培養24小時。對照細胞例如不表達唾液酸粘附素的細胞可用于評估結合的特異性和^^情況。這樣的細胞包括例如HEK293T細胞、在DuBridge，R.B.etal，1987，MolCellBiol7:379-8中描述的用SV40大T-Ag(SV40TtsA1609)轉染的人胚胎腎細胞系。HEK293T細胞維持在添加有10%FBS、2mML-谷氨酰胺和抗生素混合物的DMEM中。在本實施例中所使用的抗體包括針對唾液酸粘附素的Mab41D3。對照抗體包括在Nauwynck，H.J.，an線B.Pensaert，1995，ArchVirol140:1137-46中進一步描述的針對PRV糖蛋白gD、同種型匹配(IgGl)的mAb13D12與SWC3(Pescovitz，M.D.etal.，1984，JImmunol133:368-75中所描述的一種用作豬單核細胞、巨噬細胞和嗜中性粒細胞的標記的膜蛋白/表面蛋白)起反應的mAb74-22-15。使用G蛋白瓊脂糖柱色諉法(AmershamBiosciences)純化抗體，用PBS透析，并在使用前于4'C或-70'C保存。對照細胞例如不表達唾液酸粘附素的細胞可用于評估結合的特異性和攝入情況。這樣的細胞包括例如HEK293T細胞、在DuBridge，R.B.etal，1987，MolCellBiol7:379-8中描述的用SV40大T-Ag(SV40TtsA1609)轉染的人胚胎腎細胞系。HEK293T細胞維持在添加有10%FBS、2mML-谷氨酰胺和抗生素混合物的DMEM中。在本實施例中所使用的抗體包括針對唾液酸粘附素的Mab41D3。對照抗體包括在Nauwynck，H.J.，an線B.Pensaert,1995，ArchVirol140:1137-46中進一步描述的針對PRV糖蛋白gD、同種型匹配(IgGl)的mAb13D12與SWC3(Pescovitz,M.D.etal.，1984，JI醒no1133:368-75中所描述的一種用作豬單核細胞、巨噬細胞和嗜中性粒細胞的標記的膜蛋白/表面蛋白)M應的mAb74-22-15。4吏用G蛋白瓊脂糖柱色譜法(AmershamBiosciences)純化抗體，用PBS透析，并在使用前于4x:或-7on保存。在評估唾液酸粘附素結合部分的特征的分析中，將細胞與多個條件和多個濃度下的唾液酸粘附素結合部分一起孵育。在本實施例中，原代巨噬細胞與濃度為25微克/毫升的純化抗體于4'C一起孵育1小時，目的是僅貼壁而不內化。然后洗滌細胞以除去未結合的抗體，并轉移至37*0來開始胞吞。不同時間之后，細胞用3'/。多聚曱醛(PF)固定、用0.1%TritonX-100透化，并用FITC標記的山羊抗小鼠IgG染色，以顯現結合到細胞且內化至細胞中的抗體。作為對照，將細胞在4匸孵育(時間0)之后固定。使用恰當的技術例如共聚焦顯微鏡，可對內化到于不同條件下孵育的巨噬細胞和對照細胞中的小嚢泡數目進行計數。共聚焦分析的進行使用掃描光譜共聚焦系統，例如與來自LeicaMicrosystemGmbH、與LeicaDMIRBE倒置顯微鏡連接的LeicaTCSSP2激光。圖像獲取使用LeicaTCSSP2共聚焦軟件包進行，重疊圖像由AdobePhotoshopCS產生。105在一個具體的實施例中，將巨噬細胞與唾液酸粘附素特異性mAb41D3于4t:一起孵育來使抗體結合而不內化。然后洗滌細胞來除去未結合的抗體，病轉移至37'C來進行內化。固定細胞，并在不同時間對其進行染色，以分析結合情況以及攝入至細胞的情況。圖l表明，原代豬巨噬細胞與mAb41D3—起孵育引發唾液酸粘附素和抗體內化。圖1示出巨噬細胞于37"C與mAb41D3孵育之后，唾液酸粘附素結合部分在不同時間的特異性結合和內化。攝入動力學由巨噬細胞與mAb41D3于37'C—起賻育之后，在不同時間具有內化的唾液酸粘附素的細胞百分比表示。圖1中的數據表示三個獨立實驗中的平均值士標準差。在時間0時，觀察到清晰的膜染色，并且沒有一個巨噬細胞細胞質內含有唾液酸粘附素陽性嚢泡，如在該圖原點的點所示。在轉移至37'C之后，在37C隨著時間的增加，內化有唾液酸粘附素和抗體的細胞數目在90分鐘時上升到最大值90%(圖1)，然后在120分鐘時下降到61%，在180分鐘是下降到50%。在較早的時間點，胞吞嚢泡主要存在于質膜周圍，而隨時間的增加，胞吞的唾液酸粘附素主要位于核周區。作為對照，將原代豬巨噬細胞與非唾液酸粘附素結合抗體、同種型匹配的mAb13D12或mAb74-22-15—起醉育。與mAb13D12—起孵育的細胞未顯示有染色(數據未給出)，而mAb74-22-15孵育的細胞在檢測的全部時間點均顯示出獨有的質膜染色。此外，將mAb41D3于37X:直接添加至巨噬細胞時，這得到了相似的內化動力學。實施例2在一個分析中使用多種細胞來評估唾液酸粘附素結合部分的攝入情況和/或內化情況。表達唾液酸粘附素的細胞系可用于唾液酸粘附素結合部分的結合和/或攝入分析。在一個分析中，豬細胞系PK-15可用于評估唾液酸粘附素結合部分的攝入和/或內化情況。如Vanderheijden，N.etal.，2003，J.Virol.77:8207-15所述維持PK-15細胞。大約25%的PK-15細胞通常表達唾液酸粘附素。PK-15細胞任選由唾液酸粘附素表達構建體來轉染，以增強唾液酸粘附素在用于評估唾液酸粘附素結合部分的M和/或內化的分析中的細胞中的表達。豬肺泡巨噬細胞系3D4/31(37)維持于添加有10%FBS、2mML-谷氨酰胺、r/。非必需氨基酸(Gibco)和抗生素混合物的RPMI/MEM(50/50)中。通常約5%的3D4/31細胞表達唾液酸粘附素。3D4/31任選由唾液酸粘附素表達構建體來轉染，以增強唾液酸粘附素在用于評估唾液酸粘附素結合部分的攝入和/或內化的分析中的細胞中的表達。依據制造商的說明書，^f吏用磷酸釣(Cellphecttransfectionkit，AmershamBiosciences)轉染HEK293T細胞，并使用LipofectaminePlus(Invitrogen)轉染PK-15和3D4細胞。在轉染后24小時將細胞用于實驗中。實施例3可處理其特征在于少量表達或不表達唾液酸粘附素的原代細胞或細胞系，來表達唾液酸粘附素和/或來增強唾液酸粘附素表達。在具體的實施方案中，細胞用唾液酸粘附素表達構建體轉染，目的是提供用于評估唾液酸粘附素結合部分的結合和/或攝入的分析中的細胞。任選使用本文詳細描述的包含編碼豬、小鼠或人唾液酸粘附素的核苷酸序列的表達構建體。含有克隆至pcDNA3.1載體(Invitrogen)的豬唾液酸粘附素cDNA的pc腿3.1/Sn質粒在Vanderheijden，N.etal.，2003，J.Virol.77:8207-15中述及。實施例4在其他具體的實施方案中，細胞由唾液酸粘附素表達的刺激物處理，目的是提供用于評估唾液酸粘附素結合部分的結合和/或攝入的分析中的細胞。唾液酸粘附素表達的刺激物包括干擾素-a。在該實施例中，依據制造商的說明書(AmershamBiosciences),人夕卜周血單核細胞經由在Ficoll-paque離心分離自來自健康供體的肝素化血液。單核細胞的半純化通過塑料粘附和除去非粘附淋巴細胞的幾次洗滌步驟。采用小鼠抗人CD14抗體的流式細胞術分析表明，該方法通常會使得單核細胞的純度高于90%。將細胞在含有10%FBS的RPMI培養基(RPMI-FBS)中或含有500U/ml干擾素-y和10ng/ml腫瘤壞死因子-a(TNF-cc)的RPMI-FBS中(如Hartnell，A.，etal.，Blood，2001.97(1):p.288-96所述)，或在添加有干擾素-y(100U/ml)的rpmi-fbs中培養3天。通過在4°C與冰冷的PBS賻育，將細胞從塑料基底轉移至它們附著處。先讓細胞在4'C與小鼠抗人唾液酸粘附素特異性抗體或者同種型匹配的無關對照抗體13D12—起孵育。然后用多聚甲醛(3°/。，溶于PBS)固定細胞，或者在37。C孵育1小時以內化所結合的抗體，隨后進行多聚甲醛固定。將細胞洗滌3次，然后與FITC標記的山羊抗小鼠Ab(MolecularProbes)賻育。一些細胞由APC-標記的小鼠抗人CD14(BDPharmingen)進《亍雙染。最后，將細胞洗滌兩次，重懸于PBS中，并用Becton-Dickinson(SanJose，California)FACScalibur進行分析。對每個樣本中的一萬個細胞進行分析，并保存四個參數用于進一步分析前向散射光、側向散射光、綠色熒光和紅色熒光，該分析的結果示于圖5。對唾液酸粘附素表達的流式細胞術分析得到了代表三個實驗的數據。染色期間，對照樣本(圖5中的I所示)如其他樣本一樣處理，但是沒有使用抗體。未處理的細胞和細胞因子處理的細胞用對照抗體13D12和人唾液酸粘附素特異性抗體7D2染色，如圖5中的II所示。在7D2的結合之后，在37。C將一個樣本孵育1小時，目的是使得受體唾液酸粘附素能內化該抗體，如圖5中的III所示。很明顯，IFN-oc處理誘導了Sn表達，并且所誘導的Sn能內化單克隆抗體7D2。如圖5所示，單克隆抗體7D2內化的表現在于對在37C與FITC標記的山羊抗小鼠IgG(MolecularProbes,InvUrogen)孵育的干擾素-a處理的細胞進行表面染色時，平均熒光強度的降低。在使用人單核細胞的三次實驗中的兩次中，低水平的唾液酸粘附素出現在未處理細胞上，而在第三次實驗中，它沒有出現。使用TNF-cc和IFN-Y處理細胞誘導Sn表達，而使用IFN-a處理導致顯著升高的唾液酸粘附素表達。采用分離自豬的外周血并由IFN-a處理來誘導Sn表達的單核細胞，獲得了相似的結果。正如IFN-a處理的單核細胞的唾液酸結合能力所示，IFN-a處理所誘導的唾液酸粘附素是具有生物學活性的。紅細胞在其表面含有唾液酸，如果單核細胞具有功能性表達的唾液酸粘附素，那么這使得紅細胞可結合這些單核細胞。如上所示，將單核細胞在96孔板中培養三天。然后，將它們在37C與正常的培養基或添加有30U/ml神經氨酸酶(Roche,目的是除去表面上的唾液酸)的培養基一起孵育30分鐘。除去神經氨酸酶之后，將單核細胞在室溫下與0.1%人紅細胞溶液一起孵育1小時。洗去多108余的紅細胞，并通過光學顯微鏡顯現紅細胞與唾液酸粘附素的結合。單核細胞的表面上存在的唾液酸未被除去時，則在所檢測的任何條件下，紅細胞均不能結合單核細胞。然而，在將唾液酸從單核細胞上除去時，則在一些條件下紅細胞能夠結合。在正常培養基中生長的細胞中觀察到少量的結合。由TNF-oc和IFN-Y處理的細胞不會結合RBC。但是，在IFN-oc處理的細胞中，觀察到了清晰形成的薔薇狀結構(rosettes)，即與單核細胞結合的紅細胞。這些數據證實了在流式細胞術中獲得的結果，表明具有生物學活性的唾液酸粘附素在單核細胞中受到IFN-ct處理的誘導。本實施例還給出了在人單核細胞上表達的細胞因子誘導的唾液酸粘附素內化唾液酸粘附素結合部分的能力。單核細胞如上所述進行分離并用IFN-oc處理3天來誘導人唾液酸粘附素。然后將細胞與人唾液酸粘附素特異性mAb7D2—起于37X:孵育60分鐘，使其結合和內化。作為對照，將細胞與mAb7D2—起于4。C孵育。在4X:，細胞不再能夠調節內化，因而該對照僅結合唾液酸粘附素結合部分mAb7D2。60分鐘后，將細胞用3%溶于PBS的多聚曱醛處理，并通過與溶于PBS中的0.1%TritonX-100孵育2分鐘來透化。通過與FITC標記的山羊抗小鼠(Invitrogen)—起孵育來顯現MAb7D2。還使用TexasRed標記的次毒萆環肽顯現對照肌動蛋白，從而區分表面結合的唾液酸粘附素和內化的唾液酸粘附素。在時間0觀察到唾液酸粘附素的表面表達以及唾液酸粘附素結合部分mAb7D2的結合。于37X:孵育60分鐘之后，在IFN-cc處理的人單核細胞中觀察到內化的唾液酸粘附素和唾液酸粘附素結合部分mAb7D2。因此，本文提供了用于評估人唾液酸粘附素結合部分和人唾液酸粘附素結合部分的綴合物的體外系統，該體外系統與用于評估唾液酸粘附素結合部分和唾液酸粘附素結合部分的綴合物的體外和體內豬系統相似。實施例5針對干擾素-ot對人THP-1細胞(一種單核細胞連續細胞系)中的唾液酸粘附素表達的影響進行測試，以確定由作為唾液酸粘附素結合部分的抗體刺激時，唾液酸粘附素是否被內化到這些細胞內。THP-1細胞保藏于美國典型培養物保藏中心(ATCC)，并被鑒定為ATCC編號TIB-202。將THP-1細胞在含10%FBS的RPMI培養基(RPMI-FBS)或含有干擾素-y(500U/ml)109和TNF-a(10ng/ml)的RPMI-FBS或在添加有干擾素-oc(100U/ml)的RPMI-FBS中培養3天。將THP-1細胞與人唾液酸粘附素特異性抗體7D2或同種型匹配的無關對照抗體13D12—起于4X:孵育。然后，細胞用多聚曱醛(3%，溶于PBS)固定，或者在37X:孵育1小時，使抗體誘導唾液酸粘附素和被結合的抗體內化，然后進行多聚甲醛固定，并使用0.1%TritonX-100透化細胞。將細胞洗滌三次，然后與FITC-標記的山羊抗小鼠Ab(MolecularProbes)一起孵育。一些細胞由APC-標記的小鼠抗人CD14(BDPharmingen)進行雙染。將細胞洗滌兩次，重懸于PBS中，并用Becton-Dickinson(SanJose，California)FACScalibur進行分析。對每個樣本中的一萬個細胞進行分析，并保存四個參數用于進一步分析前向散射光、側向散射光、綠色熒光和紅色熒光(圖10)。這些數據表明，IFN-a處理誘導了THP-1細胞上的人唾液酸粘附素，并且在用mAb7D2于37。C進行刺激時，觀察到細胞表面唾液酸粘附素熒光的下降，這指示與唾液酸粘附素結合的抗體發生了內化。圖10示出唾液酸粘附素表達和抗體誘導的唾液酸粘附素內化的流式細胞分析結果。柱狀圖代表三次實驗。染色期間，對照樣本(I)如其他樣本一樣處理，但是沒有使用抗體。未處理的和細胞因子處理的細胞用對照抗體13D12和人唾液酸粘附素特異性抗體7D2(n)染色。在7D2的染色之后，于37X:將一個樣本賻育1小時，使得受體能內化抗體(III)。IFN-a處理顯著誘導了唾液酸粘附素表達，并且被誘導的唾液酸粘附素能內>[匕單克隆抗體7D2，這由下降的平均值示出，該平均值在37匸孵育時從364下降至258。在本實施例中^^用共聚焦顯^^鏡來顯現唾液酸粘附素和被結合的唾液酸粘附素結合部分mAb7D2的內化情況。將THP-1細胞與人唾液酸粘附素特異性mAb7D2于371C孵育60分鐘來內化。作為對照，通過將該細胞與mAb7D2于4匸一起孵育來分析時間0。在41C,細胞不再能夠調節內化，因而該對照僅結合細胞表面未被內化的唾液酸粘附素。60分鐘后，將細胞用3%溶于PBS的多聚甲醛處理，并通過與溶于PBS中的0.1%TritonX-100孵育2分鐘來透化。通過與FITC標記的山羊抗小鼠(Invitrogen)一起孵育和染色來顯現內化的抗體。在時間0時觀察到這些細胞的表面標記，而在時間60時，觀察到唾液酸粘附素和被結合的抗體被內化到THP-1細胞中。因此，本發明提供了一個包含人單核細胞THP-1細胞系的體外系統，使得可對抗體誘導的人唾液酸粘附素內化進行進一步分析，無需分離原代血液單核細胞或巨喧細胞。實施例6對唾液酸粘附素結合部分和貨物部分的化學交聯進行了描述。在本實施例中，人血清白蛋白(HSA)是貨物部分，是待與mAb41D3(唾液酸粘附素結合部分)綴合來形成本發明的組合物的抗原。此外，作為對照，將人血清白蛋白(HSA)與非唾液酸粘附素結合抗體mAb13D12綴合。就本實施例中HAS和邁Ab的化學交聯而言，采用了兩步交聯法。通過將600微克LC-SMCC與20毫克mAb于8升磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中室溫孵育30分鐘，將具有胺活性的交聯劑LC-SMCC(Pierce)偶聯至經純化的mAb41D3。通過將2亳克SPDP與40亳克HSA在8升PBS中于37"C孵育30分鐘，將具有胺活性的交聯劑SPDP(Pierce)偶聯至經純化的HAS。然后通過添加125孩￡克DTT來活化SPDP-HAS，從而形成硫醇活化的蛋白。然后，使用截留量為10-14kDa的膜將mAb-LC-SMCC和該硫醇活化的HAS在4X:用PBS透析，以除去殘留的未反應的LC-S醒C、SPDP和DTT。然后將mAb-LC-SMCC和該硫醇活化的HAS混合在一起，并在37匸孵育30分鐘，目的是使得HAS上的巰基與mAb上的LC-SMCC的馬來酰亞胺端反應，從而形成共價的巰醚鍵。偶m應之后，使用截留量為100kDa的膜將該混合物用PBS透析，以將任何未反應的HSA從該混合物中除去。進行相似的反應來形成包含綴合有非唾液酸粘附素結合抗體mAb13D12的Aj6l清白蛋白(HSA)的對照綴合物。對在交聯方案的不同步驟之間采集的樣本進行分析，以確認綴合物的形成。例如，這樣的樣本可通過7°/。凝膠上的SDS-PAGE來分離，并且可使用試劑例如考馬斯藍來染色，目的是顯現反應物和反應產物。實施例7在原代巨噬細胞中以舉例方式示出了包含唾液酸粘附素結合部分和貨物部分的綴合物組合物的內化。在本實施例中，將HSA-mAb41D3綴合物和HSA-mAb13D12綴合物與表達唾液酸粘附素的原代豬巨噬細胞一起在37。C孵育一小時。將在不同培養皿中的細胞與mAb41D3、mAbl3D12或僅與HAS—起于37'C孵育1小時。然后洗滌細胞，并通過與3%多聚甲醛一起孵育10分鐘來固定，并通過與0.1%TritonX-100—起孵育2分鐘來進行透化。隆豬血清一起孵育，然后與FITC標記的鏈霉素親和素FITC(MolecularProbes)—起賻育。用TxRed標記的山羊抗小鼠Ig(MolecularProbes)來檢測單克隆抗體。然后使用合適的技術例如共聚焦顯微鏡來對該細胞進行分析。共聚焦分析的進行使用掃描光語共聚焦系統，例如與來自LeicaMicrosystemGmbH、與LeicaDMIRBE倒置顯^:鏡連接的LeicaTCSSP2激光。圖像獲取使用LeicaTCSSP2共聚焦軟件包進行，重疊圖像由AdobePhotoshopCS產生。分析表明不管是否與HSA偶聯，mAb41D3均發生內化，這說明該偶聯反應對mAb41D3結合唾液酸粘附素和誘導內化的能力沒有影響。當與mAb41D3偶聯的游離HSA被添加至沒有巨噬細胞時，其內化不存在或者水平極低，然而，在HSA與mAb41D3偶聯時，觀察到其明顯的內化。此外，在由HSA-mAb41D3綴合物處理的細胞的共聚焦圖像中，內化的HAS與mAb41D3位于同一位置。因此，將HAS與mAb41D3偶聯^(吏得HSA與mAb41D3通過唾液酸粘附素受體一起內化。因此，將本發明的包含與唾液酸粘附素特異性mAb41D3偶聯的HSA的綴合物與表達唾液酸粘附素的原代巨噬細胞相接觸，會使得HSA以唾液酸粘附素依賴形式被攝入巨噬細胞內，然而，將非偶聯的HSA添加至巨噬細胞并不會得到高效的HSA攝入。實施例8在本實施例中，采用本發明的綴合物組合物進行免疫接種。從豬動脈炎病毒陰性牧場購買六周齡普通豬，并依照根特大學獸醫學院倫理委員會的建議，將其圏養在具有HEPA過濾空氣的隔離單位。六只豬用一亳克本發明的具有偶聯有唾液酸粘附素特異性mAb41D3的HSA的綴合物進行免疫接種。三只豬用一毫克具有偶聯有對照mAb13D12的HSA的對照綴合物112進行免疫接種。每次免疫接種包括給予2毫升PBS中的綴合物，其中1.5毫升通過靜脈內給予，1.5亳升通過肌內給予。作為對照，六只豬用一亳克未綴合的HSA進行免疫接種。在免疫接種之前以及免疫接種之后第10、17、24、32和38天收集血液樣本。三個月之后，再次采集血樣，并用一毫克HSA通過肌內注射對該豬進行加強免疫。針對是否存在HSA特異性IgM和IgG抗體，通過ELISA對獲自經免疫接種的豬的血清進行分析。HSA特異性IgM和IgG抗體滴度由VanderStede，Y.，E.etal，2001,Vaccine19:1870-8和Verdonck，F.etal，2005，JControlRelease104:243-58中所述的間接ELISA來確定。簡而言之，將96孔PolysorbImmuno微滴定板(NUNC)的孔用溶于PBS、濃度為30微克/毫升的HSA于37。C包被2小時。然后洗滌該板，并用添加有0.2%Tween⑧80的PBS對剩下的結合位點在4X:進行過夜封閉。將在ELISA稀釋緩沖劑(PBS+0.05%Tween20)中兩倍系列稀釋的血清樣本(從1/10開始)添加至該板_中，然后加入如在VanZaane，D.，andM.M.Hulst，1987，VetImmunolImmunopathol16:23-36所述的豬特異性IgM或IgGMab，和添加有2。/。豬血清、綴合有過氧化物酶的兔抗小鼠多克隆抗體(Dako)。ABTS和H202用作色原體和底物，并且通過分光光度計在405nm(OD405)測量光密度。截留值被計算為在第0天所有血清(稀釋度為1/10)的平均OD柳值加上三倍的標準差。抗體滴度是最高稀釋度的倒數，所述最高稀釋度仍然具有高于計算得到的截留值的OD4。5。圖2示出初次免疫接種之后，HSA特異性IgM(圖2A)和IgG(圖2B)血清滴度的平均值(士SEM)。圖2C示出加強免疫接種之后，HSA特異性IgG血清滴度的平均值。方格符號指示用偶聯有Sn特異性mAb41D3的HSA進行免疫接種的豬；三角符號指示用偶聯有無關對照mAb的HSA進行免疫接種的豬；并且圓形符號指示用游離HSA進行免疫接種的豬。初次免疫接種之后，在用僅HSA或用偶聯有對照mAb13D12的HSA進行免疫接種的豬中，檢測到低至不能檢測的IgM抗體滴度。相反，在用偶聯有唾液酸粘附素特異性mAb41D3的HSA免疫接種的豬中，從免疫接種后(dpi)10天開始就存在IgM抗體。這些抗體維持在接近穩定的水平，直至17dpi,并從24dpi開始下降，如圖2A所示。同樣，在用僅HSA免疫接種的豬中，直至24dpi均不能檢測到HSA特異性IgG抗體，從32dpi開始檢測到低滴度。在用偶聯有對照mAb13D12的HSA進行免疫接種的豬中，從10dpi開始檢測到低滴度的HSA特異性IgG抗體，所述IgG抗體在32dpi時達到最大滴度。HSA和非唾液酸粘附素結合抗體的交聯會刺激一些HSA特異性IgG抗體應答。相反，用偶聯有唾液酸粘附素特異性mAb的HSA進行免疫接種的豬會出現在10dpi就已開始的高低度IgG抗體。最大的抗體滴度在17dpi檢測到，并且這些抗體直至38dpi—直維持4艮頂，如圖2B所示。為研究采用偶聯有唾液酸粘附素特異性mAb41D3的HSA進行免疫接種是否會對誘導HSA特異性記憶細胞有影響，在用僅HSA進行初次免疫接種之后3個月對所有動物進行加強免疫。在加強免疫接種和4dpi時，所有動物均具有低至不能檢測的HSA特異性IgG滴度。從7dpi開始，在所有動物中均檢測到IgG抗體應答，但是最高滴度在接受偶聯有唾液酸粘附素特異性mAb41D3(作為初次免疫接種)的HAS的動物中檢測到，如圖2C所示。用HSA-mAb41D3構建體進行免疫接種的豬在整個研究中均展現出最高的IgG和IgM抗體滴度，這表明將HSA偶聯至唾液酸粘附素特異性mAb大大提高了誘導速度和HSA特異性IgG和IgM抗體的滴度。因此，免疫原至巨噬細胞的靶向送遞通過將免疫原偶聯至唾液酸粘附素特異性mAb是可能實現的，并且這會影響體液免疫應答，提高誘導速度和抗原特異性抗體滴度。實施例9唾液酸粘附素結合部分/病毒蛋白綴合物，給藥和免疫應答。在本實施例中，流感病毒血凝素(HA)綴合至唾液酸粘附素結合部分單克隆抗體(mAb)41D3。綴合至唾液酸粘附素結合部分單克隆抗體41D3的流感病毒血凝素為自病毒純化的天然蛋白或在真核細胞中產生的重組蛋白形式。在本實施例中，綴合至唾液酸粘附素結合部分單克隆抗體41D3的血凝素以化學方式與mAb41D3交聯，并被注射到豬內來顯示并評估該綴合物誘導HA特異性抗體的能力。天然血凝素的純化114為了獲得天然血凝素，基本按照VanReeth，K.，S.etal，VetRec，2003.153(1):p.9-13所述來制備分開的H1N1組件。將具有胚胎的10日齡SPF雞蛋接種HlNl豬流感毒林A/豬/比利時/1/98。接種后72小時收集尿嚢液，并通過離心除去紅細胞和細胞碎片。然后將被凈化的尿嚢液于4。C70，000g離心90min來沉淀病毒。將病毒沉淀于4'C在TSE緩沖液(10mMTris-HClpH7.4、100mMNaCl和1mMEDTA)中過夜重懸。流感病毒是否存在通過以下方法確認血凝素(HA)測試例如VanReeth，1L，S.etal.，VetRec，2003.153(1):p.9-13所述，然后通過在20-60%(w/v)蔗糖線性梯度液中于4。C130，000g超速離心14小時來濃縮和純化。含有病毒的梯度級分用HA測試鑒定、被收集起來，并在slide-a-lyzer透析盒(IO，OOO匿O)中用磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)透析來除去蔗糖，并通過在20。/。聚乙二醇(PEG-20，OOO)溶液中透析來濃縮。最后，通過在20-60%(w/v)變性的線性蔗糖梯度液(由溶于TSE緩沖液中的0.1%Tween80和1.2%去氧膽酸鈉組成)上于4'C離心14小時，從經純化和濃縮的病毒中釋放出血凝素。含有血凝素的級分用HA測試鑒定、#皮收集起來，并在slide-a-lyzer透析盒(10，000MWCO)中用PBS透才斤，并通過在20%PEG溶液中透析來濃縮。殘留的感染性病毒通過對該溶液進行UV處理(5J/cm2)來滅活。完全滅活的確定通過在MDCK細胞上接種以及在具有胚胎的10日齡SPF雞蛋中的兩次盲目傳代。通過SDS-PAGE，然后進行蛋白質印跡和考馬斯藍染色來對純化過程進行分析。HA清晰存在于最初的尿嚢液中，并且還存在于變性蔗糖梯度液處理后的純化溶液中。在純化過程所有步驟期間，HA被檢測為單體，并被檢測為兩種不同的多聚體，主要是二聚體和三聚體。圖6A示出在純化期間獲得的不同級分中天然流感病毒血凝素的存在情況和純度的SDS-PAGE分析包括使用針對H1N1病毒HA的單克隆抗體通過蛋白質印跡來檢測HA。圖6B示出對樣本中所有蛋白的檢測可通過考馬斯藍染色來完成。圖6A和6B中泳道A:分子標記，泳道B:除去RBC之后的尿嚢液，泳道C:除去細胞碎片之后的尿嚢液，泳道D:沉淀病毒之后的上清，泳道E:病毒沉淀(稀釋度1/100),泳道F:第一次蔗糖梯度液處理之后并且在除去蔗糖之后的病毒(稀釋度1/100),泳道G-J:變性蔗糖梯度液處理之后的病毒泳道G:HAU為64和128的級分(1/100)，泳道H:HAU>256的級分(1/100)，泳道I:HAU為64和128的級分(未稀釋)，泳道J:HAU>256的級分(未稀釋)。HA被檢測為單體，并被檢測為兩種不同的多聚體，主要是二聚體和三聚體。重組血凝素的產生在其他實施方案中，產生了重組流感病毒血凝素蛋白。在本實施例中所使用的重組流感病毒血凝素蛋白包括與pcDM3.1D/V5-His載體(Invitrogen)中的V5-His標簽融合的血凝素的胞外結構域。病毒RNA通過Rneasy迷你試劑盒(Qiagen)分離自H1N1豬流感病毒毒林A/豬/比利時/1/98，然后通過隨才幾引物(Invitrogen)和SuperscriptII反轉錄酶(Invitrogen)轉化為cDNA，之后進行RNaseH(Gibco)處理。所獲得的單鏈cDNA作為使用以下引物對HA序列進行PCR擴增的模板正向引物5，GAAGATCTCACCATGGAAGCAAAACTGTTTGTATTATTCTG3'(SEQIDNo.1)和反向引物5,TCCCCGCGGAATCTGGTAAACTCCCATTGATTC3*(SEQIDNO.2)(Invitrogen)。然后將PCR片段克隆至pcDNA3.1D/V5-His載體。然后通過限制性酶切和測序驗證序列。分離得到的且得到發逸的編碼流感病毒血凝素的胞外結構域的核苷酸序列被給出并在本文中表示為SEQIDNO.3。流感病毒血凝素的胞外結構域-SEQIDNO.3TGTTACCCATTCAGTTAATTTACTAGAAAACAGCCATAATGGAAAACTCTGCAGCCTGAATGGGTGACTTGTTGCTCACAGCGAATTCATGGTCTTACATAATAGAGACTTCAAATTCAAAAAATGGAAAATGCTACCCCGGAGAATTCGCTGATTATGAGGAATTAAGGGAGCAGCTGAGTACAGTTAAAGGTACCACAACTGCATGCTCCCACTCTGGAACCAGCAGTTTTTACCGGAACTTGCTATGGCCAGAATGCTTATACATATGTTTCAGTTGAATCATCAAAATACTACCGAAGGTTCACACCAGAAATAGCAGCTAGACCTAAAGTCAGAGGACAAGCAGGCAGAATGAATmTTATTGGACACTGTTAGATCAAGGAGACACCATAACATTTGAAGCCACTGGGAACTTAATAGCACCATGGTACGCATTTGCnTGAATAAGOGCTCTAATTCTGGAATTATGATGTCGGATGCTCATGTTCACAATTGCA116CTACAAAGTGCCAAACTCCTCATGGGGCCTK3AAAAGTAATCTTCCTTTTCAgAACGTACATCCCATCACTATTGGAGAATGCCCTAAATATGTTAAAAGCACCCAACTAAGAATGOCAACAGGATTAAGAAACGTCCCCTCTATCCAATCCAGAGGACTTTTTOGAGCAATTGCTGGGTTCATTGAAGCTCAGTAATrGAAAAAATGAACATTCAATTrACTTCAGTGGGCAAGGAGTTCAATAATCTGOAGAAAAGGATTGAGAAnTGAATAAGAAGGTCGATGATGGGTTTTTGGATATATGGACATATAATGCTGAGTTGCTCATTTTGCTCGA'GAATG'AAAGGACTCTAGATTTCCATGACTTTAACGTAATGTTTTGAGTTCTATCACAAATGT(3ATAATGA.ATGCATGGAGAGCGTAAAGAATGGCACATACAGAATCAATGGGAGTTTACCAGATT-3'在人胚胎腎細胞系HEK293T中以舉例方式給出了可溶性重組HA的產生和純化。使用磷酸鈞轉染HEK293T細胞來產生可溶性血凝素。轉染后十六小時，用含或不含胎牛血清(FBS)的新鮮培養基替換培養基。轉染后每24小時采樣，并經由SDS-PAGE和蛋白質印跡分析，來確定在轉染后什么時間上清含有最高濃度的可溶性HA(圖7A和7B)。不管FBS是否存在于血清中，在HEK293T細胞中均產生可溶性重組HA。在不存在FBS的情況下，血清中最大量HA在轉錄后72小時達到。在存在FBS的情況下，HA的量保持相同，一直到轉錄后120小時。產生得到的重組HA主要為單體，一小部分為三聚體，這可以通過二硫化物還原劑P巰基乙醇來確定。圖7A和7B示出對生產具有V5-His標記的重組HA的SDS-PAGE分析。重組HA在不存在(圖7A)或存在(圖7B)胎牛血清的情況下產生。在轉染后24小時采樣，圖7A和7B中的泳道同上所述。HA由識別V5標簽的單克隆抗體檢測。在非還原條件下，HA作為單體主要存在于上清中，但是它也形成三聚體。在存在二硫化物還原劑P巰基乙醇的情況下，如圖7A和7B中的星號"斤示，HA僅作為單體存在，這確定了高分子量蛋白事實上是HA三聚體。蛋白質的分子量通過泳道A(預先染色的)和B中的分子標記確定。收集到上清之后，依據制造商的說明書(Qiagen),經由Ni-FTA珠純化重組HA。由于FBS對該純化步驟的干擾，還在不存在FBS的情況下產生HA,并在轉染后72小時收集上清。在純化過程期間采集不同的級分，并且先通過SDS-PAGE,然后通過蛋白質印跡或考馬斯藍染色來顯現HA，如圖8A和8B分別所示。重組HA存在于原始上清中，而不存在于流出液中。單體和三聚體兩種形式的HA均被完全濃縮。圖8A和8B示出經由Ni-NTA珠對重組HA-V5-His的純化過程的SDS-PAGE分析。先進行SDS-PAGE,然后進行蛋白質印跡，并使用針對V5標簽的單克隆抗體檢測HA，從而鑒定含HA的級分(圖8A)，或者先進行SDS-PAGE,然后進行考馬斯藍染色，從而顯現HA的純度(圖8B)。泳道A:分子標記，泳道B:含FBS的原始上清，泳道C和D:來自兩個不同的不含FBS的產物的原始上清，泳道E:純化流出液，以下泳道洗脫級分O.8ml，級分由在泳道上的其各自編號示出。HA存在于所有原始上清中而不存在于流出液中。單體和三聚體形式的HA被完全濃縮。抗體與HA的綴合培養產生單克隆抗體41D3(在Duan，X.，etal.，AdvExpMedBiol，1998.440:p.81-8中述及)或單克隆抗體13D12(在Na鼎ynck,HJ.andM.B,Pensaert，ArchVirol，1995.140(6):p.1137-46中述及)(分別針對豬唾液酸粘附素或同種型匹配(IgGl)的無關對照抗體)的雜交瘤細胞，并且每72小時收集上清。如制造商(GEHealthcare)所述，通過G蛋白瓊脂糖柱來純化抗體。具有被鑒定為GenP印t獲取號為AY590824并且在本文中凈皮作為SEQIDNo.4的蛋白序列的流感病毒血凝素A型/豬/比利時/1/98在本實施例中被用作綴合有mAb41D3的貨物部分。SEQIDNo.4:MEAKLFVLFCWNALKADTICVGYHANNSTDTVDTILEKNVTVTHSVNLI￡NSHNGKLCSLNGKAPLQLGNCNVAGWILGNPECDLLLTANSWSYIIETSNSKNGKCYPOEFADYEELREQLSTVSSFERFEIFPKATSWPDHETTKGTTTACSHSGTSSFYRNLLWIVKKGNSYPKLSKSYTNNKGKEVLVIWGVHHPPTNSDQQTLYQNAYTYVSVESSKYYRRFTPEIAARPKVRGQAGRMNYYWTLLDQGDTITFEATGNLIAPWYAFALNKGSNSGIMMSDAHVHNCTTKCQTPHGALKSNLPFQNVHPmGECPKYVKSTQLRMATGLRNVPSlQSRGLFGAIAGF正GGWTGMIDGWYGY冊QNEQGSGYAADQKSTQIAIDGISNKVNSV正KMNIQFTSVGKEFNNLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLILLENERTLDFHDFNVKNLYEKVKSQLRNNAKEVGNGCFEFYHKCDNECMESVKNGTYNYPKYSEESKLNREEIDGVKLESMGVYQI通過二硫鍵將經純化的抗體偶聯至流感病毒血凝素(HA)SEQIDNo.4。為完成此舉，依據制造商的說明書(PierceBiotechnology)，用交聯劑SPDP(卜琥珀酰亞胺基-3-(2-硫代吡啶)-丙酸酯)來激活41D3單克隆抗體、同種型匹配的對照單克隆抗體和HA。對于HA，SPDP的激活是通過二硫蘇糖醇(DTT)。被激活的蛋白通過PD-10脫鹽柱(AmershamBiosciences)自未反應的交聯劑純化。被激活的蛋白以1:1抗體HA比例混合。通過用匿C0100，000的float-a-lyzer(Spectra/Por)透析，將未偶聯的HA從偶聯產物、41D3-HA和對照單克隆抗體-HA除去。抗體和HA偶聯來形成綴合物可先通過SDS-PAGE、然后通過蛋白質印跡并對原代肺泡巨噬細胞對偶聯產物的攝入進行分析來驗證。對于兩種抗體而言，存在明顯的朝向較大蛋白的偏移，這確認了每種蛋白均與HA偶聯。圖9A和9B示出抗體13D12(圖9A)或41D3(圖9B)與分離得到的天然HA偶聯的顯現情況。在偶聯過程期間采集的樣本先通過SDS-PAGE、然后通過蛋白印跡并通過三種識別H1N1的HA的單克隆抗體的混合物檢測來進行分析。泳道A:原始抗體，泳道B:過PD-10脫鹽柱之后SPDP處理的抗體，泳道C:偶聯有抗體的HA，泳道D:透析之后偶聯有抗體的HA,和泳道E:分子標記。免疫接種十二只六周齡的豬獲自流感病毒血清陰性的農場，并被隨機分為每組4只豬的三組。這些動物被圈養在具有高效分子空氣(HEPA)過濾器的隔離單位。對水和食物的提供沒有限制。將第一組4只豬用1mgHA-13D12綴合物/豬來進行免疫接種，第二組用1mgHA-41D3綴合物/豬來進行免疫接種，對照組用相同體積不含任何蛋白的PBS來進行免疫接種。對于每只豬而言，將綴合物稀釋于3mlPBS中。將一半綴合物靜脈內注射，另一半肌內注射至頸部。在免疫接種時以及免疫接種之后第4、7、11、14和18天從全部豬收集血樣。血清用血細胞凝集抑制(HI)測試、病毒中和(VN)測試以及免疫過氧化物酶單層分析(IPMA)檢測，如VanReeth，K.，S.VanGucht，和M.Pensaert，VetRec，2003.153(1):p.9—13所述。血細胞凝集分析(HA)將含有流感病毒血凝素的樣本系列稀釋，并用0.5%雞紅細胞在室溫下混合一個小時。仍表現出血細胞凝集作用的最高稀釋度被認為是使血細胞凝集的滴度。血細胞凝集抑制(HI)用針對HlNl毒林A/豬/比利時/1/98的血細胞凝集抑制(HI)測試檢測血清。被滅活的血清先用來自霍亂弧菌的受體破壞酶(RDE)處理，然后通過檸檬酸鈉處理來使該酶失活。然后，將血清吸附于雞紅細胞來除去流感病毒血細胞凝集的非特異性抑制劑。依據包含陽性和陰性對照的標準方法來進行HI測試。由于預處理，在二倍血清稀釋之后血清的起始稀釋度為1:10。另外，每個孔與四個血細胞凝集單位的H1N1毒林和0.5%雞紅細胞混合。孵育l小時之后，結果得到了解釋。在存在HA識別抗體的情況下，未觀察到血細胞凝集，并且RBC全都聚集在板底的一個點上。HI滴度是完全抑制血細胞凝集所需要的滴度的倒數。作為參照，陽性和陰性對照血清均包含在HI測試中。病毒中和(VN)還用病毒中和(VN)測試針對是否存在H1N1中和抗體對血清進4亍了測試。將兩倍血清稀釋液與100組織培養感染劑量(TCIDs。)A/豬/比利時/1/98病毒一起醉育。然后加入濃度為600，000細胞/ml的Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞。賻育24小時之后，通過免疫過氧化物酶染色檢測病毒陽性細胞。血清的起始稀釋度為1:2。免疫過氧化物酶單層分析(IPMA)最后，通過免疫過氧化物酶單層分析(IPMA)針對是否存在流感病毒識別抗體對血清進行分析。因此，在存在1000TCIDs。A/豬/比利時/1/98病毒的情況下，使MDCK細胞生長24小時。固定之后，將細胞與二倍稀釋的血清稀釋液孵育，然后通過免疫過氧化物酶染色來檢測抗體。血清的起始稀釋度為1:2。結果示于圖12。圖12示出用13D12-HA或41D3-HA免疫接種的豬的平均免疫過氧化物酶單層分析(IPMA)滴度。對于每一組而言，將4只豬用偶聯有同種型匹配的(IgGl)對照抗體13D12的天然血凝素(HA)或者偶聯有41D3(—種針對豬唾液酸粘附素的單克隆抗體)的HA進^f亍免疫接種。在免疫接種之后第O、4、7、11、14和18天收集血清，并通過IPMA進行分析。用偶聯有唾液酸粘附素特異性mAb41D3的HA進行免疫接種的豬表現出IPMA抗體被快速誘導，并且具有較高滴度的IPMA抗體。實施例10在本實施例形成了包含唾液酸粘附素結合部分和細胞毒劑的綴合物組合物。細胞毒劑急草素是30kDa的植物酶，屬于核糖體滅活蛋白(RIP)家族。皂草素可依據本領域已知的方法分離自植物石堿草的種子，或者購買獲得。在本實施例中使用作為細胞毒劑的代表的皂草素，它可包含在本發明的綴合物內。皂草素自身沒有細胞結合部分，因此不能進入細胞。但是，在與唾液酸粘附素結合部分綴合產生綴合物之后，皂草素與唾液酸粘附素結合部分一起被共同內化到細胞內。皂草素也是能夠通過唾液酸粘附素結合部分和皂草素之間的二硫鍵與唾液酸粘附素結合部分連接的細胞毒劑的代表。其他細胞毒劑描述于Thrush，G.R"etal.,A廳RevImmunol,1996.14:p.49-71。唾液酸粘附素結合部分和皂草素之間的二硫鍵使得毒素的解離成為可能。細胞毒素與唾液酸粘附素結合部分的綴合將經純化的抗體41D3通過二硫鍵綴合至皂草素(Sigma)。因此，依據制造商的說明書(PierceBiotechnology),用交聯劑SPDP(N-琥珀酰亞胺基-3-(2-硫代吡咬)-丙酸酯)激活抗體和皂草素。就急草素而言，用二硫蘇糖醇活化SPDP，并^f吏用PD-10脫鹽柱(AmershamBiosciences)將該蛋白從未處理的交聯劑中純化出來。被活化的蛋白以l:l抗體皂草素比例混合。通過用MWC0100,000float-a-lyzer(Spectra/Por)透析來將未偶聯的皂草素從偶聯產物中除去。急草素和抗體41D3的偶聯先通過SDS-PAGE、然后通過考馬斯藍染色并通過對原代肺泡巨噬細胞對偶聯產物的^7v進行分析來檢驗。SDS-PAGE的考馬斯藍染色表明，在綴合之后有明顯的向上偏移，表明大小增加，這確定了一部分抗體與皂草素偶聯在一起。在透析之后未偶聯的蛋白被完全除去。圖11示出在抗體-皂草素綴合法期間采集的不同樣本的SDS-PAGE和考馬斯藍染色。泳道I:分子標記，泳道A:原始抗體，泳道B:SPDP處理的抗體，泳道C:過PD-10脫鹽柱之后的SPDP處理抗體，泳道D:原始皂草素，泳道E:SPDP和DTT處理的皂草素，泳道F:過PD-10脫鹽柱之后的SPDP和DTT處理的急草素，泳道G:偶聯有抗體的急草素,泳道H:透析之后偶聯有抗體的皂草素，和最后，泳道J:在負載染料中存在二硫化物還原劑P巰基乙醇的情況下，偶聯有抗體的急草素。對于兩種抗體而言，存在朝向較大蛋白的明顯偏移，這肯定了一部分抗體偶聯有急草素。未偶聯的蛋白在透析之后被完全除去。皂草素被綴合至mAb41D3，從而得到本發明的綴合物組合物。還形成了包含非唾液酸粘附素識別抗體mAb13D12和皂草素的對照綴合物。將mAb41D3/急草素綴合物和對照mAB13D12/鬼草素綴合物每一種分別與表達唾液酸粘附素的原代豬巨噬細胞孵育。恰當時間之后，將細胞進行免疫染色，并通過共聚焦顯微鏡來分析，從而確定綴合物是否結合以及是否被內化到細胞。細胞與mAb41D3/皂草素綴合物孵育引起綴合物內化，表明41D3mAb仍然具有結合綴合物并剌激該綴合物內化的能力。相反，并未觀察到mAb41D3/皂草素綴合物被內化。實施例11對mAb41D3/急草素綴合物和mAB13D12/皂草素綴合物對原代豬巨逸細胞的細胞毒性作用進行了測試。將巨噬細胞與多個濃度的mAb41D3/皂草素綴合物或者mAB13D12/皂草素綴合物一起孵育不同時間。使用MTT分析來通過比色法測定細胞數目并區分活細胞和死細胞。以下表格示出這些處理所得到的OD值和時間的函數關系，以及活細胞百分比與綴合物濃度的函數關系。巨噬細胞0D值01030100APOPLevend41D3-Sap0.7720.5370.5410.4012.64413D12-Sap0.8510.7080.7030.7800.4452.824平均值0.3890.423活細胞百分率0If)-70.3*10-610641D3-Sap89.829.330.413D12-Sap110.273.472.191.9122圖3以繪圖形式給出活細胞百分比和綴合物濃度的函數關系。實施例12將mAb41D3/皂草素綴合物與多種細胞一起孵育，來評估細胞毒劑皂草素的作用。表達重組唾液酸粘附素的CH0細胞和不表達唾液酸粘附素的CHO細胞每一種與不同量的mAb41D3/皂草素綴合物一起孵育，病在加入綴合物之后不同時間測量對細胞活力的影響。使用MTT分析來通過比色法分析細胞數目并區分活細胞和死細胞。以下表格示出這些處理所得到的OD值和時間的函數關系，以及活細胞百分比與綴合物濃度的函數關系。<table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table>圖4以繪圖形式給出活細胞百分比和綴合物濃度的函數關系。CHO-Sn指示表達唾液酸粘附素的CHO細胞。CH0-Kl指示不表達唾液酸粘附素的CHO細胞。采用皂草素-41D3免疫毒素對豬的體內處理通過肌內方式給豬注射0.1或1mg皂草素-41D3綴合物(溶于1mlPBS)/kg體重，以一個劑量形式，或者分為間隔6小時注射的兩個劑量。將四頭豬用于各皂草素-41D3綴合物條件，四頭對照豬僅注射PBS,總共二十頭豬。在首次注射之后24小時將豬麻醉，并收集和分析局部引流淋巴結。淋巴結免疫細胞的流式細胞術分析通過流式細胞術分析淋巴結的免疫細胞數目的變化。全部免疫細胞均通過機械分離或膠原酶D消化從淋巴結制備。對于機械分離而言，淋巴結樣本用注射針分離并在40微米孔徑尼龍濾器上過濾。將細胞收集到50-ml錐形管，并用RPMI洗滌兩次。對于膠原酶D消化而言，淋巴結與1邁g膠原酶D(Sigma)/ml在RPMI中于37。C孵育1小時。然后將細胞懸液用40微米孔徑尼龍濾器過濾，并收集于含30%FBS的RPMI中。400xg離心15分鐘之后，用含5%FBS的RPMI將細胞洗滌三次。對于紅細胞裂解而言，將細胞在5ml裂解液(NH4C1、KHC03[1mM]、Na2+EDTA)中孵育5分鐘，并用含5%FBS的RPMI洗滌三次。用FITC-標記的SWC3特異性mAb74-22-15鑒定單核細胞/巨噬細胞。先用生物素化的mAb41D3、然后用FITC標記的鏈霉素生物素對表達唾液酸粘附素的巨噬細胞進行染色。通過用FITC標記的CD3特異性mAb染色來對全部T細胞進行定量，而一小部分T細胞由FITC-標記的CD4或CD8來定量。B細胞用FITC標記的小鼠單克隆抗豬IgM抗體(CloneM160)來鑒定。淋巴結微觀解剖學分析將淋巴結樣本在磷酸鹽緩沖的3.5%多聚曱醛溶液固定24小時。固定之后，使用自動系統(ShandonCitadelTissueProcessor,Cheshire,UK)將樣本固定在石蠟中。制備厚度為8微米的切片、二曱苯脫蠟、下行梯度酒精再水合、染色、酒精和二甲苯的上行梯度脫水，并用DPX封片。進行蘇木精-伊紅染色來分析被處理和未被處理的豬的淋巴結的形態學和顯微解剖學。免疫組織化學分析將來自引流淋巴結的樣本包被在甲基纖維素介質中，并在-70t:冷凍。制備冷凍切片(厚度為5至8微米)，并用丙酮于-2(TC固定。用一種或多種以下抗體對切片進行染色(1)FITC標記的山羊抗小鼠IgG抗體來檢測所注射的免疫毒素；U)先用生物素化的mAb41D3，然后用FITC標記的生物素鏈霉素，目的是對表達唾液酸粘附素的細胞進行定量，并對免疫毒素對表達唾液酸粘附素的細胞的數目的影響進行評估；胞都進行染色的生物素化抗體74-22-15(抗SWC3抗體)，然后用FITC標124記的鏈霉素生物素，目的是評估毒素對單核細胞巨噬細胞鐠系的所有細胞的影響；和(4)先用生物素化mAb41D3，再用FITC標記的鏈霉素生物素同特異性針對活化半胱天冬酶-3(細胞凋亡標記)的山羊多克隆抗體一同染色，最后用TexasRed標記的兔抗山羊抗體，目的是對凋亡整體水平和皂草素-41D3綴合物免疫毒素處理豬的引流局部淋巴結中凋亡的表達唾液酸粘附素的巨噬細胞數目進行定量。唾液酸粘附素結合部分/細胞毒劑綴合物例如皂草素-41D3綴合物的體內給藥，為評估唾液酸粘附素特異性免疫毒素的體內功能性，以及評估該綴合物選擇性殺死淋巴結中的表達唾液酸粘附素的巨噬細胞的能力提供了可能。體外和體內分析兩者提供了最佳的清除淋巴結中表達唾液酸粘附素的巨噬細胞的給藥劑量和方式的信息。清除表達唾液酸粘附素的巨噬細胞可用于治療涉及巨噬細胞的特定疾病，例如類風濕性關節炎、炎性皮膚病、持續感染等。唾液酸粘附素蛋白和核苦酸序列序列IDNo.5是GenBank獲取號為AF509585.1的豬唾液酸粘附素的蛋白序列。序列IDNo.5:mdflllllllassalaglaswtvsspetvqgikgscli工pctfgfp週vewhgitaiwyydysgkrlwshsrnpkwe朋fqgralllgqveq:rtcslllkdlqpqdsgsynfrfeisegnrwsdvkgtwtvtevpsvptialpaklhegmsvdfncstpyvcptepvnlqwqgqdptrsvtshlqklepsgtshmetlhmalswqdhgrilscqvsaaerrmqkeihlqvqyapkgveiushsgrnvlpgdlvtlscqvkssnpqvssvqwvkdgtklkdqkrvlqlrraawadagvytcqagnavgssvsppvslhvfmaevqvspvgsiiienqwtiiacntpkeapselryswyknhaklegshsrtlirlhsvtradsgfyfcevqnargrersppvsvwshppi/tpd;ltafletqag:lvg助cswseppat:lv:ls.hgglilastsgegdhsprfsvasapnslrleigdlgptdsgeymcsassslg皿sstldfhanaarllispaaewegqavtlscrsslslmpdtrfswyl船alilegpssslllpaasstdagsyhcraqnshstsgpsspavltvlyaprqpwtaqldpdtagagagrqglllcdegvylceassalguasasatldaqawlvitpshtlqegieanltcnvsreasgpanCQVPIGVLEGTSYRWYRDGQPLQESTSiVTLRFAAITLSQAGAYHCQAQAPGSATTDIAeel.agssprlqvatapntlrle工hnavledegvytceatisitlgqtlasaafdaqamrvqvwp:natvqegqlv^tclvwtthlaqltytwyrdqqqlpgaahs工e:lpwtvtdaasxrcg工lipgqalrlsrpvaldvlyaprrlrlthllesrggolawlctvdsrpaaqltlshagrllasstaasvpntlrlelweprpsdeglyscsarsplgqantslelrlegvqlshdgkvlatshgvhglavgtghvqvarnalqlrvqnvpsrdkdtyvcmdrwslgsvstmgqlqpegvhwaepgldvpegtalnlscrlpsgpghignstfawfrngrqlhtesvptltfthvaraqaglyhcqaelpagaatsapvxlrvlyppktptmtvfvepeggiqgiLDCRVDSEPLASLTLHLGSRLVASSQPQAAPAKPHIRVSASraALRVDMEELKPSDQGeyvcsasnalgsasaatyfgtralhrlhlfqhllwflgliasllflllglgvwyawrrgnfyklrmgeysvemvsrkettqmstdqeevtgigddagsvnqaafdpahlcentqsvKSTV序列IDNo.6是編碼GenBank獲取號為AF509585.1的豬唾液酸粘附素的核苷酸序列。序列IDNo.6:13tggacttcctgctcctgctcctcctcctggcttc改tctgctctagcaggcctggcctcg61tggacggtttccagccccgagaccgtgcsgggcatcaagggctcctgcctcatcatcccc12Htgcaccttcggcttcccggccaacgtggaggtgccccatggcatcacagccatctggtac181tatgactaetcaggcsagcgcctggtagtgagccactccaggaacccaasggtggtggsg241a.accacttccaaggccgggccctgctgttggggcaggttgaacagaggacgtgcagcctg301ctgctgaaggaectgcagccccaggactcgggctcctataacttccgctttgagatcagc361gagggcaaccgctggtcagatgtcaaaggcacagttgtcsccgtgacagsggtgcccagc421gtgcccaccattgccttgccagceaagctgcatgagggcatggaggtggscttcaactgc481tccactccctatgtgtgcccgacggagccggtcaacctacagtggcsaggccaggatccc541acccgctccgtcacctccc.acctccag3atgc仁tgagccctcgggcaccagccacatggag601accctgcacatggccctgtcctggx:aggaccatggccggstcctgagctgccaggtctcs661gcagccgascgcagga七gcagaaggagattcacctccaagtgcagtstgcccccaagggt721gtggagstccttttcagccactccggscggaacgtccttccaggtgatctggtcaccctc781agctgccaggtgaatagcagcaaccctraggtcsgttccgtgcagtgggtcsaggatggg841acgaagctcaaagsccagssiacgtgtactgcagttgcgccgggcagcctgggctgstgct901ggcgtctacacctgccaagccgggaatgccgtgggctcttcagtctcscccccggtcsgc961ctxcac:gtcttcatggctgaggtc;caggtaagccctgtgggctccstectggagaaccsg1021stcggtgacgctggcctgcaatacacctaaggasgcgcccagcgagctgcgctacagctgg1081tacaagaaceacgccc七gctggagggctctcacagccgcaccctccggctge3Ctcagtt1141acca.gggcggattcgggcttctacttctgcgaggtgcagaacgcccggggcagagagcgc1201tctccccctgtcagcgtggtggtcagccacccacccctcaccccggacct33ctgccttc1261ctggagacacaggcggggctggtgggcatcctccaatgctctgtggtcsgcg3gccccc31321gctactctggtgttgtcacacgggggcctcatcttggcctctacctccggggagggtgac1381cacagcccacgcttcagtgtcgcctctgcccccasctccctgcgcctggagattcaagac1441ctggggccaacagaca.gtggggatatacstgtgctcagccagcagttctcttggga匈cg1501tcctccaccctggacttccatgccsatgcagcccgcctcctcatcsgcccagcagcagag1561gtggtgg3agggcaggcggtgacactgagctgcaggagcagcct:gagcct:gstgcctgac1621scccgtttttcctggtacctgaacggggccctgattctcgaggggcccagcagcagcctc1681ctgctcccagcagcct:ccagcacagatgccggctcataccact:gccgggccc3gaac3gc1271741cacagcaccacccacgccag1801cccgtgttcaacgccaaggcl"lcicictettgtccscaggggc1921cgtgttgtggaggctgttte1981caccgc:atgaagacccggtg2CHIcrggeggatgcgcctccgcc2101tctgcMCCtcacgctgcag2161gaaggcattgccctgccaac2221ttctcctggtcgtga.cgctg2281ctacctgtggcgaggetggt2341gctggcctcttccaaagttg2401tcagccctcctgtggacegt2461cgccctcttg2521ctccggctcc2581gaggtccgagC3CC5L3CStC2641cttggatcagccgggtgtca2701ccgtcgcctgacccataggg2761gtcctggaggggagtccact2821tcggccacgcccsttgccas2881gcccatagctcccacgtgacc2941tacgcacctcgcgactgg.gc3001ctccttctgtccstgggagc3061cgcctcgtggtccccgccts3121csggtggccagctggsggat3181ga^ggcgtctctccgccgcc3241ttcgstgccc3301ctggtgaaccctacacgtgggcgggccc.tcccccaqctcctcrttctctaggtcaccaa^gcca3ccl:tccgaLgatggccsgaactgaccacccctgttggacgtggacccagttggccccctcgtggccsacax:tt:ctcegttttgcgccaggccacgccgt:gtgsacctctsctcttgac;ctgcct.gga.ccctgatgtcatgggggaLgcacccsdccctgtgcgagggccectgtcggcgctstggtgetgccctcccagggccaccctgttccgtccgcctccagtggggsctcttCtt5LCCttCgggccnggcttcgttggtatcagtgaccctcacgctgcgcagtgcaggtgtgtatggsccgttctcsccgactgcaggagggcggctgctctactgegtggccagcsgcgctggtcat.cagtgsgccgtgtatgcttgccgtgetetatcacggctgtgtgccaaagcctgtggtcctgacgggatggccctggct.gcccctgstggactcctgcccsgcgaggagcttga_ccctgggtctggcccaatga_cgca_cctggctggggccggtgc裊gctgctgc.acetgcggccctgggcaacaccgtcacaaagcc.agcggctctggacacgcatcgtcaccccccgatcctcgtctgtsctcctggccgccggcc3actcactgtgaggcgagcctgggtgctgccaggtagcccctccactggagcctactgtcsgcctcaggcctcggtccgsctgctcaggcsgctcagaccttggccccagctcsc1283361taccgagacccaatgtcact3421gtcscsgatgsctccgcctc3481tcc^gacctggscccatctc3541ttggagagcctcgcccagct3601gcccagctgaa.gcctctgtc3661cccaacaccctctctacagc3721tgctcggcccgctagagggc3781gtgc3ggtggcscagtgacc3841tgtgaagacccagccgttgg3901ctgcatggagg3961gccta"cctcgcagcactg4021c改C3tcctct40^1cctaitggccggsccctgtcc4141catgatggcaggggacaggc4201catgtccaggGtcacgtg己c4261aaggacacct4321ctgcsigccag4381gcgctgaaccctccaccttt4441gcttggttcc4501catgtggccccgccggggct4561gccacctctgcaccatgact4621gtttttgtggggacagtgagccagcctcag4741gctgcccctg4801atggaggagccaatgccctg4861ggctctgcctgcatctgttc4921csgcaccttcgttgggcctgccgcc七cctatcgc;c:c;tgg3gtggtgggcaccctcsgccattgcgcctggagc^gtcctctcsctggctccctgctgcccgggtcggctgcgceaggtccsatgcccctcgtggtscsgtgaggtgctggctggcccgcsaaaggtgtgcs七g丑gctgtcgggeacggtcggcgcccaatgcctccsgtcttagcccgaggggcctgaccctccaagccgcatgaagcccagtctggttcctcccaggrtgctccgctgtgg.ctgtcctctacgctggccgtgtgctggccgcgctgtgggaggggcca^gccCCC3CCC8Ctctccctctcgggatgcccsgggatgctgtccactgtggaccaccagccstcgccctgcagggaccgcsaccgtggtsigctcctccctsgttggcttgtacgctccgggtgtggcatccagccacctgggccatccgcgtcctacttcggaggggctgctgatattgatccgcac:cc;cgc^gtgctgtgcsctcctggcctccccggccca^atcac3tcccgtgccggaggctctatgtcttttccagcggggc丑cacgceagcgagccacggggtccacgctgcgggtgctccttgggctgagccagggcggccctgggccactgccaggCtCt5LCCCtCggcsttctggagtcggctggtcagccsgtcgagtdtgtgtaccagagcccgcg^igcctcctccticctgccctggccsggcgactgcgcctctgtggacagcctcwccgcgtgatgagggtggdgctgcggggcccctgtctacacgggctctcccagcctctgggactcctgccgagatgcttagcagtagaatgtgcctgga/tgtgccacataggcaatgcccsccctctg丑gctcccccaagacgccsctgccgagttggcctccsgccaatgccttgctcggcctctgcatcgccttcttectact4981ggggtctggtacgcctggagacggggaaatttttacaagctgagaatgggcgaatattc.a5041gt,agagatggtat:ctcggaaggaaaccacgcagatgtccactgaccaggasgaagtt3ct5101ggsatcggtgatgatgcgggctctgtgaaccaggcggcatttgatcctgcccacctctgt5161gaaaacacacagtctgtgaaaagcscstgtctga序列IDNo.7是GenBank獲取號為NM—011426的小鼠唾液酸粘附素的蛋白序列。序列IDNo.7:MCVLFSLLKLASVFSLGQTTWGVSSPKNVQGLSGSCLL工PC工FSKDIiKPEDSGTYMFRFEISDSlSIRWLDVKGTWTVTTDPSPPTITIPEELREGMERNFNCSTPYLCLQEKQVSLQWRGQDPTHSVTSSFQSLEPTGVYHQTTLHMALSWQDHGRTLLCWARDG西LGVTGHVXRLFSA服NDSGAYTCQATNDMGSLVSSPLSLHVFMAEVKMNPAGPVLE腿TVTIiCSTPKEAPQEUlYSWYK麗工L]LEDAHASTLiH]LPAVTRADTGFYFCEVQNAQGSERSSPLSWVRYPPLTPDLTTFLETQAGLVGILHCSWSEPLATWLSHGGLTLASNSGENDFNPRFR工SSAPNSLRLE工RDLQPADSGEYTCLAVNSLGNSTSSLDFYANVARLLINPSAEWEGQAVTLSCRSGLSPAPDTRFSWYLNGAKLLEGSSSSLKLPAASSTDAGSYYCRTQAGPNTSGPSLPTVLTVFYPPRKPTFTARLDLDTSGVGDGRRGICHVDSDPPAQLRLMKGHWATSLPSRCGSCSQRTKVSRTSNSLHVEIQKPVXEDEGVYLCEASNTLGNSSAAASFNAKATVLV工TPSNTLREGTEANLTCNVNQEVAVSPANFSWFRNGVLWTQGSLETVRLQPVARTDAAVYACRIXTEDGAQLSAPWLSVLYAPDPPKLSALLDVGQGHMAVFICTVDSYPtAHLSIiFRGDHLLATOLEPQRPSHGRIQAKATANSLQLEVRELGLVDSGNYHCEATNILGSANSSLFFQVRGAWVQVSPSPELEEGQAWLSCQVPTGVSEGTSYSWYQDGRPLQESTSSTLR工AAIS闊AGAYHCQAQAPDTAIASLAAPVSLUVSYTPRHVTLSALLSTDPERLGHLVCSVQSDPPAQLQLFHRNRLVASTLQGADELAGSNPRLHVTVLP,LRLQIHFPELEDDGTYTCEASNTLGQASAAADFDAQAVRVTVWPNMVQEGQQVNLTCL酉STHQDSLSYTWYKGGQQLLGARSITLPSVKVLDATSYRCGDQLVASSTEASVPMTLHLELQDPKPSNEGLYSCSAHSPLGKANTSLELLLEGVRVK麗PSGSVPEGEPVTVTCEDPMlLSSAXYMFHMG冊LQEGPASSLQFLVTTRMAGM:FCqvhdtqgtrssrpaslqilyaprdavxssfrdsrtrlmwiqctvdseppaemvlshngkvxaasherhssasgighiqvahnm^qvqdvtlgdgntyvctaqntlgsisttqrl:ltetdirvtaepg:ldvpegtadsi:lscl:l:pggsgptg]sissfiw柳rhrlhsapvptxsftpwraqagkracradlptgattsapvmlrvilyppktptlivfvepqgghqgildcrvdseplmltlhrgsglvas恥lhdaptkph工rvtappnalrvd工eelgpsnqgeyvctasntlgsasasayfgtralhqlquqrliiwvlgflagflcliiglvayhtwrkksstkojedensaematkknt耶ewami序列IDNo.8是編碼GenBank獲取號為NM—011426的小鼠唾液酸粘附素的核苷酸序列。序列IDNo.8:1agaeaagatt:aggcc匸agagtaagtctatgaaacacagagaaaggggacagcataggggt61taagaaatgsggtctttcaasatctcagggggcaatgaiggagttttttgagagaggaagg121丑ctctttasagg3agttg3aggsggattctgtgaacttgagaccaccctgagctgcc33g181ttgsg33Ctttgtct3C3S3ca^gccaggcagcctcsgcgtgtgctcsgtccgscttgta241gctggagaggeaggagaceaatttccggtgcttaeggtgcttgctgga'tgccctggagta301agtgacagggtctcactgg^ctccaggttctgttggtttgagtaataggaggcggcaggg361gagaagtgaagagagacatgcactgctgstctgccttgaggctgtgtccttaaggggtgg421agecasggggcacag'aagsctctctgggacatgccaccsagtgagagcatttceaatcsc481tccctgagcea,gga.acaggggct匸ct:ggttccctgctggtggctgccacsgcagtcct541ctgttgggttgaccaacacagcaggtgagataaac:cctatagacttgggccctggatgt601tccaggcagtctct:gtg'tgcctacecacccggcttccctsggcacctgaatgcacctg661cactgggatgtgtgtcc七gttctccctgctcctgctggcctctgtcttctcsctsggc721gaccacatggggtgtctccagtcccaagaatgtgcagggcttgtc;gggatcctgcctg781eattccctgcatcttcagctacc:ctgccgatgtcccagtgtccaatggcatcacagcc841ctggtact:stgact:actcgggcasgcggcaggt.ggtaatccactcaggggaccecaag901ggtggacaagcgtttcaggggtcgagctga在ctgatggggascatggaccacaaggtg961caacctgttgctcaaagacttgaagcctgaagactctggcacctacaacttccgcttt1021gatcagtgattgacaacggs1081tcccsgcccca,gagg^ctt1141C33ctgttccsgtggcgagg1201ccaggaccccctggcgtcta1261tcac.csgac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sypavssikwlkdgvrlqtk"tgvlhlpqaawsdagvytcqaengvgslvspp工slh工fmaevqvspagpile恥tvtlvcntpneapsdlryswyknhvlledahshtlrlhlatradtgfyfcevqnvhgsersgpvsvvvnhppltpvltafletqagilvgiilhcswseplatwlshgghilastsgdsdhsprfsgtsgpnslrleirdleetdsgeykcsatnslgnatstldfranaarllispaaewegqavtiiscrsglisptpdarfswylngallhegpgsslllpaasSTDAGSYHCRARDGHSASSSPAVL1VIjYPPRGPTFTTR!LDIDAAGAGAGRRG.KL]jCRVDSDPPARLQLIiHKDRWATSLPSGGGCSTCGGCSPRMKVTKAP肌IiRVEI柳P:l:LEeeglylceasralgnastsmtisigqatvlaiapshtlqegteanltcnvsreaagspanfswfrngvlwaqgpletvtllpvar1daalyacr工lteagaqlstpvllsvlyppdrpklsakldmgqghmalfictvdsrplallalfhgehllatslgpgvpshgrfqakaeaNSLKLEVRELGLGDSGSYRCEATNVLGSSNTSLjFFQVRGAWQVSPSPELQEGQAVVLscqvhtgvpegtsyrwyrdgqplqestsatlrfaaitltqagayhcqaqapgsattslaapislhtoyaprhvtlttlmdtgpgrlglllcrvdsdppaqlrllhgdrlvastlqgvqvwpgatvregqlvnltclvwithpaqltytwyqdgqqrldahs工plpnvtvrdatsYRCGVGPPGRAPRiSRPITLDVLYAPRNLRLTYliESHGGQLALCTVDSRPPAQLAlshagrllasstaasvpntlrlelrgpqprdegfyscsarsplgqantslelrlegvrVILAPEAAVPEGAPITVTCADPAAHAPTLYTWYHNGRWLQEGPAASLSFLVATRA.HAGAYSCQAQDAQGTRSSRPAALQVLYAPQDAVLSSFRDSRARS艦V-工QCTVDSEPPAELALSHDGKVLATSSGVHSIASGTGHVQVARNALRLQVQDVPAG.DDTWCTAQNLLGSISTI&R3LQVEGARWAEPGVPEGAAIWCRLiGGPGPVGNSTF.腸F麗DRRLHAEPVPTLAFTHVARAQAGMYHCLAELPTGAAASAPVMLRVLYPPKTPTMMVFVEPEGGLRGILDCRVDSEPLASLTLHLGSRLVASSQPQGAPAEPHIHVLASPNAKRVDIEALRPSDQGEYICSASWLGSASTSTYFGVRALHRLHQFQQLLW/LGLLVGLLLIXLGLGACYTWRRRRVCKQSMGENSVEMAFQKETTQLIDPDAATCETSTCAPPLG序列IDNo.lO是編碼GenBank獲取號為NM-023068的小鼠人唾液酸粘附素的核苷酸序列。序列IDNo.10:1atgggcttcttgccc改agcttctcctcctggcc.tcaitt;ctt:occagoaggccaggcetcs61tggggcgtctccsigtcccc^ggacgtgcagggtgtgwggggtcttgcctgdttetcccc121tgc改tct.t:cagcttecctgccg這cgt;gg改gfgtgGc:c:gacggcatescrggcc:atctggtsc181taegactactcgggccagcggcaggtggtgagccactcggcggaccecaagctggtggag241gcecgcttcc.gcggccgcaccgagttcatggggaaccccgageacagggtgtgcaacctg301cngctgaagg改cctgcagcccgaggactc'tggttcctacascttccgcttcgagatcagt.361g8ggtca3GCgctggtc^gaitgtga^8ggcaccttggtca.C6tgtd3e3g3ggeigGcc3gg42:1gcgcceaccattgoctccccggtgga.gcttctcg3gggcatc5tg3ggtgg3cttcaactgc481tccactcectacgtatgcctgcaggagcagg'tcagac'tgcagtggca3ggecaggacGCt541gctcgctcitgtcaccttcaseagccagaagtttgagcccacc:ggcgtc:ggceaectggag601改ccctcc改catggccatgtcctggcaggstecacggccggatcetgcgctgccsgctetcc661gtggccwtcacsgggctcag3gcgag3tteacctccaagtg3agtatgcccccaagggt721g七gaagateetecteagcecet.eggggaggaae改七eettceaggtgagetggteac:acte781acctgccaggtgaacagcagctaccctgcagtc;sgfttceattaagtggctcaaggatggg841gtacgcctce改a&ccaagactggtgtgctgcaectgccccaggcagcctggagcgstgct9Q1ggcgtctac^cctgecaagctgagaacggcgtgggctctttggtctc3cc2ccccatcagc961ctccacatcttcatggetgaggtcc:aggtg3gccc叫c3ggtccc3tc:ctggag^ccaig1021acagtgscsct5gtctg。3acaeacccaatgaggcacccagtgatetc:c:g1081tac:asgasicc.atgUcctgctggaggat.gcccsctcccat:accctccggctgcscttggcc1141act3gggctgatactggcttctacttctgtgsggtgeagaacgtccetgg1201tcgggcectgtcagcgtggtagtcascc;acccgcctctcactcc這gtcctgacagccttc1261ctggagscccaggcgggact:gtgggcatcettcactgctctgtggtcag1321gccacactggtgctgtcsc為tgggggtcatatcctggcctce為cctccg"gggacagtgat.1381c3cagcoc^cgcttcsgtggt3cctctggtccc33Ctccctgcgoctgg3gatccgdgac1M1ctgg3ggaat3ctgscsgtggggsgtscssgtgctc3gcc3ccnaictccct15013cctccacc:ctggactt:ccatgccsatgccgcccgtctcctcstl:cagcc:cggcagccgag1561gtggtgg33ggacaggicagtgacactgagctgcsg犯gcggcctSL3gccc1621gcccgcttctcctggt改cctgaatggagccctgcttcscgagggtcccggcsgca^gcctc1681ctgctcccegcggcctccagcactgdcgccggctcstsccsctgcegggc1361741cacagcgec:accc'tcgscas1801CC3dC￡L=tCa1861ctcc:ttxgt1921cgcg二tgtgggggct;gttcc1981cc^cgcatga2041ctggaagaggrcgoctccscc2101:c3gccscct2161gagggc;3C的CEgccctgct2281ctgctgcccg2341ggtgcecsgc2401ctgtcagccccac二gtggac2461agccgccccccsccdgcctg2521ggtccccaggctccccgsag2581ttag改ggtcc旭lgttcttggat2701tcaccatcaic2761ggatgt:occ3g2821ac:ctcggcc古2881csatgccceiggcctcc3cgtg2941tcctstgfccctggacgaict:g3001ggccxcetcc3061gstcgcct七g3121ctgcatgtggtatgc:ggag3181gatg,gtg3241gactccgac:ggcggg柳gg3301cagc二ggtgstGCtccaicrccagggg^cct:cccccsggc:ctgtgccg二gtc:gtggcccct:tcgccagc二cagcgaccec:gatt:gc二gc;ccgcgctcczggggc,ggcggccttgttxzgg二cggt:ccc"ctggggsic31arccgntggsigccaccatcgggcggct:gcatxgct:gcgt:gc3C3二ggecc:tctggcagc二gccg二ggt:cct3tcgggetgcctccggccegtgggggg^gng二ggcccgaccsctcscccgc^gctgcc3為gctgctgggucccctggagccgcatccttgt二cstctgacctcctggcgccagcccccaagetggggctccacggggcgccaggcctcgggctaecgtcggcccagct3361二ggiaccagg3421gtC3ggga^ga^ccccgcctc34S1t:ccagacct:a3541ctggagagccccgeccgccc3601gd。c:3gc:tggagcctctgtc3661cccsdc3ccc3721cgctctgcccgctggaggg:3781gtgcgggtga3841二g二gcggaeccgg二cg七tgg3901ctgcsggaggtcatgcaggc，OiC*1a~^""t"如，"—。t"—J>3(j丄gk、udv^tv^Wtg"gccctg4021c^g二cetct4081t:ccat:ggct:gggccGt3tct4141c:a二g3"tggca>4201ca二gi:ccaggtgcaggtgat:4261gacacctatgcgggcggt:tg4321eaggt:ag^ggggcgctgcc4381ctga3cetca4441nggni:c;tggaCttC3CCC3C4501gtggctcgtgtggggctgct4561gcctctgctc4521ctcgcgga^gceatgcgsgccg46Mctcgccagcc4741gctcctgcsgggtggatc改tc4801gaggcgctga^tgtee二gggc4861二c匸gcc二eta4921cagc二gctctgggciccgggggcagccctcttcc二ggctccgtccagctgctgatacagcgagg二gc::ggctggcccga^3gtgcacgcgtgctgccgcctaxg^ccggegctcs改gctggctgagggtggggcccegcgsgcgcc二gga二ccgc二gcgg;:gc:ggccct:gggaggc二gcccsotgtgg3Ccgccc二acggcctgggtggcgc二gcatcgt:gccgtg:gctccctccggggccc二tggcsg:ecst:g二cctgcc^ggggatad二ggggtcgcgccc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細胞激活和/或發炎的抑制劑選自IL-IO、TGF-P、6-(甲基亞硫酰基)己基異硫氰酸酯、倍半薛色酮以及它們的組合。87.權利要求79的方法，其中所述病理狀態為癌癥。88.,實質上:^本文所^免疫接種方法。89.—種實質上如本文所述的將貨物送遞至細胞的方法。90.—種實質上如本文所述的誘導或增強唾液酸粘附素表達的方法。91.一種實質上如本文所述的針對唾液酸粘附素結合活性和/或唾液酸粘附素結合所刺激的細胞內化活性篩選化合物的方法。92.—種實質上如本文所述的包含綴合有貨物部分的唾液酸粘附素結合部分的化合物，。93.—種實質上如本文所述的用表達構建體轉染細胞的方法。94.一種實質上如本文所述的治療病理狀態的方法。95.—種實質上如本文所述的將貨物送遞至細胞的試劑盒。全文摘要本發明的實施方案提供了一種將貨物部分送遞至細胞的方法，所述方法包括將表達唾液酸粘附素的細胞與具有唾液酸粘附素結合部分和貨物部分的綴合物相接觸。該唾液酸粘附素結合部分結合由細胞表達的唾液酸粘附素，并與該貨物部分一起被內化，藉此將該貨物部分送遞至該細胞內。由本發明所提供的具體方法包括誘導或增強唾液酸粘附素在天然情況下產生少量或不產生唾液酸粘附素的細胞內表達。唾液酸粘附素表達的誘導或增強包括唾液酸粘附素表達構建體的轉染和/或有效誘導或增強唾液酸粘附素表達的試劑的給予。具體描述了在受試者內刺激免疫應答的方法和組合物。本發明提供了刺激針對病毒的免疫應答的具體方法和組合物。文檔編號A61P37/04GK101678116SQ200780025209公開日2010年3月24日申請日期2007年5月11日優先權日2006年5月11日發明者H·諾英坷,P·德爾皮特申請人:根特大學