炎性疾病的預防或治療藥的制作方法

專利名稱：炎性疾病的預防或治療藥的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有NR10拮抗劑作為有效成分的、新型炎性疾病的預 防或治療藥。本發明還涉及使用NR10拮抗劑的預防或治療炎性疾病的 方法。
背景技術：
作為參與各種細胞的增殖分化或分化成熟的細胞的功能賦活化 的液性因子，已知存在多種細胞因子。在機體內受到細胞因子刺激的 細胞產生另外的細胞因子，由多個細胞因子形成網絡。機體恒常性是 通過該網絡的相互調節而保持著微妙的平衡。有人認為多種免疫炎性 疾病是由這些細胞因子網絡的破壞而引起的，基于單克隆抗體的抗細 胞因子療法備受關注。例如，抗TNF抗體和抗IL-6受體抗體在臨床上 顯示出較好的效果。但另一方面，在實際病態中由于補償經路發揮作 用，僅靠阻斷IL-4等一種細胞因子還無法取得治療效果，失敗的例子 頗多。
本發明人等成功分離了與IL-6的信號傳遞受體gpl30同源性高的 新型細胞因子受體NR10(專利文獻1)。 NR10與制癌蛋白M受體(OSMR) 形成異源二聚體，發揮IL-31受體的作用(非專利文獻1)。 Zymogenetics 社報道了過量表達IL-31的轉基因小鼠自然發生搔癢性皮炎(專利文獻 2)。
但還不能斷言小鼠中細胞因子的強制表達或病態小鼠血中的高 細胞因子濃度是實際的病因。利用抗體阻斷信號時是否取得治療效果 還完全不清楚。例如，使IL-18在角質形成細胞中過量表達的轉基因小鼠發生搔癢性皮炎。另外，特應性皮炎自然發病模型NC/Nga小鼠的血 中IL-18濃度隨病態的發展而升高。基于上述發現，推測IL-18的過量 表達是致病原因。但實際中尚未確認到給予中和抗體所產生的治療效 果(非專利文獻2)。
如上所述，在細胞因子的表達上升的疾病中，即使阻礙其細胞因 子的功能也未必能得到治療效果，根據細胞因子的表達量難以推測實 際中取得治療效果的疾病。因此，發現通過阻礙靶細胞因子的信號傳 遞而在實際中取得治療效果的疾病至關重要。
本發明的先行技術文獻如下所示。 專利文獻l: WO00/75314 專利文獻2: WO03/060090
非專利文獻1 : IL-31 is associated with cutaneous lymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis (IL-31與特應性皮炎患者中的皮膚淋巴細胞抗原陽性皮膚歸巢T細胞 有關)，J Allergy Clin Immunol. 2006 Feb; 117(2): 418-25 非專利文獻2: Administration of anti-interleukin 18 antibody fails to inhibit development of dermatitis in atopic dermatitis-model mice NC/Nga (給予抗白介素18抗體不能抑制特應性皮炎模型小鼠NC/Nga中皮炎的 發展)，British Journal of Dermatology 149: 39-45, 200
發明內容
發明所要解決的課題
本發明鑒于上述背景而設，本發明的課題在于提供使用細胞因子 受體拮抗劑來治療炎性疾病的抗細胞因子療法。更具體而言，本發明
的課題在于發現使用抗NR10中和抗體可取得治療效果的炎性疾病，提 供針對這些疾病的新型治療方法。本發明的另 一課題在于提供可臨床 應用于人的抗人NRl 0中和抗體。 解決課題的方法本發明人等為了解決上述課題進行了深入研究。本發明人等以各
種病態模型小鼠為對象，嘗試了評價抗小鼠NR10中和抗體的藥效。結 果表明，在使用NC/Nga小鼠的特應性皮炎模型小鼠和反復涂布苦基氯 而產生的慢性皮炎模型小鼠中，上述中和抗體顯示出顯著的癥狀抑制 效果，明確中和抗體在實際中可以用作治療藥。另外，在風濕癥;fi型一 膠原關節炎和變形性關節癥模型 一膠原酶關節炎中也確認到了抑制 癥狀的效果。上述結果表明本申請的NR10中和抗體可用于慢性炎癥 的預防或治療。
并且，本發明人等還成功獲得了人NR10中和抗體。即，本發明提 供下述[1]~[17]。 [l]所述的預防或治療藥，其中NR10拮抗劑為具有NR10中和活性 的抗體。 [2]所述的預防或治療藥，其中抗體為單克隆抗體。 [2]所述的預防或治療藥，其中抗體為具有人NRIO中和活性的單
克隆抗體。 [2] [4]中任一項所述的預防或治療藥，其中抗體為重組抗體。 [5]所述的預防或治療藥，其中重組抗體為嵌合抗體、人源化抗體
或人抗體。[2] 問中任一項所述的預防或治療藥，其含有具NRIO中和活性的 抗體的片段和/或其修飾物作為有效成分。 [1] [7]中任一項所述的預防或治療藥，其中炎性疾病為特應性皮 炎。 [1] [7]中任一項所述的預防或治療藥，其中炎性疾病為慢性皮炎。 [10] [1] [7]中任一項所述的預防或治療藥，其中炎性疾病為風濕癥。 [11] [1] [7]中任一項所述的預防或治療藥，其中炎性疾病為變形性關 節癥。抗體，該抗體具有NRIO中和活性。[13] [12]所述的抗體，該抗體為單克隆抗體。 [12]所述的抗體，其中NR10為人NRIO。 [12] [14]中任一項所述的抗體，該抗體為重組抗體。 [15]所述的抗體，其中重組抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。 [12] [16]中任一項所述的抗體的片段和/或其修飾物。預防或治療炎性疾病的方法，該方法包括對患有炎性疾病的患者
給予NR10拮抗劑的步驟。 NR10拮抗劑在制造用于預防或治療炎性疾病的藥物中的應用。附圖簡述


圖1是顯示向IL-31依賴性Ba/F3細胞增殖測定系統中添加BM095時，觀察BM095的細胞增殖抑制效果的結果圖。橫軸表示測定系統中mlL-31的推定濃度，縱軸(OD450 (450 nm的吸光度))表示細胞量。凡例顯示BM095添加量(單位ng/mL)。觀察到細胞增殖抑制效果依賴于BM095的添加量。
圖2是顯示對特應性皮炎模型'J 、鼠給予抗NR10抗體時的治療效果圖。與陰性對照組(溶劑對照組(vehicle))相比，抗NR10抗體給藥組中確認到顯著的炎癥抑制效果。
圖3是顯示對特應性皮炎模型小鼠給予抗NR10抗體時體重隨時間變化的圖。盡管在現有抗炎藥給藥組中觀察到體重減少，但抗NRIO給藥組沒有出現體重變化，抗NR10抗體的安全性得到確認。
圖4是顯示對慢性皮炎模型小鼠給予抗NR10抗體時的治療效果圖。在抗NR10抗體給藥組中確認到顯著的耳廓腫脹抑制效果。
圖5是顯示慢性皮炎模型小鼠耳廓的免疫組織染色的照片。與人一樣，在肥厚的表皮中觀察到小鼠NR10的表達亢進。
圖6是顯示對膠原誘導性關節炎模型小鼠給予抗NR10抗體時抑制關節炎發病的效果圖。
7圖7是顯示膠原酶誘導性關節炎(變形性關節癥)模型中BM095的給藥濃度與AUC的關系圖。其中以左右膝關節的寬度差作為表示右膝關節的胂脹的值，AUC意思是指上述寬度差的推移的曲線下面積。
圖8是表示在IL-31存在下人NR10中和抗體(純化抗體)的濃度與細胞增殖抑制活性的相關圖。抗體l、抗體2、抗體3顯示出高的NR10中和活性。
細胞增殖抑制活性的相關圖。NA633顯示出高的NR10中和活性。
圖lO是比較食蟹猴(cynomol) NR10與人NR10的氨基酸序列的圖。
帶有雙重下劃線的序列表示跨膜結構域。
圖11是顯示嵌合NA633抗體在人IL-31刺激食蟹猴NR10/人
OSMR/BaF細胞林中的細胞增殖抑制活性的圖。NA633對食蟹猴NR10
也顯示出中和活性。
圖12是顯示DSS大腸炎模型小鼠的體重變化率的推移圖。圖13是顯示急性苦基氯接觸性皮炎模型的耳廓厚度變化的推移圖。
實施發明的最佳方式
治療藥。本發明基于本發明人等的發現，即MIIO拮抗劑(例如抗NRIO中和抗體)在患有特應性皮炎、慢性皮炎、風濕癥、變形性關節癥等的
模型小鼠中顯著抑制其癥狀。
NR10是一種與制癌蛋白M受體(OSMR)形成異源二聚體并發揮IL-31受體作用的蛋白質。NR10還以glm-r (J Biol Chem 277, 16831-6,2002)、 GPL (J Biol Chem 278, 49850-9， 2003)、 IL-3 IRA (Nat Immunol 5,752-60, 2004)等名稱而為人所知，本發明的NR10還包括以上述名稱稱呼的蛋白質。另外，本發明的NR10還包括來源于人、小鼠或其它哺乳動物的NRIO,雖然沒有特別限定，但優選的NR10的例子有來源于
8人或小鼠的NRIO。作為來源于人的NRIO,已知有多種剪接變異體(WO00/075314)。上述剪接變異體中，MU0.1的特征在于包含662個氨基酸且具有跨膜結構域。而NR10.2是包含252個氨基酸且不具有跨膜結構域的可溶性受體樣蛋白質。另一方面，發揮跨膜型受體蛋白功能的NR10剪接變異體已知有NR10.3和IL-31RAv3。本發明中的人NRIO只要是與制癌蛋白M受體(OSMR)形成異源二聚體并發揮IL-31受體功能的蛋白質即可，沒有特別限定，但優選的NR10的例子有NR10.3 (也稱作ILRAv4 (Nat Immunol 5, 752-60， 2004))和IL-31RAv3。 NR10.3(IL-31RAv4)包含662個氨基酸(W000/075314, Nat Immunol 5, 752-60，2004),而IL-31RAv3包含732個氨基酸(GenBank檢索號NMJ39017)。IL-31RAv4的氨基酸序列見SEQ ID No:6， IL-31RAv3的氨基酸序列見SEQIDNo:7。另一方面，來源于小鼠的NR10的例子有包含SEQ IDNo:5中記載的氨基酸序列的蛋白質。
在本發明中，NR10拮抗劑是指通過與NR10結合，阻斷基于NR10活化的細胞內信號傳遞，使細胞的生理活性喪失或受到抑制的物質。其中，生理活性的例子有生理活性物質(例如趨化因子、炎性細胞因子等)的產生誘導活性、產生抑制活性、分泌促進活性、分泌抑制活性、增殖活性、增殖誘導活性、存活活性、分化活性、分化誘導活性、轉錄活性、膜轉運活性、結合活性、蛋白酶解活性、磷酸化/脫磷酸化活性、氧化還原活性、轉移活性、溶核活性、脫水活性、誘導細胞死亡的活性、誘導凋亡的活性等，但并不限于這些。
判定是否具有拮抗活性可以利用本領域技術人員所公知的方法來進行。例如只要在配體的存在下使受試化合物與在細胞表面上表達的NR10接觸，判定是否產生作為NR10的活化指標的細胞內信號傳遞即可。上述判定例如可以按照文獻"Dillon SR等，Interleukin 31, acytokine produced by activated T cells, induces dermatitis in mice G舌4匕T細胞產生的細胞因子一白介素31誘發小鼠皮炎).Nat Immunol. 2004Jul; 5(7): 752-60"中記載的方法進行。認為阻礙應答配體刺激的細胞內信號傳遞的化合物是NR10的拮抗劑。
明中的拮抗劑可以使用公知的物質。還可以使用經上述方法判定為具 有拮抗活性的新型化合物。
作為本發明中的NR10拮抗劑的一種形式，可以列舉出具有NRIO 中和活性的抗體。本發明中"具有NR10中和活性的抗體"是指具有抑制 基于NR10的生理活性的作用的抗體。本發明中"具有NR10中和活性的 抗體，，可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體，但優選的形式為單克隆 抗體。
具有NR10中和活性的單克隆抗體可如下得到以來源于人或小鼠 等哺乳動物的NR10或其片段肽作為免疫原，按照公知方法制備抗 NR10單克隆抗體，之后從所得抗NR10單克隆抗體中篩選具有NR10中 和活性的抗體，即可得到。即，使用所需抗原或表達所需抗原的細胞 作為致敏抗原，按照通常的免疫方法對其進行免疫。利用通常的細胞 融合法使所得免疫細胞與公知的親本細胞融合，再利用通常的篩選方 法篩選單克隆抗體產生細胞(雜交瘤)，從而可以制作抗NR10單克隆抗 體。被免疫的動物例如可以使用小鼠、大鼠、兔、綿羊、猴、山羊、 驢、牛、馬、豬等哺乳動物。制備抗原時，可以使用公知NR10基因序 列，按照公知方法、例如使用桿狀病毒的方法(W098/46777等)等來進 行。篩選具有NR10中和活性的抗體時，如下所述，例如在實施例中利 用在IL-31依賴性細胞抹中添加候選抗體時觀察該IL-31依賴性細胞林 的增殖抑制效果的方法，可以判定該抗體是否為具有NR10中和活性的 抗體。上述方法中，認為抑制IL-31依賴性細胞抹增殖的抗體為具有 NH10中和活性的抗體。
雜交瘤的制作例如可以按照Milstein等人的方法(Kohler, G.和 Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46)等來進行。當抗原的免 疫原性低時，使抗原與白蛋白等具有免疫原性的巨大分子結合可以進 行免疫。
10本發明的具有NR10中和活性的抗體的優選形式的例子有具有人 NR10中和活性的單克隆抗體。作為用于制作具有人NR10中和活性的 單克隆抗體的免疫原，只要可以制作具有人NR10中和活性的抗體即 可，沒有特別限定。例如，已知人NR10中存在多種變異體，但只要可 以制作具有人NR10中和活性的抗體，可以以任一種變異體作為免疫 原。或者在相同條件下，可以以NR10的片段肽或在天然的NR10序列 中導入了人為突變而得到的序列作為免疫原。人NR10.3在制作本發明 的具有NR10中和活性的抗體方面是優選的免疫原之一。
其中，本發明的上述抗體只要是具有NR 10中和活性的抗體即可， 沒有特別限定，還包括嵌合抗體、人源化抗體、人抗體等重組抗體。 嵌合抗體是指包含除人以外的哺乳動物例如小鼠抗體的重鏈、輕鏈的 可變區和人抗體的重鏈、輕鏈的恒定區的抗體。嵌合抗體可以利用已 知的方法來制造。例如，由雜交瘤克隆抗體基因，并插入適當的載體 中，再將其導入宿主中，即可制造嵌合抗體(例如參照Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990)。具體而言，使用逆轉錄酶由雜交瘤的mRNA 合成抗體可變區(V區)的cDNA。當得到編碼目標抗體V區的DNA時， 將其與編碼所需人抗體恒定區(C區)的DNA連接，將其插入表達栽體 中。或者可以將編碼抗體V區的DNA插入包括人抗體C區的DNA的表 達載體中。為了在表達調節區例如增強子、啟動子的調節下進行表達， 將DNA插入表達載體中。接下來，可以利用該表達載體轉化宿主細胞， 使嵌合抗體表達。
人源化抗體也稱重構(reshaped)人抗體，是指將除人以外的哺乳動 物例如小鼠抗體的互補性決定區(CDR; complementarity determining region)移植到人抗體的互補性決定區而得到的抗體，其通常的基因重 組方法也已知。具體而言，利用PCR法由制作成末端部具有重疊部分 的多個寡核苷酸合成DNA序列，上述DNA序列設計成連接小鼠抗體的CDR與人抗體的構架區(framework region; FR)。人源化抗體可如 下得到連接所得DNA與編碼人抗體恒定區的DNA,然后插入表達
號EP239400、國際專利申請公開號WO96/02576)。經由CDR連接的 人抗體的FR，篩選互補性決定區形成良好的抗原結合部位的FR。根 據需要，可以取代抗體可變區的構架區的氨基酸，使重構人抗體的互 補性決定區形成適當的抗原結合部位(Sato, K.等，Cancer Res. (1993) 53,851-856)。
另外，獲得人抗體的方法也是已知的。例如，在體外用所需抗原 或表達所需抗原的細胞致敏人淋巴細胞，使致敏淋巴細胞與人骨髓瘤 細胞例如U266融合，也可以得到具有抗原結合活性的所需人抗體(參 照日本特公平1-59878)。另外，還可以通過用所需抗原對具有完全人 抗體基因庫的轉基因動物進行免疫而獲得所需人抗體(參照國際專利 申請公開號W093A2227、 WO92/03918、 WO94/02602、 W094/25585、 WO%/34096、 W096/33735)。
并且，還已知使用人抗體噬菌體文庫通過篩選法獲得人抗體的技 術。例如，利用噬菌體展示法使人抗體的可變區作為單鏈抗體(scFv) 在噬菌體表面表達，可以篩選與抗原結合的噬菌體。通過分析所篩選 的噬菌體的基因，可以確定編碼與抗原結合的人抗體的可變區的DNA 序列。如果清楚了與抗原結合的scFv的DNA序列，就可以制作具有 該序列的適當的表達載體，獲得人抗體。上述方法廣為人知，可以參 考WO92/01047 、 WO92/20791 、 WO93/06213 、 W093/11236 、 W093/19172、 WO95/01438、 W095/15388等。
重鏈可變區或輕鏈可變區的氨基酸序列只要具有NR10中和活性 即可，可以是在確認具有NRIO中和活性的抗體的重鏈可變區或輕鏈 可變區的氨基S吏序列中取代、缺失、添加和/或插入一個或多個氨基酸 的氨基酸序列。作為在重鏈可變區或輕鏈可變區的氨基酸序列中取 代、缺失、添加和/或插入一個或多個氨基酸以制備具有NR10中和活性的抗體的重鏈可變區或輕鏈可變區的氨基酸序列的、本領域技術人 員所熟知的方法，已知有向蛋白質中導入突變的方法。例如，本領域
技術人員通過利用位點特異性誘變法(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno， T, Ogasahara, Y 和 Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleot 畫ide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275 ; Zoller， MJ,和Smkh， M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into Ml 3 vectors (克隆至'J M13載 體的DNA片段的寡核苷酸位點定向誘變).Methods Enzymol. 100， 468-500; Kramer, W, Drutsa, V, Jansen， HW, Kramer, B， Pflugfelder, M， 和 Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12， 9441—9456; Kramer W，和Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel， TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection (不需要表型選擇的快速有歲文 的位點特異性誘變法).Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492)等向具有 NR10中和活性的抗體的重鏈可變區或輕鏈可變區的氨基酸序列中導 入適當的突變，可以制備與具有NR10中和活性的抗體的重鏈可變區 或輕鏈可變區功能相同的突變體。這樣，重鏈可變區或輕鏈可變區中 有一個或多個氨基酸發生突變、且具有NR10中和活性的抗體的重鏈 可變區或輕鏈可變區也在包含在本發明的重鏈可變區或輕鏈可變區 中。
改變氨基酸殘基時，優選突變成保存有氨基酸側鏈的性質的另一 種氨基酸。例如，作為氨基酸側鏈的性質，例子有疏水性氨基酸(A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水性氨基酸(R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、具有脂肪族側鏈的氨基酸(G、 A、 V、 L、 I、 P)、 具有含羥基的側鏈的氨基酸(S、 T、 Y)、具有含硫原子的側鏈的氨基 酸(C、 M)、具有含羧酸和酰胺的側鏈的氨基酸(D、 N、 E、 Q)、具有
13含堿基的側鏈的氨基酸(R、 K、 H)和具有含芳香族的側鏈的氨基酸(H、 F、 Y、 W)(括弧內均表示氨基酸的一文字標記)。上述各組內氨基酸 的取代稱作保守取代。已知含有對某氨基酸序列通過缺失、添加一個 或多個氨基酸殘基和/或用其它氨基酸取代而被修飾的氨基酸序列的 多肽能夠維持其原有的生物學活性(Mark， D. F.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 5662-6; Zolier， M. J.和Smith, M.， Nucleic Acids Res. (1982) 10: 6487-500; Wang, A.等，Science (1984) 224: 1431-3; Dalbadie-McFarland， G.等，Proc. Natl. Acad. Sd. USA (1982) 79: 6409-13)。上述突變體與本發明的重鏈可變區或輕鏈可變區的氨基酸 序列具有至少70%、優選至少75%、更優選至少80%、進一步優選至 少85%、更進一步優選至少90%、最優選至少95%的氨基酸序列的同 源性。本說明書中，序列的同源性定義為根據需要進行序列排比并 適當導入間隙使序列同源性達到最大后，與原始重鏈可變區或輕鏈可 變區的氨基酸序列的殘基相同的殘基的比例。氨基酸序列的同源性可 以利用上述方法確定。
另外，在重鏈可變區或輕鏈可變區的氨基酸序列中取代、缺失、 添加和/或插入一個或多個氨基酸并具有NRIO中和活性的重鏈可變區 或輕鏈可變區的氨基酸序列，還可以由核酸得到，所述核酸是在嚴格 條件下與包含編碼該重鏈可變區或輕鏈可變區的氨基酸序列的核苷 酸序列的核酸進行雜交的核酸。作為用于分離在嚴格條件下與包含編 碼重鏈可變區或輕鏈可變區的氨基酸序列的核苦酸序列的核酸雜交 的核酸的嚴格的雜交條件，可以例示6M尿素、0.4%SDS、 0.5xSSC、 37。C的條件或與其同等嚴格的雜交條件。采用更嚴格的條件例如6M 尿素、0.4%SDS、 O.lxSSC、 42。C的條件時，可以期待分離同源性更高 的核酸。確定已分離的核酸的序列時，可以按照后述公知的方法進行。 關于所分離的核酸的同源性，在核苷酸序列整體中具有至少50%以上、 進一步優選70%以上、更進一步優選90%以上(例如95%、 96%、 97%、 98%、 99%以上)的序列同源性。除上述利用雜交技術的方法以外，利用基因擴增法、例如聚合酶 鏈鎖反應(PCR)法，也可以分離在嚴格條件下與包含編碼重鏈可變區 或輕鏈可變區的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸雜交的核酸，上述基 因擴增法使用根據編碼重鏈可變區或輕鏈可變區的氨基酸序列的核 苷酸序列信息而合成的引物。
核普酸序列和氨基酸序列的同源性可以通過Karlin和Altschul的 算法BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 5873-7)來確定。根 據該算法開發了被稱作BLASTN和BLASTX的程序(Altschul等，J. Mol. Biol. (1990) 215, 403-10)。根據BLAST通過BLASTN來解析核 普酸序列時，參數設定為分值(score)-100、字長(wordlength)-12。 另夕卜，根據BLAST通過BLASTX來解析氨基酸序列時，參數設定為 分值=50、字長=3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時，采用各程 序的默認參數。上述解析方法的具體手法廣為人知(參照NCBI (National Center for Biotechnology Information)的BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)的網址；http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)
本發明中的抗體可以是低分子抗體。本發明的低分子抗體包括全 抗體(例如全IgG等)的一部分缺失的抗體片段，只要具有NR10中和 活性即可，沒有特別限定。本發明的低分子抗體只要是全抗體的一部 分即可，沒有特別限定，但優選包括重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區 (VL),特別優選為包括VH和VL兩方的低分子抗體。
本發明中的低分子抗體優選較全抗體的分子量小，但有時也會形 成例如二聚體、三聚體、四聚體等多聚體，有時還會較全抗體的分子 量大。
作為本發明中的低分子抗體之一，例如有scFv抗體。scFv抗體 是指將重鏈可變區([VH])和輕鏈可變區([VL])經接頭等連接而形成的 單鏈多肽的抗體(Huston, J. S.等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85 5879-5883; Plickthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" 113 巻,Resenburg和Moore編,Springer Verlag, New York, 269-315頁，
15(1994))。對所連接的重鏈可變區和輕鏈可變區的順序沒有特別限定，
可以按照任何順序進行排列，例如有以下排列。接頭[VL] [VL]接頭[VH]
重鏈可變區或輕鏈可變區的氨基酸序列可以被取代、缺失、添加 和/或插入。并且，使重鏈可變區與輕鏈可變區締合時，只要具有抗原 結合活性即可，可以缺失一部分，還可以添加其它多肽。并且可以將 可變區嵌合或人源化。
在本發明中，連接抗體可變區的接頭可以使用能通過基因工程 導入的任意的肽接頭或合成化合物接頭，例如Protein Engineering, 9(3): 299-305, 1996中公開的接頭。
本發明中優選的接頭為肽接頭。對肽接頭的長度沒有特別限定， 本領域技術人員可以根據目的適當選擇，但通常為1-100個氨基酸， 優選3 50個氨基酸，進一步優選5~30個氨基酸，特別優選為12~18 個氨基酸(例如15個氨基酸)。
肽接頭的氨基酸序列的例子有以下序列。
Ser
Gly.Ser
Gly.Gly.Ser
Ser.GlyGly
Gly'Gly'Gly'Ser (SEQ ID No:8) Ser'Gly.Gly.Gly (SEQ ID No:9) Gly'Gly.GlyGly'Ser (SEQ ID No:10) Ser.Gly.Gly'Gly.Gly (SEQ ID No:l 1) GlyGly.Gly.Gly.Gly,Ser (SEQ ID No:12) SerGly.Gly.Gly.Gly'Gly (SEQ ID No: 13) Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ IDNo:14) Ser.Gly.Gly.Gly'Gly.Gly.Gly (SEQ ID No: 15)(Gly.Gly.Gly.GlySer (SEQ ID No:10))n (Ser.Gly.Gly.Gly.Gly (SEQ IDNo:l l))n 可以列舉[n為1以上的整數]等。
合成化合物接頭(化學交聯劑)是通常用于肽交聯的交聯劑，例如 有N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)、辛二酸 雙(磺基琥珀酰亞胺酯)(BS3)、 二硫代雙(丙酸琥珀酰亞胺酯)(DSP)、 二硫代雙(丙酸磺基琥珀酰亞胺酯)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀酸琥詢酰 亞胺酯)(EGS)、乙二醇雙(琥珀S臾磺基琥珀酰亞胺酯)(Sulfo-EGS)、 二 琥珀酰亞氨基酒石酸鹽(DST)、 二磺基琥珀酰亞氨基酒石酸鹽 (Sulfo-DST)、雙P-(琥珀酰亞氨氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、雙 [2-(磺基琥珀酰亞氨氧基羰基氧基)乙基]砜(Sulfo-BSOCOES)等，上述 交聯劑市場上可以買到。
本發明的抗體還包括在本發明抗體的氨基酸序列中添加了多個 氨基酸殘基而得到的抗體。另外，還包括上述抗體與其它肽或蛋白融 合而成的融合蛋白。制作融合蛋白的方法可以采用本領域技術人員所 公知的方法，例如連接編碼本發明抗體的多核普酸與編碼其它肽或多 肽的多核苷酸使構架一致，將其導入表達載體中，使之在宿主中表達 即可。作為與本發明抗體融合的其它肽或多肽，例如可以使用FLAG (Hopp， T. P.等,BioTechnology (1988) 6， 1204-1210)、包含6個His (組 氨酸)殘基的6xHis、 10xHis、流感血凝素(HA)、人c-myc片段、VSV-GP 片段、pl8HIV片段、T7-tag、 HSV-tag、 E-tag、 SV40T抗原片段、lck tag、 (x-微管蛋白片段、B-tag、蛋白C片段等公知的肽。另外，與本 發明抗體融合的其它多肽例如有GST(谷胱甘肽-S-轉移酶)、HA(流 感血凝素)、免疫球蛋白恒定區、P-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖結合蛋 白)等。使編碼市售的這些肽或多肽的多核苦酸與編碼本發明抗體的多 核苷酸融合，使由此制備的融合多核芬酸表達，從而可以制備融合多 肽。
17而在氨基酸序列、分子量、等電點或是否具有糖鏈或構象等方面有所 不同。但所得抗體只要具有與本發明抗體相同的功能，即包括在本發 明中。例如，使本發明的抗體在原核細胞例如大腸桿菌中表達時，在 原始抗體的氨基酸序列的N末端添加甲硫氨酸殘基。本發明的抗體也 包括這樣的抗體。
本發明的抗體可以利用本領域技術人員所公知的方法進行制作。
例如，可以根據識別NR10的抗體的序列，采用本領域技術人員所公 知的基因重組技術進行制作。具體而言，根據識別NR10的抗體的序 列構建編碼抗體的多核苷酸，將其導入表達載體中，之后使之在適當 的宿主細胞中表達即可(例如參照Co， M. S.等，J. Immunol. (1994) 152， 2968-2976; Better, M.和Horwitz， A. H.， Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A.和Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi， E., Methods Enzymol. (1986) 121， 652-663; Rousseaux, J.等，Methods Enzymol. (1986) 121， 663-669; Bird, R. E.和Walker, B. W.， Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137)。
載體的例子有M13系載體、pUC系載體、pBR322、 pBluescript、 pCR-Script等。為了亞克隆和切除cDNA時，除上述載體外，例如還 有pGEM-T、 pDIRECT、 pT7等載體。為了產生本發明的抗體而使用 載體時，表達載體是特別有用的。作為表達載體，例如為了在大腸桿 菌中表達時，載體除了具有在大腸桿菌中擴增的上述特征外，還必須 具有可以在JM109、 DH5a、 HBIOI、 XL1-Blue等大腸桿菌宿主中高 效率地表達的啟動子，例如lacZ啟動子(Ward等，Nature (1989) 341， 544_546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427)、 araB啟動子(Better等，Science (1988)240, 1041-1043)或T7啟動子等。作為這樣的載體，除上述載體 夕卜，還包括pGEX-5X畫l (Pharmacia制)、"QIAexpress system" (Quiagen 制)、pEGFP、或者pET (此時宿主優選表達T7 RNA聚合酶的BL21) 等。
載體中還可以包括用于抗體分泌的信號序列。作為用于抗體分泌的信號序列，當向大腸桿菌的周質中分泌蛋白時，可以使用pe舊信號 序列(Lei, S. P.等，J. Bacteriol. (1987) 169， 4379)。例如可以利用氯化4丐 法、電穿孔法將載體導入宿主細胞中。
除大腸桿菌外，用于制造本發明抗體的載體例如還有來源于哺 乳動物的表達載體(例如pcDNA3 (Invitrogen社制)或pEF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), 5322頁)、pEF、 pCDM8)、來源于昆 蟲細胞的表達載體(例如"Bac-to-BAC桿狀病毒表達系統"(Gibco-BRL 制)、pBacPAK8)、來源于植物的表達載體(例如pMHl 、 pMH2)、來源 于動物病毒的表達載體(例如pHSV、 pMV、 pAdexLcw)、來源于反轉 錄病毒的表達載體(例如pZIPneo)、來源于酵母的表達載體(例如 "Pichia Expression Kit" (Invitrogen制)、pNVll、 SP-QOl)、來源于枯草 菌的表達載體(例如pPL608、 pKTH50)。
為了在CHO細胞、COS細月包、NIH3T3細胞等動物細胞中表達時， 載體必須具有在細胞內表達所必需的啟動子、例如SV40啟動子 (Mulligan等，Nature (1979) 277, 108)、 MMLV-LTR啟動子、EFla啟 動子(Mizushima等，Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、 CMV啟動子 等，進一步優選栽體具有用于篩選轉化細胞的基因(例如可用藥物(新 霉素、G418等)判別的耐藥基因)。具有上述特性的載體的例子有 pMAM、 pDR2、 pBK-RSV、 pBK-CMV、 pOPRSV、 pOP13等。
并且，為了穩定表達基因且擴增細胞內的基因拷貝數時，可以列 舉以下方法，即向缺失核酸合成路徑的CHO細胞中導入補償該路徑 的具有DHFR基因的載體(例如pSV2-dhfr (Molecular Cloning第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等)，再用氨曱蝶呤擴增該 載體的方法。另外，為了瞬時表達基因時，可以列舉以下方法，即使 用染色體上具有表達SV40 T抗原的基因的COS細胞，用具有SV40 的復制起點的載體(pcD等)進行轉化的方法。復制起點可以使用來源 于多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒(BPV)等的起點。為了在宿主 細胞系中擴增基因拷貝數，表達載體可以進一步含有氨基糖苷轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃噪呤鳥噪呤磷酸核糖轉 移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為篩選標記。
由此得到的本發明的抗體，可以將其從宿主細胞內或細胞外(培養 基等)分離，并純化成實質上純粹且均勻的抗體。抗體的分離、純化可 以使用通常抗體的純化中所使用的分離、純化方法，但沒有任何限制。 例如，可以適當選擇和組合層析柱、過濾器、超濾、鹽析、溶劑沉淀、 溶劑提取、蒸餾、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點電泳 法、透析、重結晶等來分離和純化抗體。
層析例如有親合層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、 反相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization (蛋白質純化與鑒定實'驗指南)A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshark等,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。上述層析可以使用液相層析例如HPLC、 FPLC等來進行。親合 層析柱有蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱例如有HyperD、 POROS、 Sepharose FF (GE Amersham Biosciences)等。本發明還包含經上述純化 方法進行高度純化的抗體。
本發明還提供含有上述本發明抗體的片段和/或其修飾物作為有 效成分的炎性疾病的預防或治療藥。本發明抗體的片段和/或其修飾物 包括本發明的抗體(全抗體(例如全IgG)、重組抗體(例如嵌合抗體、人 源化抗體、人抗體等)、低分子抗體(例如scFv抗體等))的一部分缺失的 抗體片段，只要具有抗原結合能即可，沒有特別限定。本發明的抗體 片段只要是全抗體的一部分即可，沒有特別限定，但優選包括重鏈可 變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL)。 VH或VL的氨基酸序列可以包含取 代、缺失、添加和/或插入。并且，VH和/或VL可以部分缺失，只要具 有抗原結合能即可。還可以將可變區嵌合或人源化。抗體片段的具體 例子有Fab、 Fab，、 F(ab，)2、 Fv等。為了得到上述抗體片段，只要構 建編碼上述抗體片段的基因，將其導入表達載體中，之后使之在適當 的宿主細胞中表達即可(例如參照Co， ML S,等,J. Immunol. (1994) 152，
202968-2976; Better, M.和Horwitz， A. H.， Methods Enzymol. (1989) 178， 476-496; Pluckthun, A.和Skerra， A.， Methods Enzymol. (1989) 178， 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J.等，Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E,和Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9， 132-137)。
本發明的抗體還可以是與聚乙二醇(PEG)、放射性物質、熒光物 質、發光物質、酶、毒素等各種分子結合而成的綴合抗體。上述綴合 抗體可以通過對所得抗體實施化學修飾而得到。需要說明的是，抗體 的〈'務飾方法已在本領域中確立(例如US 5057313、 US 5156840)。本發 明中的"抗體"還包括上述綴合抗體。
測定抗體的NR10結合活性時，可以利用本領域技術人員所公知 的方法進行。例如，測定抗體的抗原結合活性的方法可以采用ELISA (酶聯免疫吸附測定法)、EIA(酶免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法) 或熒光抗體法。例如使用酶免疫測定法時，在包被了抗原的平板上加 入含有抗體的試樣、例如抗體產生細胞的培養上清或純化抗體。添加 用石成性磷酸酶等酶標記的二次抗體并溫浴平板，清洗后加入對硝基苯 磷酸等酶底物，之后測定吸光度，由此可以評價抗原結合活性。
測定抗體的NR10中和活性時，例如可以按照實施例記載的7見察 該IL-31依賴性細胞林的增殖抑制效果的方法來進行。
本發明的NR10拮抗劑或具有NR10中和活性的抗體可用于炎性 疾病的預防或治療藥中。本發明人等證實對各種炎癥模型動物給予 小鼠NR10中和抗體時，取得了顯著的治療效果。另外，有才艮道稱， 在特應性皮炎患者的肥厚表皮中人NTUO的表達亢進(非專利文獻1)。 另 一方面，本發明人等進行上述慢性皮炎模型小鼠耳廓的免疫組織染 色時，確認與人的情形一樣，在肥厚表皮中小鼠NR10的表達亢進(實 施例5)。以上情況表明NR10在所有動物種中都同樣參與了炎性疾 病，認為人NR10中和抗體與小鼠NR10中和抗體一樣，對各種炎性 疾病的預防或治療有效。并且認為抗體以外的NR10拮抗劑也與本實
21施例中的所見相同，對各種炎性疾病具有治療效果。
在本發明中，炎性疾病是指，與由于物理、化學或生物學作用物 質引起的損傷或異常刺激而在受患血管和相鄰組織中發生的細胞學.
組織學反應相關的、伴有病理學所見的疾病(Stedman醫學大辭典第5 版，林式會社MEDICAL VIEW社，2005年)。常見的炎性疾病的例子 有皮炎(特應性皮炎、慢性皮炎等)、炎性腸病(大腸炎等)、哮喘、關 節炎(類風濕性關節炎、變形性關節癥等)、支氣管炎、Th-2型自身免 疫疾病、系統性紅斑狼瘡、重癥肌無力、慢性GVHD、克羅恩氏病 (Crohn's disease)、變形性脊推炎、腰痛、痛風、手術外傷后的炎癥、 腫脹的緩解、神經痛、咽喉炎、膀胱炎、肝炎(非酒精性脂肪肝、酒精 性肝炎等)、乙型肝炎、丙型肝炎、動脈硬化等。
成為本發明對象的炎性疾病的優選例有特應性皮炎、慢性皮炎、 風濕癥、變形性關節癥、慢性哞喘。
本發明人等發現NR10拮抗劑抗體對特應性皮炎、慢性皮炎、 風濕癥、變形性關節癥具有治療效果。另一方面，判明NR10拮抗劑 抗體在急性接觸性皮炎和DSS急性大腸炎模型中沒有治療效果。
本發明的炎性疾病的預防或治療藥的特征在于含有上述NR10 拮抗劑或具有NR10中和活性的抗體作為有效成分。"含有NR10拮抗 劑作為有效成分"意思是指，含有NR10拮抗劑作為活性成分的至少一 種，對其含有率沒有限定。另外，本發明的炎性疾病的預防或治療藥 在含有NR10拮抗劑的同時，可以含有其它促進炎性疾病的預防或治 療的成分。
可以按照常規方法將本發明的NR10拮抗劑制成制劑(例如 Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton， US A)。而且，根據需要還可以含有醫藥上可接受的 載體和/或添加劑。例如可以含有表面活性劑(PEG、 Tween等)、賦 形劑、抗氧劑(抗壞血酸等)、著色劑、香料、保存劑、穩定劑、緩沖 劑(磷酸、枸櫞酸、其它有機酸等)、螯合劑(EDTA等)、懸浮劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、矯味劑等。但本發明的炎性 疾病的預防或治療藥并不受限于此，還可以適當含有其它常用的載 體。具體例子有輕質無水硅酸、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、淀粉、 羧甲基纖維素鈞、羧曱基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基曱基纖維 素、聚乙烯醇縮乙醛二乙氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、中鏈
脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、蔗糖、羧曱基纖維素、玉 米淀粉、無機鹽類等。還可以含有其它低分子量的多肽、血清白蛋 白、明膠和免疫球蛋白等蛋白質；以及甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、
精氨酸和賴氨酸等氨基酸。制成注射用水溶液時，將mio拮抗劑溶
于含有例如生理鹽水、葡萄糖或其它佐劑的等滲溶液中。佐劑的例子 有D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化鈉，并且可以與適當的 助溶劑例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非離子性表面活 性劑(聚山梨酯80、 HCO^0)等結合使用。
根據需要，還可以將NR10拮抗劑封入微膠嚢(羥曱基纖維素、明 膠、聚甲基丙烯酸甲酯等的微膠嚢)中、或者制成膠體藥物傳遞系統(月旨 質體、白蛋白微球體、微乳、納米粒子和納米膠嚢等)(例如參照 Remington's Pharmaceutical Science第16片反&， Oslo Ed. (1980)等)。并 且，將藥物制成緩釋制劑的方法也已公知，這些方法可適用于NR10 4吉4元劑(Langer等，J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15， 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12， 98-105;美國專利第3,773,919號；歐洲專利申 請公開(EP)第58,481號；Sidman等，Biopolymers (1983) 22， 547-56; EP第133,988號)。
本發明的炎性疾病的預防或治療藥可以口服給藥也可以胃腸外 給藥，但優選胃腸外給藥。具體而言，對患者進行注射給藥和經皮給 藥。作為注射劑型的例子，例如可以通過靜脈內注射、肌肉內注射或 皮下注射等進行全身或局部給藥。可以在欲抑制炎癥的部位或其周邊 局部注入、特別是肌肉內注射。可以根據患者的年齡、癥狀選擇適當 的給藥方法。給藥量例如可以在每次、每lkg體重活性成分為0.0001mg 100mg的范圍內選擇。或者，例如對患病的人給藥時，可以選擇 每人的給藥量在活性成分為0.0001~1000 mg/kg體重的范圍，每次的 給藥量例如優選含有約0.01-50 mg/kg體重的量的NR10拮抗劑。但 本發明的炎性疾病的預防或治療藥并不受上述給藥量的限制。
本發明還提供具有NRIO中和活性的抗體(包括具有NRIO中和活 性的抗體的片段和/或其修飾物。下同)。本發明的具有NR10中和活 性的抗體可以在上述炎性疾病的預防或治療藥中作為有效成分。本發 明的具有NTUO中和活性的抗體可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗 體，但優選為單克隆抗體。具有NRIO中和活性的單克隆抗體可以通 過上述方法得到。另外，本發明的單克隆抗體對來源于哺乳動物的 NR10或其片段具有中和活性，優選對來源于人或小鼠的MUO或其 片段具有中和活性，進一步優選對來源于人的NR10或其片段具有中 和活性。為了作成具有人NRIO中和活性的單克隆抗體，可以使用人 的NR10或其片段肽作為免疫原。本發明的具有NR10中和活性的抗 體可以是重組抗體。本發明的具有NRIO中和活性的重組抗體并不受 限于此，其例子有嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、低分子抗體。
本發明中，具有NRIO中和活性的抗體的例子有具有包含SEQ ID No:l中記載的氨基酸序列的重鏈可變區、包含SEQ ID No:3中記 載的氨基酸序列的輕鏈可變區的抗小鼠NR10抗體。
本發明還包括具有人NRIO中和活性的單克隆抗體。如上所述， 本發明的具有人NR10中和活性的單克隆抗體，可以通過使用人NR10 或其片段肽作為免疫原來制作單克隆抗體，再利用使用上述IL-31依 賴性細胞林的測定系統從上述抗人NR10單克隆抗體中篩選具有人 NR10中和活性的抗體。
本發明中具有人NRIO中和活性的抗體的例子有下述(a) (d)中 任一項所記載的抗體。
(a)抗體，其具有含有SEQIDNo:18所記載的氨基酸序列作為CDR1、 含有SEQ ID No: 19所記載的氨基酸序列作為CDR2、含有SEQ ID
24No:20所記載的氨基酸序列作為CDR3的重鏈可變區。
(b) 抗體，其具有含有SEQIDNo:21所記載的氨基酸序列作為CDR1、含有SEQ ID No:22所記載的氨基酸序列作為CDR2、含有SEQ IDNo:23所記載的氨基酸序列作為CDR3的輕鏈可變區。
(c) 抗體，其具有(a)的重鏈可變區和(b)的輕鏈可變區。
(d) 抗體，其識別與(a) (c)中任一項記載的抗體相同的表位。
某抗體是否與其它抗體識別相同的表位，這可以通過兩者對表位的竟爭來確認。抗體間的竟爭可以通過竟爭結合分析進行評價，其方法有ELISA、熒光能量轉移測定法(FRET)或焚光微量測定技術(FMAT (注冊商標))等。與抗原結合的該抗體的量與候選竟爭抗體(受試抗體)的結合能間接相關，所述候選竟爭抗體竟爭性地結合相同表位。即，受試抗體與相同表位結合的量或親和性越大，該抗體與抗原結合的量越低，受試抗體與抗原的結合量越增加。具體而言，向抗原中同時添加已適當標記的該抗體和應該評價的抗體，利用標記沖全測結合的抗體。通過預先標記該抗體可以容易地測定與抗原結合的該抗體量。對該標記沒有特別限定，根據檢測方法來選擇標記方法。標記方法的具體例子有焚光標記、放射標記、酶標記等。
例如，向使NR10表達的動物細胞中同時添加熒光標記的該抗體和未標記的該抗體或受試抗體，利用熒光微量測定技術纟全測被標記的該抗體。
這里所說的識別相同表位的抗體是指，當受試抗體的濃度為非標
記抗體的ICsg的10倍時能夠使標記抗體在該表位的結合量下降至少
50%的抗體。其中IC5o是指利用非標記抗體的結合使標記抗體在該表
位的結合量下降50%的濃度(1<:50)。
蟹猴NR10結合活性，進一步優選具有食蟹猴NR10中和活性。測定對食蟹猴NR10的結合活性或中和活性時，可以使用包含SEQ IDNo :24中記載的氨基酸序列的食蟹猴NR10。本發明還提供以下所示的治療方法。其中，NRIO、拮抗劑、單克 隆抗體、重組抗體、炎性疾病等的說明同上。
(1) 炎性疾病的預防或治療方法，該方法包括對患有炎性疾病的患者
給予NR10拮抗劑的步驟。
(2) (1)所述的方法，其中NR10拮抗劑為具有NR10結合活性的抗體。
(3) (2)所述的方法，其中抗體為單克隆抗體。
(4) (2)所述的方法，其中抗體為與人NR10結合的單克隆抗體。
(5) (2) (4)中任一項所述的方法，其中抗體為重組抗體。
(6) (5)所述的方法，其中重組抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
(7) (2) (6)中任一項所述的方法，其含有具NRIO中和活性的抗體的片 段和/或其修飾物作為有效成分。
(8) (1) (7)中任一項所述的方法，其中炎性疾病為特應性皮炎。
(9) (1 )~(7)中任一項所述的方法，其中炎性疾病為慢性皮炎。
(10) (1) (7)中任一項所述的方法，其中炎性疾病為風濕癥。
(11) (1) (7)中任一項所述的方法，其中炎性疾病為變形性關節癥。 并且，本發明還提供以下所示的發明。其中，NRIO、拮抗劑、單
克隆抗體、重組抗體、炎性疾病等的說明同上。
(1) NR10拮抗劑在制造用于預防或治療炎性疾病的藥物中的應用。
(2) (1)所述的應用，其中NR10拮抗劑為具有NR10結合活性的抗體。
(3) (2)所述的應用，其中抗體為單克隆抗體。
(4) (2)所述的應用，其中抗體為與人NR10結合的單克隆抗體。
(5) (2) (4)中任一項所述的應用，其中抗體為重組抗體。
(6) (5)所述的應用，其中重組抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
(7) (2) (6)中任一項所述的應用，其含有具N1U0中和活性的抗體的片 段和/或其修飾物作為有效成分。
(8) (1) (7)中任一項所述的應用，其中炎性疾病為特應性皮炎。
(9) (1) (7)中任一項所述的應用，其中炎性疾病為慢性皮炎。
(10) (1) (7)中任一項所述的應用，其中炎性疾病為風濕癥。
26(11) (1) (7)中任一項所述的應用，其中炎性疾病為變形性關節癥。
需要說明的是，本說明書中引用的所有先行技術文獻，均作為參
照而納入本"i兌明書。 實施例
以下通過實施例來進一步具體說明本發明，但本發明并不受限于 這些實施例。
「實施例11確立表達NRIO和OSMR的Ba/F3細胞抹
將人NR10 cDNA (WO 0075314 SEQ ID No:l)插入表達載體 pCOSl (Biochem Biophys Res Commun. 228， 838-45頁，1996)中，制成 pCosNR10.3。利用PCR法從人胎盤文庫中分離制癌蛋白M受體cDNA (OSMR, GenBank檢索號NM003999)，同樣構建表達載體 pCosl-hOSMR。利用電穿孔法將各lO,g的載體同時導入來源于小鼠 IL-3依賴性pro-B細胞的細胞林Ba/F3中(BioRad Gene Pulser, 960 pF, 0.33 kV)。導入后添加人IL-31進行培養，得到依賴于IL-31而增殖的 細胞林。同樣，由表達小鼠KR10和小鼠OSMR基因的Ba/F3細胞制 作小鼠IL-31依賴性細胞抹。
所有細胞抹均顯示數ng/mL的ED50,得到了進行良好增殖的細 胞林。人IL-31依賴性細胞株不與小鼠IL-31反應，通過添加人NR10 蛋白(胞外域)，增殖受到抑制。小鼠IL-31依賴性細胞抹不與人IL-31 反應，通過添加小鼠NR10蛋白(胞外域)，增殖未受到抑制。 「實施例21 NR10蛋白(胞外域)的制備
以人NR10 cDNA為模板，利用PCR法僅擴增胞外域，另外在C 末端附加FLAG tag序列，并插入表達載體pCXND3 (WO2005/005636) 中(pCXND3-NR10-flag)。利用電穿孔法將10 ,g直鏈狀的該載體導入 中國倉鼠卵巢細胞林DG44中(BioRad Gene PulserII; 25 , 1.5 kV)， 得到顯示出高表達的細胞株。利用抗FLAG抗體柱(SIGMA制)和凝膠 過濾法從將該細胞林大量培養的培養上清中得到純化樣品，供給以下實驗。C末端添加有FLAG tag序列的小鼠NR10 (胞外域)也同樣制備。 r實施例31具有抗小鼠NR10中和活性的scFv的分離和嵌合IgG化 BM095的制備
具體而言，本發明人等使用生物素化小鼠NR10蛋白(胞外域)， 利用篩選法從人抗體噬菌體文庫中縮小候選克隆的篩選范圍。從這些 克隆中純化分泌性scFv,將其添加到實施例1中記載的IL-31依賴性 Ba/F3細胞增殖測定系統中。結果成功地獲得了顯示強增殖抑制活性 的克隆BM095。
利用PCR法將BM095的人H鏈可變區序列(VH)連接到小鼠 IgG2a恒定區(CH1后)、將人L鏈可變區序列(VL)連接到小鼠X鏈恒 定區，構建表達載體。此時VH的氨基酸序列見SEQ ID No:l,編碼 該氨基酸序列的核苷酸序列見SEQ IDNo:2。 VL的氨基酸序列見SEQ ID No:3,編碼該氨基酸序列的核苷酸序列見SEQ ID No:4。將直鏈狀 的各表達載體同時導入DG44林中，篩選以高水平表達嵌合IgG的細 胞4朱。利用蛋白A (rProtein A Sepharose Fast Flow, GE Amersham Biosciences制)柱和陽離子交換(SP-TOYOPEARL 650M, TOSOH制) 柱層析法從將該細胞抹大量培養的培養上清中得到純化樣品。再利用 ActiClean Etox (Sterogen制)樹脂將致熱源減少至檢測限以下，供給以 下的動物實驗。向上述測定系統中添加BM095時的結果見圖1。 「實施例41利用NC/Nga小鼠的特應性皮炎模型研究藥效
通過每周重復涂布一次苦基氯(PiCl)來制作皮炎模型。即，用 5。/oPiCl(150〃l)致敏腹部、足趾4天后，每周用0.8。/。PiCl(150/4)涂布 背部、耳廓一次，通過反復涂布誘發皮炎。從第3周一直到第6周每 周觀察2次癥狀，從5個方面((l)搔癢癥、(2)發紅和出血、(3)浮腫、 (4)損傷和組織破損、(5)形成痂皮和干燥)各進行0 3分的評分。按10 mg/kg腹腔內給予抗體，在致敏、各誘發前一天共給藥6次(BM095 組)，或者第3周后在各誘發前一天共給藥3次(V/B組)。第3周后每 天按l mg/kg經口給予地塞米松(DEX組)，作為陽性對照。每組使用10只NC/Nga雄性小鼠。
如圖2所示，與溶劑給予組相比，抗體給予組確認到顯著的抑制 效果。此時如圖2所示，DEX組確認到體重顯著減輕，但抗體給予組 的體重沒有變化，表明該抗體是非常安全的藥物。 「實施例51利用反復涂布苦基氯而產生的慢性皮炎模型研究藥效
在6周齡雌性BALB/c小鼠的右耳涂布200.5%的苦基氯(丙酮/ 橄欖油(1:4， v/v)溶液)進行致敏。致敏后第8天起每隔1天在右耳涂 布20^10.25%的苦基氯(丙酮/橄欖油(1:4， v/v)),通過反復涂布誘發皮 炎。對BM095預防效果評價組從致敏前一天起按10 mg/kg每周腹腔 內給予一次BM095,而對BM095治療效果評價組從誘發開始后第20 天起按IO mg/kg每周腹腔內給予一次BM095。通過用表盤式測厚儀 經時性測定右耳的厚度，來評價耳廓腫脹。
其結果見圖4，在抗體給予組確認到顯著的抑制效果。有"R告稱， 在特應性皮炎患者的肥厚表皮中人NR10表達亢進(非專利文獻1)。進 行上述慢性皮炎模型小鼠耳廓的免疫組織染色時，與人的情形一樣， 觀察到在肥厚表皮中小鼠NR10表達亢進(圖5。在實施例3中制作將 恒定區變換為人IgG的BM095,用于免疫組織染色。呈茶褐色的部分 為NR10表達部位)。本發現表明在人和小鼠中NR10同樣參與了炎 -!"生疾病。
r實施例61利用膠原誘導性關節炎(風濕癥)模型研究藥效 模型小鼠的制作和藥效評價如下進行。
對9周齡雌性DBA/1JN小鼠在尾根部皮內給予來源于牛關節的 0.3%11型膠原與完全佐劑H37Ra等量混合的140/^膠原凝膠(第0天， 致敏)。3周后在背部皮內給予同樣調制的膠原凝膠，誘發關節炎的發 病(第21天，誘發)。根據致敏前兩天(天數-2)的體重將16只小鼠分成 2組、每組8只，設定為溶劑給予組和BM095給藥組。將受試物質 BM095以經PBS稀釋6倍的20 mmol/L的乙酸緩沖液(pH5.5) (200 mmol/L NaCl)作為溶劑，對BM095給藥組的8只小鼠在致壽丈前一天(天
29數-l)按10 mg/kg體重進行靜脈內給藥 而對作為對照的溶劑給予組 的8只小鼠在Day-l天給予相同劑量的溶劑。需要說明的是，從誘發 前一天(第20天)起每隔2-3天觀察四肢的肺脹，通過打分(每肢0-4分 滿分16分)來進行評價。
結果見圖6, BM095給藥組在第20天后四肢肺脹的分數降低， 這表明BM095具有抑制關節炎發病的作用。
「實施例71利用膠原酶誘導性關節炎(變形性關節癥)模型研究藥效 模型小鼠的制作和藥效評價如下進行。
對8周齡雄性C57BL/6J Jcl小鼠(日本CLEA制)從尾靜脈進行靜 脈內給予溶劑對照(經PBS稀釋6倍的20 mmol/L乙酸緩沖液，pH5.5， 200 mmol/L NaCl， n=5)、 BM095 2 mg/kg (n=5)、 BM095 20 mg/kg (n=6) (5 mL/kg)。之后在3%異氟烷吸入麻醉下，向右膝關節腔內注入6 ;d 經0.45 /rni濾器(MILLIPORE社制)過濾的1.5。/。膠原酶溶液(Type11， Sigma社制)(Am J Pathol 1989; 135(6): 1001-14)。
在即將給予膠原酶之前、給予后3、 7、 14天用卡規(Mitsutoyo制) 測量左右膝關節寬度，算出左右之差。以該差作為表示右膝關節肺脹 的值，利用梯形法則算出其推移曲線下面積(AUC),作為藥效指標。 使用統計解析軟件(SAS Institute社制)，對溶劑對照組與CNP給藥組 之間的AUC進行斯氏t檢驗(p0.05時存在顯著差異)。其結果見圖7, BM095給藥組的AUC在所有用量中均較溶劑對照組明顯小。由該結 果可知BM095抑制了變形性關節癥模型中的關節炎。 「實施例81抗人NR10中和抗體的獲得
用人NR10蛋白(胞外域)[實施例2中記載]對小鼠進行免疫，按 照常規方法制作雜交瘤。使用實施例1所示的人IL-31依賴性細胞抹 (hNR10/hOSMR/BaF3細胞)評價上述雜交瘤培養上清的中和活性，得 到具有高的NR10中和活性的若干個克隆(圖8)。 「實施例91人嵌合抗體的制備
中和抗體中活性最高的NA633的重鏈可變區的氨基酸序列見SEQ ID No:16、輕鏈可變區的氨基酸序列見SEQ ID No:17。此外， NA633的重《連可變區的CDR1、 CDR2和CDR3的氨基酸序列分別見 SEQIDNo:18、 SEQIDNo:19和SEQIDNo:20,輕鏈可變區的CDR1、 CDR2和CDR3的氨基酸序列分別見SEQ ID No:21 、 SEQ ID No:22和 SEQIDNo:23。
再按照常規方法制作具有上述小鼠可變區和人恒定區(H鏈為 IgGl型、L鏈為K型)的嵌合抗體，測定中和活性。如圖9所示，嵌 合NA633抗體在低濃度下顯示出強的中和活性。 「實施例101食蟹猴NR10的分離
在臨床前階段的安全性評價中認為對食蟹猴的交差反應性、中和 活性至關重要，所以本發明人等嘗試著分離食蟹猴NR10基因。根據 公開的恒河猴基因組信息等設計引物，利用PCR法成功地由食蟹猴臟 器擴增NR10基因。分離的食蟹猴NR10與人NR10的氨基酸序列的 排比見圖10。此外，食蟹猴NR10的氨基酸序列見SEQIDNo:24。如 實施例1所述，將該食蟹猴NR10基因與人OSMR基因 一 同導入Ba/F3 細胞中，確立顯示人IL-31依賴性增殖的細胞抹。使用該細胞抹研究 實施例9的嵌合抗體NA633的中和活性時，判明該抗體在食蟹猴中也 顯示出強的中和活性(圖11)。
「參考例11 BM095對硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘發大腸炎的藥效
制作作為炎性腸病(IBD)的病態模型被報道的DSS誘發大腸炎模 型(J Immunol (2003); 171: 5507-5513)，研究抗小鼠NR10中和抗體一 BM095的效果。使用經0.22 〃m濾器(Millipore制)過濾滅菌的蒸餾水 制備硫酸葡聚糖鈉(和光純藥制)的5。/。(w/v)水溶液，讓6周齡雄性 Balb/cAnN Crj小鼠(日本CHARLES RIVER制)經給水瓶自由攝取7天 上述溶液，測定體重，以相對于DSS給藥起始日的體重的變化率作為 藥效評價指標。
使用該模型，在DSS給藥前一天按10 mg/kg的用量靜脈內給予 抗小鼠NR10中和抗體BM095，評價體重減輕(n-10)，以枱r驗通過中和IL-31信號病態是否得到改善。設定在DSS給藥前一天靜脈內給予 溶劑(乙酸緩沖液[20mmol/L乙酸鈉、20mmol/L氯化鈉]與磷酸緩沖生 理鹽水[PBS ， GIBCO制]以容量比1:5混合的混合液)的組(溶劑組，n= 10) 作為溶劑對照組。另外，為了掌握正常小鼠體重變化率的推移，還觀 察與DSS給藥組相同周齡和性別的Balb/cAnN Crj小鼠的體重變化率 的推移(n-l)。
體重的推移見圖12。溶劑組通過給予DSS體重變化率降低。另 一方面，雖然BM095給藥組也顯示出與溶劑組相同的體重推移，但 DSS給藥后4天和5天后BM095組的體重變化率較溶劑組明顯下降。 由上述結果確認到給予BM095對該模型的大腸炎沒有產生治療效果。
有報道稱，在該模型中IL-31RA的表達亢進(W02004/003140), 但上述實驗結果表明同分子的中和抗體對該模型的大腸炎沒有治療 效果。
「參考例21 BM095對急性苦基氯接觸性皮炎模型的藥效
制作作為急性接觸性皮炎模型被報道(Clin Immunol (2003); 108: 257-262)的、經涂布苦基氯而致敏和誘發的產生延遲型過敏癥反應結 果的皮炎，研究抗小鼠NRIO中和抗體一BM095的效果。在8周齡雌 性Balb/cAnN Crj小鼠(日本CHARLES RIVER制)的腹部皮膚上涂布 50//L 7。/。的苦基氯(nacalai tesque， Inc.)溶液(乙醇:丙酮=3:1, v/v)進行致 敏，5天后在右耳廓皮膚上涂布20 〃L i。/。的苦基氯溶液(丙酮:橄欖油 =1:4， v/v)，誘發接觸性皮炎(誘發)。在同一只小鼠的左耳廓皮膚上涂 布20/^溶劑(丙酮:橄欖油=1:4， Wv)，作為用于評價溶劑對耳廓厚度 影響的對照(陽性對照組，n=6)。在臨i秀發前和誘發后24、 48、 72小 時用表盤式測厚儀(尾崎制作所制)測量左右耳的厚度，以相對于臨誘 發前的耳廓厚度的變化作為藥效評價指標。
設立致敏時于腹部皮膚上涂布不含苦基氯的乙醇丙酮混合液 (3:1, v/v)、在此5天后于右耳廓皮膚上涂布20^Ll。/c)的苦基氯溶液、 于左耳廓皮膚上涂布20〃L溶劑(丙酮:橄欖油=1:4， v/v)的組(陰性對照
32組，n=6)，作為用于評價病態成立的對照組。
為了評價本類病態中抗NR10抗體的給藥效果，設立按照上述陽 性對照組的方法誘發急性接觸性皮炎并在致敏前一天和誘發前一天 靜脈內給予10mg/kgBM095的組(BM095組，n-6)和按相同計時給予 溶劑(乙酸緩沖液口Ommol/L乙酸鈉、ZOmmol/L氯化鈉]與磷酸緩沖生 理鹽水[PBS， GIBCO制]以容量比1:5混合的混合液)的組(溶劑組， n=5)。
誘發后直至72小時的耳廓厚度變化見圖13。在誘發后24、 48、 72小時，陽性對照組的耳廓均較陰性對照組明顯肥厚，顯示病態成立。 此時，BM095組顯示出與溶劑組同樣的耳廓厚度的推移，沒有確認到 顯著的抑制。
由上述結果判明給予BM095并沒有對該才莫型所觀察到的急性 接觸性皮炎產生治療效果。
產業實用性
根據本發明，可提供新型的炎性疾病的預防或治療藥。本發明所 提供的炎性疾病的預防或治療藥含有NR10拮抗劑、更優選具有NR10 中和活性的抗體作為其活性成分。
近年來，使用單克隆抗體的抗細胞因子療法備受關注。但在實際 病態中的許多場合，即使阻斷一種細胞因子，但其補償經路起作用， 故難以得到治療效果。并且，在阻斷靶細胞因子時，難以預測會在哪
—種疾病中取得治療效果。在上述狀況下，本發明人等發現抗NRIO 中和抗體在患有特應性皮炎、慢性皮炎、風濕癥、變形性關節癥等的 模型小鼠中可以顯著抑制其癥狀。
本發明人等還成功地獲得了人NRIO中和抗體。含有人NR10中 和抗體作為有效成分的炎性疾病的預防或治療藥可臨床應用于人。
權利要求
1. 炎性疾病的預防或治療藥，其含有NR10拮抗劑作為有效成分。
2. 權利要求l所迷的預防或治療藥，其中NR10拮抗劑為具有NR10 中和活性的抗體。
3. 權利要求2所述的預防或治療藥，其中抗體為單克隆抗體。
4. 權利要求2所述的預防或治療藥，其中抗體為具有人NR10 中和活性的單克隆抗體。
5. 權利要求2 4中任一項所述的預防或治療藥，其中抗體為重 組抗體。
6. 權利要求5所述的預防或治療藥，其中重組抗體為嵌合抗體、 人源化抗體或^v抗體。
7. 權利要求2~6中任一項所述的預防或治療藥，其含有具NRIO 中和活性的抗體的片段和/或其修飾物作為有效成分。
8. 權利要求1 7中任一項所述的預防或治療藥，其中炎性疾病 為特應性皮炎。
9. 權利要求1~7中任一項所述的預防或治療藥，其中炎性疾病 為慢性皮炎。
10. 權利要求1~7中任一項所述的預防或治療藥，其中炎性疾病 為風濕癥。
11. 權利要求1~7中任一項所述的預防或治療藥，其中炎性疾病 為變形性關節癥。
12. 抗體，該抗體具有NR10中和活性。
13. 權利要求12所述的抗體，該抗體為單克隆抗體。
14. 權利要求12所述的抗體，其中NR10為人NR10。
15. 權利要求12 14中任一項所述的抗體，該抗體為重組抗體。
16. 權利要求15所迷的抗體，其中重組抗體為嵌合抗體、人源 化抗體或人抗體。
17. 權利要求12~16中任一項所述的抗體的片段和/或其修飾物。
18. 預防或治療炎性疾病的方法，該方法包4舌對患有炎性疾病的 患者給予NR10拮抗劑的步驟。
19. NR10拮抗劑在制造用于預防或治療炎性疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明人等從人抗體噬菌體文庫中獲得了在IL-31依賴性Ba/F3細胞增殖測定系統中顯示出強增殖抑制活性的克隆BM095。對使用NC/Nga小鼠的特應性皮炎模型小鼠、反復涂布苦基氯而產生的慢性皮炎模型小鼠、類風濕性關節炎模型小鼠、變形性關節癥模型小鼠給予該抗小鼠NR10中和抗體時，顯示出顯著的抑制癥狀的效果，這表明抗NR10中和抗體實際上可以用作炎性疾病治療藥。本發明人等還成功獲得了抗人NR10中和抗體，提供了實際上可臨床應用的、極為有用的治療藥。
文檔編號A61K45/00GK101500608SQ20078002960
公開日2009年8月5日 申請日期2007年6月8日 優先權日2006年6月8日
發明者北村秀智, 安達秀樹, 糟谷惠子, 長谷川雅一 申請人:中外制藥株式會社