專利名稱：：含有新木脂素b作為活性組分的皮膚外用組合物及其用于皮膚增白的用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種皮膚外用組合物以及該組合物用于皮膚增白的用途，該組合物含有從三白草(5"m^wmsc/z/"e"^ySa///)中提取的新木脂素B(manassantinB)作為活性組分。更具體地，本發明涉及一種含有新木脂素B作為活性組分的皮膚外用組合物以及該組合物用于皮膚增白的用途，所述新木脂素B抑制黑素細胞中的兩種黑素體轉運蛋白(melanosometransporterprotein)(黑素親和素(melanophilin)與肌球蛋白5a(myosin5a))之間的結合，以抑制黑色素的遷移，從而表現出優異的皮膚增白的效果。
背景技術：
：對于黑素生成的化學機理和酶促機理的理解已經得到了很好地證實，黑素生成決定了皮膚的顏色。黑素細胞在細胞器黑素體內合成黑色素，然后通過角質形成細胞轉移到角質形成細胞樹突。實際上，以這種方式轉移到角質形成細胞內的黑色素是決定皮膚顏色的重要因素。在黑素體轉移到角質形成細胞樹突的過程中，涉及到重要的成分。這些成分被稱為"MTC"(黑素體轉運復合體(melanosometransportcomplex)),所述MTC由三禾中蛋白質組成(黑素親和素、Rab27a和肌球蛋白5a)。Rab27a用作轉運體(transporter),結合到黑色素的表面上，從而識別并轉運黑素體。為了使Rab27a遷移到外周(periphery),它必須與作為胞內細胞骨架的肌球蛋白5a蛋白質會合，而用于識別上述兩種蛋白質并將上述兩種蛋白質相互結合的作為接合器(adapter)的蛋白質是所述黑素親和素蛋白質。當上述三種成分相互會合并形成復合體時，可以正常地將黑素體轉移到外周，并最終轉移到角質形成細胞。如果上述三種成分中的任意一種出現異常，可以觀測到黑素體的轉移過程出現了問題，而在黑色素的產生過程中則不會出現任何問題，從而使得皮膚的顏色變白。因此，通過調整這些成分來抑制黑素體的轉移，可以獲得皮膚增白的效果。三白草是一種類似于魚腥草(7/OM"Wj;m'"COWato)的多年生植物，具有多種藥學效果。已知三白草在多種成年人疾病的預防和治療中具有顯著的效果，所述成年人疾病包括便秘、糖尿病、肝病、癌癥、高血壓、心臟病、婦科疾病和腎病。已知在三白草中發現的活性組分類黃酮物質(包括櫟精、櫟素、異櫟素和蕓香苷)都可以起到凈化血液的功效，并且比銀杏樹葉中的類黃酮物質更有效，還可以保護并強化向人體的各個組織均勻地提供清潔的血液的外周動脈(peripheralartery),水溶性的單寧(tannin)具有防止DNA突變的效果，從而表現出抑制癌癥的發展的良好性能。在從三白草中分離出的提取物的藥理學研究中，為了利用抗氧化效果(上述類黃酮物質的自由基清除效果(韓國專利公開No.96-21001))，韓國專利公開No.96-21001公開了所述提取物在預防衰老(皺紋)的化妝品組合物中的應用。另外，為了利用抑制酪氨酸酶(一種產生黑色素的酶)活性的效果，韓國專利公開No.2002-0035656公開了三白草提取物在皮膚增白的化妝品組合物中的應用，盡管如此，上述專利公開并未對通過精細地分離和提純而得到的所述提取物的活性成分進行描述。據報導，新木脂素B可以抑制酰基輔酶A膽固醇酰基轉移酶(acylCoAcholesterolacyltransferase)的活性(韓國專利申請No.10-2003-0080397)，但是這種物質本身的皮膚增白效果還沒有報導。
發明內容本發明的發明人首次發現，當用三白草提取物對作為黑素細胞的mdan-a細胞進行處理時，黑素體的轉移被抑制。而且，通過對所述三白草提取物進行分離和提純，本發明的發明人首次確認實現該功能的活性成分是新木脂素B。此外，本發明的發明人發現通過抑制實現黑素細胞內的黑素體轉移的轉運蛋白之間的結合，即使黑色素合成是正常的，所述活性成分新木脂素B也具有抑制黑素體轉移的效果，從而使其具有皮膚增白的效果。因此，本發明的目的是提供一種用于皮膚增白的皮膚外用組合物，該組合物含有新木脂素B(—種三白草提取物)，從而具有抑制黑素細胞內的黑素體的轉移的效果。為了實現上述目的，一方面，本發明提供了一種皮膚外用組合物，該組合物含有新木脂素B作為活性組分。所述新木脂素B的特征在于它是從三白草中分離并提純得到的。另一方面，本發明提供了皮膚外用組合物用于皮膚增白的用途，該組合物含有新木脂素B作為活性組分。下面，將對本發明進行更詳細的描述。黑素細胞的黑素體是產生具有阻止由紫外線導致的細胞損傷的功能的黑色素的胞內細胞器，并且是非常重要的因素，因為該細胞器必須被轉移到角質形成細胞，從而使由紫外線導致的細胞損傷最小化。新木脂素B是通過抑制黑素親和素和肌球蛋白5a之間的結合來抑制黑素體的轉移的，所述黑素親和素和肌球蛋白5a是實現黑素細胞內的黑素體轉移的轉運蛋白，因此，即使黑色素合成是正常的，所述新木脂素B也可以提供皮膚增白的效果。考慮到所述組合物的效果、安全性和制劑穩定性，以所述組合物的總重量為基準，根據本發明的皮膚外用組合物含有的作為活性組分的新木脂素B的量為0.0001-10重量％，優選為0.001-10重量％。這是因為，如果新木脂素B的含量小于0.001重量％，所述組合物不能達到預期的效果；如果新木脂素B的含量超過10重量％，將難以保證所述組合物的安全性和制劑穩定性。本發明的組合物的劑型優選選自溶液、懸浮液、乳液、膏劑(paste)、凝膠、霜劑、洗液、散劑(powder)、肥皂、含表面活性劑的清潔劑(cleasing)、油齊U、粉餅(powderfoundation)、粉底乳液(emulsionfoundation)、粉底蠟(waxfoundation)禾口噴齊!j。含有新木脂素B的所述皮膚外用組合物可以用于皮膚增白。如上所述，當細胞用從三白草中分離出的新木脂素B進行處理時，可以觀察到在作為黑素細胞的mdan-a細胞內的黑素體的轉移被抑制時，出現黑素體的聚集，這種結果是由作為黑素體轉運蛋白的黑素親和素和肌球蛋白5a之間的結合被抑制所產生的。因此，新木脂素B干擾了作為黑素體轉運蛋白的黑素親和素和肌球蛋白5a之間的結合，從而能夠通過抑制黑素體的轉移來提供皮膚增白的效果，而不影響所述黑素體的黑色素合成功能。圖1示出的照片用于展示用新木脂素B處理后的黑素細胞(melan-a)的形態的光學顯微鏡觀測結果；圖2是表示Mlph(黑素親和素)和肌球蛋白5a之間結合的抑制程度的示意圖；圖3是表示本發明的新木脂素B在細胞水平上不抑制酪氨酸酶活性的示意圖；圖4是表示在黑素細胞與角質形成細胞的共培養過程中，本發明的新木脂素B以隨濃度而定的方式抑制黑色素合成的示意圖；圖5是通過以下方法獲得的圖表在豚鼠的背部形成人工色素斑點，將樣品涂敷在所述斑點上并持續一周，目測涂敷有所述樣品的人工色素斑點的顏色是否變得比未經任何處理的人工色素斑點(未處理組)的顏色更淺，并將觀測結果表示為數值；圖6表示在用所述樣品進行為期一周的處理之后，通過用色度計對所述人工色素斑點的顏色進行測量而獲得的L值。具體實施例方式下面，將結合以下實施例和測試例對本發明作更詳細的描述，但是本發明的范圍不僅限于這些實施例。實施例1:三白草提取物的制備將1kg的三白草(整棵植物)加到5L的70%的乙醇(水、含水的有機溶劑(乙醇、甲醇、丁醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷等)或有機溶劑)中，在回流下提取三次。然后，將所述溶液在15'C下放置1天。之后通過濾布對所述溶液進行過濾，并離心分離成為濾液和殘渣，在減壓下對分離出的濾液進行濃縮。將生成的提取物懸浮于1L的水中，然后用1L的二氯甲烷萃取五次。在減壓下對如此獲得的全部二氯甲垸層進行濃縮，從而獲得50g的三白草提取物。實施例2:新木脂素B的結構分析步驟l:新木脂素B的提純通過硅膠柱色譜法(裝填有300g的硅膠)對10g由實施例1獲得的三白草提取物進行提純。使用己烷和乙酸乙酯作為展開劑，己烷對乙酸乙酯的濃度梯度從5:l增加至l:5，以獲得餾分。從這些餾分中獲得0.62g的新木脂素B。步驟2:通過NMR分析新木脂素B的結構使用NMR波譜儀對由步驟1獲得的產品進行分析。結果，獲得如下表l所示的數據，并且所述產品表現出以下性質。因此，確定該產物為新木脂素B，并且具有由以下化學式l表示的結構'化學式l<新木脂素B的物理性質和化學性質>性質淺米色的微晶正離子的快原子轟擊質譜(positiveFAB-MS):734.5(M+H20)—〉LC-MS(APCI，正離子)734.5(M+H20)表l新木脂素B的iH-NMR和13C-NMR數據<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>測試例1:新木脂素B在細胞水平上抑制黑素體轉移的效果的測試步驟l:黑素細胞的培養在10。/。CO2培養器中，使melan-a細胞(永生化小鼠黑素細胞)在含有10%的胎牛血清的RPMI1640培養基中培養至90%匯合(confluency)，同時每隔3天用新鮮的培養基替換原來的培養基。步驟2:新木脂素B抑制黑素細胞中的黑色素轉移的測試用0.25%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)對步驟1中培養的melan-a細胞進行分離，并以3><105個細胞/孔的密度將所述細胞鋪展在6-孔的平板上。然后，將所述細胞放置24小時。用不同濃度的新木脂素B對所述細胞進行處理，4天之后，用光學顯微鏡觀察上述細胞的形態。觀察結果如圖1所示。從圖1中的看來為黑色的部分可以看出，與未用新木脂素B處理的對照組不同，在用新木脂素B處理過的細胞中，黑素體聚集在細胞核的周圍，而不是均勻地分布在整個細胞中。測試例2:新木脂素B抑制黑素親和素與肌球蛋白5a之間的結合的測試步驟l:重組蛋白質的制備使用適當的系統(大腸桿菌(￡.或桿狀病毒(baculovirus)大量生產該測試中需要的蛋白質。在本發明中，設計的蛋白質必須包括已知為蛋白質相互作用所必要的結構域(domain),并含有谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)標簽、組氨酸標簽(Histag)或Flag標簽(flagtag),以便生成的蛋白質能夠很容易地進行提純和分離。使每一個組氨酸標簽-綠色熒光蛋白-黑素親和素(histidinetagged-GFP-melan叩hilin)重組蛋白質和Flag-肌球蛋白5a(Flag-MyosinVa)重組蛋白(上述重組蛋白質用作誘餌蛋白質(baitprotein))在桿狀病毒系統中進行表達，使含有上述蛋白質的細胞進行分裂，然后制備提取物。用PBSTG緩沖溶液將Flag-肌球蛋白5aGT(Flag-MyosinVaGT)制備成為提取物，然后通過Flag-親合色譜法(flag-affinitychromatography)進行提純。步驟2:黑素親和素與肌球蛋白5a之間的結合蛋白質通過反應將步驟1中制備的組氨酸-綠色熒光蛋白-黑素親和素(his-GFP-mlphCT)蛋白質結合至涂有鎳的平板上。將結合伙伴Flag-肌球蛋白5aGT(Flag-MyosinVaGT)結合至上述平板上，然后結合可以識別Flag的M2抗體。使上述平板進行顯色反應，通過化學發光對上述蛋白質之間的結合程度進行測定。測定結果示于圖2中。從圖2中可以看出，新木脂素B抑制了黑素親和素與肌球蛋白5a之間的結合。測試例3:新木脂素B對酪氨酸酶活性的抑制效果的測試步驟l:黑素細胞的培養以與測試例1中的步驟1相同的方式培養黑素細胞。步驟2:抑制酪氨酸酶活性的測試用冷的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)對步驟1中培養的細胞進行一次洗滌，然后用0.1M的磷酸鹽緩沖劑(含有1。/。的曲拉通X-100(tritonx-100))使其進行分裂。然后，上述細胞在1400轉/分(rpm)下離心20分鐘，并分離出細胞上清液。將由此制得的40昭的蛋白質與不同濃度的新木脂素B混合，并使其反應1小時。用2mg/ml的L-多巴(L-DOPA)溶液對反應物質進行處理，并在37'C下放置。15分鐘之后，檢測在490nm處的吸光度，檢測結果示于圖3中。從圖3中可以看出，新木脂素B完全沒有抑制酪氨酸酶的活性。測試例4:新木脂素B抑制黑色素合成的測試步驟l:黑素細胞和角質形成細胞的共培養以與測試例1中的步驟1相同的方式培養黑素細胞。在10。/。C02培養器中，將小鼠角質形成細胞(SP-1細胞)在含有8%的胎牛血清的s-MEM培養基中培養至90%匯合，同時每隔3天用新鮮的培養基替換原來的培養基。步驟2:抑制黑色素合成的測試用0.25G/。的胰蛋白酶-EDTA對melan-a細胞和步驟1中培養的SP-1細胞進行分離，并以1:10的比例將上述細胞共同鋪展在12-孔的平板上，mdan-a細胞的細胞密度為^104個細胞/孔，而SP-1細胞的細胞密度為&105個細胞/孔。然后，將上述細胞放置24小時。用不同濃度的新木脂素B對上述細胞進行處理，5天之后，用1N的NaOH收集細胞。檢測所收集的細胞在405nm處的吸光度，并用勞里測定法(Lowrymethod)檢測蛋白質濃度。測試結果示于圖4中。從圖4中可以看出，在黑素細胞和角質形成細胞的共培養過程中，新木脂素B以由濃度而定的方式抑制黑色素合成，而且當新木脂素B的濃度為0.02ppm時，所述黑色素的合成被抑制了約50%。測試例5:通過動物試驗測試新木脂素B的增白效果步驟l:用于動物試驗的樣品的制備將實施例2中制備的提取物以0.1%的濃度溶解于賦形劑(乙二醇丙二醇水=5:3:2)中，并使曲酸以5%的濃度溶解于賦形劑中。步驟2:使用褐色豚鼠進行新木脂素B的增白效果的動物試驗將重約500g的豚鼠的背部的毛發剃掉，并將步驟1中制備的樣品以直徑為約1cm的圓形涂敷在剃掉了毛發的皮膚上，早晨和傍晚每天兩次，涂敷兩天。在第3天時，用戊巴比妥(30mg/kg)將所述豚鼠麻醉，然后用250mJ的紫外光照射涂敷有所述樣品的圓形部位。從紫外照射的第二天起，用與第一天涂敷的物質相同的物質進行為期一周的涂敷，早晨和傍晚每天兩次。然后，目測僅用賦形劑處理過的人工色素斑點和用所述樣品處理過的人工色素斑點與沒有涂敷任何物質的人工色素斑點(未處理組)在顏色上的差異。在目測結果中，0.5表示只有專家才能夠識別的增白效果；l表示任何人都能夠識別的增白效果；3表示增白效果表現為光亮度與最初的皮膚顏色一致；2表示增白效果介于1和3之間；4表示增白效果表現為光亮度比最初的皮膚顏色更高。將四只動物作為一組用于該試驗，獲得的數值求平均值并繪制成圖。較高的數值表示所述人工色素斑點通過施用樣品而變白，觀測結果示于圖5中。除進行以上目測之外，用色度計評估所述人工色素斑點的光亮度，結果用數值(L值)表示并求平均值。將平均值繪制成圖并示于圖6中，其中數值越高表示顏色越明亮。從圖6中可以看出，與對照組相比較，所述含有新木脂素B的提取物表現出優異的增白效果。制劑例l:含有新木脂素B的洗液將下表2中的組分l-6相互混合，并在7(TC下進行溶解以獲得水相。然后，使組分8-14在7(TC下進行溶解以獲得油相。之后將所述水相與組分7一起添加到所述油相中，在均質混合機(TokushuKika，日本)中對上述混合物進行攪拌以獲得乳液。然后，通過加入組分15使所述乳液變稠。去除泡沬之后，將獲得的物質冷卻至室溫，從而制得洗液。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>制劑例2:含有新木脂素B的滋養霜制備具有下表3中所示的組分和含量的滋養霜。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>制劑例3:含有新木脂素B的美容涂敷劑(pack)制備具有下表4中所示的組分和含量的美容涂敷劑。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>測試例6:通過人體試驗測試新木脂素B的增白效果12名健康的男性作為受試者。將不透明膠帶(沿該膠帶形成有6個直徑為1.5cm的開孔)貼在每個受試者的上臂之上，然后使每個受試者暴露于劑量約為最小紅斑劑量的1.5-2倍的UV光(UVB)下以誘導皮膚變黑，并涂敷被測試的物質。2個月之后，用色度儀測量皮膚的光亮度。給每個受試者涂敷作為被測試的物質的由實施例1、制劑例l和對比例獲得的組合物，一天兩次，在早晨和傍晚進行涂敷。在本發明中，對比例是除不含有新木脂素B之外而與制劑例1相同的組合物。通過測量表示皮膚的光亮度的"L值"來確定被測試的物質的效果(韓國人的未曬黑的皮膚的顏色通常表現出50-70的L值)。L值逐漸增大表示被測試的物質是有效果的，并且被測試的物質之間的比較用AL值表示。在本發明中，AL=最終的L值-施用被測試的物質之前的L值。AL值越高表示增白效果越好。測試結果示于下表5中。表5制劑例1實施例1對比例AL2.252.891.04如表5所示，含有新木脂素B的組合物的AL值分別為2.25和2.89，均高于對比例的1.04。這說明含有新木脂素B的組合物具有優異的增白效果。工業實用性如上所述，本發明的含有從三白草中提取的新木脂素B的皮膚外用組合物通過抑制黑素體的轉移能夠提供皮膚增白效果。權利要求1、一種皮膚外用組合物，該皮膚外用組合物含有新木脂素B作為活性組分。2、根據權利要求1所述的皮膚外用組合物，其中，所述新木脂素B是從三白草提取物中分離的。3、根據權利要求1所述的皮膚外用組合物，其中，以該組合物的總重量為基準，所述新木脂素B的含量為0.001-10重量％。4、一種皮膚外用組合物用于皮膚增白的用途，該皮膚外用組合物含有新木脂素B作為活性組分。5、根據權利要求4所述的用途，其中，所述新木脂素B是從三白草提取物中分離的。6、根據權利要求4所述的用途，其中，以該組合物的總重量為基準，所述新木脂素B的含量為0.001-10重量％。全文摘要本發明公開了一種皮膚外用組合物以及該組合物用于皮膚增白的用途，該組合物含有從三白草中提取的新木脂素B作為活性組分。更具體地，本發明公開了一種含有新木脂素B作為活性組分的皮膚外用組合物以及該組合物用于皮膚增白的用途，所述新木脂素B抑制黑素體的轉移，從而提供了皮膚增白的效果而不影響黑素細胞的黑色素合成功能。文檔編號A61K31/343GK101534816SQ200780042533公開日2009年9月16日申請日期2007年11月2日優先權日2006年11月17日發明者安秀美,崔賢貞,廉明勛,張希景,朱璟美,金大建,黃在晟申請人:株式會社太平洋