專利名稱：：針對4種登革熱血清型的免疫方法針對4種登革熱血清型的免疫方法
技術領域：
：本發明涉及用于在患者中誘導針對4種登革熱血清型的保護的方法，其包括(a)第一次給藥單價疫苗，該單價疫苗包含第一血清型登革熱的疫苗病毒,和(b)第二次給藥四價疫苗，該四價疫苗包含4種登革熱血清型的疫苗病毒,和其中在第一次給藥(a)之后至少30天至最多12個月實施第二次給藥(b)。登革熱疾病是由四種黃病毒屬的病毒引起的，這四種病毒具有相似血清型，但在抗原方面有區別(Giibler等，1988在Epidemiologyofarthropod-borneviraldisease中.MonathTPM，編者BocaRaton(FL):CRCP認:223-60;Kautner等，1997,J.ofPediatrics,131:516-524;Rigau曙P6rez等，1998，Lancet;352:971-977;Vaughn等,1997,J.Infect.Dis;176:322-30)。感染登革熱血清型可以產生臨床疾病語，該譜從非特異的病毒綜合征到嚴重的致死出血性疾病。在蚊叮咬之后登革熱的潛伏期是大約4天(從3到14天)。登革熱的特征在于雙相發熱(fi^vrebiphasique)、頭痛、身體各個部分的疼痛、虛脫、滲、淋巴結病(lymphad6nopathie)(Kautner等,1997，J.ofPediatrics,131:516-524;Rigau-P6rez等，1998,Lancet;352:971-977)。病毒血癥期與發熱期相同(Vaughn等，1997,J.Infect.Dis.;176:322-30)。在7到10天后完成登革熱的治愈，但通常有延長的虛弱。經常出現白細胞和血小板數目的減少。出血性登革熱是嚴重的發熱疾病，特征在于內環境穩定的異常和血管通透性(perm6abili")的升高，其可以引起血容量不足和低血壓(伴有休克綜合征的登革熱)，常常因嚴重的內出血而復雜化。出血性登革熱的死亡率在沒有治療的情況下可以達到10%,^旦在大多數有治療經驗的中心里是^P/o(WHOTechnicalGuide,1986.Denguehaemorrhagicfever:diagnosis,treatmentandcontrol,p.1-2.WorldHealthOrganization,Geneva,Switzerland)。登革熱的常規實驗室診斷是基于病毒的分離和/或檢測登革熱病毒特異性抗體。登革熱是繼疾疾之后第二重要的熱帶傳染性疾病，超過半數的世界人口生活在具有流行病傳播風險的區域內。每年，登革熱的病例估計為5千萬到1億，由于出血性登革熱就醫的患者的病例為500,000,死亡的數目為25,000。在亞洲、太平洋區域、非洲、拉丁美洲和加勒比地區，登革熱是地方病。超過100個熱帶國家對于登革熱病毒的感染是地方性的，在這些國家的60個中已經記錄了出血性登革熱(Gubler，2002,TRENDSinMicrobiology.10:100-103;Monath,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.，91:2395-2400)。許多充分描述的因素似乎與登革熱有關人口增長；無計劃的和不受控制的城市化，特別是與貧窮相關；空中旅行的增加；缺乏對蚊子的有效控制，以及衛生和公眾健康基礎設施的惡化(Gubler,2002,TRENDSinMicrobiology.10:100-103)。旅游者和移居國外的個體越來越多地被警告防登革熱(Shirtcliffe等，1998,J.Roy.Coll.Phys.Lond.;32:235-237)。美國軍隊在登革熱地方性流行的熱帶地區內部署期間，登革熱在美國軍隊中構成了發熱性疾病的主要原因之一(DeFraites等，1994,MMWR1994;43:845-848)。病毒在涉及到人類和埃及伊蚊(jec/waeg)^")的循環(cycle)中得到維持，其中埃及伊蚊04^/maegy;")是與人共處的在白天叮咬的蚊子，其傾向于以人為食。人類中的感染起始于受感染的埃及伊蚊04W^aegyp")吸血時病毒的注入。唾液中的病毒主要沉積在血管外的組織中。在接種后的被傳染的第一類細胞是樹突狀細胞，其然后遷移到淋巴結(Wu等，2000,NatureMed.，7:816-820)。在皮膚中和在淋巴結中的初始復制之后，病毒在急性發熱期期間病毒在血液中出現，一般是3到5天。與樹突狀細胞一起，這些單核細胞和巨噬細胞處在登革熱病毒的第一目標之中。對同型再感染的保護是完全的，可能持續終生，但是不同登革熱類型之間的交叉保護持續少于數周到數月(Sabin，1952，Am.J.Trop.Med.Hyg.;1:30-50)。因而，個體可能經歷不同血清型的感染。理論上，登革熱的二次感染理論上是發生嚴重的登革熱疾病的風險因素。然而，出血性登革熱是多因素的這些因素包括涉及的病毒的毒林、以及患者的年齡、免疫狀態和遺傳易感性。兩種因素在出血性登革熱的發生中起到主要作用具有高病毒血癥(vir6mie)的快速病毒復制(疾病的嚴重度與病毒血癥的水平相關；Vaughn等，2000,J.Inf.Dis.,181:2-9)以及具有高水平的炎癥性介質釋放的明顯的炎癥性反應(r岳ponseinflammatoire)(RothmanandEnnis,1999，Virology,257:1-6)。沒有一種抗登革熱的特效治療。登革熱治療的特征是臥床、用解熱和鎮痛藥控制發熱和疼痛以及攝取充足的液體。出血性登革熱的治療需要體液損耗的平衡、凝血因子的替換和肝素輸注。預防措施當前是基于控制媒介和采取個人防護措施，這些是難以實施和昂貴的。現在還沒有抗登革熱的疫苗被批準。考慮到上述四種登革熱血清型在世界上傳播，并且已經報道被涉及到出血登革熱(fidvreh6morragiquedengue)的病例中，因此，免疫接種理想地應當提供抗這四種血清型登革熱病毒的保護。當通過四價疫苗進行免疫時，可以達到優勢性地引起僅僅抗一種或最多3種血清型的反應。因此存在對一種方法的需要，這種方法可以減少不同血清型之間的干擾并可以誘導抗4種登革熱血清型的中和抗體(anticorpsneutralisant)。本發明人發現當用僅僅一種血清型的減毒活疫苗進行初次免疫后給藥用來誘導抗4種血清型反應的疫苗制劑，可以產生包含中和4種血清型的抗體的免疫反應，該第二次免疫是在第一給藥后30天至12個月實施。本發明人特別地證實在單價免疫DEN-2后的四價免疫DEN-1,2,3,4在所有經免疫的猴子中誘導抗四種血清型的反應。相反地，僅僅四價免疫不能誘導令人滿意的抗4種中的兩種反應，甚至在加強劑量(rappel)通過根據本發明的方法產生的免疫反應因而是數量上和質量上是更強的(覆蓋所有血清型)。根據第一個目的，本發明因而涉及可以在患者中誘導抗4種登革熱血清型(4serotypesdeladengue)的中和抗體的反應的方法，其包4舌(a)第一次給藥單價疫苗，該單價疫苗包含第一血清型登革熱的疫苗病毒,和(b)第二次給藥四價疫苗，該四價疫苗包含4種登革熱血清型的疫苗病毒和其中，在笫一次給藥(a)之后至少30天至最多12個月實施第二次給藥(b)。根據本發明的免疫方法的特定的實施方式，在第一次給藥(a)期間使用的所述疫苗病毒選自血清型1或2的登革熱疫苗病毒。根據本發明的免疫方法另一種特定的實施方式，在第一次給藥(a)期間使用的所述疫苗病毒選自VDV1和VDV2毒林。根據本發明的方法的另一種特定的實施方式，在四價疫苗中使用的所述疫苗病毒選自ChimerivaxTMDEN-l、2、3和4。根據本發明的方法的另一種特定的實施方式，血清型1、2、3和4登革熱疫苗病毒的數量在103到1()SDICC5()的范圍內。根據本發明的方法的另一種特定的實施方式，單價疫苗包含104DICC5Q的VDV1或VDV2，四價疫苗包含105DICC5o的ChimerivaxDEN-1、2、3和103DICC5。的ChimerivaxDEN誦4。根據本發明的方法的另一種實施方式，所述第二次給藥(b)在所述第一次給藥(a)之后30至60天實施。本發明還一個目的是抗登革熱病毒的免疫試劑盒，其包括至少含有(a)包含單價組合物或疫苗的第一容器，所述單價組合物或疫苗含有第一登革熱血清型的疫苗病毒，(b)包含四價組合物或疫苗的第二容器，所述四價組合物或疫苗含有4種登革熱血清型的疫苗病毒。根據一種實施方式，根據本發明的試劑盒至少包含(a)含有單價疫苗的第一容器，所述單價疫苗包含VDV1或VDV2疫苗病毒，(b)含有四價疫苗的第二容器，所述四價疫苗包含4種ChimerivaxTMDEN-l、2、3和4。根據一種特定的實施方式，根據本發明的試劑盒包含含有104DICC5Q的VDV1或VDV2的單價疫苗和包含105DICC5o的ChimerivaxDEN陽1、2、3和103DICC5。的ChimerivaxDEN畫4的四價疫苗。本發明因此還涉及登革熱疫苗病毒用于制備用于抗登革熱病毒的免疫的單價疫苗和四價疫苗的用途，其中所述單價疫苗包含笫一血清型的登革熱疫苗病毒，所述四價疫苗包含4種登革熱血清型的疫苗病毒，并且其中該四價疫苗是在給藥單價疫苗后至少30天至最多12個月進行給藥的。在下文的描述中將更詳細地描述本發明。定義"登革熱病毒，，或"DEN，，是正鏈、單鏈ARN病毒，其屬于黃病毒(/7"v/Wn^e)科黃病毒屬。基因組ARN在5'末端含有I型帽(coiffedetypeI),但是在3'末端缺少poly-A尾部(queuepoly-A)。基因組結構由以下元件組成5'非編碼區(NCR)、結構蛋白質(衣殼(C)、膜前(pr&membrane)/膜(prM/M)、包膜(E))和非結構蛋白(NS1畫NS2A-NS2B-NS3-NS4A國NS4B-NS5)，和3，NCR。基因纟且病毒ARN與衣殼蛋白締合以形成核殼。在黃病毒的情況中，DEN病毒基因組編碼不間斷的編碼區域，其被翻譯成單個聚蛋白質。在本發明的范圍中，對于"登革熱疫苗病毒，，，理解為任何病毒形式的能夠誘導特異的包含抗體的免疫反應的登革熱病毒，優選的是任何病毒形式的可以在人類中對抗登革熱病毒感染的免疫計劃的框架內可使用的登革熱病毒。對于"登革熱疫苗病毒"，因而理解為滅活病毒、減毒病毒(vimsatt6nu6s),或重組蛋白質如登革熱病毒的包膜蛋白。如果不再在允許的細胞上進行復制，則疫苗病毒被認為是"滅活的"。如果在37。C或39。C在Huh-7、VERO和/或C6/36肝細胞上生長之后，所述疫苗病毒具有的最大滴度最高為用野生型親本毒抹在相同培養條件下獲得的和如通過利用相同滴定方法測量的最大滴度的1/10，則疫苗病毒被認為是"減毒的，，。因而在上文鑒定的三種細胞類型的至少一種上顯示了降低的生長的疫苗病毒在本發明的范圍中被認為是"減毒的"。可以用于人類的疫苗病毒具有正的效益/風險比率，所述比率一般可以滿足為獲得銷售授權的規定要求。在本發明的范圍中使用的登革熱疫苗病毒優選地是減毒病毒，這樣它不會在人類中誘導疾病。有益地，所述疫苗病毒在大部分進行疫苗接種的個體中僅產生最多中等強度(即，中度到弱，或甚至沒有)的副作用，而同時保存它誘導中和抗體反應的能力。作為可以在本發明的范圍中可使用的登革熱疫苗病毒的非限制性實例，可以提及滅活疫苗病毒、減毒疫苗病毒，如減毒毒林VDV-1、VDV國2,例如在申請WO02/66621、WO0057904、WO0057908、WO0057909;WO0057910、WO02/0950075和WO02/102828中描述的毒林，或嵌合體。所述嵌合病毒具有表現出上文所定義的減毒病毒的特征的特性。所有表達登革熱病毒的包膜蛋白并誘導包含中和血清型(由其產生所述包膜蛋白)的抗體的免疫反應的嵌合病毒因而可以用于本發明的范圍中。作為非限制性實例，可以提及的是如在例如專利申請WO98/37911中所描述的ChimerivaxTM登革熱，如在例如專利申請WO9640933和WO0160847中描述的登革熱/登革熱嵌合體。例如，血清型1登革熱疫苗病毒可以是VDV1疫苗毒抹或ChimerivaxDEN-l,特別是YF17D/DEN-1病毒，或是DEN-116007/PDK13毒林。血清型2登革熱疫苗病毒可以例如是VDV2疫苗毒林或ChimerivaxDEN-2,特別是YF17D/DEN-2病毒，或是DEN-216681/PDK53毒抹。血清型3登革熱疫苗病毒可以是ChimerivaxDEN-3,特別是YF17D/DEN-3病毒。血清型4登革熱疫苗病毒可以是ChimerivaxDEN-4,特別是YF17D/DEN-4病毒。可以參考在這里提到的申請以獲得所提到的毒抹的精確描述和它們的獲得方法。"VDV，，或"Vero登革熱疫苗"表示適應Vero細胞的活的減毒登革熱病毒毒抹(即，能夠在Vero細胞上以顯著水平可繁殖地(defa^onreproductible)進行復制)，并且能夠在靈長類中、特別是在人類中誘導特異的體液反應，包括誘導中和抗體。"VDV-r，是由DEN-116007野生型毒林獲得的，其在PDK細胞上經歷了11次傳代(DEN-116007/PDK11),其然后在32。C在Vero細胞中進行擴增(amplifi6e)，純化它的ARN并將其轉染到Vero細胞中。與疫苗毒抹DEN-116007/PDK13(在PDK-原代狗腎臟(PrimaryDogKidney)-細胞上13次傳代)相比，VDV-1毒抹具有14個另外的突變。DEN-116007/PDK13毒抹，也稱為"LAV1",在以MahidolUniversity名義的專利申請EP1159968中得到描述，并以編號1-2480保藏在CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes(CNCM)。VDV陽1毒抹的完整序列在序列SEQIDNO:1中給出。所述毒林可以容易地由所述序列進行再生(reproduite)。VDV-1毒株的制備和鑒定(caract6risation)方';去已纟至在以Sanofi-Pasteur禾口CenterforDiseaseControlandPrevention(疾病控制和預防中心)名義提交的編號WO2006/134433的國際專利申請中得到描述。"VDV-2"是由DEN-216681野生型毒林得到，其通過PDK細胞經歷了50次傳代(DEN-216681/PDK50)、進行了噬斑純化(purifi6eparplaque),并提取它的ARN并純化然后轉染到Vero細胞中。然后通過噬斑純化和在Vero細胞中擴增獲得了VDV-2毒林。與疫苗毒抹DEN-216681/PDK53(通過PDK細胞53次傳代)相比，VDV-2毒林具有10個另外的突變，其中4個突變是沉默的(silencieuses)。DEN-216681/PDK53毒抹，也被稱為"LAV2",在MahidolUniversity名義的專利申請EP1159968中得到描述，并以編號1-2481保藏在CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes(CNCM)。VDV-2毒林的完整序列在序列SEQIDNO:2中給出。所述VDV-2毒抹可以容易地由所述序列進行復制。VDV-2毒林的制備和鑒定(carac&risation)方法已經在以Sanofi-Pasteur和CenterforDiseaseControlandPrevention名義提交的編號為WO2006/134433的國際專利申請中得到描述。VDV1和2毒抹通過在Vero細胞中擴增進行制備。收獲所產生的病毒，并通過過濾來凈化(clarifi6s)細胞碎片。ADN通過酶處理進行消化。通過超濾除去雜質。可以通過濃縮方法來提高傳染性滴度。在添加穩定劑之后，毒株在使用前以凍干的或冷凍的形式進行保存，然后即時地進行重建(reconstitu6es)。對于"ChimeriVaxTM登革熱，，或"CYD",表示嵌合的黃熱病(YF)病毒，其包含YF病毒的骨架(squelette),其中編碼膜前和包膜蛋白的序列被DEN病毒的序列替換。因而把含有登革熱血清型1毒株(DEN-1)的prM和E序列的嵌合YF病毒稱為"CYD-1或CYDDEN1"。把含有DEN-2毒林的prM和E序列的嵌合YF病毒稱為"CYD-2或CYDDEN2"。把描述含有DEN-3毒林的prM和E序列的嵌合YF病毒稱為"CYD-3或CYDDEN3"。把含有DEN-4毒抹的prM和E序列的嵌合YF病毒稱為"CYD-4或CYDDEN4"。這些ChimeriVaxTM登革熱的制備已經在國際專利申請WO98/37911和WO03/101397中得到詳利用來自DEN1PU0359(TYP1140)、DEN2PU0218、DEN3PaH881/88和DEN41288(TVP980)毒株的prM和E序列產生在實施例中描述的嵌合體。登革熱病毒的任何毒林可以在本發明的范圍中用于構建嵌合體。優選地，嵌合的YF病毒包括減毒的黃熱病毒林YF17D的骨架(TheilerM和SmithHH(1937)JExp.Med65,第767-786頁)(YF17D/DEN-1、YF17D/DEN-2、YF17D/DEN-3、YF17D/DEN-4病毒)。可以使用的YF17D毒抹的實例包括YF17D204(YF-Vax,Sanofi-Pasteur,Swifwater,PA，USA;Stamaril,Sanofi曙Pasteur,Marcyl，Etoile,France;ARILVAX，Chiron,Speke,Liverpool,UK;FLAVIMUN，BernaBiotech，Bern,Switzerland);YF17D-204France(X15067,X15062);YF17D-204,234US(Rice等，1985,Science,229:726-733)、或相關的毒抹YF17DD(Genbank索取號U17066)、YF17D-213(Genbank索取號U17067)和由Galler等(1998，Vaccines16(9/10):1024-1028)描述的YF17DD毒林。可在人類中使用任何其它的減毒黃熱病病毒的毒株也可以在本發明的范圍中用于構建嵌合體。根據特定的實施方式，對于在不同給藥中使用的每種血清型，疫苗病毒以103-1()5dICC5(,的量存在。根據特定的實施方式，疫苗病毒VDV1或VDV2在單價疫苗中以104DICC5o的水平存在。根據特定的實施方式，ChimerivaxDEN-1、2、3在三價疫苗中以105DICCso的水平存在，ChimerivaxDEN-4在四價疫苗中以103DICC5。的水平存在。通過每種血清型在Vero細胞中的擴增來制備每種ChimerivaxTM單價登革熱疫苗病毒(血清型1、2、3和4)。更特別地，在無血清的培養基中在貼壁的Vero細胞(cellulesVeroadh6rentes)中分別地產生上述四種病毒。通過過濾凈化細胞碎片的病毒收獲物接著通過超濾和色譜法來濃縮和純化，以除去來自宿主細胞的ADN。在添加穩定劑之后，在使用前疫苗毒抹以冷凍的或凍干的形式進行保存，然后即時被重建。相同的方法適用于上述四種嵌合體。除了藥學上可接受的賦形劑之外，當它僅含有單一的登革熱血清型疫苗病毒時，劑、組合物或疫苗是"單價的，，。當它含有四種登革熱血清型疫苗病毒時，劑、組合物或疫苗是"四價的"。所述多價組合物通過簡單地混合單價的組合物而獲得。對于"患者，，表示可能感染登革熱的人(兒童或成年人)，特別是具有感染風險的人，例如，在存在登革熱的地區中旅行的人或這些地區的居民。因而該術語包括未接觸過登革熱病毒的(nai've)人以及接觸過病毒的(non-nai've)人。^7/義#/介義瘦^^四#^i€根據第一個方面，本發明的目的因此為抗登革熱病毒的免疫方法。事實上，本發明人特別地已經表明了在第一次給藥單價疫苗后30天至12個月給藥4種血清型可以獲得抗4種血清型的有效保護。因而，根據本發明的方法在抗登革熱的免疫策略的范圍中具有非常特別的益處。根據本發明，第一次免疫可以使用包含所述4種登革熱血清型的任一種的疫苗病毒的單價組合物或疫苗進行實施，第二次給藥使用所有所述4種疫苗血清型來進行。根據特別的實施方式，血清型1或2的登革熱疫苗病毒，優選地血清型2用于第一次給藥。優選地，在第一次給藥中使用的登革熱疫苗病毒是減毒登革熱病毒并且不是由嵌合病毒進行構建(constitu⑤。根據特定的實施方式，VDV1或VDV2毒抹，優選地VDV2毒林被用作在第一次給藥中的疫苗病毒。活的減毒疫苗病毒用于第二次給藥中，優選地為表達4種血清型的登革熱病毒的抗原的嵌合病毒，特別是ChimerivaxDEN1、2、3和4。根據特別的實施方式，本發明因此覆蓋了以下方案-(a)VDV1(b)CYDDEN-1、2、3和4-(iaVDV2(b)CYDDEN-l、2、3和4在本發明的范圍中，對于"疫苗或組合物"，理解為包含"免疫有效量"的登革熱疫苗病毒的組合物，即，對于誘導包含中和抗體的特異性免疫反應充足量的登革熱病毒，其可以例如通過以下在實施例1中描述的血清中和測試進行證實。當如此測定的中和抗體的滴度大于或等于1:10(單位1/稀釋度(dilution))時，血清被認為對于中和抗體的存在是陽性的(positif)。疫苗毒林的量通常是以病毒噬斑形成單位(PFU)或以感染50%組織培養物的劑量或以感染50。/。細胞培養的劑量(DICC5())進行表示的。例如，根據本發明的組合物對于單價的或四價的組合物可以含有10到106DICC5。、特別是103到105DICC5。的血清型1、2、3或4登革熱疫苗病毒。因而，在根據本發明的組合物或用途中，血清型1、2、3和4登革熱疫苗病毒的劑量優選地各自在10到1(^DICC5()的范圍內，如10、102、103、104、105或106DICC50,特別是在103到105DICC5o的范圍內。上述疫苗病毒可以以相同的或不同的劑量進行使用，其可以根據所使用的疫苗病毒的性質和獲得的免疫反應的強度進行調整。根據本發明的方法的特定實施方式，在單價或四價組合物或疫苗中的活的減毒疫苗病毒的量為103-105DICC5q。根據特定的實施方式，該單價疫苗包含104DICC5。的VDV1或VDV2，優選VDV2。根據特定的實施方式，該四價疫苗包含105DICCsq的ChimerivaxTMDEN-l、2、3和4。根據一種有利的實施方式，該四價疫苗包含105DICC50的ChimerivaxTMDEN-l、2、3和103DICC5。的ChimerivaxDEN隱4。在本發明的范圍內，第二次給藥(b)在給藥(a)后30天至最多12個月實施。根據有利的實施方式，第二次給藥在第一次給藥(a)后30天至60天實施。中和抗體反應有利地是可持久的，即，它可以在第二次給藥后直到至少6個月時在血清中可^皮檢測到。疫苗病毒以組合物或疫苗的形式進行給藥，它們可以根據本領域技術人員已知的任何方法來制備。通常，一般為凍干形式的病毒與藥學上可接受的賦形劑(如，水或磷酸鹽緩沖鹽水溶液)、潤濕劑或穩定劑混合。對于"藥學上可接受的賦形劑"，理解為任何溶劑、分散介質、填料等等，其在人類或動物中不產生繼發反應，例如過敏性反應。根據所選的藥物形式、給藥方法和途徑來選擇賦形劑。在"Remington:TheScience&PracticeofPharmacy"中描述了合適的賦形劑以及與藥物制劑有關的要求，這代表了本領域的參考文獻。優選地，所述疫苗組合物以可注射的形式進行制備，并且可以對應于液體溶液、懸浮液或乳液的形式。所述組合物特別地可以包括緩沖的水溶液，以將pH值維持在大約6-9(如在環境溫度下使用pH計進行測定)。雖然添加佐劑不是必需的，然而所述組合物可以包含這樣的化合物，即，提高、刺激或增強同時給藥的疫苗病毒所誘導的細胞或體液免疫反應的物質。本領域技術人員能夠從在疫苗領域中通常使用的佐劑中選擇在本發明的范圍內可以適用0的佐劑。途徑進行給藥，例如胃腸外途徑(特別是皮內的、皮下的或肌內的)，有益地通過皮下途徑。優選地，所述組合物或疫苗是通過皮下途徑(有利地在左側三角肌區和右側三角肌區域處)給藥的可注射組合物。進行給藥的組合物或疫苗的體積取決于給藥途徑。對于皮下注射，體積一般在0.1至1.0ml之間，優選地大約0.5ml。給藥全部血清型1到4的最佳時期是暴露于登革熱病毒之前大約1到3個月。所述疫苗可以在成年人和兒童中作為感染登革熱病毒的預防性處理進行給藥。因而目標人群包括未接觸登革熱病毒的(即，先前沒有進行免疫過)或接觸過病毒的人。血清型1到4登革熱疫苗病毒的加強劑量給藥(administmtionsderappel)也可以例如在給藥根據本發明的第二次給藥(b)之后6個月至10年之間，例如，6個月、l年、3年、5年或10年時進行。所述加強劑量給藥有益地將通過使用相同的組合物或疫苗(即，相同的疫苗病毒)且優選地在與用于第二次給藥(b)的條件相同的給藥條件(解剖學部位和給藥途徑)下進行實施。干擾現象可以通過一種或多種血清型相對于其他血清型占優勢(dominance)進行解釋，因而與用來制造疫苗候選物(來自VDV或Chimerivax)的工藝無關。因而根據本發明的方法一般地可以應用于任何登革熱疫苗病毒。因此本發明目的還包含登革熱疫苗病毒用于制備用來抗登革熱病毒的免疫的單價疫苗和四價疫苗的用途，其中該單價疫苗包含第一血清型登革熱疫苗病毒，該四價疫苗包含4種登革熱血清型的疫苗病毒，并且其中該四價疫苗在給藥單價疫苗后至少30天至最多12個月進行給藥。為了說明在本發明的用途范圍內可使用的疫苗和條件，可以參考關于根據本發明的免疫方法所給出的說明。根據另一方面，本發明的目的為抗4種血清型登革熱病毒的免疫試劑盒。根據本發明的試劑盒包含如在上面關于所提出的免疫方法中所定義的組合物或疫苗。根據本發明的試劑盒因此包含含有不同容器的盒子，所述容器包含上述組合物和疫苗，有利地包含解釋性說明手冊，所述說明手冊包含用于給藥所述組合物或疫苗的信息。根據一種實施方式，本發明的目的因此為抗登革熱病毒的免疫試劑盒，所述盒子至少包含(a)第一容器，其含有包含第一登革熱血清型的疫苗病毒的單價疫苗，和(b)第二容器，其含有包含4種登革熱血清型的疫苗病毒的四價疫苗。對于可以在本發明的試劑盒中使用的登革熱疫苗、組合物或疫苗''根據二種;寺定"實施方式，根據本發明的i劑盒至少包含:、(a)第一容器，其含有包含VDV1或VDV2的疫苗病毒的單價疫苗，和(b)第二容器，其含有包含4種ChimerivaxTMDEN-l、2、3和4的四{介疫苗。根據一種特定的實施方式，根據本發明的試劑盒包含至少一種單價疫苗，其包含104DICCsq的VDV1或VDV2,和四價疫苗，其包含105DICC5。的ChimerivaxDEN-1,2,3和103DICC5。的ChimerivaxDEN誦4。根據本發明的試劑盒可以含有如上所述的容器的單個實例或幾個實例。如果所使用的疫苗是凍干的形式，則所述試劑盒將有益地包含至少一個額外的容器，其含有可以重建可注射疫苗劑的稀釋劑。任何藥學上可接受的稀釋劑都可以用來進行該行為，通常是水或磷酸鹽緩沖的水溶液。本發明通過以下實施例進行說明。實施例實施例1:通過在猴子中先后注射單價組合物然后四價組合物的抗4種血清型登革熱病毒的免疫在猴模型中測試了病毒血癥和免疫原性。特別地，病毒血癥已被鑒定為與人類中疾病的毒力和嚴重度相關的因素之一，因而構成了必須要考慮的重要參數。對于免疫原性，它是在所提供的保護的評價范圍中的關鍵參數。1.1材料和方法根據關于動物實驗的歐洲指令(DirectivesEurop6ennes)對猴子進行實驗。對來自于毛里塔尼亞的獼猴(A勿caca/wc/cw/Gn》進行免疫。在免疫之前，猴子被隔離六周。用0.5ml的疫苗組合物在臂部通過皮下途徑對猴子進行免疫。在用氯胺酮(Imalgene,Merial)輕度麻醉之后，通過在腹股溝靜脈或隱靜脈處穿刺采集血液。在每次免疫之后的第0天和第28天，采樣5ml的血液以評估抗體反應，而在第2和第IO天之間，采樣1ml的血液以評估病毒血癥。血液采集到水上，并在冰上保存直到血清分離。為此，在4°C離心血液20分鐘，并將采集的血清在-80。C保存直到測試之時。病毒血癥的測量通過定量的實時RT-PCT(qRT-PCR)監控疫苗接種后的病毒血癥。位于DEN1和DEN2毒林的NS5基因中的兩套引物(amorces)和探針(sonde)被用來分別定量VDV-1和VDV-2的ARN。位于YF病毒的NS5基因中的第三套2個引物和1個探針被用來定量CYD的ARN。最后，4套不同CYD血清型的特定引物和探針(位于E(DEN)/NS1(YF)基因的接點處)凈皮用來鑒定對于ARNNS5YF為陽性的樣品中的血清型(也參見表I)。在T7啟動子控制下，含有每種PCR的目標區域(r6gioncibl6eparchaquePCR)的7種質粒在體外被轉錄，以產生一系列合成的ARN,其在每次RT-PCT分析中被包括作為內部參照(r6伝renceinterne)。通過分光光度法測定這些合成的ARN的量，所獲得的ARN的量被轉化成ARN拷貝數并用GEQ(基因組當量)進行表示。利用MachereyNagel的"Nucleospin96virus"ARN提取試劑盒，根據廠家的說明書提取0.140ml猴子血清，然后將純化后的ARN用0.140ml(0.090ml,然后0.05ml)的無RNA酶(RNase)的水進行洗提。為了避免重復的冷凍/解凍循環，在提取之后立刻對5pi的所述ARN制品進行笫一次定量。在7(TC冷凍其余的體積。除了"QiagenQauntitectprobes"RT-PCR定量試劑盒(Qiagen)的組分之外，反應混合物在25pi的總體積中還含有IO皮摩爾的每種引物、4皮摩爾的每種探針和5piARN。對于測試的ARN的情況，將5|Lil的純化制劑直接加入到該反應混合物中，而不用任何預先稀釋步驟。將合成的ARN在無RNA酶(RNAse)的水中以1/10進行稀釋，平行地對在5)Lil中含有大約IO至106GEQ的7個稀釋度進行定量以獲得標準曲線。定量反應通過AppliedBiosystem的ABIPrism70()TM設備通過^f吏用以下程序來進行50。C/30分鐘，95。C/15分鐘，然后40個95°C/15秒-60°C/60秒的循環。根據所述目標PCR,在這個測試中的病毒ARN的定量的極限是2.9到3.3log1QGEQ/ml(800-2000GEQ/ml;4-10GEQ/反應)(標準偏差+/-0.3log10)。通過分析0.140ml的陰性猴血清樣品(DO)(在其中已添加已知量的已用于免疫的傳染性的病毒顆粒(CYD或VDV)),與上述分析平行地建立傳染性滴度和病毒ARN量之間的相關性。所述對照血清已被制備為在5]ul中包含大約1PFU和大約100PFU的兩個稀釋度(分別地2.3和4.3log10PFU/ml)。在這些實施例中使用的測試中，GEQ和PFU之間的相關性如下對于那些對YF或CYD為陽性(serapositifsenYFouCYDs)的血清，GEQ/PFU比率為2.7logw(即1PFU=500GEQ)。對于那些對VDVl或VDV2為陽性的血清，GEQ/PFU比率為2.51og!。(即:1PFU=320GEQ)。對于qRT-PCRYF和CYDs,定量的極限是<3.31ogK)GEQ/ml(即<4PFU/ml),對于qRT-PCRVDVl和VDV2,是〈2.91og!oGEQ/ml(即<2,5PFU/ml)。所使用的引物和探針在以下表1中給出，其中按每次分析的順序歹寸出了正義引物(amorcessens)和反義引物((amorcesanti-sens))和4笨4十。表1序列YF-NS5正義5'織CGGATGTAACAGACTGMGA(23bas的YFNS5反義5'CCCCGAACCTGTCAT(18bases)YF-NS55'F'arrvCGACTGTOTGGTCCGGCCCATC-Tamra(22bases)CYD1特異CYD1-正義5'CATTGCAGTTGGCCTGOTAA(20b〉CW1-反義5'CTTTGGCAA,AOAOCTCAA<3T(23b〉CYD1-5'FanvCCGATCA船GATGCGCCATCA'Tamra(21b)CYD2特異CYD2"正義5'GTGGGAGTCGTGACGCTGTA(20b)CYD2-反義5'G丌OAT(3GCGCATCCTTGATC(21b)CYD25'FarrvTGGGAG丌ATGGTGGGCGCCG-Tamra(21D)CYD3特異CYD3^正義5'AAAACACTTCCATGTCAT丌TCATG(25b)CYD3"反義5'G丌.GATGGCOCATCCTTGATC(21b)CYD3>5'FarrvTGC(MTAGGAA丌ATCACACTCTA丁CTGGGAGOTarwa(33b)CYD4特異CYD4-正義5'C丌A"3TATTGTGGATTGGCACGAA'(24b)CYD4"反義5'GCGCCAACTGTGAAACCTAGA(21b〉CYW-5'-Fam"AGAAACAC丌CMTGGCA.ATGACGTGCAT-Tamra(29b〉VCV1-NS5正義5'TCGCAACAGCCTTMCAGC(簡廿抽VDV1-NS5反義5'ACTATCTCCCTCCCATCCTTC(21b)VCft/1-NS55'F掛TTCACACCACTTCCAOMGB/NFQ(16b)cmVDV2-NS5正義5'AATGACAGA.CACGACTCC(18b)g$VDV2-NS5反義5'CCCAAAACCTACTATCTTCMC(22b)VDV2-NS55'FsroTGGAAGTCGGCACGTGA掘B/NFQ(17中和抗體的測量(血清中和測試)(SN50)通常，利用PRNT50測試(通過PFU數量的50%的降低的中和測試)測量登革熱抗體。由于這種測試是費力的和消耗大量材料，我們開發了SN50測試，其基于DICC50測試中測量的單位數的50%的降低。在96孔平板中，將0.120ml的每種去補體后的血清(s6rumd6compl6men&)添加到每孔0.480ml稀釋劑(ISCOVE4%SVF)中。通過將0.150ml血清轉移到0.450ml稀釋劑中制備因數為6(facteur6)的系列稀釋度。450pl的2.71og1GDlCC50/ml的病毒稀釋度添加到每孔中以獲得25DICC50/孔。平板在37。C孵育1小時。然后將0.1ml的每種稀釋液分配到96孔平板的6個孔中，在該平板中在實驗開始前的3天已經以8000細胞/孔的密度、在0.1ml的ISCOVE4%SVF的培養基中接種(ensemenc6es)了VERO細胞。在37。C在存在5%C02時孵育6天之后，細胞在4。C用乙醇/丙酮(70/30)混合物固定15分鐘，然后在PBS中洗滌3次，并在存在0.05ml的1/2000稀釋度的抗黃病毒單克隆抗體(mAb4G2，其從ATCCH-B112雜交瘤獲得)時在37。C進行孵育1小時。然后洗滌上述平板兩次，在存在0.05ml的1/1000稀釋度的與堿性磷酸酶結合的抗小鼠lgG時在37。C孵育1小時。裂解噬斑(plagesdelyse)通過添加0.05ml的染色底物(subtratecolors):BCIP/NBT進4亍顯現。利用如以下定義的Karber公式計算中和抗體滴度log10SN50=d+f/N(X+N/2),其中d代表產生100%中和的稀釋度(即，6個陰性復制子(implicate),即，沒有顯示感染征兆的復制子)f:代表以loglO表示的稀釋因數(例如，l:4的稀釋因數，f=0.6)N:代表復制子/稀釋度的數目(N^6)X:除了稀釋度d之外，沒有顯示感染征兆的孔的總數，病毒檢測的極限是10SN50(即1.0log10SN50)。已用于中和的病毒毒抹是DEN116007、DEN216681、DEN316562或DEN41036毒才朱。對于所述對照樣品，重新滴定了起始的病毒稀釋度。在SN50測試中測量的中和滴度和通常在PRNT50測試中測量的中和滴度之間的相關性是1ogK)PRNT5(MogK)SN50+0.21.2同時免疫的評估對年齡和重量相當的兩組4只猴子進行免疫(參見表2)。通過皮下途徑、使用23G1針、使用105DICCso每種血清型CYDDENl-4(用于四價疫苗)和使用劑量104DICC5Q單價VDV-2在臂部進行免疫。表2:組分和免疫方案的組合<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>在一次免疫(笫0+28天)和兩次免疫(第56+28天)之后獲得的免疫原性結果在表3中被給出。病毒血癥結果在表4中被給出。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表4:病毒血癥分析(單位loglOGEQ/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>概括地，結果可以概述如下-根據本發明的給藥方案可以定性地和定量地提高使用包含兩次相同的四價疫苗的方案獲得的中和抗體反應。國與在VDV2單價初次免疫后進行的CYD畫1、2、3、4免疫在所有猴子中誘導了提高水平的抗上述四種血清型的反應，這與包含2次四價疫苗免疫的方案相反。-如預期地，使用VDV2進行的初次免疫誘導了幾乎專有地抗血清型2的反應，其在某些動物中具有低強度的抗血清型1和4的交叉反應性。-在初次免疫后觀察到具有VDV2的病毒血癥，其主要由CYD-4在第二次給藥(b)后引起的(組1)。在沒接觸過病毒的動物中，在四價疫苗的初次免疫引起的病毒血癥中沒有觀察到明顯不同(組2)。因此可以得出結論由本發明提出的方案在第二次給藥后不利于血清型1、3和4的病毒血癥的出現。上述實施例因此顯示出根據本發明的免疫方法改善了登革熱的疫苗病毒的免疫原性，而不損害后者的安全性。在本申請中引用的所有公開物以其整體引入作為參考。權利要求1.登革熱疫苗病毒用于制備用于抗登革熱病毒的免疫的單價疫苗和四價疫苗的用途，其包括(a)第一次給藥單價疫苗，該單價疫苗包含第一血清型登革熱的疫苗病毒，和(b)第二次給藥四價疫苗，該四價疫苗包含4種登革熱血清型的疫苗病毒，其中，在給藥所述單價疫苗之后至少30天至最多12個月給藥所述四價疫苗。2.根據權利要求1的用途，其中在第一次給藥(a)期間使用的所述疫苗病毒選自血清型1或2登革熱疫苗病毒。3.根據權利要求1或2的用途，其中在第一次給藥(a)期間使用的所述疫苗病毒選自VDV1和VDV2毒林。4.根據權利要求l-3任一項的用途，其中在四價疫苗中使用的疫苗病毒為ChimerivaxTMDEN-l、2、3和4。5.根據權利要求l-4任一項的用途，其中血清型1、2、3和4登革熱的疫苗病毒的數量在103到1(^DICC5o的范圍內。6.根據權利要求1-5任一項的用途，其中單價疫苗包含104DICC5G的VDV1或VDV2和四價疫苗包含105DICC50的ChimerivaxDEN誦1、2、3和4。7.根據權利要求1-5任一項的用途，其中單價疫苗包含104DICC5G的VDV1或VDV2,四價疫苗包含105DICC50的ChimerivaxTMDEN-l、2、3和103DICC50的ChimerivaxDEN-4。8.根據權利要求l-7任一項的用途，其中所述第二次給藥(b)在所述第一次給藥(a)之后30至60天實施。9.抗登革熱病毒的免疫試劑盒，其包括至少含有以下的盒子(a)包含單價疫苗的第一容器，所述單價疫苗含有第一登革熱血清型的疫苗病毒，(b)包含四價疫苗的第二容器，所述四價疫苗含有4種登革熱血清型的疫苗病毒。10.根據權利要求9的免疫試劑盒，其至少包括(a)含有單價疫苗的第一容器，所述單價疫苗包含VDVl或VDV2疫苗病毒，(b)含有四價疫苗的第二容器，所述四價疫苗包含4種ChimerivaxTMDEN-l、2、3和4。11.根據權利要求10的免疫試劑盒，其中所述單價疫苗包含104DICC5o的VDV1或VDV2,所述四價疫苗包含105DICC50的ChimerivaxTMDEN-1、2、3和4。12.根據權利要求10的免疫試劑盒，其中所述單價疫苗包含104DICC5Q的VDV1或VDV2,所述四價疫苗包含105DICC50的ChimerivaxDEN-1、2、3和103DICC5。的ChimerivaxDEN畫4。全文摘要本發明涉及在患者中誘導抗4種登革熱血清型的保護的方法，包括(a)第一次給藥單價疫苗，該單價疫苗包含第一登革熱血清型的疫苗病毒，和(b)第二次給藥四價疫苗，該四價疫苗包含4種登革熱血清型的疫苗病毒，其中，在給藥所述單價疫苗之后至少30天至最多12個月給藥所述四價疫苗。文檔編號A61K39/12GK101541344SQ200780043955公開日2009年9月23日申請日期2007年11月30日優先權日2006年12月1日發明者B·蓋伊,J·蘭,R·福拉特,V·巴班申請人:賽諾菲巴斯德有限公司